KR101247641B1

KR101247641B1 - Ｃｘｃｒ２에 결합하는 펩타이드 리간드를 포함하는 감염성 및 염증성 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101247641B1
Application number: KR1020100103259A
Authority: KR
Inventors: 배외식; 김상두
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2013-03-29
Anticipated expiration: 2030-10-22
Also published as: WO2012053827A2; WO2012053827A9; WO2012053827A3; KR20120041875A; US8937038B2; US20130252878A1

Abstract

본 발명은 감염성 및 염증성 질환 치료제에 관한 것으로, 보다 자세하게는 CXCR2에 결합하는 펩타이드 리간드, 특히 Ac-PGP를 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유효성분은 식세포에 의한 박테리아의 제거를 촉진하고, 염증을 억제하며, 면역세포의 아폽토시스를 억제하여 패혈증 및 패혈증 쇼크를 포함한 감염성 및 염증성 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

Description

ＣＸＣＲ２에 결합하는 펩타이드 리간드를 포함하는 감염성 및 염증성 질환 치료용 조성물{Composition of treatment for infectious and inflammatory diseases comprising peptide ligand binding to CXCR2}

본 발명은 감염성 및 염증성 질환 치료제에 관한 것으로, 보다 자세하게는 CXCR2에 결합하는 펩타이드 리간드를 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

감염성 질환은 바이러스, 박테리아, 기생충 등의 감염에 의한 질환으로, 그 중 박테리아 감염에 의한 질환은 항생제로 치료되어 왔으나, 최근 항생제 남용으로 인하여 다양한 슈퍼 박테리아가 등장하면서 박테리아에 의한 감염성 질환에 대한 새로운 치료 전략이 모색되어야 한다. 염증성 질환은 면역반응의 조절 실패와 연관된 질환으로, 아토피 피부염, 천식, 관절염 등을 예시로 들 수 있다. 이러한 질환들은 최근 남녀노소를 불문하고 급증하고 있으므로 부작용이 적은 효과적인 치료제가 필요한 상황이다.

패혈증은 감염에 대한 해롭거나 피해를 유발하는 숙주의 반응으로부터 야기되는 중환자실에서 일반적인 복잡한 임상적 증후군이다. 미국에서 200,000 건 이상의 사망이 패혈증에 의해 유발되는 것으로 보고되어 있다. 또한, 중증의 패혈증 및 패혈성 쇼크는 지난 20년 동안 현저하게 증가되었다. 중증의 패혈증 및 패혈성 쇼크의 사망률은 매우 높기 때문에 패혈증에 대한 신규한 효과적인 치료제의 개발이 절실하다.

패혈증에 의한 사망률은 염증 반응의 조절 실패와 연관되고, 이는 선천 면역 시스템의 상당한 결함에 의해 야기된다. 패혈증 중에 과다한 림프구의 아폽토시스가 일어나고, 이는 여러 기관의 마비로 이어진다. 초기 패혈증 단계에서는 TNF-α 및 IL-1β를 포함한 몇몇 전염증(pro-inflammatory) 사이토카인이 현저하게 증가되어 숙주 면역 시스템의 전반적인 기능상실을 일으킨다. 또한, 공격적 박테리아가 패혈증의 진행과 발병에서 주요 역할을 함이 알려져 있다. 따라서, 식세포의 활성을 촉진하고, 전염증 사이토카인의 생산을 억제하며, 면역세포의 아폽토시스를 차단함으로써 박테리아를 제어하는 효과적인 방법을 개발하는데 초점을 맞추는 것이 타당할 것이다.

CXCR2는 전통적인 화학주성물질(chemoattractant)의 수용체로서, 호중구, 단핵구 및 대식세포와 같은 식세포에서 발견되었다. 사람에서 CXCL8이 CXCR2에 결합한다. CXCL8의 마우스 상동체는 존재하지 않지만, 이의 기능은 CXCL1(KC, keratinocyte-derived chemokine)을 포함한 마우스의 다른 케모카인에 의해 대체될 수 있다. CXCL8 또는 KC에 의한 CXCR2의 시험관내 활성화는 호중구 및 단핵구에서 백혈구 화학주성적 이동을 유도하는 것으로 알려졌다. 패혈증 환자의 호중구에서 CXCR1이 아닌 CXCR2의 발현이 정상 대조군에 비해 50%까지 하향 조절되어 있음이 밝혀졌다. CXCR2의 하향 조절은 CXCR2 리간드에 의해 촉발되는 호중구 활성화의 부전으로 이어진다. CXCR2 차단 항체의 투여는 패혈증 실험 모델에서 생존율을 증가시키는 보고가 있다. 또한, CXCR2의 결핍이 생존율을 증가시키는 것으로 보고되었다. CXCL8에 대한 노출은 내피세포의 기능상실 및 내피의 정상적인 항응고 상태의 상실을 유발한다. Kuliopulos 등은 CXCR2의 세포내 영역으로부터 유래된 신규한 펩듀신(pepducin)(x1/2pal-3: pal-RTLFKAHMGQKHR) 리간드의 투여가 CXCL8 또는 CXCL1에 의한 CXCR2를 통해 매개되는 시그널링을 차단하여 CLP-패혈증 마우스의 생존율을 현저하게 증가시킴을 입증하였다.

본 발명자는 박테리아 제거 효과를 높이면서, 염증을 억제하고, 면역세포의 아폽토시스도 억제할 수 있는 물질을 탐색하던 중 CXCR2에 결합하는 펩타이드 리간드, 특히 Ac-PGP가 상기 조건에 부합하여 패혈증과 같은 감염성 및 염증성 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 CXCR2에 결합하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 CXCR2에 결합하는 펩타이드 리간드는 바람직하게는 Ac-PGP를 의미한다.

상기 감염성 및 염증성 질환은 바람직하게는 패혈증 또는 패혈증 쇼크를 의미한다.

본 발명의 유효성분은 식세포에서 과산화수소와 같은 반응성 산소종의 생산을 촉진함으로써 식세포에 의한 박테리아의 제거(살균)를 촉진한다.

또한, 유효성분은 Th1 사이토카인(예, IFN-γ, IL-12, IL-2)의 생산을 촉진하고, 상기 IFN-γ가 전염증성 사이토카인(예, TNF-α, IL-1β, IL-6)의 생산을 억제함으로써 염증 반응을 억제한다.

또한, 유효성분은 비장세포 및 흉선세포와 같은 면역세포의 아폽토시스를 억제한다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용된 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 피하 주사용으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 체중 1kg당 1 내지 200mg의 유효량으로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, CXCR2에 결합하는 펩타이드 리간드, 특히 Ac-PGP는 식세포에 의한 박테리아의 제거를 촉진하고, 염증성 사이토카인의 생산을 감소시켜 염증을 억제하며, 면역세포의 아폽토시스를 억제함으로써 패혈증 및 패혈증 쇼크를 포함한 다양한 감염성 및 염증성 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

도 1a는 CLP 마우스에 다양한 농도의 Ac-PGP를 주입한 후 농도별 생존율을 나타낸 것이다.
도 1b는 CLP 마우스에 Ac-PGP를 다양한 회수로 처리한 후 회수별 생존율을 나타낸 것이다.
도 1c는 CLP 마우스에 17.5mg/kg의 Ac-PGP를 4회 접종한 경우의 생존율을 나타낸 것이다.
도 1d는 LPS가 접종된 패혈증 마우스에 17.5mg/kg의 Ac-PGP를 4회 접종한 경우의 생존율을 나타낸 것이다.
도 1e는 CLP 마우스를 CXCR2 길항제(SB225002)의 전처리 유 또는 무 조건에서 Ac-PGP로 처리한 경우 생존율을 나타낸 것이다.
도 1f는 야생형 또는 CXCR2 결핍된 CLP 마우스에 Ac-PGP를 처리한 경우 생존율을 나타낸 것이다.
도 2a는 CLP에 의해 유발되는 주요 장기의 염증에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 2b는 CLP에 의해 유발되는 비장 세포의 아폽토시스에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 2c는 CLP에 의해 유발되는 흉선 세포의 아폽토시스에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 3a는 CLP 마우스의 복막액내 박테리아에 대한 Ac-PGP의 살균 효과를 나타낸 것이다.
도 3b는 마우스 호중구내 대장균에 대한 Ac-PGP의 살균 효과를 나타낸 것이다.
도 3c는 다양한 농도의 Ac-PGP로 처리된 마우스 호중구에서 과산화수소의 생산량을 나타낸 것이다.
도 3d는 마우스 호중구를 CXCR2 길항제(SB225002)의 전처리 유 또는 무 조건에서 Ac-PGP로 처리한 경우 과산화수소의 생산량을 나타낸 것이다.
도 4a는 CLP 마우스에서 전염증 사이토카인 TNF-α 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 4b는 CLP 마우스에서 전염증 사이토카인 IL-1β 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 4c는 CLP 마우스에서 전염증 사이토카인 IL-6 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 4d는 LPS에 의한 마우스 비장세포에서 전염증 사이토카인 TNF-α 생산 양에 대한 Ac-PGP 또는 KC의 영향을 나타낸 것이다.
도 4d는 LPS에 의한 마우스 비장세포에서 전염증 사이토카인 IL-6 생산 양에 대한 Ac-PGP 또는 KC의 영향을 나타낸 것이다.
도 5a는 CLP 마우스에서 타입 1 사이토카인 IFN-γ 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 5b는 CLP 마우스에서 타입 1 사이토카인 IL-12 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 5c는 CLP 마우스에서 타입 1 사이토카인 IL-2 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 5d는 IFN-γ가 결핍된 CLP 마우스에서 비장세포의 아폽토시스에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 5e는 CLP 마우스의 비장세포에서 카파제-3의 활성화에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 5f는 LPS로 자극된 마우스의 비장세포에서 IFN-γ의 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 5g는 IFN-γ의 존재 또는 부재 조건에서 LPS로 자극된 마우스의 비장세포에서 생산되는 TNF-α의 양을 나타낸 것이다.
도 5h는 IFN-γ의 존재 또는 부재 조건에서 LPS로 자극된 마우스의 비장세포에서 생산되는 IL-6의 양을 나타낸 것이다.
도 6a는 사람의 호중구내 대장균에 대한 Ac-PGP의 살균 효과를 나타낸 것이다.
도 6b는 LPS에 의한 사람 비장세포에서의 전염증 사이토카인 TNF-α 생산 양에 대한 Ac-PGP 또는 CXCL8의 영향을 나타낸 것이다.
도 6c는 LPS에 의한 사람 PBMCs에서의 전염증 사이토카인 TNF-α 생산 양에 대한 Ac-PGP 또는 KC의 영향을 나타낸 것이다.
도 6d는 LPS로 자극된 사람의 비장세포에서 IFN-γ의 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.
도 6e는 LPS로 자극된 사람의 PBMCs에서 IFN-γ의 생산 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 CXCR2에 결합하는 펩타이드 리간드를 유효성분으로 포함하는 감염성 및 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 유효성분인 'CXCR2(CXC-chemokine receptor 2)에 결합하는 펩타이드 리간드'는 CXCR2에 결합하여 이의 작용을 조절할 수 있는 임의의 펩타이드를 의미하며, 바람직하게는 Ac-PGP를 의미한다.

본 발명의 바람직한 유효성분인 'Ac-PGP(acetylated-Pro-Gly-Pro)'는 아미노산 프롤린(P; Pro), 글리신(G, Gly), 프롤린 순으로 아미드 결합된 트리 펩타이드(tri peptide)로서, 프롤린이 아세틸화된(acetylated, Ac) 구조이다. Ac-PGP는 세포외 기질(extracellular matrix)의 분해 산물이므로, 천연의 세포외 기질을 분해하여 수득할 수 있다. 또는, 각 아미노산을 아미드 결합으로 연결하고, 아세틸화하여 인공적으로 합성할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서, CLP(cecal ligation and puncture) 패혈증 동물 모델에 Ac-PGP를 투여한 결과, 동물 모델의 생존율이 증가하였다. 특히 17.5mg/kg의 Ac-PGP를 4 내지 5회 투여한 경우 생존율이 가장 높았다.

본 발명의 다른 실시예에서, 패혈증 동물 모델에 Ac-PGP를 투여한 결과, 주요 장기(간, 폐, 흉선)의 염증이 억제되었다. 또한, Ac-PGP는 비장세포 및 흉선세포와 같은 면역세포의 아폽토시스를 억제하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 패혈증 동물 모델 또는 대장균을 포식한 호중구에 Ac-PGP를 처리한 결과, 박테리아 제거 효과가 나타냈으며, 이러한 효과는 과산화수소에 의해 매개되었다. 과산화수소 생산은 Ac-PGP에 의해 증가되었으나, 이러한 증가는 CXCR2 길항제에 의해 상쇄되었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 패혈증 동물 모델 또는 LPS로 자극된 호중구에 Ac-PGP를 처리한 결과, 전염증 사이토카인의 생산이 저해됨을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, Ac-PGP는 Th1 사이토카인(IFN-γ, IL-12, IL-2)의 생성을 증가시켰고, IFN-γ는 TNF-α 및 IL-6과 같은 전염증 사이토카인의 생산을 억제시켰다. 그런데, IFN-γ 결핍 마우스에서는 Ac-PGP의 림프구 아폽토시스 억제 효과가 상쇄되었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 Ac-PGP에 의한 패혈증 치료 효과가 CXCR2에 의해 매개됨을 확인하였다.

이와 같이, CXCR2에 결합하는 펩타이드 리간드에 속하는 Ac-PGP는 식세포에 의한 박테리아의 제거를 촉진하고, 염증을 억제하며, 면역세포의 아폽토시스를 억제하므로 다양한 감염성 및 염증성 질환 치료제, 특히 패혈증 또는 패혈증 쇼크의 치료제로 이용 가능하다.

본 발명에서 '감염성 질환'은 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충과 같은 미생물의 감염으로 인하여 발생하는 모든 질환을 의미하며, 바람직하게는 박테리아의 감염으로 인한 질환을 의미한다.

본 발명에서 '염증성 질환'은 면역반응 조절 실패와 연관된 질환으로, 예를 들면, 아토피 피부염, 천식, 각종 알레르기 질환, 당뇨병, 관절염, 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 염증성 장질환 등이 언급될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등 경구 투여용 제형, 멸균 주사용액, 좌제 및 경피 투여용 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용된 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제형화한다.

한 양태로서, 본 발명의 약학 조성물은 경구 투여용 고상 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고상 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 유효성분을 함유한 약학 조성물을 경구 투여용 액상 제제로 제형화할 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불활성 희석제 (예를 들면, 정제수, 에탄올, 리퀴드 파라핀) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 유효성분을 함유한 약학 조성물은 비경구, 바람직하게는 복강내 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제로, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 경구 또는 비경구(경피, 피하, 정맥, 근육, 복강 등)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양(즉, 유효성분의 양)을 말한다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 체중 1kg당 1 내지 200mg, 보다 바람직하게는 5 내지 100mg, 보다 더 바람직하게는 10 내지 50mg의 유효량으로 투여될 수 있다. 투여 회수는 1 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 6회, 더욱 바람직하게는 4 내지 5회일 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

1. 동물 및 패혈증 모델

Ac-PGP의 치료 효과를 평가하기 위해 수컷 WT ICR 마우스가 이용되었다. IFN-γ-결핍 마우스(Y.K. Kim에 의해 제공됨, Pohang University of Science and Technology, Pohang, Republic of Korea)가 메커니즘 연구에 이용되었다. 동물을 포함한 모든 실시예는 동아대학교의 실험동물의 이용 및 관리에 대한 임상시험 심사위원회의 허가를 받고, 지침에 따라 수행되었다. CLP의 경우에, 마우스는 펜토탈 소듐(pentothal sodium, 50 mg/kg, 복강내 주사)으로 마취하고, 복부에 작은 중간선 절개를 만들어 맹장이 노출되도록 하였다. 그리고, 맹장을 돌막창자판막(ileocecal valve) 밑을 묶고, 22-게이지 바늘을 이용하여 양쪽 표면을 2회 (또는 사이토카인 생산을 측정하기 위해 1회) 천자하고 복부를 봉합하였다. 샴(sham) CLP 마우스도 동일하게 처리하되, 맹장의 천자(CLP)는 수행하지 않았다. 10일 동안 매일 생존율을 모니터링하였다. LPS 또는 대장균(E. coli) 모델의 경우, 대장균(1 x 10⁹세포/마우스) 또는 60 mg/kg의 LPS를 복강으로 각각 주입하였다. 생존율을 10일 동안 매일 한차례 모니터링하였다.

2. 생체내 살균 활성 측정

CLP 후 24시간에 복막세척액(peritoneal lavage fluid)을 회수하여 혈액 한천 평판 배지(blood-agar base plates; Trypticase Soy Agar Deeps, Becton Dickinson)에서 하룻밤 동안 37℃에서 배양하였다. CFU의 수는 공지된 바에 따라 카운팅하였다(Yan JJ et al. 2004 Nat. Med. 10:161-167).

3. 폐부종의 정량

폐부종의 정도는 공지된 바와 같이 폐의 W/D 중량 비율을 평가하여 정량하였다(Liu D et al. 2005 Inflamm. Res. 54:464-470). 전체 회수된 젖은 폐를 중량 측정 후 오븐내에서 60℃에서 48시간 동안 위치시켰다. 그리고 건조된 중량을 측정한 후 W/D 중량 비율을 계산하였다.

4. 조직학적 분석

마우스에 CLP 시술을 가하고 2시간 후 PBS 또는 Ac-PGP를 17.5mg/kg의 용량으로 제공하였다. 시술 후 24시간에 마우스를 희생시킨 후 형태학적 분석을 위해 폐를 고정하고, 절편화한 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.

5. 아폽토시스 평가를 위한 면역조직화학

먼저, 파라핀으로 포매된 조직을 통상의 조직학적 프로토콜을 이용하여 탈파라핀화한 후 TUNEL 분석을 수행하였다. 절편을 4℃에서 2분 동안 Triton X-100으로 투과시킨 후 37℃에서 60분 동안 TdT 효소 및 TUNEL(digoxigenin-dUTP reaction buffer) 시약으로 홍수하였다. 아폽토시스 세포(TUNEL-양성인 세포)의 백분율을 광 현미경하에서 500 비장세포를 카운팅함으로써 결정하였다. 또한, 파라핀으로 포매된 조직을 통상의 조직학적 프로토콜을 이용하여 탈파라핀화한 후 절단된 카파제-3에 대한 면역조직화학 분석을 수행하였다(Wang J et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98:4038-43).

6. 마우스 호중구의 분리 및 H₂O₂의 측정

마우스 호중구를 Histopaque-1077 용액(Sigma)를 이용하여 말초 혈액으로부터 분리하였다(Bae YS et al. 2001 Blood. 97: 2854-2862). 정상 마우스로부터 분리된 호중구를 사이토칼라신 B(cytochalasin B)(5μM)의 존재에서 10분 동안 다양한 농도의 Ac-PGP로 자극하였다. mCXCR2의 역할을 규명하기 위해, 호중구를 여러 농도의 SB225002 또는 비히클 (DMSO)로 30분 동안 전정치배양한 후 Ac-PGP(20μM)을 첨가하고 10분간 배양하였다. 상층액내 H₂O₂는 H₂O₂ 측정 키트(Molecular probe)를 이용하여 측정하였다.

7. 사람 호중구 및 PBMCs의 분리

사람을 대상으로 한 모든 프로토콜은 동아대병원의 생명윤리위원회에 의해 승인받았고, 모든 혈액 기증에 대해 사전 동의를 구하였다. 건강한 수여자로부터 말초 혈액을 회수하여 Histopaque-1077 그래디언트(gradient)에서 사람의 말초 단핵구를 분리하였다. 호중구는 종래 알려진 바에 따라 적혈구의 덱스트란 침강, 저장성 용균 그리고 림프구 분리 배지 그래디언트 사용 등을 통해 분리하였다(Bae, Y.S. et al .Blood 97, 2854-2862(2001)). 분리된 사람 백혈구는 즉시 이용되었다.

8. 호중구의 살균 활성

호중구의 살균 활성은 Yan 등의 방법에 따라 측정되었다(Yan JJ et al. 2004 Nat. Med. 10:161-167). 호중구를 60-mm 플라스틱 배양 디쉬내 13-mm 플라스틱 커버 슬립 상에서 37℃에서 1시간 동안 정치배양하였다. 비접착 세포를 PBS로 제거하였다. 접착된 호중구를 10⁶ 옵소닌화된(opsonized) 대장균과 1시간 동안 정치배양하였다. 포식되지 않은 대장균을 세척한 후 호중구내 생존 박테리아의 수를 다양한 농도의 Ac-PGP 또는 비히클로 1시간 동안 처리하기 전 및 후에 확인하였다. 사멸된 박테리아의 백분율을 아래와 같이 계산하였다.

100 x (1- Ac-PGP 자극 후 CFU 수/Ac-PGP 자극 전 CFU 수)

9. CLP 후 사이토카인 측정

복막세척액내 CLP에 의해 유도되는 사이토카인의 생산을 측정하기 위해, CLP 후 마우스에 Ac-PGP를 2시간, 14시간, 26시간 및 38시간에 제공하였다. CLP 후 4시간 및 72시간 사이 다양한 시간대에 복막세척액을 회수하여 복막액에 존재하는 사이토카인을 ELISA(BD Biosciences Pharmingen)로 측정하였다.

10. 시험관내 염증 세포로부터 사이토카인 방출

마우스 비장세포를 96-구판내에 5% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지에 위치시키고 37℃, 5% CO₂ 배양기내에 유지시켰다. 그 다음 이 비장세포를 Ac-PGP의 존재 또는 부재 조건에서 24시간 동안 LPS(100 ng/ml)와 정치배양하였다. 30분 후에 세포에 LPS를 첨가한 후 세포가 없는 상층액을 회수하여, 원심분리한 후 ELISA(BD Biosciences Pharmingen)로 TNF-α, IL-6 및 IFN-γ를 측정하였다. LPS에 의한 전염증 사이토카인의 생산에 대한 IFN-γ의 영향과 관련하여, 마우스 비장세포 5 x 10⁵ 세포/ml를 여러 농도의 IFN-γ(R&D) (1, 10, 100 및 1000 IU/ml) 존재 또는 부재 조건에서 100 ng/ml의 LPS로 자극하였다. 정치배양 후 20시간에 TNF-α 및 IL-6의 양을 ELISA(BD Biosicences Pharmingen)로 측정하였다.

실시예 2: 결과

1. Ac-PGP는 패혈증에 의해 유도되는 사망을 예방함

실험적 패혈증에 대한 Ac-PGP의 치료 효과는 알비노 ICR(albino Institute of Cancer Research) 마우스를 이용하여 CLP에서 조사하였다. 마우스의 생존은 CLP 후 10일 동안 모니터링되었다. CLP 후 2일에 무처리 WT 마우스의 20%만이 생존하였다(도 1a). CLP 후 2시간째에 Ac-PGP의 피하 투여는 생존율을 용량 의존적으로 현저하게 증가시켰다(도 1a). 7.5, 12.5 또는 17.5mg/kg의 Ac-PGP 주입은 PBS 주입된 대조군에 비해 마우스의 생존을 현저하게 증가시켰다(도 1a). 주입 주기와 관련하여, 생존은 17.5mg/kg의 Ac-PGP를 CLP 후 2시간째에 12시간 간격으로 3 또는 4회 추가로 주입하였을 때 크게 증진되었다(도 1b). 이러한 결과를 근거로, 추후 실시예에서는 CLP 마우스에 17.5mg/kg의 Ac-PGP를 CLP 후 2시간째부터 시작하여 12시간 간격으로 3회 추가로 주입하였다. Ac-PGP를 CLP 후 10시간째에 주입하였을 때에도 치료 효과는 여전히 나타났다(도 1c).

다른 패혈증 마우스 모델에서 Ac-PGP의 치료 효과를 또한 평가하였다. 대장균이 접종된 마우스(1 x 10⁹ 세포/마우스)에 접종 후 2시간째부터 17.5mg/kg의 Ac-PGP를 4회 피하로 처리한 경우 PBS로 처리된 대장균 접종 마우스에 비해 치사율이 감소하였다. 또한, Ac-PGP는 60mg/kg의 LPS가 복강 주입된 마우스의 사망률도 감소시켰다(도 1d).

Ac-PGP의 항패혈증 활성이 이의 공지된 수용체인 CXCR2를 통하여 작용하는 것인지 여부를 확인하였다. CXCR2 선택적 길항제 (SB225002)로 전처리된 CLP 마우스에서 Ac-PGP는 생존율을 개선하지 못하였다(도 1e). Ac-PGP 처리는 CXCR2 결핍된 패혈증 마우스에서는 생존율을 개선하지 못하였다(도 1f). 이러한 결과는 Ac-PGP가 특이적으로 CXCR2를 통해 작용하여 실험 패혈증에서 생존율을 증가시킴을 보여준다.

2. Ac-PGP는 주요 장기의 염증과 면역세포의 아폽토시스(apoptosis)를 억제함.

폐와 같은 주요 장기의 기능 상실이 패혈증 후 사망률과 관련이 있다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하여 형태학적 변화를 관찰하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, CLP는 간, 폐 및 흉선과 같은 주요 장기에 상당한 염증을 유발하였다. CLP 마우스에서 간 조직은 더 많은 네크로시스(necrosis)를 보였으나, 이는 Ac-PGP의 투여에 의해 감소하였다. CLP 마우스의 폐는 심각한 폐포 울혈 및 광범위한 혈전 병소의 형성을 보였으나, 이 또한, Ac-PGP에 의해 현저하게 억제되었다. Ac-PGP의 투여는 CLP에 의해 유도되는 흉선 및 비장 세포의 아폽토시스를 억제시켰다. CLP 마우스의 흉선 또는 비장에서의 아폽토시스 대부분은 미성숙 세포가 군집된 흉선 또는 비장의 피질에서 발생하였다. 샴 또는 Ac-PGP 마우스에 비해 CLP 마우스의 아폽토시스 세포에서 중요한 형태학적 변화는 아폽토시스 림프구에 다중 핵 절편(아폽토시스체)을 가진 작은 조밀한 핵(pyknosis)이 존재한다는 것이다(도 2a). Ac-PGP의 투여는 CLP에 의해 유도되는 주요 장기의 염증을 강하게 차단하였다. 또한, 본 실시예에서는 CLP가 급성 폐 염증의 지표인 폐 젖은/건조(W/D) 중량 비율에서의 증가를 유도함을 확인하였다. 면역세포의 아폽토시스가 또한 패혈증에 동반되었다. CLP에 의한 패혈증은 비장 및 흉선에서 면역세포의 아폽토시스를 유도하였다; 그러나, 이러한 영향은 Ac-PGP의 투여에 의해 현저하게 억제되었다(도 2b, 2c).

3. Ac-PGP는 살균 효과를 증진시킴

CLP에 의한 치사율은 복막액내 박테리아 콜로니 수와 상관관계가 있다. 이에, Ac-PGP의 복막액에서 박테리아를 제거하는 효과를 검사하였다. Ac-PGP의 투여는 CLP 후 24시간째에 복강의 박테리아 콜로니 수를 82.1%까지 현저하게 감소시켰다(도 3a). 시험관내 Ac-PGP의 살균 활성은 마우스의 호중구를 이용하여 검사하였다. 마우스 호중구가 1시간 동안 대장균을 섭취하도록 한 후 다양한 농도의 Ac-PGP(0.1 - 100 nM)로 20분 동안 자극하였다. 마우스 호중구의 Ac-PGP로의 자극은 용량 의존적으로 살균 활성을 크게 증진시켰다(도 3b). 과산화수소와 같은 반응성 산소종이 살균 활성에 관여하는 주요 분자로 알려져 있다. 이에, 마우스 호중구내 과산화수소 생산에 대한 Ac-PGP의 영향을 검사하였다. 마우스 호중구의 다양한 농도의 Ac-PGP로의 자극은 농도 의존적으로 과산화수소의 생산을 강하게 증진시켰다(도 3c). Ac-PGP에 의한 과산화수소 생산에서 CXCR2의 역할을 검사하기 위해, 호중구를 Ac-PGP로 처리하기 전에 CXCR2 길항제(SB225002)로 전처리하였다. Ac-PGP에 의한 과산화수소 생산은 CXCR2 길항제에 의해 완전히 억제되었다(도 3d).

4. Ac-PGP는 CLP 모델에서 전염증 사이토카인을 감소시킴

CLP에 의한 복막액내 전염증 사이토카인에 대한 Ac-PGP의 영향은 CLP 후 4시간부터 72시간까지 측정하였다. CLP는 24시간내에 전염증 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 현저한 증가를 유도하였다(도 4a-c). CLP에 의한 패혈증 모델에 Ac-PGP의 주입은 사이토카인의 양에서 현저한 변화를 유발하였다. Ac-PGP 주입은 전염증 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 양의 감소를 유발하였다(도 4a-c). LPS에 의한 전염증 사이토카인 생산에 대한 Ac-PGP의 영향을 평가하기 위해, 마우스 비장세포에 의한 TNF-α 및 IL-6의 시험관내 생산을 평가하였다. LPS에 의한 마우스 비장세포로부터 TNF-α 및 IL-6의 직접적 방출은 시험관내 Ac-PGP 처리에 의해 억제되었다(도 4d, e). 그러나, 마우스 IL-8의 카운터파트인 KC는 LPS에 의해 자극된 TNF-α 및 IL-6의 생산을 억제하지 못하였다(도 4d, e).

5. Ac-PGP의 살균 효과 및 항염증 효과는 타입 1 사이토카인(IFN-γ)에 의해 매개되는 경로에 의존함

복막액내 CLP에 의한 Th1 사이토카인 양에 대한 Ac-PGP의 영향을 또한 CLP 후 4시간부터 72시간까지 측정하였다. T-헬퍼 타입 1 사이토카인(IFN-γ, IL-12p70 및 IL-2)의 양은 Ac-PGP 주입 즉시 현저하게 증가하였다(도 5a-c). Ac-PGP는 CLP 후 24시간째에 복막액에서 IFN-γ 및 IL-12의 양을 개선하였으므로(도 5a-c), Ac-PGP에 의한 살균 활성에 대한 타입 1 사이토카인의 영향을 평가하였다.

면역세포의 아폽토시스는 패혈증의 사망률과 연관이 있다. 여기서, CLP는 비장세포의 아폽토시스를 현저하게 증가시킴을 확인하였다(도 5d). Ac-PGP의 투여는 비장세포의 아폽토시스를 현저하게 억제시켰다. 그러나, 이러한 Ac-PGP에 의한 비장세포 아폽토시스의 억제 효과는 IFN-γ 결핍 마우스에서 현저하게 완화되었다(도 5d). 림프구 아폽토시스는 카파제-3을 포함한 몇 개의 주요 카파제의 활성화에 의해 유도된다. 이에, 카파제-3의 활성화에 대한 Ac-PGP의 영향 뿐만 아니라 CLP에 의한 카파제-3의 활성화도 조사하였다(도 5 e). 카파제-3 활성화가 CLP에 의한 패혈증에서 관찰되었다; 그러나, 카파제-3의 활성화는 Ac-PGP에 의해 현저히 억제되었다(도 5e).

Ac-PGP의 투여는 생체내에서 IFN-γ 생산을 개선함을 확인하였으므로 비장세포에 의한 IFN-γ의 생산에 대한 Ac-PGP의 직접적인 영향을 조사하였다. 도 5f에 나타낸 바와 같이 비장세포의 Ac-PGP로의 활성화는 LPS에 의한 IFN-γ의 생산을 증진시켰다. 또한, 전염증 사이토카인의 생산에 대한 IFN-γ의 영향을 조사하였다. 마우스 비장세포의 IFN-γ로의 자극은 LPS에 의한 TNF-α 및 IL-6의 생산을 완화시켰다(도 5g 및 5h).

5. Ac-PGP는 살균 효과 및 IFN-γ 생산을 촉진하지만, LPS에 의해 유도된 사람 중성구와 PBMCs에서의 TNF-α의 생산을 억제함

Ac-PGP가 마우스 호중구의 살균 활성을 강하게 촉진하였으므로 사람 중성구에 대한 Ac-PGP의 살균 효과를 검사하였다. Ac-PGP는 사람 중성구에 의한 박테리아 살상에 용량 의존적 효과를 보였다. 극히 적은 100nM의 Ac-PGP만으로도 살균 활성이 현저하게 개선되었고, 20μM의 Ac-PGP는 첨가된 옵소닌된 대장균을 거의 완전히 살상하였다(도 6a).

다음으로, 사람 호중구 및 PBMCs에 의한 사이토카인 생산에 대한 Ac-PGP의 영향을 조사하였다. 시험관내에서 마우스 비장세포와 유사하게 LPS로 자극된 사람 호중구 또는 PBMCs에 의한 TNF-α의 생산은 Ac-PGP 처리에 의해 현저하게 억제된 반면(도 6b, 6c), IFN-γ의 생산은 현저하게 개선되었다(도 6d, e). 사람 CXCR2 케모카인 작용제 CXCL8은 LPS로 자극된 TNF-α 또는 IFN-γ 생산에 거의 영향을 미치지 못하였다(도 6b-e). 따라서, Ac-PGP는 사람과 마우스의 백혈구 모두의 항패혈증 활성을 개선할 수 있다.

Claims

CXCR2 (CXC-chemokine receptor 2)에 결합하는 펩타이드 리간드인 Ac-PGP(acetylated-Pro-Gly-Pro)를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증 쇼크 치료용 약학 조성물.
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제 1항에 있어서,
상기 유효성분은 식세포에 의한 박테리아 제거 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 유효성분은 염증 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 유효성분은 면역세포의 아폽토시스를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
약제학적으로 허용된 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
피하 주사용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
체중 1kg당 1 내지 200mg의 유효량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.