KR101213948B1 - 잔가시모자반으로부터 분리한 활성물질을 이용한 항염증성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잔가시모자반으로부터 분리한 활성물질을 이용한 항염증성 조성물을 개시한다. 상기 잔가시모자반으로부터 분리한 활성물질은 사가퀴노산, 사가크로멘올 및 이소케토차브롤산이며, 이들 물질은 NO 생성 억제 활성, PGE₂ 생성 억제 활성, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 생성 억제 활성, iNOX 생성 억제 활성 및/또는 COX-2 생성 억제 활성을 갖는다.

Description

잔가시모자반으로부터 분리한 활성물질을 이용한 항염증성 조성물{Anti-inflammation Composition Using Effective Compounds Isolated From Sargassum micracanthum}

본 발명은 잔가시모자반(Sargassum micracanthum)으로부터 분리한 활성물질을 이용한 항염증성 조성물에 관한 것이다.

염증은 외부의 물리?화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다.

염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.

이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다.

NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.

eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).

COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복신A₂(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE₂의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다.

COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.

따라서 NO, PGE₂, 염증성 사이토카인 등의 억제제나 iNOS 억제제 그리고 COX-2 억제제는 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.

본 발명은 NO, PGE₂, 염증성 사이토카인 등의 생성 억제 활성을 가지거나 iNOS 및 COX-2 억제 활성을 가지는 잔가시모자반으로부터 분리한 세 가지 활성물질을 개시한다.

본 발명의 목적은 잔가시모자반으로부터 분리한 세 가지 활성물질을 이용한 항염증성 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 잔가시모자반의 항염증 활성에 기초하여(대한민국 공개특허 제2009-0121102호 참조), 잔가시모자반으로부터 세 가지 활성물질 즉, 사가퀴노산(Sargaquinoic acid), 사가크로멘올(Sargachromenol) 및 이소케토차브롤산(Isoketochabrolic acid)을 분리?동정하고, 그것들이 NO, PGE₂, 염증성 사이토카인 등의 생성 억제 활성 및/또는 iNOS 및 COX-2 억제 활성을 가짐을 확인함으로써 완성된 것이다.

상기 세 가지 활성물질은 모두 공지의 물질들이며(Neuroscience 132(3) 633-643 2005; Chem . Pharm . Bull . 55(4) 594~97 (2007)), 그 구조식과 IUPAC 명칭은 아래의 화학식 1 내지 3에서 확인할 수 있다.

(화학식 1)

사가퀴노산(Sargaquinoic acid)

(화학식 2)

사가크로멘올(Sargachromenol)

(화학식 3)

이소케토차브롤산(Isoketochabrolic acid)

본 발명의 항염증성 조성물은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 완성된 것으로서, 사가퀴노산, 사가크로멘올 및/또는 이소케토차브롤산을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선, 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리?화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 사가퀴노산 또는 사가크로멘올을 유효성분으로 포함하는 iNOS 억제제 조성물에 관한 것이다.

전술하였지만, iNOS의 억제는 NO의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다.

본 발명의 아래의 실험예는 사가퀴노산과 사가크로멘올이 NO의 생성을 억제하고 iNOS의 생성을 억제함으로 보여주고 있으며, iNOS의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.

본 명세서에서, "iNOS 억제"의 의미는 iNOS 유전자의 발현 억제 및 iNOS 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 NO의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 사가퀴노산 또는 사가크로멘올을 유효성분으로 포함하는 COX-2 억제제 조성물에 관한 것이다.

전술하였지만, COX-2의 억제는 PGE₂의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다.

본 발명의 아래의 실험예는 본 발명의 사가퀴노산과 사가크로멘올이 PGE₂의 생성을 억제하고 COX-2의 생성을 억제함으로 보여주고 있으며, COX-2의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.

본 명세서에서, "COX-2 억제"의 의미는 COX-2 유전자의 발현 억제 및 COX-2 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 PGE₂의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.

한편 본 발명의 조성물(즉 항염증성 조성물, iNOS 억제제 조성물 및 COX-2 억제제 조성물을 말함; 이하 같음)은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 아토피성 피부염 조성물처럼 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분이 포함되는 것 이외에, 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 감미제, 사과, 레몬, 감귤 등의 과일이나 녹차잎, 둥굴레, 대잎 등의 차류에서 얻어진 풍미제, 카테킨, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤 등의 생리활성 성분, 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물 등의 미네랄 등이 또한 첨가될 수 있다.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성(예컨대 관절염 또는 골다공증 예방)을 추가하기 위하여 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 항염증성 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 항염증성 조성물은 약품이나 식품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 잔가시모자반으로부터 세 가지 활성물질의 분리 모식도이다.
도 2는 사가퀴노산의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3은 사가퀴노산의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 4는 사가퀴노산의 LC-MS/MS 스펙트럼이다.
도 5는 사가크로멘올의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 사가크로멘올의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 7은 사가크로멘올의 LC-MS/MS 스펙트럼이다.
도 8는 이소케토차브롤산의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 9은 이소케토차브롤산의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 10은 이소케토차브롤산의 HSQC 스펙트럼이다.
도 11은 이소케토차브롤산의 HMBC 스펙트럼이다.
도 12는 이소케토차브롤산의 LC-MS/MS 스펙트럼이다.
도 13 및 14는 사가퀴노산(SQ)과 사가크로멘올(SM)의 NO 생성 억제 활성과 특별한 세포독성이 없음을 보여주는 결과이다.
도 15 내지 도 17은 사가퀴노산(SQ)의 PGE₂와 IL-6의 생성 억제 활성을 보여주는 결과와 사가크로멘올(SM)의 PGE₂의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 18 내지 도 21은 사가퀴노산(SQ)과 사가크로멘올(SM)의 iNOS와 COX-2의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 22는 이소케토차브롤산(IKCA)의 NO 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 23은 이소케토차브롤산(IKCA)의 PGE₂ 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 24 내지 도 26은 이소케토차브롤산(IKCA)의 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 잔가시모자반 80% 에탄올 추출물로부터 항염증 활성을 갖는 유효성분 분리, 정제 및 동정

<실시예 1> 잔가시모자반 80% 에탄올 추출물로부터 항염증 활성 물질의 분리 및 정제

잔가시모자반 80% 에탄올 추출물 36g을 증류수에 헌탁시킨 후 n-Hexane(Hex), methylene chloride(MC), ethyl acetate(EtOAc) 및 butanol을 이용하여 순차적으로 각각 2회씩 용매 분획을 실시하였다. 분획 후 얻어진 MC 분획물 6.5g을 셀라이트(60g)에 표면에 코팅시킨 후 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼트로마토그래피에 사용된 이동상의 조성은 다음과 같다: Hex, Hex:MC(10:1, 5:1, 2:1), MC, MC:EtOAc(10:1, 5:1, 2:1), EtOAc, methnaol 이동상을 각각 2L 씩 컬럼에 흘려주어, 총 10개의 분획을 회수하고 그 중 3번 분획, MC-H5(700mg) 분획에 대해 순상실리카겔을 이용하여 다시 한 번 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼의 크기는 2cm X 50cm이며 Hex:EtOAc:metanol(3:1:0.1)을 이동상으로 사용하였다. 분당 1.5ml의 속도로 이동상을 흘려주었으며 총 12개의 정제물을 얻었다. 그 중 MC-H5-4(13.5mg), MC-H5-9(3.5mg), MC-H5-11(22.8mg) 분획을 농축해 TLC(실리카겔 60 F 254 , 클로로포름;메탄올=1:1, v/v)에 전개했을 때 Rf는 각각 0.4, 0.25, 0.21이며 단일 스팟으로 나타났다. 도 1에 활성물질의 분리 과정을 모식도로 나타내었다.

<실시예 2> 활성물질의 구조 분석

분리된 활성물질의 구조를 분석하기 위해 MC-H5-4, 9, 11 정제물을 각각 CDCl₃에 녹여 NMR spectrum을 측정하였다.

<실시예 2-1> 사가퀴노산(MC-H5-4)의 구조 동정

1H NMR 스펙트럼(도 2)에서 5개의 메틸기를 확인했으며 그 중 하나는 벤젠고리에 연결된 메틸기(δ 2.05ppm ,s)임을 확인했다. 또한 6.4ppm 부근의 시그널들로 미루어 벤젠고리를 예상하였다. 13C NMR 스펙트럼(도 3)에서 화합물의 탄소수는 총 27개로 분석되었다. 또한 172.1ppm의 카르보닐 탄소가 acid 형태임을 확인하였고 188.3, 188.2ppm 시그널로 미루어 퀴논 구조가 있음을 예상하여 문헌(Silva D.H. et al., Phytochemistry, 2001, 57(3), 437-442)과 1H, 13C NMR chemical shift를 비교한 결과 모자반류에서 여러 번 분리 보고된 바 있는 상기 [화학식 1]의 사가퀴노산임을 확인하였다.

동정된 물질의 분자량을 측정하기 위해 LC-MS/MS 분석을 실시했다. 사가퀴노산의 분자량 424.2를 LC-MS/MS 분석으로 확인하였으며 좀 더 정확한 구조 확인을 위해 MS/MS를 수행한 결과 [COOH]^- 가 떨어져 생성된 고유의 쪼개짐 패턴을 얻을 수 있었다(도 4).

<실시예 2-2> 사가크로멘올( MC - H5 -11)의 구조 동정

1H NMR 스펙트럼(도 5)에서 5개의 메틸기를 확인했으며 그 중 하나는 벤젠고리에 연결된 메틸기(δ 2.1ppm ,s)임을 확인했다. 또한 6.0-6.5ppm 부근의 시그널들로 미루어 하나 이상의 벤젠고리를 예상하였다. 13C NMR 스펙트럼(도 6)에서 화합물의 탄소수는 총 27개로 분석되었다. 또한 173.3ppm의 카르보닐 탄소가 acid 형태임을 확인하였고 사가퀴노산 유사한 패턴으로 분석되어 chromen 형태의 화합물임을 예상하여 문헌(Silva D.H. et al., Phytochemistry, 2001, 57(3), 437-442)과 1H, 13C NMR chemical shift를 비교한 결과 모자반류에서 여러 번 분리 보고된 바 있는 [화학식 2]의 사가크로멘올로 동정하였다. 동정된 물질의 분자량을 측정하기 위해 LC-MS/MS 분석을 실시했다. 사가퀴노산의 분자량 424.2를 LC-MS/MS 분석으로 확인하였으며 좀 더 정확한 구조 확인을 위해 MS/MS를 수행한 결과 [COOH]^- 가 떨어져 생성된 고유의 쪼개짐 패턴을 얻을 수 있었다(도 7).

<실시예 2-2> 이소케토차브롤산( MC - H5 -9)의 구조 동정

13C NMR(도 8) 스펙트럼에서 4개의 메틸기와 6개의 메틸렌, 3개의 메틴 탄소를 확인하였으며 5개의 4차 탄소도 확인하였다. 그 중 카르보닐 탄소가 acid 형태(172.1ppm)와 케톤 형태(209.05)임을 알 수 있었다. 따라서 이 화합물의 총 탄소수는 18개 이상으로 예상하였다. 1H NMR 스펙트럼(도 9)에서는 2.11ppm 의 시그널로 미루어 4개의 메틸기 중 하나의 메틸기는 아세틸 메틸 형태임을 알 수 있었다. 좀 더 정확한 구조 동정을 위해 2D NMR분석 기법인 HSQC(도 10), HMBC(도 11)를 이용하여 화합물의 구조를 분석 한 결과 [화학식 3]의 이소케토차브롤산로 동정 되었다. 동정된 물질의 분자량을 측정하기 위해 LC-MS/MS 분석을 실시하였다. 이소케토차브롤산의 분자량 291.0[M-H]^-를 확인하였으며 좀 더 정확한 구조 확인을 위해 MS/MS를 수행한 결과 고유한 쪼개짐 패턴을 얻을 수 있었다(도 12).

< 실험예 > 잔가시모자반으로부터 분리한 활성물질의 항염증 활성 실험

<실험예 1> 활성물질 사가퀴노산와 사가크로멘올의 항염증 활성 실험

<실험예 1-1> 세포배양

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포를 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)로부터 분양받아 penicillin (100 unit/mL), streptomycin (100 ug/mL) 그리고 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지(Grand Island, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기 (incubator)에서 배양하였으며, 2-3일에 한 번씩 계대 배양을 실시하였다.

<실험예 1-2> 세포 독성 평가

시료의 독성은 MTT assay를 이용하여 실험하였다. RAW 264.7 세포 (1.0x10⁵ cells/mL)에 시료와 LPS(lipopolysaccharide, sigma (St. Louis, MO)) (1 ug/mL)를 동시 처리하고 24시간 배양한 후, MTT (Sigma, MO, USA) 용액 50 uL (2 mg/mL)를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 상층액을 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO : Sigma, MO, USA)를 200 uL 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(무처리군)의 흡광도 값과 비교하여 독성 정도를 평가하였다.

결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. 도 13 및 도 14를 참조하여 보면 시료는 모두 모든 농도에서 특별한 세포 독성을 나타내지 않음을 보여준다.

<실험예 1-3> Nitric oxide ( NO ) 측정

RAW 264.7 세포 (1.5x10⁵ cells/mL)를 18시간 전 배양 후 시료와 LPS (1 ug/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였고, 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^- 의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100 uL와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 동량 혼합하여 10분간 실온 암소에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO₂)를 serial dilution하여 얻었다 (1-100 μM).

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 도 13 및 도 14에 함께 나타내었는데, 사가퀴노산와 사가크로멘올 모두 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함을 알 수 있다.

<실시예 1-4> PGE ₂ 및 IL -6의 정량

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포 (2.5X10⁵ cells/mL)를 18시간 전 배양하고 시료와 LPS (1 ug/mL)를 동시처리 하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액으로 PGE₂와 IL-6의 함량을 측정하였다. 정량은 IL-6의 ELISA assay kit(BD Bioscience, USA) 및 PGE₂ ELISA assay kit(R&D systems, USA) 이용하였으며, standard에 대한 표준곡선의 r² 값은 0.99 이상이었다.

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 도 15 내지 도 17에 나타내었다.

도 15 및 도 16은 사가퀴노산를 처리하였을 때의 PGE₂와 IL-6의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이고, 도 17는 사가크로멘올을 처리하였을 때 PGE₂의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 15 내지 도 17에서 사가퀴노산와 사가크로멘올 모두 농도 의존적으로 PGE₂ 및/또는 IL-6의 생성을 억제함을 확인할 수 있다.

<실시예 1-5> 웨스턴 블럿을 통한 iNOS 및 COX -2의 정량

RAW 264.7세포 (5.0X10⁵ cells/mL)를 18시간 전 배양한 후, 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 후 배양한다. 세포를 2회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후 200 ul의 lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₃, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulofonyl fluoride, 25 ug/mL aprotinin, 25 ug/mL leupeptin]를 첨가하여 4°C에서 30분~1시간 동안 lysis시킨 후 15,000rpm에서 15분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA (bovine serum albumin)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 20~30 ug의 lysate를 10~12% mini gel SDS-PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane (BIO-RAD, HC, USA)에 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking 처리는 5% skim milk가 함유된 TTBS (TBS+ 0.1% Tween 20) 용액에서 overnight 하였다. iNOS와 COX-2의 발현 양을 확인하기 위한 항체로는 anti-rabbit iNOS (1:2500)(Calbiochem, USA))와 anti-mouse COX-2 (1:2500)(BD Bioscience, USA)을 TTBS 용액에 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 4회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG와 anti-mouse IgG (Vector Laboratiories, Burlingame, USA)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 4회 세정한다. 반응이 완료된 membrane을 ECL 기질 (Intron Biotechnology, Inc, Korea)과 1분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

결과를 도 18 내지 도 21에 나타내었다. 도 18 및 도 19는 사가퀴노산를 처리하였을 때의 결과이고, 도 20 및 도 21은 사가크로멘올을 처리하였을 때의 결과이다.

도 18 내지 도 21을 참조하여 보면, 사가퀴노산 및 사가크로멘올 모두 iNOS 및 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있다.

<실시예 1-6> 통계처리

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 student's t-test 분석방법을 사용하였다(* P<0.05, ** P<0.01).

<실험예 2> 이소케토차브롤산의 항염 활성 평가

<실험예 2-1> 세포 배양

대식세포 계열(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양받아 penicillin-streptomycin 100 units/㎖과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지(GIBCO, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

<실험예 2-2> NO ( Nitric oxide ) 측정

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료와 LPS(1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포 배양 상등액 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 도 22에 나타내었다. 도 22을 참조하여 보면, 이소케토차브롤산은 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함을 알 수 있다.

<실시예 2-3> Prostaglandin E ₂ ( PGE ₂ ) 정량

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 시료와 LPS (1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지로 교체하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 PGE₂를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE₂의 측정은 PGE₂ ELISA assay kit(R&D Systems Inc., USA)를 이용하여 측정하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다.

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 도 23에 나타내었다.

도 23을 참조하여 보면, 도 22의 결과와 유사하게 PGE₂ 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다.

<실시예 2-4> 염증성 사이토카인( TNF -α, IL -1β 및 IL -6) 정량

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 시료와 LPS(1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지로 교체하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 염증성 사이토카인을 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6는 ELISA assay kit(R&D Systems Inc., USA)를 이용하여 측정하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 도 24 내지 도 26에 나타내었는데, 농도 의존적으로 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였다.

<실시예 2-6> 통계처리

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 student's t-test 분석방법을 사용하였다(* P<0.05, ** P<0.01).

Claims (6)

1. 이소케토차브롤산을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 약품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
   
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6. 삭제

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