KR101230638B1 - 내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 클루이베로마이세스 마르샤너스 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 및 이를 이용한 에탄올 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 내열성 및 에탄올 생산성이 매우 우수하여, 바이오매스, 바람직하게는 섬유질계 바이오매스를 이용한 에탄올 제조시 동시에 당화 및 발효가 가능하므로 에탄올 제조에 용이하게 사용될 수 있다.

Description

내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 클루이베로마이세스 마르샤너스 균주{Kluyveromyces marxianus having superior heat resistance and ethanol productivity}

본 발명은 내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 클루이베로마이세스 마르샤너스 균주 및 이를 이용한 에탄올 제조방법에 관한 것이다.

최근 환경 문제와 화석연료의 고갈에 대한 우려로 인해 바이오 에탄올에 대한 관심이 증가하고 있다. 그 중에서도 식량자원과의 충돌을 피하고, 원료 비용의 큰 감소를 가져올 수 있는 섬유질계 바이오에탄올에 대한 관심과 연구가 증대하고 있다.

상기 섬유질계 바이오에탄올은 보릿짚, 억새, 폐목재 등의 섬유질계 바이오매스를 원료로 하여 박테리아나 효모와 같은 미생물을 이용한 에탄올 발효를 통해 얻어진다. 주로 농임산 폐자원과 같은 섬유질계 바이오매스를 활용하므로 원료가격이 당질계, 전분질계 바이오매스에 비해 매우 저렴하나 섬유질계 바이오매스로부터 당을 얻어내는 전처리 및 당화 공정에 있어 상대적으로 많은 비용이 발생하여 산업화에 어려움이 따르고 있다.

통상적으로 섬유질계 바이오매스는 직접적인 당화가 어렵기 때문에 산, 염기 처리, 암모니아 처리, 열수 처리, 증기 폭쇄 처리 등의 전처리를 통해 조직을 와해시킨 후 셀룰레이즈, 헤미-셀룰레이즈, 베타-글루코시데이즈와 같은 복합 당화 효소의 작용으로 주로 포도당과 목당 형태의 당을 얻어낸다. 당을 얻어낸 이후는 미생물을 이용한 종래의 에탄올 발효 및 증류와 크게 다르지 않으나, 전처리 및 당화에 들어가는 비용이 전체 섬유질계 바이오에탄올 생산비용의 절반을 상회하므로 당화 효소 생산 기술의 개발과 효율적인 공정 기술 개발 및 우수한 에탄올 발효 미생물의 개발이 요구되고 있다.

특히 섬유질계 바이오매스의 당화는 섬유질계 당화효소의 특성상 45-50℃의 고온에서 최적 당화가 이루어지고, 에탄올 발효 산업에 사용되는 에탄올 발효 미생물, 주로 효모들은 40℃ 이하의 30-35℃ 정도에서 최적 발효가 수행되며, 40℃ 이상의 고온에서는 대부분 생육조차 어렵다. 따라서 현재 당화 공정과 발효 공정을 완전히 분리하여 진행하여야 하므로, 공정상 불편을 초래하고 공정 운영 비용이 많이 소요되는 문제점이 있다. 그러므로 동시에 당화 및 발효에 의한 에탄올 생산방법의 개발이 필요하며 이를 위해서는 40℃ 이상의 고온에서도 에탄올 발효가 가능한 효모 균주의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 신규한 균주를 개발하고, 상기 균주를 이용하여 동시 당화 및 발효함으로써 효과적으로 에탄올 생산이 가능함을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 기탁번호 KCTC11250BP인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 기탁번호 KCTC17631인 클루이베로마이세스 마르샤너스를 원형질 융합하여 제조된 내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 클루이베로마이세스 마르샤너스(Kluyveromyces marxianus) 변이 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 에탄올 생산용 생균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 균주 및 당화효소를 바이오매스(Biomass) 기질에 처리하여 당화 및 발효하는 단계를 포함하는 에탄올 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC11250BP인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 기탁번호 KCTC17631인 클루이베로마이세스 마르샤너스를 원형질 융합하여 제조된 내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 클루이베로마이세스 마르샤너스(Kluyveromyces marxianus) 변이 균주를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 에탄올 생산용 생균 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 및 당화효소를 바이오매스(Biomass) 기질에 처리하여 당화 및 발효하는 단계를 포함하는 에탄올 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 기탁번호 KCTC11250BP인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 기탁번호 KCTC17631인 클루이베로마이세스 마르샤너스를 원형질 융합하여 제조된 내열성 및 에탄올 생산성이 우수한 균주이다.

상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 에탄올 생산성이 뛰어난 기탁번호 KCTC11250BP인 사카로마이세스 세레비지에 및 내열성이 뛰어난 기탁번호 KCTC17631인 클루이베로마이세스 마르샤너스를 원형질 융합하여 제조됨으로써 에탄올 생산성이 뛰어나면서 내열성도 있는 특징이 있다.

상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 기탁번호 KCTC11250BP인 사카로마이세스 세레비지에 또는 이의 돌연변이체와 기탁번호 KCTC17631인 클루이베로마이세스 마르샤너스 또는 이의 돌연변이체와 원형질 융합하여 제조될 수 있으며, 상기 돌연변이체는 기탁번호 KCTC11250BP인 사카로마이세스 세레비지에 또는 기탁번호 KCTC17631인 클루이베로마이세스 마르샤너스를 식별할 수 있는 선별 마커가 도입된 균주를 말한다.

구체적으로 상기 사카로마이세스 세레비지에의 돌연변이체는 돌연변이를 유발하는 물질, 바람직하게는 Acriflavine을 상기 균주에 처리하여 제조된 사카로마이세스 세레비지에의 호흡결여 돌연변이체 일 수 있다.

또한 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스의 돌연변이체는 돌연변이를 유발하는 물질, 바람직하게는 EMS(ethylmethansulphate), NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 상기 균주에 처리하여 제조된 클루이베로마이세스 마르샤너스의 Isoleucine 및 Valine과 관련된 생합성 유전자가 결손된 영양요구성 돌연변이체일 수 있다.

상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주를 제조하기 위하여 사용되는 원형질 융합은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.

상기 원형질 융합은 서로 다른 형질을 가진 두 균주를 융합하여 두 세포의 좋은 형질을 모두 가진 새로운 우량형질의 잡종 균주를 만드는 기술로, 일부 원생동물에서 핵의 융합이 없이 두 개의 반수체 세포의 원형질이 결합하는 경우도 이에 해당된다. 상기 원형질 융합은 이에 한정되지는 않지만 두 균주를 대수기 상태로 배양한 후, 각각 적정 완충액 조건 하에서 라이티케이즈(Lyticase) 등의 세포벽 분해 효소로 처리하여 세포벽을 제거한 후, 원형질 상태의 두 세포를 융합 완충액 조건에서 혼합하여 융합을 유도하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 생육온도가 28 내지 48℃이고, 보다 바람직하게는 35 내지 43℃이며 에탄올 발효 적정온도가 32 내지 45℃이고, 보다 바람직하게는 35 내지 41℃ 이다. 따라서 40℃ 이상에서도 생육이 가능하며 에탄올 발효도 가능한 특징이 있다. 또한 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 pH 3 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 6에서 생육할 수 있다.

또한 본 발명의 한 구체예에서 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열은 서열번호 5의 염기서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열정보를 근거로 NCBI database에 등록된 다른 효모 균주들의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열과 상동성(homology) 분석을 수행한 결과, 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 신규한 균주임을 알 수 있다.

본 발명의 한 구체예에 따른 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주(균주명: CHY1612)는 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC11757BP로 2010년 9월 3일자로 기탁된 균주일 수 있다.

본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 통상의 균주 배양용 배지에서 당업자에게 공지된 방법에 따라 배양될 수 있으며, 에탄올 생산을 위해 YPD(Yeast extract Peptone Dextrose, 10 g/L Yeast Extract(Difco), 20 g/L Peptone(Difco), 50 g/L Glocose(Junsei)) 배지를 사용하여 배양될 수 있다.

본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 바이오매스(Biomass), 바람직하게는 섬유질계 바이오매스의 당화 최적 온도인 45 내지 50℃ 수준에서도 생육 및 에탄올 생성능을 유지할 수 있어, 바이오매스를 이용한 에탄올 제조시 동시에 당화 및 발효가 가능하므로 에탄올 제조에 용이하게 사용될 수 있다.

한편 본 발명의 에탄올 생산용 생균 조성물은 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 또는 이의 배양물를 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는데 사용될 수 있는 생균 조성물로, 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주, 또는 이의 배양물을 함유하며, 상기 배양물은 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주를 통상의 균주 배양방법에 따라 배양된 것을 말한다. 상기 변이 균주의 배양을 위해 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 YPD(10 g/L Yeast Extract(Difco), 20 g/L Peptone(Difco), 50 g/L Glocose(Junsei)) 배지를 사용하여 배양될 수 있다.

상기 에탄올 생산용 생균 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 조성물 전체 중량에 대하여 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주를 분말의 경우 80% 내지 90%, 배양액의 경우 0.5% 내지 1.5%로 포함될 수 있다.

상기 바이오매스는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 섬유질계 바이오매스, 또는 전분질계 바이오매스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 섬유질계 바이오매스일 수 있으며 구체적으로는 하기 기재한 바와 같다.

한편 본 발명의 에탄올 제조방법은 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 및 당화효소를 바이오매스(Biomass) 기질에 처리하여 당화 및 발효하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 당화는 바이오매스를 효소에 의해 가수분해하여 당을 생산하는 공정을 의미하며, 상기 당화효소의 종류에는 제한이 없으나 바람직하게는 카보하이드라아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 헤미셀룰라이제 및 글루코시다아제 로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 당화는 당화효소를 이에 한정되지는 않지만 기질 중량 대비 0.06 내지 25%로 첨가하여 5 내지 72 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.

상기 바이오매스는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 섬유질계 바이오매스, 또는 전분질계 바이오매스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 섬유질계 바이오매스일 수 있다.

상기 섬유질계 바이오매스는 셀룰로오스계 바이오매스 또는 리그노 셀룰로오스계 바이오매스라고도 불리며, 이에 한정되지 않기만 목재, 잉여농산물, 및 초본계 작물로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있으며 바람직하게는 보릿짚, 억새, 옥수수대, 유채대 및 팜열매껍질 (empty fruit bunch, EFB)로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있다.

본 발명의 기질로 사용되는 바이오매스는 리그닌 제거와 섬유질의 분해를 돕기 위한 고온, 고압의 암모니아 전처리, 산, 염기 처리, 및 열수 처리로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 공정으로 전처리된 것일 수 있으며, 상기 바이오매스를 전처리하는 공정이 본 발명의 에탄올 제조방법에 추가적으로 포함될 수 있다. 상기 전처리 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 선택하여 적용할 수 있다.

본 발명의 에탄올 제조방법에서 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 이에 한정되지 않지만 기질 배양액에 대하여 0.5 내지 5 g yeast/L (2 x 10⁸ 내지 8 x 10⁹ viable cells/g yeast) 또는 변이 균주 배양액을 기질 배양액에 대하여 3 내지 10%(v/v) 처리할 수 있으며 처리 시간도 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 24 내지 84시간일 수 있다. 상기 수치범위 미만으로 처리하는 경우 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주에 의한 발효가 효과적으로 진행되지 않을 수 있으며, 상기 수치범위를 초과하는 경우 처리량 또는 처리시간에 비하여 효과가 미미하여 경제성이 없을 수 있다.

본 발명의 에탄올 제조방법은 동시에 당화 및 발효 공정을 수행할 수 있는 것이 중요한 특징이다. 이는 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주가 고온에서 생육할 수 있는 내열성이 있고 고온에서도 에탄올 생산능이 우수하기 때문이다.

상기와 같이 동시에 당화 및 발효 공정이 수행됨으로써, 당화로 생성된 당을 동시에 소모하여 당화 효소의 기질 저해를 감소시켜 당화율을 증가시키며, 당화와 함께 에탄올 발효가 동시에 진행되므로 총 당화, 발효 시간의 감소로 에탄올 생산성의 증대를 가져올 수 있다.

따라서 본 발명의 에탄올 제조공정은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 35℃ 내지 45 ℃에서 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 및 당화효소를 바이오매스(Biomass) 기질에 함께 투여하여 동시에 당화 및 발효를 수행할 수 있는 공정일 수 있다.

특히 본 발명의 에탄올 제조방법은 상기와 같이 동시에 당화 및 발효 공정을 수행하는 경우, 이에 한정되지는 않지만 바람직하게는, 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 및 당화효소를 바이오매스 기질에 처리하여 40℃ 이상 내지 50℃이하에서 1차로 당화 및 발효한 다음, 30℃ 이상 내지 40℃ 미만에서 2차로 당화 및 발효할 수 있으며 더 바람직하게는 40℃ 내지 45℃에서 1차로 당화 및 발효한 다음, 32℃ 내지 38℃에서 2차로 당화 및 발효할 수 있다. 상기 1차 당화 및 발효는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 5 내지 24 시간 동안 수행할 수 있고, 2차 당화 및 발효는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 48 내지 67 시간 동안 수행할 수 있다.

상기 2차 당화 발효는 1차 당화 및 발효 후 자연 냉각을 통하여 수행될 수 있으며, 구체적으로 1차 당화 및 발효 후 추가적인 냉각 수단을 사용하지 않고 자연 냉각으로 온도를 서서히 낮추어 2차 당화 및 발효가 가능하므로 발효 효율을 올리고 냉각비용을 효과적으로 절감할 수 있다.

상기 수치범위는 당화 효율 및 에탄올 생산효율을 고려한 것이며, 상기와 같이 온도 변환 공정이 포함되어 2 단계로 당화 및 발효 공정을 수행함으로써 1 단계에서 당화 효율을 높이고 2단계에서 에탄올 발효 효율을 높여 최종 당화 효율 및 에탄올 생산 효율을 극대화할 수 있다.

특히 상기 온도 변환 공정을 이용한 동시당화 및 발효는 당화 최적 온도의 당화율과 유사한 당화율로 당화 공정을 수행할 수 있으며, 또한 에탄올 발효 최적 온도의 발효율과 유사한 정도의 발효율로 발효 공정을 동시에 수행할 수 있다. 이를 통해 종래 섬유질계 에탄올 생산의 당화에만 소요되는 시간 내에 당화 및 에탄올 발효까지 모두 완료하므로 매우 효과적으로 에탄올을 생산할 수 있다.

본 발명의 에탄올 제조방법은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 회분식 공정, 반연속식 공정 및 연속식 공정으로 이루어진 군에서 선택된 공정으로 수행될 수 있다.

본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 내열성 및 에탄올 생산성이 매우 우수하여, 바이오매스, 바람직하게는 섬유질계 바이오매스를 이용한 에탄올 제조시 동시에 당화 및 발효가 가능하므로 에탄올 제조에 용이하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612와 원형질 융합에 사용된 CHY1012 및 CHY1703와 에탄올 발효능을 비교한 그래프이다. (A: 35℃, B: 41℃)
도 2는 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612의 형태학적 관찰 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612의 염기서열 분석에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region을 나타낸 도면이다. (검은 부분: ITS1, 5.8SrDNA 및 ITS2, 파란색 부분: 26S rDNA D1/D2)
도 5는 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612로 45℃에서 동시 당화 및 발효를 실시한 후 에탄올 생성량 및 글루코오스 잔량을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612를 이용한 동시 당화 및 발효에서 온도 변환 공정(45 -> 35℃)을 적용하여 수행한 결과와 그렇지 않은 경우 에탄올 생성량 및 글루코오스 잔량을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1>

에탄올 생산성이 우수한 균주 및 내열성이 우수한 균주의 선별

두 균주의 우수 형질을 얻기 위한 원형질 융합을 효과적으로 수행하기 위해서는 두 균주의 융합 후 우수한 융합 균주만을 선택하기 위한 선별마커가 필요하다. 이에 본 발명자는 먼저 에탄올 생산성이 뛰어난 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisia) CHY1011에 대해서는 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) 중층 배양 후 발색 반응이 차이가 나는 호흡결여 마커를 부여하고, 내열성이 뛰어난 클루이베로마이세스 마르샤너스 KCTC17631에 대해서는 결손 아미노산을 첨가해 주어야만 최소배지에서 생육이 가능한 영양요구성 마커를 부여하기로 하였다. 이러한 선별 마커는 융합 후 융합 균주만을 선별하는 지표로 사용될 수 있다.

<1-1> 호흡결여 돌연변이 사카로마이세스 세레비지에 CHY1012 의 선별

사카로마이세스 세레비지에 CHY1011은 에탄올 생산성이 뛰어난 산업용 균주이나 어떠한 선별 마커도 가지고 있지 않아 균주의 개량과 선별이 어렵다. 그러므로 CHY1011에 대한 호흡 결여 돌연변이를 유도하여 선별마커로 사용하고자 하였다. 상기 호흡결여 돌연변이는 고체 배지의 효모 콜로니 위에 Triphenyltetrazolium chloride (TTC)의 중층 배양시에 TTC를 분해하지 못하므로 발색반응이 일어나지 않아 흰색을 유지하게 된다. 정상세포의 경우는 TTC 중층 배양시 붉은색으로 발색반응이 일어나므로 융합 후 선별마커로 사용할 수 있다.

구체적으로, 호흡결여 돌연변이의 제조를 위해 CHY1011을 대수기로 배양한 후, 적정 농도로 희석하여 돌연변이원, Acriflavine 100 uM을 30분간 처리하였다. 처리된 배양액은 YPD 고체배지(10 g/L Yeast Extract(Difco), 20 g/L Peptone(Difco), 20 g/L Glocose(Junsei), 20 g/L Agar(junsei))에 도말하여 32℃ 에서 48-72시간 배양한 후, 저농도 한천이 포함된 TTC 용액을 중층 배양하여 발색반응이 없는 흰색 콜로니만을 분리하였다.

상기 방법으로 얻어진 균주들 중에서 에탄올 생산성을 확인하여 사카로마이세스 세레비지에 CHY1011(KCTC11250BP)과 에탄올 생산성이 유사한 균주를 최종 선별하여 CHY1012라 명하고, 본 원형질융합의 호흡결여 마커를 가진 모균주로 사용하였다.

<1-2> 영양요구성 돌연변이 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1703 의 선별

클루이베로마이세스 마르샤너스(Kluyveromyces marxianus) KCTC17631(생명공학연구원 생물자원센터 기탁번호: KCTC17631)은 40℃ 이상의 고온에서도 생육 및 에탄올 발효가 가능한 균주이나 에탄올 생산성이 산업용 균주에 미치지는 못하고, 선별 마커도 가지고 있지 않아 균주의 개량과 선별이 어렵다. 그러므로 KCTC17631에 대한 영양요구성 마커를 이용하기 위해, KCTC17631을 대수기로 배양한 후, 적정 농도로 희석하여 돌연변이원 EMS(ethylmethansulphate) 1mg/ml, NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 5mg/ml 을 각각 1시간, 3시간 처리하였고, 이후 고체배지에 도말하여 35℃ 에서 48-72시간 배양하였다.

이렇게 얻어진 콜로니들은 YPD 고체배지(10 g/L Yeast Extract(Difco), 20 g/L Peptone(Difco), 20 g/L Glocose(Junsei), 20 g/L Agar(junsei)) 와 최소배지(MM, 6.7 g yeast nitrogen base w/o a.a.(Difco), 20 g/L glucose(Junsei), 20 g/L Agar(junsei)) 에 각각 배양하여 최소배지에서는 자라지 않는 영양 요구성 변이주를 검출하였다. 상기 방법으로 얻어진 균주는 Iso^-(Isoleucine), Val^-(Valine) 변이주였으며, 클루이베로마이세스 마르샤너스 KCTC17631과 에탄올 생산성은 크게 다르지 않았다. 상기 균주를 CHY1703이라 명하고, 본 원형질융합의 영양요구성 마커를 가진 모균주로 사용하였다.

< 실시예 1>

원형질 융합에 의한 본 발명의 균주의 제조

상기 <참조예 1-1>의 사카로마이세스 세레비지에 CHY1012는 에탄올 생산성은 매우 우수하나 41℃ 이상의 온도에서 생육이 어렵고 상기와 같이 고온에서는 에탄올 생산성이 현저히 감소하는 문제점이 있다. 반면, 상기 <참조예 1-2>의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1703은 40℃ 이상의 온도에서도 생육과 에탄올 발효가 가능하나 40℃ 이하의 온도에서 에탄올 생산성이 상기 균주에 비해 낮다.

따라서 양 균주의 우수한 특성을 보유한 원형질 융합 균주를 제조하기 위해 두 모균주를 32℃에서 대수기 상태로 배양한 후, 각각 반응완충액(0.06M phosphate buffer, 0.2% β-mercaptoethanol, 0.6M KCl, 0.8M sorbitol)에서 Lyticase(Sigma)를 이용하여 33℃에서 30분간 효소 처리하였다.

상기 각각 효소처리에 의해 세포벽이 제거되어 원형질(protoplast) 상태로 제조된 두 균주를 1:1로 혼합하고, 융합 완충액(30% PEG 6000, 50 mM CaCl₂, 10mM Tris-HCl buffer, pH 7.5)를 이용하여 35℃에서 60분 또는 120분간 처리하여 융합을 유도하였다.

상기 융합을 유도하기 위해 제조된 혼합액은 융합되지 않은 영양요구성 돌연변이 CHY1703들은 자라지 못하도록 최소 고체 배지(MM, 6.7 g yeast nitrogen base w/o a.a.(Difco), 20 g/L glucose(Junsei), 20 g/L Agar(junsei))에 도말하고, 마찬가지로 내열성이 없는 호흡결여 돌연변이 CHY1012들은 자라지 못하도록 41℃ 고온 조건에서 48-72시간 배양하였다.

상기 배양에 의해 콜로니를 형성한 균주를 수득한 후, 최소 고체 배지에 계대배양하여 생육여부를 확인하고, TTC 중층 배양하여 호흡결여 여부를 확인하여, 원형질 융합에 의해 기능들이 복구된 내열성 융합 균주만이 선별되도록 선별 마커들을 활용하여 1차 선별하였다.

이렇게 선별된 균주들은 유전적 안정성을 확보하기 위해, 수차례 계대 배양을 한 후 그 이후에도 최소 고체 배지에서 41℃ 조건에서 생육이 가능하고 TTC 중층 배양 결과 붉은색으로 변하는 정상 균주만을 2차 선별하였다.

상기 2차 선별된 균주들은 YPD 배지(3 g/L Yeast Extract(Difco), 5 g/L Peptone(Difco), 110 g/L Glocose(Junsei))에 배양하여 에탄올 발효 실험을 수행하였으며, 각 균주들의 발효능을 비교하여 고온 조건, 41℃에서도 에탄올 생산성이 우수한 균주를 최종 우수 균주로 선별하여 이를 CHY1612로 명명하였다.

상기와 같이 선별된 CHY1612 균주를 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁번호 KCTC 11757BP로 2010년 9월 3일자로 기탁하였다.

< 실시예 2>

본 발명의 균주의 내열성 및 에탄올 생산성 검증

상기 <실시예 1>에서 제조된 본 발명의 균주인 CHY1612의 에탄올 생산성은 산업용 YPD 배지(2.5 g/L Yeast Extract(Difco), 2.5 g/L Peptone(Difco), 0.25 g/L MgSO₄ㆍ7H₂0(Junsei), 1 g/L K₂HPO₄(Junsei), 140 g/L Glocose(Junsei))를 이용하여 일반 발효 조건(도 1의 A, 35℃)과 우수 균주 선별 조건(도 1의 B, 41℃)에서 확인하고 그 결과를 도 1에 기재하였다.

상기 도 1에 기재한 바와 같이, 본 발명의 균주는 고온에서 가장 우수한 발효능을 보였을 뿐 아니라 일반 발효 온도에서도 CHY1012와 유사한 수준의 최종 에탄올 생산성을 보여 에탄올 발효 균주로 유용할 것으로 예상되었다. 특히 고온 발효의 특성을 이용하여 섬유질계 동시당화발효의 균주로 적합할 것으로 예상되었다.

< 실시예 3>

본 발명의 CHY1612 균주의 동정

상기 고온에서 생장 가능하고, 에탄올 발효 수율이 우수한 것으로 확인된 본 발명의 CHY1612 균주에 대해 형태학적 관찰 결과와 생화학적 특성 및 26S rDNA D1/D2 및 ITS에 대하여 DNA sequencing을 수행한 결과를 기초로 동정하였다.

<3-1> 형태학적 특징

먼저 형태학적 관찰을 위해 각 균주를 YPD 배지(3 g/L Yeast Extract(Difco), 5 g/L Peptone(Difco), 20 g/L Glocose(Junsei))에서 18시간 배양한 후, 광학현미경을 이용하여 600배의 배율에서 관찰하였다.

상기 형태학적 관찰 결과, 본 발명의 균주는 도 2와 같이 타원형 또는 막대형으로 <참조예 1>의 CHY1012보다는 단축이 짧아 <참조예 2>의 CHY1703과 유사한 형태이나 CHY1703보다는 크기가 조금 더 컸다. 또한 출아법에 의해 번식이 가능하며, 통성 혐기성이고, 생육 온도는 28 내지 48℃이며, 에탄올 발효 적정 온도가 32 내지 45℃인 것으로 확인되었다.

<3-2> 생화학적 특징

본 발명의 균주의 생화학적 특성은 프랑스 회사 비오메리으(Biomerieux)의 효모 자화성 확인 kit인 API20 C AUX를 사용하였고, 자화성 여부의 결과를 -, +, ++, +++로 나타내었다. 상기 균주의 생화학적 특성을 <참조예 1>의 CHY1012과 <참조예 2>의 CHY1703과 비교하여 표 1에 나타내었다.

	CHY1012	CHY1703	CHY1612
Glucose	+++	+++	+++
Glycerol	-	+++	+++
2-Keto-D-Gluconate	-	-	-
L-Arabinose	-	-	-
D-Xylose	-	-	-
Adonitol	-	+	++
Xylitol	-	++	+++
D-Galactose	+++	+++	+++
Inositol	-	-	-
D-Sorbitol	-	+++	+++
a-Methyl-D-Glucoside	-	-	-
N-Acetyl-D-Glucosamine	-	-	-
D-Cellobiose	-	-	-
D-Lactose	-	-	-
D-Maltose	+++	-	++
D-Saccharose(Sucrose)	+++	+++	+++
D-Trehalose	-	-	-
D-Melezitose	-	-	-
D-raffinose	-	+	+++

- API 20C AUX + Iso(Isoleucine), Val(Valine) 첨가

<3-3> 염기서열 분석

효모 균주 동정을 위한 염기 서열의 분석은 26S rDNA D1/D2 서열 결정을 통한 분자생물학적 분류와 ITS(internal transcribed spacer) 서열 결정을 통한 분자생물학적 분류를 이용하였다. DNA sequencing은 하기와 같은 방법으로 수행하였다.

구체적으로 본 발명의 CHY1612 균주를 배양하고, 상기 배양액에 대해 원심분리를 수행하여 균체를 회수한 후에, 상기 균체로부터 genomic DNA 추출하였다. 상기 추출된 genomic DNA에 대하여, 서열번호 1의 ITS5 프라이머(5`-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3`)와 서열번호 3의 NL4 프라이머(5`-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3`)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 하기 표 2와 표 3에 따라 수행하였다.

	사용량(ul)
주형(10ng/ul)	1
Primer (F,R) 10pmole/ul	각 2
10X Taq pol buffer(Takara, Japan)	5
dNTP(Takara, Japan)	4
Taq polymerase(Takara, Japan)	0.3
D.W.	35.7
합계	20

	온도	Cycle number
Predenaturation	95 ℃ / 5 min
Amplification	95 ℃ / 30 sec	30
	54 ℃ / 30 sec
	72 ℃ / 90 sec
Final Extension	72 ℃ / 7 min

상기 중합효소 연쇄 반응을 통해 26S rDNA D1/D2와 ITS 지역을 포함한 1300bp 가량의 DNA를 증폭하였다.

상기 PCR 산물은 T-vector(New England biolabs)를 이용하여 클로닝(cloning)하였고, sequencing 의뢰 기관인 SolGent Co.(대한민국)을 통해 염기서열을 분석하여 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열을 확보하였다. 보다 정확한 서열확인을 위해서, Sequencing에는 PCR product 약 1300bp 중 내부에 있는 두 프라이머인 서열번호 4의 NL1 프라이머(5`-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3`) 및 서열번호 2의 ITS4 프라이머(5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`)를 추가적으로 제공하여 분석하였다.

도 3에 상기 PCR 및 Sequencing을 위한 프라이머의 서열 및 그 위치를 나타내었다.

상기 분석결과, 서열번호 5 및 도 4에 나타낸 염기서열을 확인하였다. 특히 도 4에서는 26S rDNA D1/D2 및 ITS region를 별도로 표시하였다.

상기 염기서열을 이용하여, 각각 NCBI database에 등록된 타 효모 균주들의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열과 상동성(homology) 분석을 수행한 결과, 종과 속은 클루이베로마이세스 마르샤너스로 동정되었으며, 기존 보고된 타 클루이베로마이세스 마르샤너스의 염기서열과는 다른 고유의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열을 가지고 있으므로 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY 1612이라 명하였다.

상기 NCBI database를 이용한 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY 1612의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열 비교결과(blast search) 를 하기 표 4에 나타내었다.

균 주	26s rDNA D1/D2, ITS region	NCBI 등록번호
Kluyveromyces marxianus	Identities = 923/926 (99%), Gaps = 2/926 (0%)	AF543841
Kluyveromyces marxianus	Identities = 907/910 (99%), Gaps = 1/910 (0%)	AB480229
Kluyveromyces marxianus isolate VA 116042-03	Identities = 719/721 (99%), Gaps = 0/721 (0%)	AY939806
Kluyveromyces marxianus isolate AS2.1549	Identities = 717/721 (99%), Gaps = 0/721 (0%)	EU019227
Kluyveromyces marxianus isolate F4-3	Identities = 713/724 (98%), Gaps = 3/724 (0%)	EU019224
Kluyveromyces marxianus strain ATCC 4135	Identities = 672/676 (99%), Gaps = 0/676 (0%)	DQ249191
Kluyveromyces lactis isolate UOA/HCPF BUL74	Identities = 716/747 (95%), Gaps = 6/747 (0%)	GQ376079
Kluyveromyces dobzhanskii	Identities = 612/635 (96%), Gaps = 5/635 (0%)	AJ401722

< 실시예 4>

본 발명의 CHY1612 를 이용한 섬유질계 에탄올 동시당화 발효

본 발명의 CHY1612 효모는 고온에서도 생육과 에탄올 발효가 가능하므로 섬유질계 에탄올 동시당화발효에 유용하다. 상기 효모는 45℃ 수준의 고온의 섬유질계 당화조건에서도 생육 및 발효가 가능하여 동시당화발효 공정의 적용이 가능하고, 상기 동시당화발효 공정시 당화로 생성된 당을 동시에 소모하여 당화 효소의 기질 저해를 감소시켜 당화율을 증가시키며, 당화와 함께 에탄올 발효가 동시에 진행되므로 총 당화, 발효 시간의 감소로 에탄올 생산성의 증대를 가져올 수 있다.

<4-1> 바이오매스의 전처리

섬유질계 바이오매스는 보릿짚을 이용하였으나 바람직한 실시예를 제시하는 것으로 범위가 보릿짚에 한정되는 것은 아니다.

농진청에서 제공받은 보릿짚은 39.0% cellulose, 19.8% hemicelluloses, 23.0% lignin, 1.7% ash로 구성되어 있다. 파쇄기 및 분쇄기를 이용하여 1mm 이하로 분쇄한 보릿짚 10 %(w/v) 를 15 %(v/v) 암모니아 용액을 이용하여 150 ℃에서 90분간 전처리하였다. 전처리 후 건조한 보릿짚의 조성은 다음 표 5와 같다.

구 성 (%)	전처리 후
셀룰로스(글루코스)	57.1
헤미셀룰로스(자일로스)	19.2
리그닌	14.7
수분	5.5
회분	2.3

<4-2> 전처리 바이오매스의 온도별 당화 비교

일반적으로 섬유질계 당화효소는 45-50℃ 수준의 고온에서 최적 활성을 갖고 일반적인 에탄올 발효 온도인 32-35℃ 에서는 활성이 낮은 것으로 알려져 있다. 상기 <실시예 4-1>에서 전처리된 보릿짚은 각 온도에 따른 효소 당화 실험을 진행하여 그 차이를 확인하였다.

상기 전처리된 보릿짚 80 g에 0.1 M Sodium citrate buffer(pH 4.8) 200 mL 과 증류수 211 mL을 혼합한 후 당화를 위하여 복합 셀룰레이즈 (Novozyme, NS50013) 30 FPU(filter paper unit)/g과 β-glucosidase (Novozyme, NS50010) 30 CBU(cellobiase unit)/g을 첨가하여 진탕 배양기에서 하기 표의 각 온도 조건에서 150 rpm으로 72시간 당화시켰다. 당화가 완료된 당화액은 HPLC를 이용하여 당을 분석하였고, 당화율은 다음과 같이 계산하였다.

온도 조건	전환당(g/L)	당화율(%)	상대당화율(%)
50℃	79.8	90	100
45℃	78.4	88.4	98.2
45->35℃	72.9	82.2	91.3
35℃	58.8	66.2	73.6

상기 표 6의 내용과 같이 온도가 낮을수록 당화효소의 활성이 낮아 당화율이 낮게 나오는 것을 확인하였다. 이와 같이 섬유질계 바이오매스의 당화에서 낮은 발효 온도 조건에서도 동일한 당화율을 얻기 위해서는 값비싼 당화효소를 더 많이 첨가하여야 하므로 섬유질계 에탄올 생산비 저감을 위한 동시당화발효의 적용에서는 고온 조건에서도 발효가 가능한 내열성 효모가 필수적이다.

<4-3> 본 발명의 CHY1612 에 의한 동시 당화 및 발효

상기 <실시예 4-2>의 이유로 인해 섬유질계 동시당화발효에 있어서 내열성 융합 효모, 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612의 이용은 43-45℃ 수준의 섬유질계 동시 당화 및 발효가 가능하게 한다. 이러한 섬유질계 동시 당화 및 발효는 별도의 당화 공정이 필요 없어 초기 설비 비용의 감소뿐 아니라, 당화시 생성되는 당을 바로 소모함으로 당화효소의 기질 저해를 감소시켜 당화 효율을 증대시키고, 총 에탄올 발효 시간을 감소시켜 에탄올 생산성의 증대를 가져온다.

상기와 같은 효과를 확인하기 위하여, 45℃에서 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612를 이용한 섬유질계 바이오매스를 동시당화 및 발효시켰다, 구체적으로는, 상기 <실시예 4-2>와 같이 상기 <실시예 4-1>의 전처리 보릿짚 80 g에 0.1 M Sodium citrate buffer(pH 4.8) 200 mL 과 증류수 211 mL을 혼합하여 멸균하고, 당화를 위한 복합 셀룰레이즈(Novozyme, NS50013) 30 FPU/g과 β-glucosidase(Novozyme, NS50010) 30 CBU/g을 첨가하고 YPD 배지(3 g/L Yeast Extract(Difco), 5 g/L Peptone(Difco), 50 g/L Glocose(Junsei))를 이용하여 35℃에서 18-24시간 동안 전배양한 CHY1612 배양액을 5%(v/v) 접종하여 45℃ 동시당화발효를 실시하여 에탄올과 글루코오스 생성량을 측정하고 그 결과를 도 5에 기재하였다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 45℃의 고온 조건에서도 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612를 이용할 경우 섬유질계 바이오매스를 기초로 동시 당화 및 발효가 가능함을 알 수 있다.

그러나 당화효소의 당화율은 최적(90% 수준)인 반면 하기 수학식 2에 따른 에탄올 생산성은 최적 수준(발효율-90%수준)에 이르지는 못하였다.

<4-4> 본 발명의 CHY1612 에 의한 동시 당화 및 발효 공정 개선

상기 섬유질계 에탄올 동시당화발효에서 당화효소의 최적 당화온도(43-50℃)에서는 당화율은 우수하나 에탄올 발효율이 낮아지고, 일반적인 효모의 최적 발효온도인 32-38℃ 수준에서는 에탄올 발효율은 우수하나 당화율이 낮아지므로, 본 발명에서는 동시 당화 및 발효의 최적 조건을 찾기 위해 초기에는 당화 최적온도에서 당화위주의 동시 당화 및 발효를 실시하고 이후 자연 냉각하여 발효 최적온도에서 발효 위주의 동시 당화 및 발효를 실시하여 당화율과 발효율 모두를 최적 수준으로 향상시켰다.

구체적으로 35℃ 에서 동시 당화 및 발효와 45℃에서 동시 당화 및 발효, 그리고 본 발명의 온도 변환 공정인 45℃에서 24시간 후 자연 냉각하여 35℃에서의 동시 당화 및 발효를 상기 <실시예 4-3>과 같이 수행하고 이의 결과를 비교하여 도 6에 기재하였다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 클루이베로마이세스 마르샤너스 CHY1612를 이용한 동시 당화 및 발효에 있어 최적의 당화와 최적의 발효 조건을 적절히 조합한 온도 변환 공정이 가장 우수함을 알 수 있다.

또한 각 조건에 따른 최종 배양액의 당 분석과 에탄올 분석 결과와 수학식 1 및 2를 이용하여 당화율 및 에탄올 발효율을 계산하여 하기 표 7에 기재하였다.

	동시당화 발효시간(h)	Glucose (g/L)	Xylose (g/L)	Ethanol (g/L)	전환당 (g/L)	당화율 (%)	발효율 (%)
45℃	71	18	21.3	22.2	75.3	90.8	57.7
45-35℃	71	0	19.9	34.3	74.0	89.3	90.6
35℃	71	0	18.6	31.0	67.3	81.2	90

상기 표 7에 나타낸 것과 같이 온도 변환 공정(45->35℃)을 이용한 동시당화발효는 당화 최적 온도의 당화율(90%)과 유사한 당화율을 보였으며 에탄올 발효율 또한 발효 최적 온도의 발효율과 유사한 90.6%를 보여 가장 많은 에탄올을 생산하였다. 본 발명에서 바이오매스의 투입량이 증가할 경우 에탄올 생산량 또한 증가할 수 있으며, 발명 균주를 이용한 90.6%의 발효율은 산업적으로도 유용한 결과이다. 더불어 일반적으로 섬유질계 에탄올 생산의 당화에 소요되는 72시간 내에 에탄올 발효까지 모두 완료하므로 에탄올 생산성 또한 매우 우수함을 알 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC11757 20100903

<110> CHANGHAE ETHANOL CO., LTD. <120> Kluyveromyces marxianus having superior heat resistance and ethanol productivity <130> DPP20104444KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS5 primer <400> 1 gaagtaaaag tcgtaacaag g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NL4 primer <400> 3 ggtccgtgtt tcaagacgg 19 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NL1 primer <400> 4 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 5 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26S rDNA D1/D2 and ITS of CHY1612 <400> 5 ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attaaagatt 60 atgaatgaat agattactgg gggaatcgtc tgaacaaggc ctgcgcttaa ttgcgcggcc 120 agttcttgat tctctgctat cagttttcta tttctcatcc taaacacaat ggagtttttt 180 ctctatgaac tacttccctg gagagctcgt ctctccagtg gacataaaca caaacaatat 240 tttgtattat gaaaaactat tatactataa aatttaatat tcaaaacttt caacaacgga 300 tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaattgc gatatgtatt gtgaattgca 360 gattttcgtg aatcatcaaa tctttgaacg cacattgcgc cctctggtat tccagggggc 420 atgcctgttt gagcgtcatt tctctctcaa acctttgggt ttggtagtga gtgatactcg 480 tctcgggtta acttgaaagt ggctagccgt tgccatctgc gtgagcaggg ctgcgtgtca 540 agtctatgga ctcgactctt gcacatctac gtcttaggtt tgcgccaatt cgtggtaagc 600 ttgggtcata gagactcata ggtgttataa agactcgctg gtgtttgtct ccttgaggca 660 tacggcttta accaaaactc tcaaagtttg acctcaaatc aggtaggagt acccgctgaa 720 cttaagcata tcaataagcg gaggaaaaga aaccaaccgg gattgcctta gtaacggcga 780 gtgaagcggc aaaagctcaa atttgaaatc tggcgtcttc gacgtccgag ttgtaatttg 840 aagaaggcga ctttgtagct ggtccttgtc tatgttcctt ggaacaggac gtcatagagg 900 gtgagaatcc cgtgtggcga ggatcccagt tatttgtaaa gtgctttcga cgagtcgagt 960 tgtttgggaa tgcagctcta agtgggtggt aaattccatc taaagctaaa tattggcgag 1020 agaccgatag cgaacaagta cagtgatgga aagatgaaaa gaactttgaa aagagagtga 1080 aaaagtacgt gaaattgttg aaagggaagg gcatttgatc agacatggcg tttgcttcgg 1140 ctttcgctgg gccagcatca gttttagcgg ttggataaat cctcgggaat gtggctctgc 1200 ttcggtagag tgttatagcc cgtgggaata cagccagctg ggactgagga ttgcgacttt 1260 tgtcaaggat gctggcgtaa tggttaaatg ccgcccgtct tgaaacacgg acc 1313

Claims (10)

1. 기탁번호 KCTC11250BP인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 기탁번호 KCTC17631인 클루이베로마이세스 마르샤너스를 원형질 융합하여 제조되고,
   내열성 및 에탄올 생산성을 가지는,
   클루이베로마이세스 마르샤너스(Kluyveromyces marxianus) 변이 균주 (기탁번호 : KCTC11757BP).
2. 제1항에 있어서, 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주는 생육온도가 28 내지 48℃이고, 에탄올 발효의 적정온도가 32 내지 45℃인 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주.
3. 제1항에 있어서, 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열이 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것인 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주.
4. 삭제
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 및 당화효소를 바이오매스(Biomass) 기질에 처리하여 당화 및 발효하는 단계를 포함하는 에탄올 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 바이오매스는 섬유질계 바이오매스 또는 전분질계 바이오매스인 에탄올 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 당화 및 발효는 동시에 수행되는 것인 에탄올 제조방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 클루이베로마이세스 마르샤너스 변이 균주 및 당화효소를 바이오매스 기질에 처리하여 40℃ 이상 내지 50℃ 이하에서 1차로 당화 및 발효한 다음, 30℃ 이상 내지 40℃ 미만에서 2차로 당화 및 발효하는 것인 에탄올 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 1차 당화 및 발효는 5 내지 24 시간 동안 수행하고, 2차 당화 및 발효는 48 내지 67 시간 동안 수행하는 것인 에탄올 제조방법.
10. 제5항에 있어서, 상기 에탄올 제조방법은 회분식 공정, 반연속식 공정 및 연속식 공정으로 이루어진 군에서 선택된 공정으로 수행하는 것인 에탄올 제조방법.

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