KR101172045B1 - 아포리포단백질 유사체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아포리포단백질 구조물, 의약으로서 사용되기 위한 아포리포단백질 구조물, 아포리포단백질 구조물을 코딩하는 핵산 서열, 이 핵산 서열을 포함하는 벡터, 아포리포단백질 구조물의 제조방법, 및 약학적 조성물의 제조를 위한 상기 아포리포단백질 구조물의 용도에 관한 것이다. 제시된 데이터는 본 발명에 따른 구조물들이 지질에 결합할 수 있고, 강력한 Apo AI 리셉터인 큐빌린에 결합할 수 있으며, 천연 Apo A-I보다 강력하고, 본 발명의 구조물이 천연 Apo A-I에 비해 그 혈장 반감기가 적어도 3배 연장되었음을 문서로 보여준다. 이와 함께 이러한 데이터는 본 발명에 따른 구조물들이 심혈관 질환의 치료에 유용한 강력한 후보 물질임을 입증해준다.

Description

아포리포단백질 유사체 {APOLIPOPROTEIN ANALOGUES}

본 발명은 아포리포단백질 구조물 (apolipoprotein constructs), 의약으로서의 아포리포단백질 구조물의 용도, 아포리포단백질 구조물을 코딩하는 핵산 서열, 핵산 서열을 포함하는 벡터, 아포리포단백질 구조물의 제조방법, 아포리포단백질 구조물을 함유하는 약학적 조성물, 및 약학적 조성물의 제조를 위한 아포리포단백질 구조물의 용도에 관한 것이다.

다음에서, Apo A 또는, 아포리포단백질 A라는 용어는 아포리포단백질, 아포리포단백질 A I, 아포리포단백질 A II, 또는 아포리포단백질 A IV를 가리키는 것이다.

혈관 내의 동맥경화증으로 인한 심장혈관성 질환은 전세계적으로 산업화된 국가에서 가장 흔한 사망원인이다. 동맥경화증을 유발하는 원인의 하나는 혈관벽에 콜레스테롤이 침착되는 것으로, 이로 인해 플라크가 형성되고 이것이 동맥경화증을 일으켜 발작 위험을 상승시키는 것이다.

아포리포단백질 A-1 (apo-A-1)은 혈장 HDL (high density lipoprotein; 지질단백질)의 주성분으로서, 이것은 동맥경화증 발병과 반비례한다. 이 효과가 말초조직으로부터 간으로의 소위 콜레스테롤의 역전달 (reverse cholesterol transport) 에 의해 일어난다는 강력한 실험적 증거가 있다. 또한, 이 콜레스테롤 역전달은 포유류에 있어서 apo-A-1에 의해 촉진될 수 있다는 실험적인 증거도 있다.

아포리포단백질 A-1은 혈장으로부터 신속하게 제거된다. Apo-A-1은 분해되는 일 없이, 신장 내에서 여과에 의해 혈장으로부터 대부분 제거되는 것으로 믿어진다 (Braschi외, 1999, J Lipid Res, 40:522-532; Braschi 외, 2000, Biochemistry, 39:5441-5449; Glass 외, 1983, J Biol Chem 258:7161-7167).아포리포단백질 A가 혈장중에서 반감기가 짧다는 사실은 동맥경화증 치료에 있어서 이 단백질의 이용성에 제약사항이 되고 있다.

US 5,876,968 (SIRTORI 외)은 아포리포단백질 A-1-Milano라고 불려지는 apo-A-1 변이체 (variant)의 실질적으로 순수한 다이머(dimer)에 관한 것이다. 이 다이머를 함유하는 의약은 혈전증을 예방하는데 이용될 수 있으며 또는 이들은 모노머의 전구약물로서 이용될 수도 있다. apo-A-1의 이러한 특정 변이체의 독특한 특성 중 하나는 그 자신이 공유 다이머를 형성할 수 있다는 것이다. 이 특허발명의 발명자들은 Apo-A-I-M의 존재로 인해 혈장 반감기가 연장된 것 같다고 추정하고는 있으나, 결정적인 자료는 제시되어 있지 않다.

US 5,643,757 (SHA-IL 외)에는 순수하고, 안정하며, 성숙하고 생물학적으로 활성적인 인간의 아포리포단백질 A-I을 고수율로 제조하는 방법이 개시되어 있다.

US 5,990,081 (AGELAND 외)에는 아포리포단백질 A 또는 아포리포단백질 E의 치료학적 유효량을 투여함으로써 동맥경화증 또는 심혈관 질환을 치료하는 방법이 설명되어 있다.

WO 96/37608 (RHONE-POULENC ROHRER 외)에는 151번 위치에 시스테인을 갖는 아포리포단백질 A-I 변이체의 인간의 상동성 다이머가 설명되어 있다. 아미노산 서열에 시스테인 잔기가 존재함으로 해서 모노머들 사이에 디설파이드 결합을 통해 다이머가 형성될 수 있다. 이 문헌은 나아가 상응하는 핵산 서열과 이들을 포함하는 벡터 뿐만 아니라 상기 변이체를 포함하는 약학적 조성물과 유전자 요법에 있어서의 이들의 용도에 대해서도 설명하고 있다.

WO 90/12879 (Sirtori 외) 및 WO 94/13819 (Kabi Pharmacia)에는 각각 효모와 E.coli에서 ApoA-1과 ApoA-IM을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이 문헌들은 또한 ApoA-I과 ApoA-IM의 동맥경화증 및 심혈관 질환 치료용 의약으로서의 용도에 대해서도 설명하고 있다.

결론적으로 말해서, 종래기술은 주로 천연의 ApoA-I 또는 ApoA-IM 모노머 또는 ApoA-IM 다이머의 알려진 단점 (주로 급속히 제거되는 것)에도 불구하고, 이들 단백질의 혈관질환 치료용 의약으로서의 용도에 집중되어 있다. 종래기술에서는 콜레스테롤 역전달을 수행할 수 있는 능력이 개선되고/또는 혈장 반감기가 연장된 구조물을 얻기 위해 ApoA-I을 개질시키는 기술을 찾아볼 수 없다.

따라서 본 발명의 한가지 목적은 심혈관 질환을 치료 및/또는 예방하는데 이용가능한 ApoA 구조물을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 첫번째 측면은 다음 일반식을 가지며 의약으로서 사용될 수 있는 아포리포단백질 구조물에 관한 것이다:

- apo A-X

- 식 중, apo A는 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 AII, 아포리포단백질 AIV, 그의 유사체 또는 변이체 중에서 선택된 아포리포단백질 A 성분이고,

- X는 아미노산, 펩타이드, 단백질, 탄수화물 및 핵산 서열 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 이종 부분 (heterologous moiety)이며,

- 단, 상기 구조물이 정확히 두개의 동일하고 천연적인 아포리포단백질로 구성될 경우, 이들은 시리즈로 연결되어 있다.

본 발명에 따라, 의약으로서 사용가능한 신규한 구조물이 제공된다. 종래 기술은 의약 용도를 위한 본 발명에서 정의된 바와 같은 아포리포단백질 구조물을 설명하지 못했다. 본 발명에 따른 아포리포단백질 구조물은 넓게 보면, 콜레스테롤 및 다른 지질과 함께 복합체를 형성할 수 있는 그 능력 때문에 HDL 유사체로 간주될 수 있으며 이 화합물들을 간에 전달하는 것을 돕는다.

본 발명을 통해 아포리포단백질 성분 또는 이 구조물의 일부를 apo A 또는 아포리포단백질라고 칭한다. 다음의 상세한 설명 및 청구범위에서, 이종 부분은 이 구조물의 성분 X라고 칭하기로 한다. 아포리포단백질 또는 그의 유사체나 변이체는 이종 부분에 공유적으로 연결된다.

이 구조물의 성분 X는 널리 이종 부분으로서 간주되어도 좋다. 본문에서 이종 부분은 자연 조건 하에서는 아포리포단백질이나 그의 유사체 또는 변이체 또는 기능적 등가물에 연결되지 않는 여하한 종류의 모든 부분을 말한다. 따라서 이종 부분은 동종 또는 다른 종으로부터의 펩타이드나 단백질 또는 그러한 펩타이드나 단백질의 일부, 심지어는 단일 아미노산일 수 있다. 또한 합성 펩타이드일 수도 있다. 이것은 또한 탄수화물이나 또른 다른 폴리머성 및 생체적합한 특성을 갖는 폴리올, 핵산 서열의 일종일 수도 있다.

천연의 아포리포단백질 A-I, A-II, A-IV와의 기능적 동등성을 지질 결합 분석법을 이용하여 간편하게 측정할 수 있다. 포유류에 있어서 실질적으로 동일한 생리학적 응답을 이끌어내는 이 구조물의 능력은, 마우스와 같은 설치류 또는 토끼와 같은 시험 동물에 있어서 콜레스테롤 역전달을 수행할 수 있는 능력을 측정함으로써 간편하게 측정될 수 있을 것이다.

아포리포단백질 및 이종 부분을 포함하는 상기 구조물은 이종 부분의 부가에 의해 야기되는 변형에도 불구하고, 천연 아포리포단백질과 동등한, 심지어는 더 훌륭하게 콜레스테롤 역전달을 수행할 수 있다. 이 구조물의 혈장 반감기는 야생형 아포리포단백질의 그것과 비교해볼 때 바람직하게 증가된다. 연장된 반감기는, HDL에의 증가된 결합에 기인한 것일 수 있는, 신장을 통한 여과율을 감소시킬 수 있는 아포리포단백질 구조물의 증가된 크기에 기인하는 것이거나 또는 천연 Apo A에 비해 이 구조물의 감소된 분해에 기인하는 것일 수 있다.

바람직하게는 혈장 반감기가 적어도 2배 또는 3배, 또는 적어도 4배 또는 적어도 10배 배가되는 것이 좋다. 마찬가지로, 지질 결합 친화도 및/또는 콜레스테롤 결합 친화도와 같은 구조물의 결합 친화도 역시 야생형 아포리포단백질에 비해 바람직하게 증가된다. 바람직하게는, 지질 결합 친화도가 적어도 5%, 예컨데 적어도 10%, 예컨대 적어도 15%, 예컨대 적어도 20%, 예컨대 적어도 25%, 예컨대 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%,예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 100%, 예컨대 적어도 150%, 예컨대 적어도 200%, 예컨대 적어도 300%인 것이 좋다. 본 발명에 따른 구조물의 지질 결합 친화도가 천연 아포리포단백질의 지질 결합 친화도와 같거나 더 낮은 경우에서조차, 본 발명에 따른 구조물은 그 혈장 반감기가 증가됨으로 해서 임상효과는 더 좋을 수 있다.

증가된 혈장 반감기 및/또는 증가된 지질 결합 친화도는 동맥경화증의 치료에 아포리포단백질 구조물을 이용할 수 있는 깊은 연관성을 제시해준다. 따라서, 본 발명에 따른 아포리포단백질 구조물의 임상 효과는 야생형 아포리포단백질의 효과보다 우수하다.

본 발명은 또한 ㅍ유류에 있어서 실질적으로 동일한 생리학적 응답을 이끌어낼 수 있는 야생형 아포리포단백질의 유사체 또는 변이체도 포함한다.

본 발명의 두번째 측면에 따라, 다음 일반식을 갖는 아포리포단백질 구조물이 제공된다

- apo A-X

- 식 중, apo A는 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 AII, 아포리포단백질 AIV, 그의 유사체 또는 변이체 중에서 선택된 아포리포단백질 성분이고,

- X는 올리고머화 모듈, 및 말단에 연결된 아포리포단백질 중에서 선택된 이종 부분 (heterologous moiety)이다.

또 다른 측면에 따라, 상기 정의한 바와 같이 아포리포단백질 구조물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 제공된다. 바람직하게는 뉴클레노타이드 서열은 단백질 구조물의 발현을 위한 조절 서열에 작동적으로 연결되는 것이 좋다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 정의한 바와 같이 아포리포단백질 구조물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 및 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환된 숙주 세포도 제공된다.

본 발명에 따른 아포리포단백질 구조물은 여러가지 방법으로 제조될 수 있다.

첫번째 방법에서는, 구조물 내로 삽입된 DNA에 의해 코딩된 본 발명에 따른 단백질 구조물의 발현을 촉진시키는 조건 하에, 형질전환된 숙주 세포를 배양하고 상기 단백질 구조물을 회수한 다음 임의로 단백질 구조물을 더 가공한다.

이 방법은 구조물 전체가 폴리펩타이드로부터 유래한 것이고 따라서 하나의 대응하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 것일 때 바람직한 방법이다.

두번째 방법에서는 이종 부분을 화학적으로 합성한 다음 이어서 이것을 아포리포단백질 또는 유사체에 연결시켜 아포리포단백질 구조물을 얻은 다음, 이를 분리하고 임의로 추가로 가공함으로써 아포리포단백질 구조물을 제조할 수 있다. 이 방법은, 이종 부분이 비-펩타이드 유래의 것일때 바람직하다. 그러나, 이종 부분이 폴리펩타이드 유래의 것인 경우에도, 이종 부분을 화학적으로 합성하는 것이 바람직한 조건도 있을 수 있다. 이러한 조건은 이종 부분이 아미노산 20개 미만과 같이 다소 짧은 경우이다.

세번째 방법에서는, 핵산 단편에 의해 코딩된 아포리포단백질 또는 아포리포단백질 유사체의 발현을 촉진하는 조건 하에서, 형질전환된 숙주 세포를 배양한 다음, 아포리포단백질 또는 아포리포단백질 유사체를 이종 부분에 공유적으로 연결시켜 아포리포단백질 구조물을 얻고, 얻어진 아포리포단백질 구조물을 분리한 다음 이 구조물을 임의로 추가 가공함으로써 아포리포단백질 구조물을 얻을 수 있다.

마지막으로, 올리고머화 모듈 (oligomerising module)을 코딩하는 핵산 단편에 의해 코딩된 단백질 발현을 촉진하는 조건 하에서, 형질전환된 숙주 세포를 배양한 다음, 이어서 상기 모듈을 적어도 하나의 아포리포단백질에 연결시켜 아포리포단백질 구조물을 얻음으로써 아포리포단백질 구조물을 제조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라 상술한 바와 같은 아포리포단백질 구조물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 이 약학적 조성물이 주사와 같이, 비경구적으로 투여될 수 있는 것이 좋다.

본 발명은 상기 정의된 아포리포단백질 구조물의 약학적 조성물 제조를 위한 용도도 포함한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 애쥬번트, 첨가제, 예컨대, 지질, 인지질, 콜레스테롤 또는 트리글리세라이드를 추가로 함유할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 정맥내 (intravenously), 동맥내 (intraarterially), 근육내 (intramusculary), 경피적 (transdermally), 폐속 (pulmonary), 피하 (subcutaneously), 피내 (intradermally), 경막내 (intrathecally)로, 또는 뺨, 항문, 질, 결막, 또는 비강내 조직을 통해, 또는 종양 조직과 같은 조직내로 접종하거나 또는 이식에 의해, 또는 경구적으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 정의된 아포리포단백질 구조물은, 아포리포단백질 구조물을 코딩하는 DNA 서열을 적어도 하나의 세포 집단 (cell population)을 트랜스펙션 또는 감염시키기 위해 사용하는, 유전자 요법에도 이용될 수 있다.

도 1은 인간의 아포리포단백질 A-I의 아미노산 서열 (1 문자 코드)을 나타낸 것이다.
도 2aa 및 도 2ab는 BLOSUM을 이용한 아포리포단백질 A-I의 CLUSTAL W (1.74) 다중 서열 정렬을 나타낸 것이다. 다음의 서열들이 이 도면에 정렬되어 있다:
인간의 sp│P02647│APA1_HUMAN 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI) - Homo sapiens (인간)
짧은 꼬리 원숭이 (Macaque)의 sp│P15568│APA1_MACFA 아포리포단백질 A-l 전구체 (Apo-AI) - Macaca fascicularis (게를 먹는 짧은 꼬리 원숭이: Crab eating macaque)
소의 sp│P15497│APA1_BOVIN 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI) - Bos taurus (소).
돼지의 sp│P18648│APA1_PIG 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI) - Sus scrofa (돼지).
개의 sp│P02648│APA1_CANFA 아포리포단백질 A-l 전구체 (Apo-AI) - Canis familiars (개).
토끼의 sp│P09809│APA1_RABIT 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI) -Oryctolagus cuniculus (토끼).
나무 두더지 (Tree shrew)의 sp│O18759│APA1_TUPGB 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI) Tupaia glis belangeri (일반적인 나무 두더지).
마우스의 sp│Q00623│APA1_MOUSE 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI)-Mus musculus (마우스).
래트의 spSEQ ID NOPo4639SEQ ID NOAPA1_RAT 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI)-Rattus norvegicus (래트).
유럽산 고슴도치의 tr│Q9TS49 아포리포단백질 A-l, APOA-I=콜레스테롤 전달자 (CHOLESTEROL TRANSPORTER) - Erinaceus europaeus (서유럽 고슴도치)
닭의 sp│P08250│APA1_CHICK 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI)-Gallus gallus (닭).
일본산 메추라기의 sp│P32918│APA1_COTJA 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI)-Coturnix coturnix japonica (일본산 메추라기).
집오리의 sp│O42296│APA1_ANAPL 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI) -
Anas platyrhynchos (집오리).
무지개송어의 sp│O57523│AP11_ONCMY 아포리포단백질 A-I-1 전구체 (APOA-1-1) - Oncorhynchus mykiss (무지개송어) (Salmo gairdneri).
목새송어 (Brown trout)의 sp│Q91488│APA1_SALTR 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI)-Salmo trutta (목새송어).
대서양연어의 sp│P27007│APA1_SALSA 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI)-Salmo salar (대서양연어).
제브라다니오 (Zebrafish)의 sp│42363│APA1_BRARE 아포리포단백질 A-I 전구체 (Apo-AI) - Brachydanio rerio (제브라피쉬) (제브라다니오).
감성돔 (Sea bream)의 sp│042175│APAl-SPAAU 아포리포단백질 A-1 전구체 (Apo-AI)- Sparus aurata (길테드 감성돔).
도 2b는 인간, 짧은꼬리 원숭이, 마우스, 비비원숭이, 돼지 및 래트의 아포리포단백질 A-IV의 아미노산 서열 (1문자 코드)을 정렬시킨 것이다.
도 3은 테트라넥틴의 아미노 말단 대역의 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO 12). 테트라넥틴의 E1부터 L51까지의 아미노산 서열임 (1문자 코드). 엑손 1은 E1부터 D16까지의 잔기를, 엑손 2는 V17에서 V49까지의 잔기를 각각 포함한다. 알파 헬릭스는 알파 헬릭스 중의 C-말단 아미노산 잔기인 L51부터 K52를 지나서 뻗어있다.
도 4는 테트라넥틴 단백질 패밀리의 트라이머화 구조 요소의 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것이다. 인간 테트라넥틴의 엑손 2와 엑손 3의 첫 3개 잔기를 포함하는 V17부터 K52까지에 대응하는 아미노산 서열 (1문자 코드) (Sorensen외, Gene, 152: 243-245, 1995); 리프상어 연골로부터 분리된 테트라넥틴 상동성 단백질 (Neame 및 Boynton, 1992, 1996); 및 소의 연골로부터 분리된 테트라넥틴 상동성 단백질 (Neame 및 Boynton, 데이타베이스 수령번호 PATCHX:u22298). 7개짜리 한벌 반복체 (heptad repeats: 이하 헵타드 반복체라 칭함) 중의 a 및 d 위치의 잔기들을 굵은 문자로 표시하였다. 구조 요소들을 트라이머화하는 테트라넥틴 단백질 패밀리의 수록된 콘센서스 서열은 대역의 다른 보존 잔기들에 더해, 도면에 도시된 헵타드 반복체 중 a 및 d 위치에 존재하는 잔기들을 포함한다. "hy"는 지방족의 소수성 잔기를 가리킨다.
도 5는 pT7 H6UbiFx Apo A-I 플라스미드 및 그의 대응 아미노산 서열을 도시한 도면이다. 발현되어 가공된 이 폴리펩타이드는 인간의 Apo A-I의 아미노산 no 25-267 (SEQ ID NO 1)과 그것에 N-말단이 연결된 gly-gly로 구성되어 있다.
도 6은 pT7 H6UbiFx Cys-Apo A-I 플라스미드 및 그의 대응 아미노산 서열을 도시한 도면이다. 발현되어 가공된 이 폴리펩타이드는 N-말단 시스테인 잔기와 인간의 Apo A-I으로부터의 아미노산 no 25-267 및 그것에 N-말단이 연결된 gly-gly로 구성되어 있다.
도 7은 pT7H6 Trip-A-Apo A-I - Amp^R 플라스미드 및 그의 대응하는 아미노산 서열을 도시한 도면이다. 발현되어 가공된 이 폴리펩타이드 (SEQ ID NO 3)은 TTSE, 연결 서열, 및 인간의 Apo A-I으로부터의 아미노산 no 25-267로 구성되어 있다.
도 8은 pT7H6 Trip-A-Apo A-I-del 43 - Amp^R 플라스미드 및 그의 대응하는 아미노산 서열을 도시한 도면이다. 발현되어 가공된 이 폴리펩타이드 (SEQ ID NO 4)는 TTSE, 연결 서열, 및 인간의 Apo A-I으로부터의 아미노산 no 68-267로 구성되어 있다.
도 9는 pT7H6FXCysApoAI 플라스미드 및 그의 대응 아미노산 서열을 도시한 도면이다. 발현되어 가공된 이 폴리펩타이드는 N-말단 시스테인 잔기 및, 인간의 Apo A-I (SEQ ID NO 2)로부터의 아미노산 no 25-267 및 그에 N-말단 연결된 gly-gly로 구성되어 있다.
도 10a 내지 도 10g는 본 발명에 따른 플라스미드 및 그에 대응하는 아포리포단백질 구조물의 아미노산 서열을 예시한 도면들이다.
도 10a: pT7H6-Trip-A-Apo AI K9A K15A: pTH6-Trip-A-Apo Ai에 대응하지만, 트라이머화 대역의 2개의 라이신 잔기가 면이되어 헤파린 친화성이 제거되었다. 성숙한 단백질 산물을 Tip-A-AI K9A, K15A (SEQ ID NO 5)로 명명한다.
도 10b: pT7H6-Trip-A-FN-Apo AI: pT7H6-Trip-A-Apo AI에 대응하지만, 아미노산 서열 SGH를 코딩하는 염기들이 Trip A 서열 다음과 apo AI 서열 전에 삽입되었다. 성숙한 단백질 산물을 Trip-A-FN-AI (SEQ ID NO 6)으로 명명한다.
도 10c: pT7H6-Trip-A-FN-Apo AI-final: pT7H6-Trip-A-FN-Apo AI에 대응하지만, pT7H6 Trip-A-FN-Apo AI의 BamHI 자리가 제거됐고 변경된 아미노산 3개가 삽입되어, 테트라넥틴 유래 트라이머화 서열과 apo AI 사이의 아미노산 서열이 GSSGH에서 GTSGQ로 바뀌었다. 이 5개짜리 아미노산 서열은 피브로넥틴의 링커 대역의 서열에 대응한다. 성숙한 단백질 산물을 Trip-A-FN-final (SEQ ID NO 7)로 명명한다.
도 10d: pT7H6-Trip-A-FN-Apo AI-final K9AK15A: pT7H6-Trip-A-FN-Apo AI-final에 대응하지만, 트라이머화 대역의 라이신 잔기 2개가 돌연변이 되어 헤파린 친화성이 제거되었다. 성숙한 단백질 산물을 Trip-A-FN-AI-final-K9A,K15A (SEQ ID NO 8)로 명명한다.
도 10e: pT7H6-Trip-A-TN-Apo AI: pT7H6-Trip-Apo AI에 대응하지만, 아미노산 서열 KVHMK를 코딩하는 염기들이 Trip A 서열 다음, apo AI 서열 전에 삽입되었다. 성숙한 단백질 산물을 Trip-A-TN-AI (SEQ ID NO 9)로 명명한다.
도 10f: pT7H6-Trip-A-TN-Apo AI-final: pT7H6-Trip-A-TN-Apo AI에 대응하지만, pT7H6 Trip-A-TN-Apo AI의 BamHI 자리가 제거되어, 테트라넥틴 유래 트라이머화 서열과 apo AI 사이의 아미노산 서열이 GSKVHMK에서 GTKVHMK로 바뀌었다. 이 7개짜리 아미노산 서열은 트라이머화 도메인 다음의 테트라넥틴 서열에 대응한다. 성숙한 단백질 산물을 Trip-A-TN-AI-final (SEQ ID NO 10)으로 명명한다.
도 10g: pT7H6-Trip-A-TN-Apo AI-final K9AK15A: pT7H6-Trip-A-TN-Apo AI-final에 대응하지만, 트라이머화 대역의 라이신 잔기 2개가 돌연변이 되어 헤파린 친화성이 제거되었다. 성숙한 단백질 산물을 Trip-A-TN-AI-final-K9A,K15A (SEQ ID NO 11)로 명명한다.
도 10h: pT7H6Fx-Hp(alpha)-ApoAI. 이 플라스미드는 Hp(alpha)와 ApoAI 사이의 융합 단백질을 코딩한다. 성숙한 단백질 산물을 Hp(alpha)-ApoAI (SEQ ID NO 14)로 명명한다.
도 11은 실시예 6에 설명된 분석실험에서 DMPC에 대한 ApoA-I, TripA-ApoA-I, 및 TripA-FN-ApoA-I의 결합 시험 결과를 도시한 것이다.
도 12는 실시예 7에 설명된 바와 같이, 고정된 큐빌린에 대한 ApoA-I과 TripA-ApoA-I의 결합 시험 결과를 도시한 것이다.
도 13은 Apo A-I, Trip-A-AI, Trip-A-TN-AI, Trip-A-FN-AI의 분석적 겔여과도이다. 대조군으로서 BSA도 포함되어 있다. 상세한 설명은 실시예 5를 참고하면 된다.
도 14는 마우스에 있어서 아포리포단백질 A-I, TripA Apo-AI 및 TripA-피브로넥틴-링커 Apo A-I의 혈장 제거실험 평가결과를 나타낸 것이다. 이 실험에 관한 상세한 설명은 실시예 8을 참고하면 된다.

첨부된 도면을 참고로 다음에서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 구조물의 기능 및 상기 구조물의 apo-A 성분의 기능은 후술하는 DPMC 분석법과 같은 지질 결합 분석법에 의해 측정할 수 있다. 또한, 콜레스테롤 역전달에 미치는 in vivo 효과는 Miyazaki 등의 방법 (Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 1995:15: 1882-1888)에 설명되니 바와 같이 콜레스테롤이 많이 함유된 먹이를 먹인 토끼나, Apo E 결핍 마우스 (Sha PK 외, Circulation 2001, 103:3047-3050)와 같은 시험 동물에게 투여함으로써 측정할 수 있다.

아포리포단백질 또는 유사체

다음에서 "apo-A"라는 용어는 아포리포단백질 A-I, 아포리포단백질 A-II 또는 아포리포단백질 A-IV, 이들과 동일한 지질 결합 기능을 갖는 그의 변이체나 유사체를 가리키는 것으로 한다.

바람직한 아포리포단백질 A-I 유사체에는 도 2aa 및 2ab에 설명된 것들이 포함된다. 바람직한 A-IV 유사체에는 도 2b에 설명된 것들이 포함된다.

도 1에서 인간의 Apo-AI의 서열에 대한 공지 변이체로는 다음의 변이체가 포함되며, 다음에 도 1의 서열에 상응하는 변형의 위치, 변형, 및 적절한 경우 공지 변이체의 명칭을 나타내었다.

27 P →H (IN MUSTER-3C).

27 P →R.

28 P →R (IN MUSTER-3B)

34 R →L (IN BALTIMORE).

50 G →R (IN IOWA).

84 L →R (IN AUTOSOMAL DOMINANT AMYLOIDOSIS).

113 D →E.

119 A →D (IN HITA).

127 D →N (IN MUNSTER-3A).

131 MISSING (IN MARBURG/MUNSTER-2).

131 K →M.

132 W →R (IN TSUSHIMA).

133 E →K (IN FUKUOKA).

151 R →C (PARIS).

160 E →K (IN NORWAY).

163 E →G.

167 P →R (IN GIESSEN).

168 L →R (IN ZARAGOZA).

171 E →V.

189 P →R.

197 R →C (IN MILANO).

222 E →K (IN MUNSTER-4).

본 발명에 따라 "아포리포단백질"라는 용어의 의미에는 도 1, 도 2aa, 도 2ab 및 도 2b에 나타낸 적어도 한가지 서열의 기능적 등가물 또는 도 1, 도 2aa, 도 2ab 및 도 2b의 적어도 하나의 서열의 단편이 모두 포함되는 것으로 한다. "단편 (fragment)"이라 함은 다음과 같이 정의된다:

i) 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b에 도시된 소정의 아미노산 서열도 인식할 수 있는 항체에 의해 인식될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 단편, 및/또는

ii) 디미리스토일 포스파티딜콜린 또는 콜레스테롤과 같은 지질에 결합가능하고, 및/또는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b에 나타낸 소정의 아미노산 서열에도 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 단편.

본 발명에 따라 아포리포단백질의 기능적 등가물 또는 그의 단편은 적어도 하나의 아미노산을 부가, 치환 또는 결실시킴으로써 얻을 수 있다. 아미노산 서열 하나가 다른 하나로 치환된 경우, 이러한 치환은 보존적 아미노산 치환일 것이다. 도 1, 2aa, 2ab 및 2b의 서열의 단편들은 이러한 치환을 두개 이상, 예컨대, 두개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 3개 또는 4개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 5개 또는 6개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 7개 또는 8개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 10 내지 15개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 15 내지 25개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 25 내지 75개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 75 내지 125개의 보존적 아미노산 치환, 예컨대 125 내지 175개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 치환은 소정의 아미노산의 하나 이상의 그룹을 이용하여 이루어질 수 있다.

보존적 아미노산 치환을 하나 이상 포함하는 단편의 예로는, 소정의 아미노산의 동일 그룹 내에서 보존적 아미노산 치환을 하나 이상, 또는 복수개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 단편을 들 수 있으며, 여기서 각각의 보존적 치환은 소정의 아미노산의 상이한 그룹 내에서의 치환에 의해 생성된 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b에 나타난 서열의 변이체 또는 그의 단편들은, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 동일한 변이체 또는 그의 단편, 또는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 상이한 변이체 또는 그의 단편 중에서, 적어도 하나의 치환, 예컨대 서로 독립적으로 도입된 복수개의 치환을 포함할 수 있다. 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 변이체 또는 그의 단편들은 따라서 서로 독립적인 보존적 치환을 포함할 수 있다; 즉, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 글라이신 (Gly)이 Ala, Val, Leu 및 Ile으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환된 변이체, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 알라닌 (Ala)이 Gly, Val, Leu 및 Ile으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 발린 (Val)이 Gly, Ala, Leu 및 Ile으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열 또는 그의 단편의 상기한 변이체의 적어도 하나의 상기 류신 (Leu)이 Gly, Ala, Val 및 Ile으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 이소류신 (Ile)이 Gly, Ala, Val, 및 Leu으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 아스파르트산 (Asp)이 Glu, Asn, 및 Gln으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 페닐알라닌 (Phe)이 Tyr, Trp, His, Pro로 구성된 아미노산 그룹 및 바람직하게는 Tyr과 Trp로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열 또는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 단편의 상기한 변이체의 적어도 하나의 상기 티로신 (Tyr)이 Phe, Trip, His, Pro로 구성된 아미노산 그룹, 바람직하게는 Phe와 Trp로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 아르기닌 (Arg)이 Lys 및 His으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 라이신 (Lys)이 Arg 및 His으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 아스파라긴 (Asn)이 Asp, Glue 및 Gln으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 글루타민 (Gln)이 Asp, Glu 및 Asn으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 프롤린 (Pro)이 Phe, Tyr, Trp 및 His으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편, 및 그와 독립적으로, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 상기한 변이체 또는 그의 단편의 적어도 하나의 상기 시스테인 (Cys)이 Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, 및 Tyr으로 구성된 아미노산 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환되어 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 변이체 또는 그의 단편이 그러한 예이다.

상기한 개략적인 설명으로부터 동일한 변이체 또는 그의 단편이 여기정의된 바와 같은 보존적 아미노산의 두개 이상의 그룹으로부터의 두개 이상의 보존적인 아미노산 치환을 포함할 수 있음이 자명하다.

아미노산의 부가 또는 결실은 2 내지 10개의 아미노산, 예컨대 10 내지 20개의 아미노산, 예컨대 20 내지 30개의 아미노산, 예컨대 40 내지 50개의 아미노산의 부가 또는 결실일 수 있다. 그러나, 50개를 초과하는 아미노산, 예컨대 10 내지 200개 아미노산의 부가 또는 결실 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다. 더욱 구체적으로, 도 1의 서열로부터 43 N-말단 아미노산을, 상기 단백질의 지질 결합 효과에 실질적인 변화를 가함이 없이 제거할 수 있다. 이러한 결실 변이체는 본 발명의 아포리포단백질 일부로서 SEQ ID NO 4에 포함된다.

따라서, 본 발명은 DPMC와 같은 지질에 결합가능한 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 적어도 하나의 단편을 포함하는 아포리포단백질에 관한 것으로서, 이러한 적어도 하나의 단편의 기능적 등가물과 여하한 변이체도 여기에 포함된다.

본 발명에 따른 아포리포단백질은 그의 기능적 등가물과 그의 단편을 비롯하여, 본 발명의 한가지 구체예에서 243개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 240개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 225개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 200개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 180개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 160개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 150개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 140개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 130개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대120개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 110개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 100개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 90개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 85개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 80개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 75개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 70개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 65개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 60개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 55개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 50개 미만의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

단편

도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 천연 서열들의 지질 결합 대역을 포함하는 단편이 특히 바람직하다. 그러나, 본 발명의 범위가 지질 결합 대역을 포함하는 단편들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에는 지질 결합 대역을 포함하지는 않으나 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 기능적 등가 단편을 발생시키는, 상기한 단편들의 결실들도 포함된다. 본 발명에 따른 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b 펩타이드의 기능적 등가 서열 및 그의 단편들은 지질 결합 대역보다 더 많거나 더 적은 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단편이 Apo-A-I의 아미노산 100-186 또는 그의 변이체나 그의 기능적 등가물을 포함하는 것이 좋다. 이 중앙 도메인과 이 도메인 내의 알파-헬릭스는 인지질과의 상호반응에 직접 연관된 것으로 나타났다. 따라서, 이 대역이 Apo-A-I의 기능적 특성에 중요한 역할을 할 개연성이 매우 높다.

본 발명에서 "기능적 등가성 (functional equivalency)"이라 함은 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 소정으 단편의 대응하는 기능성을 참조로 수립된 한가지 바람직한 구체예에 따른 것이다.

도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 변이체의 기능적 등가물은 보존적 치환을 비롯한 치환, 삽입, 결실의 횟수와 범위가 증가할수록, 바람직한 소정의 서열과 점차 차이가 나게되는 아미노산 서열을 나타내는 것으로 이해할 수 있다. 이러한 차이는 바람직한 소정의 서열과 그의 단편이나 기능적 등가물 사이의 상동성의 감소로서 측정된다.

아포리포단백질의 모든 단편 또는 기능적 등가물은, 아포리포단백질의 바람직한 소정의 서열에 대해 그들이 나타내는 상동성의 정도와 무관하게 본 발명의 범위에 포함된다. 그 이유는, 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 어떤 대역은 결과적인 단편의 결합 활성에 하등 중대한 영향을 미치지 않으면서도 극히 쉽게 변이되거나 또는 완전히 결실될 가능성이 있기 때문이다.

치환에 의해 얻어진 기능적 변이체는 어느 형태나 어느 정도로 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 천연적인 활성을 나타낼 것이며, 기능적으로 유사한 아미노산 측쇄를 포함하는 잔기가 치환될 경우에는 그 상동성이 감소될 것이다. 여기서 기능적으로 유사하다는 의미는 소수성, 염기성, 중성 또는 산성, 또는 입체적인 벌크기의 존재 여부와 같은, 측쇄의 중요한 특성들을 가리키는 것이다. 따라서, 본 발명의 한가지 구체예에서, i) 효과를 발휘할 수 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b 단편의 주어진 서열과 ii) 바람직한 소정의 단편 간의 동일성 정도는 그 단편이 본 발명에 따른 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 바람직한 소정의 기능적 등가물이나 변이체인지를 판가름하는 주된 척도는 아니다.

아미노산 서열들간의 상동성은 BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85, 또는 BLOSUM 90과 같은 공지의 알고리듬을 이용하여 측정할 수 있다.

도 1, 2aa, 2ab 또는 2b 단편의 서열과 적어도 어느 정도의 상동성을 공유하는 단편들은 아포리포단백질 또는 그의 단편과 적어도 약 40%의 상동성, 예컨대 적어도 약 50%의 상동성, 예컨대 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b 단편의 서열들과 적어도 약 60%의 상동성, 예컨대 적어도 약 70%의 상동성, 예컨대 적어도 약 75%의 상동성, 예컨대 적어도 약 80%의 상동성, 예컨대 적어도 약 85%의 상동성, 예컨대 적어도 약 90%의 상동성, 예컨대 적어도 약 92%의 상동성, 예컨대 적어도 약 94%의 상동성, 예컨대 적어도 약 95%의 상동성, 예컨대 적어도 약 96%의 상동성, 예컨대 적어도 약 97%의 상동성, 예컨대 적어도 약 98%의 상동성, 예컨대 적어도 약 99%의 상동성을 나타낼 경우 본 발명의 범위에 속하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 한가지 구체예에 따라 상동성 백분율은 동일성 백분율을 가리키는 것이다.

본 명세서에서 사용된 의미에 따라 기능적 등가성을 측정할 경우 고려하여야할 부가적인 요소로는 i) 본 발명에 따른 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 단편들을 검색할 수 있는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열의 어느 하나에 대한 항혈청의 능력, 또는 ii) 지질 결합 분석법에서 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열과 경쟁할 수 있는 기능적 등가 단편의 능력을 들 수 있다.

보존적 치환은 바람직한 소정의 아포리포단백질 또는 그의 단편의 어느 위치로든 도입될 수 있다. 그러나 비-보존적 치환은 특히 하나 이상의 위치에서 비-보존적 치환에 도입되는 것도 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열들의 기능적 등가 단편을 형성시키는 비-보존적 치환은 예컨대 i) 실제로 극성을 변경시킨다, 즉, 예컨대 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn 또는 Gln과 같은 극성 측쇄 또는 Asp, Glu, Arg, 또는 Lys와 같은 전하를 띤 아미노산을 갖는 잔기를 비극성 측쇄 (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe 또는 Met)를 갖는 잔기로 치환하거나, 또는 비극성의 잔기를 극성 또는 전하를 띤 잔기롤 치환한다거나 및/또는 ii) 폴리펩타이드 백본의 방향성이 실제로 다르다던가, 예컨대, Glu 또는 Asp와 같은 음전하를 갖는 잔기를 Lys, His 또는 Arg와 같은 양전하를 갖는 잔기로 (또는 반대로) 바꾼다던지, 및/또는 iii) Lys, His 또는 Arg와 같은 양하전된 잔기가 Glu 또는 Asp와 같은 음하전된 잔기로 치환되는 (또는 반대로) 것과 같이 실제로 전기 전하가 달라지던가, 및/또는 iv) 예컨대 Ala, Gly 또는 Ser와 같이 크기가 작은 측쇄를 갖는 잔기를 His, Trp, Phe 또는 Tyr과 같은 부피가 큰 잔기로 치환한다던가 (또는 반대로) 하여 입체 부피에 차이가 있는 것이 그 예이다.

한가지 구체예에서 아미노산의 치환은 그의 소수성 및 친수성 값 및 전하, 크기 등을 비롯한 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 전술한 특징들을 고려한 아미노산 치환의 예는 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음이 포함된다: 아르기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 쓰레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.

여기에서 설명된 변이체에 더해, 변이체 구조의 핵신 부분을 모방하기 위해 입체적으로 유사한 변이체가 만들어질수 있으며 이러한 화합물 역시 본 발명의 변이체와 동일한 방식으로 이용될 수 있다. 이것은 당업자에게 알려진 화학적 고안 및 모델링 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 입체적으로 유사한 구조물은 모두 본 발명의 범위에 속한다.

성분 X

바람직하게는, 본 발명에 따른 단백질 구조물의 성분 X가 본질적으로 비-면역원성인 것이 좋다. 예컨대 성분 X는 포유류에게 생리학적 효과 및 특히 면역학적 효과를 실질적으로 미치지 않는, 아미노산, 탄수화물, 핵산 서열, 불활성 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다.

바람직하게는, 성분 X가 비면원성이고 리간드 결합과 관련하여 부정적으로 간섭하지 않는 것이 좋다; 즉, 아포리포단백질 성분은 X-성분과 리간드와의 상호작용을 통해 바람직하지 않은 위치로 지향되어서는 안된다.

한가지 구체예에서는 성분 X가 딱 하나의 아미노산으로 구성되는데, 이 아미노산은 바람직하게는 시스테인 잔기인 것이 좋고, 아포리포단백질 성분의 N-말단, C-말단 또는 그 내부에 위치될 수 있다. 이러한 구조물은 다른 동일 또는 유사한 구조물과 함께 다이머를 형성할 수 있다. 바람직하게는 말단의 시스테인 잔기와 아포리포단백질 성분 사이에 링커가 도입됨으로 해서 이 구조물의 지질 상호작용과 정확한 폴딩을 용이하게 해주는 것이 좋다.

그러나, 더욱 바람직하게는 성분 X가 1개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 2개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 5개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 10개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 15개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 20개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 30개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 40개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 50개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 75개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 100개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 200개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 300개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 400개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 500개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 600개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 700개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 800개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 900개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 1000개, 1250개 보다 많은 아미노산, 예컨대, 1500개, 2000개 또는 2500개 보다 많은 아미노산을 포함하는 것이 좋다.

X-성분이 단백질일 경우, 바람직하게는 이 단백질이 포유류 단백질, 더욱 바람직하게는 인간의 단백질인 것이 좋다. 적절한 단백질의 예로는 혈장 단백질, 예컨대 알부민, 혈청 알부민 또는 다른 비-면역원성 펩타이드 또는 단백질, 예컨대 플라스미노겐의 세린 프로테아제 단편 또는 촉매적 트리어드의 파괴에 의해 불활성이 되도록 조작된 또 다른 세린 프로테아제; 면역글로불린의 헤비 체인의 불변 대역을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이 단백질이 혈청 알부민을 포함하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 이 단백질이 아포리포단백질을 함유하는 양쪽성 헬릭스를 함유하는 아포리포단백질을 포함하는 것이 좋다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 성분 X는 아포리포단백질 A-I, A-II, A-IV, 그의 유사체, 기능적 변이체 또는 그의 단편 중에서 선택된 아포리포단백질 성분을 포함하는 것이 좋다. 이 2개의 아포리포단백질 성분들은 선형으로 연결될 수 있고 또는 부가적인 비-천연 말단 시스테인 다리를 통해 연결될 수도 있다.

적어도 하나의 비-천연 시스테인 잔기를 포함하는 아포리포단백질 성분의 다이머 뿐만 아니라 보다 고급의 올리고머들이 제조되어 적절한 조건 하에서 시스테인 다리를 통해 연결될 수 있다. 디설파이드 다리를 통해 연결된 올리고머들은 연속적으로 연결될 수 있다 (apo-A-S-S-apo-A, 또는 apo-A-S-S-apo-A-S-S-apo-A 또는 보다 고급의 올리고머).

본 발명에 따른 단백질 구조물은 또한 서로 연속적으로 또는 공유적으로 연결된 2개, 3개, 또는 그 이상의 아포리포단백질 또는 그 유사체를 포함할 수도 있다. 이것은 다음 아포리포단백질의 N-말단에 처음의 아포리포단백질의 C-말단을 연결시키는 방식으로 달성될 수 있다. 이 단백질은 또한 전사 및 번역이 일어난 후에 연결되거나 또는 뉴클레오타이드 서열은 아포리포단백질 사이에서 임의의 링커 펩타이드 뿐만 아니라 문제의 아포리포단백질 구조물을 코딩하는 단지 2개, 3개 또는 그 이상의 서열들을 포함할 수도 있다.

따라서, 연결을 수행할 이종 부분이 필요없게 된다. 2개, 3개 또는 그 이상의 apo-A 유닛을 갖는 구조물에서 실질적으로 모든 apo-A 유닛이 지질 결합에 참여함으로 해서, 이 구조물의 기능성에 기여하는 것으로 기대된다. 따라서 이들 멀티-apo-A 구조물은 천연의 apo-A에 필적되는 증가된 지질 결합 능력을 가질 것으로 기대된다. 천연의 apo-A에 비해 이들 구조물이 갖는 부가적인 장점은, 이들이 천연 apo-A보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는다는 것이다.

1개보다 많은 아포리포단백질 성분을 포함하는 이러한 구조물은 다음 중에서 선택된 조합을 포함할 수 있다:

다이머:

A-I A-I ; A-II All ; A-IV A-IV ; A-I A-il ; A- A-IV ; A-II A-IV.

트라이머:

A-I A-II A-IV ; A-I A- A-ll ; A-I A-I A-I ; A-I A-I A-IV ; A-II A-II A-l ; A-II A-il A-IV ; A-II A-II A-II ; A-IV A-IV A-IV ; A-IV A-IV A-II ; A-IV A-IV A-I.

올리고머화 모듈 ( oligomerisation modules )

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 이종 부분은 올리고머화 모듈인 것이 좋다. 여기서, 올리고머화 모듈은, 다른, 유사하거나 동일한 올리고머화 모듈과 상호반응할 수 있는 펩타이드, 또는 단백질 또는 단백질의 일부이다. 상호반응은 멀티머 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 유형의 반응이다. 이러한 상호반응은 멀티머 성분들간의 공유결합이나, 수소결합력, 소수성 힘, 반 데어 바알스 힘, 염다리에 의해 기인하는 것일 수 있다. 본 발명은 또한 DNA, RNA, LNA 또는 PNA의 핵산 서열과 같은 비-펩타이드 유래의 올리고머화 모듈도 포함한다. 당업자에게는 단백질과 핵산 서열을 서로 연결하는 기술이 잘 알려져 있다.

올리고머화 모듈은 다이머화 모듈, 트라이머화 모듈, 테트라머화 모듈 또는 멀티머화 모듈일 수 있다.

이 구조물의 아포리포단백질 또는 그의 유사체 부분이 올리고머화 모듈에 커플링될 경우, 구조물의 멀티머는 적절한 조건 하에서 구조물 용액을 (아포리포단백질 부분에 연결된 올리고머화 모듈) 단지 혼합하기만 하면 간단히 만들 수 있다. 이러한 방식으로, 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 또는 그 이상의 고급 -mer들을 이 구조물의 아포리포단백질 부분에 연결되는 올리고머화 모듈의 종류에 따라 만들 수 있다.

본 발명에 따른 멀티머는 여러가지 아포리포단백질들을 올리고머화 모듈에 연결시켜 멀티머 내로 인코포레이션시킬 수 있기 때문에, 호모머 (homomers) 또는 헤테로머 (heteromers)일 수 있다. 이러한 방식으로 아포리포단백질의 여러가지 유형을 혼합하여 임상효과가 개선된 구조물을 얻는 것이 바람직하다. 바람직한 호모머에는 Apo-A-I 트라이머와 Apo-A-IV 트라이머가 포함된다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 올리고머화 모듈은 테트라넥틴으로부터 유래하며, 더욱 구체적으로, WO 98/56906에 자세히 설명된 바 있는 트라이머화 구조 요소 (이하, TTSE, SEQ ID NO 12라 칭함)를 트라이머화하는 테트라넥틴을 포함한다. TTSE의 아미노산 서열이 SEQ ID NO 12에 제시되어 있다. TTSE의 트라이머화 효과는 2개의 다른 TTSE의 코일된 코일 구조와 상호반응하는 코일된 코일 구조에 의해 기인하여 트라이머를 형성하며, 이것은 극히 안정하다. TTSE의 또 다른 장점은 이것이 약한 항원이라는 것이다 (WO 98/56906).

바람직하게는, 엑손 1 (도 4)의 N-말단 대역에 위치하는 헤파린 결합 위치가, 트라이머화를 억제함이 없이 N-말단 라이신 잔기 (SEQ ID NO 12의 잔기 9 및 14)의 제거 또는 돌연변이에 의해 회피되는 것이 좋다. 바람직하게는 라이신 잔기가 알라닌으로 돌연변이되는 것이 좋다. 따라서 엑손 1의 대부분 또는 전부를 포함하는 TTSE는 황산화 다당류에게, 그 구조의 일부로서 그러한 TTSE를 포함하는 여하하게 디자인된 단백질에 대한 친화성을 부여한다. 그러나, 소망되는 경우, 이러한 친화성은 테트라넥틴의 N-말단 아미노산 잔기에 대응하는 TTSE의 일부에서 라이신 잔기의 N-말단 트렁케이션이나 돌연변이에 의해 감소되거나 회피될 수 있다 (Lorentsen 외 2000, Biochem J 347:83-87).

본 발명에 따른 트라이머화 모듈의 상호반응 도메인은 TTSE에서와 같은 동일한 유형의 것, 즉 삼중의 알파 헬리칼 코일된 코일인 것이 바람직하다.

TTSE는 인간의 테트라넥틴, 토끼의 테트라넥틴, 쥐의 테트라넥틴 또는 상어 연골의 C-형 렉틴으로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는 TTSE가 SEQ ID NO 12의 콘센서스 서열과 적어도 68%, 예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 81%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 92%의 동일성을 갖는 것이 좋다. 이에 의해 실질적으로 동일한 트라이머화 효과를 갖는 TTSE의 유사체가 본 발명의 범위에 포함된다.

바람직하게는, TTSE의 시스테인 잔기 50 (SEQ ID NO 12)은 원하지 않은 멀티머화를 초래할 수 있는 원치 않는 사슬간 디설파이드 다리의 형성을 피하기 위해, 세린, 쓰레오닌, 메티오닌 또는 그 밖의 여하한 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다.

트라이머의 존재 여부는 그 트라이머의 특성에 따라, 겔-여과, SDS-PAGE 또는 천연의 SDS 겔 전기영동과 같은 공지의 기술에 의해 확인될 수 있다. 올리고머의 존재 여부를 확인하기 위한 바람직한 한가지 방법은 DMSI (디메틸서브이리미데이트) 및 후속적으로 SDS-PAGE를 수행하는 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 이 단백질 구조물은 2개 이상의 아포리포단백질을 올리고머화 모듈이 되도록 연결함으로써 얻어진다. 이 구체예의 장점은 개개의 아포리포단백질의 서로에 대한 연결이 아포리포단백질 내부에서 일어나는 것이 아니라 올리고머화 모듈 내에서 일어난다는 것이다. 그에 따라 야생형 아포리포단백질의 특성이 보존되고 아포리포단백질은 2차 및 3차 구조를 보존하기 때문에, 그의 생리적 기능 측면에서 유리한 것이다. 아포리포단백질과 올리고머화 모듈 사이에 펩타이드 스페이서를 더 도입함으로써 구조물의 두성분 모두가 다른 성분의 상호반응에 의해 영향을 받음이 없이 각각 지질 및 다른 올리고머화 모듈과의 그 자신의 상호반응을 확실히 수행할 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드 스페이서가 비-면역원성의 것이고 기본적으로 선형의 3차원 구조를 갖는 것이 좋다.

다이머화 모듈, 트라이머화 모듈, 테트라머화 모듈, 펜타머화 모듈, 헥사머화 모듈 또는 멀티머화 모듈과 같은 올리고머화 모듈을 이용하여 같거나 다른 apo-A 유닛을 올리고머화시킬 수 있다. 올리고머화 모듈은 사슬간 인식 (interchain recognition) 및 상호반응을 할 수 있는 코일된 코일을 포함할 수 있다.

단백질 또는 펩타이드의 인공적인 트라이머를 생산하기 위한 일반적인 방법은 자연에서 트라이머를 형성하는 단백질로부터의 트라이머화 모듈을 동정하는 것을 포함한다. 세심한 분석을 통해, 단백질-단백질 상호반응에 책임이 있는 도메인이 동정, 분리 및 트라이머화될 단백질이나 펩타이드에 연결될 수 있다. 본 발명에 따라, 이러한 트라이머화는 아포리포단백질 또는 유사체의 트라이머 형성을 반드시 포함하는 것은 아니다. 단지 한개의 아포리포단백질을 트라이머화 모듈에 연결하여 이 펩타이드로 하여금 2개의 다른 트라이머화 보듈과 트라이머화시키는 것도 가능하다. 그렇게 함으로써 아포리포단백질 부분의 분자량이 증가되고 혈장 반감기가 천연의 아포리포단백질에 비해 증가될 수 있다.

올리고머화 모듈의 한가지 예가 WO 95/31540 (HOPPE 외)에 예시되어 있는데, 이 문헌에는 콜렉틴 넥 대역 (collectin neck region)을 포함하는 폴리펩타이드가 설명되어 있다. 콜렉틴 넥 대역을 구성하는 아미노산 서열은 선택된 어떠한 폴리펩타이드에도 결합될 수 있다. 이어서, 적절한 조건 하에서, 콜렉틴 넥 대역 아미노산 서열을 포함하는 3개의 폴리펩타이드간에 트라이머화가 수행될 수 있다.

올리고머화 모듈의 또 다른 예는 합토글루빈 (Haptoglobin)으로부터의 α1-체인이다. α1-체인은 다른 α1-체인과 결합하여 다이머를 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 갖는다. 본래의 변이체는 복제된 디설파이드 다리 중에 α1-체인 부분을 갖는, α2-체인이다. α2-체인은 다른 α2 또는 α1-체인에서 시스테인 잔기와 시스테인 결합을 형성함으로써, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머 및 보다 고급의 -mer를 형성할 수 있다. 자연적인 형태에서 α-체인은 β-체인과 연결되어 있다. β-체인을 아포리포단백질으로 치환함으로써 apo-A-α체인 (합토글로빈) 구조물을 만드는 것이 가능하다.

스페이서 펩타이드 ( Spacer peptide )

이 단백질 구조물은 아포리포단백질 또는 아포리포단백질 유사체 사이에 공유적으로 연결된 스페이서 부분과 이종 부분을 포함하는 것도 유리할 수 있다. 스페이서의 효과는 구조물의 이종 부분과 아포리포단백질 부분 사이에 스페이스, 즉 공간을 제공하는 것이다. 이렇게 함으로써, 아포리포단백질 부분이 존재한다고 해도 아포리포단백질 부분의 2차 구조가 영향을 받지 않기 때문에, 아포리포단백질 부분의 생리적 효과가 유지될 수 있다. 바람직하게는, 스페이서가 폴리펩타이드로부터 유래한 것이 좋다. 이러한 방식으로 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이 구조물의 아포리포단백질 부분을 코딩하는 서열 및 임의로 이종 부분에 대한 서열과 연결됨으로 해서, 구조물 전체가 동시에 제작될 수 있다.

적절한 스페이서 부분의 디자인과 제조방법은 기술분야에 잘 알려져 있으며 apo-A-스페이서-X의 포맷을 갖는 융합 폴리펩타이드를 제조함으로써 간편하게 수행될 수 있다 (상기 중, 스페이서 부분은 폴리펩타이드 단편 (종종 비교적 불활성함)이기 때문에, 스페이서와 구조물의 주변부 간의 바람직하지 못한 반응들을 피할 수 있다).

스페이서 부분은 또한 2개의 TTSE 사이에 삽입될 수도 있음으로 해서, 이들 두개를 모두 제 3의 격리된 TTSE와 상호반응하도록 하여 트라이머 복합체를 형성하도록 하고, 이것은, 2개의 별도의 펩타이드, 즉 TTSE와 TTSE-스페이서-TTSE를 포함한다. 이 구체예는 곧 엄밀하게 다이머로 보이는, 트라이머의 주요 부분이 융합 파트너 (구조물의 아포리포단백질 부분을 형성하는 여하한 폴리펩타이드 서열을 지정하는 apo-A) apo-A-TTSE-스페이서-TTSE-apo-A에 포함된 하나의 단일 폴리펩타이드로서 합성될 수 있기 때문에, 아포리포단백질 구조물의 생산을 용이하게 해준다.

2개의 TTSE가 동일한 모노머 중에 존재하는 이 구체예에서, 스페이서 부분은 스페이서 부분에 의해 공유적으로 연결된 2개의 TTSE 모두와 연관된 복합체를 형성하도록 하는 길이와 배열을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 바람직하지 못한 트라이머 포맷인 (2+1+1), (2+2+2) 및 (2+2+1) (여기서 각각의 모노머의 단지 하나의 TTSE만이 복합체 형성에 참여한다)의 형성을 감소시킬 수 있다.

스페이서 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산, 예컨대 적어도 3개의 아미노산, 예컨대 적어도 5개의 아미노산, 예컨대 적어도 10개의 아미노산, 예컨대 적어도 15개의 아미노산, 예컨대 적어도 20개의 아미노산, 예컨대 적어도 30개의 아미노산, 예컨대 적어도 40개의 아미노산, 예컨대 적어도 50개의 아미노산, 예컨대 적어도 60개의 아미노산, 예컨대 적어도 70개의 아미노산, 예컨대 적어도 80개의 아미노산, 예컨대 적어도 90개의 아미노산, 예컨대 약 100개의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.

스페이서는 공유 결합을 통해 apo-A 성분과 X에 연결될 수 잇으며, 바람직하게는 스페이서는 본질적으로 비-면역원성이고 및/또는, 단백질 가수분해성 절단되는 경향이 없으며, 및/또는 여하한 시스테인 잔기는 포함하지 않는 것이 바람직하다.

마찬가지로, 스페이서의 3차원 구조는 선형 또는 실질적으로 선형인 것이 바람직하다.

다음에 성분 X에 아포리포단백질 유사체를 연결하기에 특히 적합한 것으로 믿어지는 스페이서 서열을 예시하였다. 스페이서 또는 링커 펩타이드의 바람직한 예로는, 연결된 단백질 연결된 단백질의 기능을 실질적으로 저해하지 않거나, 또는 연결된 단백질들 중 어느 하나의 기능을 적어도 실질적으로 저해함이 없이 단백질들은 연결시키는데 이용된 것들을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 링커 또는 스페이서가 코일된 코일 구조를 포함하는 단백질을 연결하는데 이용된 것이 좋다.

테트라넥틴에 기초한 링커 ( Tetranectin based linker ):

이 링커는 테트라넥틴 중에서 β-스트랜드ㅡㄹ 형성하는 테트라넥틴 잔기 53-56과, 테트라넥틴에서 턴 (turn)을 형성하는 잔기 57-59를 포함할 수 있다 (Nielsen BB, Kastrup JS, Rasmussen H, Holtet TL, Graversen JH, Etzerodt M, Thoegersen HC, Larsen IK, FEBS-Letter 412, 388-396, 1997). 이 세그먼트의 서열은 GTKVHMK이다. 이 링커는 천연 테트라넥틴에서는 CRD-도메인과 함께 트라이머화 도메인을 연결하여, 다른 도메인과 트라이머화 도메인을 연결하는데 있어서 일반적으로 적합한 것으로 여겨진다는 장점을 갖는다. 더구나, 얻어진 구조물은 링커 없이는 구조물보다 더욱 면역원성일 것으로 기대되지 않는다. 테트라넥틴에 기초한 링커는 성분 X가 TTSE를 포함할 경우 특히 바람직하다.

피브로넥틴에 기초한 링커 ( Fibronectin based linker ):

이 링커는 인간의 피브로넥틴으로부터의 연결 스트랜드 3으로부터 서브-서열로서 선택될 수 있으며, 이것은 아미노산 잔기 1992-2102 (SWISS-PROT 넘버링, 엔트리 P02751)에 해당한다. 바람직하게는 서열: PGTSGQQPSVGQQ을 커버하는 아미노산 잔기 2037-2049를 사용하는 것이 좋으며, 이 서열 내에서 아미노산 잔기 2038-2042에 해당하는 GTSGQ 세그먼트가 특히 바람직하다. 이 구조물은 단백질 가수분해에 의해 절단되는 경향이 그다지 높지 않은 것으로 알려져 있어서 혈장 중에 피브로넥틴이 고농도로 존재한다는 사실을 감안하면 면역원성이 매우 높을 것으로 기대되지 않는다.

인간의 IgG ₃ 상부 힌지에 기초한 링커 ( Human IgG ₃ upper hinge based liker)

쥐의 IgG₃의 상부 힌지 대역으로부터 유래된 10개의 아미노산 잔기인 PKPSTPPGSS는 코일된 코일을 통한 다이머화된 항체의 생산에 있어서 이용되어 왔으며 (Pack P. and Pluckthun, A. Biochemistry 31, pp 1579-1584 (1992)), 본 발명에 따른 스페이서 펩타이드로서 유용할 수 있다. 인간의 IgG₃ 상부 힌지 대역으로부터의 대응하는 서열은 더욱 바람직할 것이다. 인간의 IgG₃로부터의 서열은 인간에서 면역원성을 일으키지는 않을 것으로 기대된다.

신축성 링커 ( Flexible linkers )

신축성 링커/스페이서 서열의 가능한 예로는 SGGTSGSTSGTGST, AGSSTGSSTGPGSTT 또는 GGSGGAP를 들 수 있다. 이 서열들은 고안된 코일된 코일을 다른 단백질 도메인에 연결시키는데 이용되어 왔다 (Muller, K.M., Arndt, K. M. and Alber, T., Meth. Enzymology, 328, pp 261-281).

결합

구조물의 두 성분은 공유 결합에 의해 서로 연결될 수 있다. 이러한 결합은 apo-A 성분의 C 또는 N 말단 아미노산과 성분 X 간에 형성될 수 있다. 이 성분들은 또한 두개 이상의 공유 결합을 통해서도 연결될 수 있다. 성분들 간의 공유 결합은 또한 S-S 다리, 바람직하게는 시스테인 잔기간의 결합을 포함할 수도 있다. 이러한 시스테인 잔기는 apo-A 성분의 C 말단 또는 N 말단 및 성분 X의 말단 또는 내부에 위치한다.

탄수화물

구조물의 다른 성분들과 관계없이 본 발명에 따른 구조물은 탄수화물 부분을 포함할 수 있다.

테트라넥틴 트라이머화 구조 요소 ( TTSE )

본 발명의 특히 바람직한 한가지 구체예는 아포리포단백질 또는 그의 유사체를 테트라넥틴의 트라이머화 모듈과 트라이머화 또는 부분적으로 트라이머화 시키는 것이다.

이 기술은 본 명세서에 참고 삽입된, WO 98/56906 (THOGERSEN 외)에 설명되어 있다. 트라이머 폴리펩타이드는 적어도 하나의 이종 부분에 공유결합되어 있는 적어도 하나의 테트라넥틴 트라이머화 구조 요소 (TTSE:tetranectin trimerising structural element)를 포함하는 모노머 포리펩타이드 구조물로서 제작된다. 이 테트라넥틴 트라이머화 구조 요소는 2개의 다른 테트라넥틴 트라이머화 구조 요소와 함께 안정한 복합체를 형성할 수 있다.

본 명세서에서 "트라이머화 구조 요소 (TTSE)"라는 용어는 테트라넥틴 폴리펩타이드 (SEQ ID NO 12) 모노머들 간의 트라이머화에 책임이 있는 테트라넥틴 패밀리의 폴리펩타이드 분자 부분을 가리키는 것이다. 이 용어는 또한 자연발생적인 테트라넥틴 패밀리 멤버의 TTSE의 변이체들도 포괄하는 것으로 여기서 변이체란 천연의 테트라넥틴 패밀러 멤버 분자의 트라이머화 특성에 비해 그 트라이머화 특성에 실질적에 하등 영향을 미침이 없이, 아미노산이 변형된 것을 의미한다.

이러한 변이체의 특별한 예를 이하에 설명할 것이나, TTSE가 인간의 테트라넥틴, 쥐의 테트라넥틴, 인간 또는 소의 연골의 C-형 렉틴 또는 상어 연골의 C-형 연골로부터 유래되는 것이 바람직하다. 인간의 테트라넥틴으로부터 유래된 TTSE를 한가지 이상 포함하는 모노머 폴리펩타이드 구조물이 특히 바람직하다.

테트라넥틴의 엑손 1 및 2에 의해 코딩된 51개 잔기의 폴리펩타이드 서열 (도 3, SEQ ID NO 12)은 다른 공지의 폴리펩타이드 서열에 대한 유의적인 서열 상동성이 수립된 바 없기 때문에, 단백질의 테트라넥틴 그룹 (도 4)에 특이적인 것으로 보인다. 테트라넥틴의 구조에 대한 실험적 조사를 위해, 완전한 테트라넥틴, CRD 도메인 (엑손 3에 의해 코딩된 폴리펩타이드에 대체로 대응함), 엑손 2+3에 의해 코딩된 폴리펩타이드에 대응하는 산물, 엑손 1+2에 대응하는 산물을 포함하는, 재조합 단백질 콜렉션이 제작되었다 (Holtet 외, 1996). 테트라넥틴은 실제로는 트라이머이지만, 엑손 2 코딩 폴리펩타이드는, 엑손 2+3에 대응하는 재조합 단백질이 실제로 용액 중에서 트라이머로 관찰된 사실이 입증해주는 바와 같이, 사실상 그 자체로 트라이머화를 수행할 수 있다.

완전한 길이의 재조합 테트라넥틴 결정의 3차원 구조 분석 (Nielsen외, 1996; Nielsen, 1996; Larsen 외, 1996; Kastrup, 1996) 결과, 엑손 2에 코딩된 폴리펩타이드와 엑손 3에 코딩된 3개의 잔기가 3중의 알파 헬리칼 코일된 코일 구조를 형성하는 것으로 나타났다.

서열 및 구조 데이타의 조합으로부터 보면, 테트라넥틴에서의 트라이머화는 엑손 2에 의해 코딩된 아미노산 잔기 및 엑손 3의 처음 3 잔기를 포함하는 구조 요소 (도 4)에 의해 평범하지 않는 헵타드 반복 서열에 의해 발생하는 것이 분명해지며, ㅏ테트라넥틴과 이 그룹의 다른 멤버들에 특이적인 것이다. 이 아미노산 서열 (도 4)는 다른 알파 헬리칼 코일된 코일이 그러하듯 a 및 d 위치에서의 소수성 잔기들과의 헵타드 반복 (abcdefg)의 두 복제물에 의해 특징지어진다. 이 2개의 펩타드 반복체 다음에는 순차적으로 헵타드 반복체의 독특한 세번째 복제물 (여기서 글루타민 44와 글루타민 47은 a 및 d 위치 모두에서 소수성 잔기를 치환할 뿐만 아니라 3중 알파 헬리칼 코일된 코일 구조의 형성에 직접 관여함)이 위치한다. 이들 헵타드 반복체들은 각각 a 및 d 위치에서의 소수성 잔기와의 2개의 절반-반복체 (half-repeats)에 의해 부가적으로 플랭킹된다.

알파 헬리칼 코일된 코일 중 a 또는 d 위치에 베타-가지달린 소수성 잔기가 존재함으로써 올리고머화 상태에 영향을 미친다는 것이 알려져 있다. 테트라넥틴 구조 요소에서 오직 한개의 보존된 발린 (37번)만이 존재한다. 테트라넥틴의 서열 위치 29에서는 어떠한 특정 지방족 잔기도 선호되는 것으로 나타나지는 않는다.

요약하면, 테트라넥틴의 3중 스트랜드 코일된 코일 구조는 공지의 코일된 코일 단백질 그룹의 특징으로 미루어 볼때 예기치못한 상호반응에 의해 크게 좌우되는 것이 명백하다.

TTSE는 놀랍게도 안정한 트라이머 분자를 형성한다. (1) 재조합 단백질의 실질적 부분이 올리고머 상태로 존재하며 70℃에서조차 트라이머 분자로서 가교할 수 있다는 관찰 및 (2) 서로 다른 트라이머간의 모노머의 교환은 상승된 온도에 노출된 후에야 비로소 검색될 수 있다는 관찰은 테트라넥틴 트라이머화 구조 요소가 극히 안정하다는 증가이다. 이러한 특성은 구조 요소의 아미노산 서열에서 반영될 것이 틀림없다. 특히, 헵타드 반복체의 순차적인 어레이 중에서 글루타민 함유 반복체의 존재와 위치는, 콘센서스 서열 (도 4)에서의 다른 보존적 잔기의 상대적인 위치 및 존재와 함께, 이들 안정한 트라이머 분자의 형성에 있어서 중요한 것으로 여겨진다. 대부분 실질적인 용도에 있어서, 시스테인 잔기 50은 이 서열을 생산하는 폴리펩타이드 산물의 조절되지 않는 멀티머화, 응집 및 침전을 결과시킬 수도 있는, 원치 않는 사슬간 디설파이드 결합의 형성을 피하기 위해, 세린, 쓰레오닌, 메티오닌 또는 다른 아미노산 잔기로 돌연변이되어야만 한다.

특히 트라이머-안정화 엑손 1 코딩된 폴리펩타이드와 연관하여, 테트라넥틴 트라이머화 구조 요소는 한쪽 또는 양쪽 모두의 말단에서 다른 단백질에 펩타이드 결합에 의해 부착되던 되지 않던, 고도로 안정한 호모트라이머 복합체를 생산하는그 구조적 인테그리티 및 성향을 유지하는, 진정한 자율적인 폴리펩타이드 모듈이다.

이 독특한 특성은 이종 단백질로부터 유도된 폴리펩타이드 서열이 융합 단백질로서 테트라넥틴 트라이머화 구조 요소에 합쳐진 경우 쉽게 트라이머화될 수 있다. 이것은 이종 폴리펩타이드 서열이 하나의 특별한 폴리펩타이드 서열 또는 기능적 실체물 (entities)의 6개 가지의 복제물을 함유하는 하나의 분자 어셈블리의 형성 또는 각각 그의 개개의 기능적 특성에 기여하는, 6개 까지의 서로 다른 폴리펩타이드 서열을 함유하는 하나의 분자 어셈블리를 가능케 하는, 트라이머화 요소에 아미노-말단적으로 또는 카르복시-말단 적으로 위치하는지와 관계없이 가치를 지닌다.

자연발생적인 인간의 테트라넥틴의 3개의 TTSE가 3중 알파 헬리칼 코일된 코일을 형성하기 때문에, 본 발명의 TTSE에 의해 형성된 안정한 복합체 역시 3중의 알파 헬리칼 코일된 코일을 형성하는 것이 바람직하다.

"테트라넥틴 패밀리 (tetranectin family)"라 함은 도 4에 도시된 콘센서스 서열, 또는 이 콘센서스 서열과 서열 수준에서 상동적인 서열을 공유하는 폴리펩타이드들을 말한다.

따라서, 도 4에 도시된 콘센서스 서열과 적어도 68%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 본 발명의 모노머 폴리펩타이드 구조물이 바람직하며, 이보다 높은 서열 동일성, 예컨대 적어도 75%, 적어도 81%, 및 적어도 92%의 동일성을 가지면 더욱 바람직하다.

Tip A-모듈

본 발명에 따른 발현 플라스미드에 있어서, 설명한 바와 같이 Cys 50을 Ser로 치환하고 C-말단 라이신 잔기에 포함시킴으로써 TTSE 모듈 (SEQ ID NO 12)을 변형시켰다. SPGT 서열을 N-말단에 부가하였다. 이것은 트라이머화 모듈에 대한 연결 서열이다. 이것은 DNA 스트랜드가 Bgl II 및 Kpn K에 의해 절단될 기회를 제공하므로 이 서열을삽입시켰다. 연결 GS 서열을 C-말단에 부가하여 Bam HI으로 절단될 기회를 제공한다. 이 변형된 TTSE를 TipA라 명명하고 SEQ ID NO 13에 개시하였다. Apo A 구조물의 트라이머화 모듈은 따라서 이 서열이나 또는, SEQ ID NO 13의 서열과 적어도 68%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는, 더 높은 서열 동일성, 예컨대 적어도 75%, 적어도 81%, 적어도 87%, 적어도 92%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

Trip A 모듈을 포함하는 구조물의 특정 예를 다음에 예시한다.

본 발명에 따른 구조물의 예

본 발명은 첨부된 실시예에 개시된 특정 서열 SEQ ID NO 2 내지 11 및 SEQ ID NO 14를 포함한다. 바람직하게는 본 발명이 SEQ ID NO 3 내지 11 및 SEQ ID NO 14를 포괄하는 것이 좋다. 이들 서열과 적어도 60%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열들 역시 본 발명의 범주 내에 속하며, 바람직하게는 적어도 80%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%의 서열 동일성을 공유하는 서열이 좋다.

단백질 구조물의 제조

단백질 구조물의 펩타이드 성분을 제조하기 위해 이 부분을 코딩하는 cDNA를 발현 벡터 내로 삽입하여 숙주 세포 내로 형질전환시킨다.

상기 숙주 세포 (본 발명의 일부이기도 함)는, 본 발명의 모노머 폴리펩타이드 구조물의 폴리펩타이드 부분을 코딩하는 핵산 단편 (대개 DNA 단편)을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포를 이 벡터로 형질전환시킨 다음, 이 숙주 세포를, 모노머 폴리펩타이드 구조물으 폴리펩타이드 부분이 발현되도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 전통적인 유전공학 기술을 이용함으로써 제조될 수 있다. 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 단편은 유도성 또는 구조적인 프로모터일 수 있는 적절한 프로모터의 조절 하에 위치될 수 있다.

발현 시스템에 따라, 폴리펩타이드를 숙주 세포의 세포질이나 세포외 상태 또는 페리플라즘으로부터 회수할 수 있다.

적절한 벡터 시스템과 숙주 세포는, 당업자가 입수할 수 있는 방대한 양의 관련 문헌과 자료로부터 증명되는 바와 같이, 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명은 또한 숙주 세포 및 벡터의 제조시 본 발명의 핵산 단편을 이용하는 것에도 관련되기 대문에, 다음에 본 발명의 이러한 측면을 실시하는데 특히 고려해야할 사항과 이러한 용도와 관련된 일반적인 사항들을 제시한다.

물론 일반적으로, 본 발명의 핵산 서열의 초기 클로닝 및 본 발명에서 유용한 벡터의 제작에는 원핵생물이 바람직하다. 예컨대, 다음에 더욱 상세히 설명되는 특정 균주에 더해, 예컨대, E. coli K12 균주 294 (ATCC No. 31446), E. coli B, 및 E. coli X 1776 (ATCC No. 31537)과 같은 균주들을 들 수 있다. 이러한 예는 어디까지나 설명 목적을 위한 것으로 본 발명을 이에 한정하려는 의도는 물론 없다.

원핵생물들은 또한 발현시키는데도 바람직한데, 이는 이들에 대해 효과적인 정제 및 단백질 리폴딩 (refolding) 전략을 세울수 있기 때문이다. 상술한 균주들 뿐만 아니라 E. coli W3110 (F-λ, 프로토트로픽, ATCC No. 273325), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실러스속, 또는 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurim)이나 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesand)과 같은 다른 엔테로박테리아, 및 여러가지 슈도모나스 종도 사용가능하다.

일반적으로, 숙주 세포와 양립가능한 (compatible)한 종으로부터 유래된 콘트롤 서열 및 레폴리콘을 함유하는 플라스미드 벡터를 이러한 숙주와 관련하여 사용한다. 벡터는 일반적으로 복제 위치, 및 형질전환된 세포에서 표현형을 선별할수 있게 해주는 마킹 서열을 지닌다. 예컨대, E. coli는 흔히, E. coli 종 (예컨대 Boliver 등, 1977 참조)으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322을 이용하여 형질전환된다. 이 pBR322 플라스미드는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하기 때문에 형질전환된 세포를 동정하는 간편한 수단을 제공해준다.

pBR 플라스미드나 다른 미생물 기원의 플라스미드 또는 파지들은 또한 이들 발현을 위해 이들 미생물이 이용할 수 있는 프로모터도 함유하여야만 한다.

재조합 DNA 제조 분야에서 가장 널리 쓰이는 프로모터에는 B-락타메이즈 (페니실리네이즈) 및 락토스 프로모터 시스템 (Chang 외, 1978; Itakura외, 1977; EPO 출원공개 No. 0036776)이 포함된다. 이들이 가장 널리 사용되기는 하지만, 다른 미생물성 프로모터들도 발견 및 사용되어 왔으며, 이들의 뉴클레오타이드 서열과 관련한 자세한 사항이 공개된 바 있으므로 당업자라면 이들을 플라스미드 벡터에 기능적으로 접합시킬 수 있다 (Siebwenlist 외, 1980). 원핵생물로부터의 특정 유전자들은 인공적인 수단에 의해 또 다른 프로모터를 부가시킬 필요없이, 그 자신의 프로모터 서열로부터 E. coli 내에서 효과적으로 발현될 수 있다.

원핵생물에 더해, 효모 배양체와 같은 진핵 미생물들도 이용가능하다. 다른 많은 균주들도 있지만, 그 중에서도 특히 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)나 일반적인 빵 효모들이 특히 널리 사용되는 진핵생물성 미생물이다. 사카로마이세스 중에서 발현시키는데는, 예컨대 플라스미드 YRp&이 일반적으로 사용된다 (Stinchcomb 외, 1979; Kingsman 외, 1979; Tschemper 외, 1980).

이 플라스미드는 예컨대 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1과 같이 트립토판에서 자랄 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커를 제공하는 trpl 유전자를 이미 함유한다 (Jones, 1977). 효소 숙주 세포에 특징적인 trpl 병변 (lesion)이 존재하면 트립토판 부재시 성장에 의해형질전환을 검색할 수 있는 효과적인 환경이 제공된다.

효모 벡터 중에서의 적절한 프로모팅 서열에는 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzman 외, 1980)에 대한 프로모터나, 예컨대 에놀라제, 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 다른 당단백질 분해 효소 (Hess 외, 1968; Holland 외, 1978)에 대한 프로모터가 포함된다. 적절한 발현 플라스미드를 제작하는데 있어, 이들 유전자와 연관된 종결 서열들도 발현시키고자 하는 서열의 발현 벡터 3'에 접합시켜 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공할 수 있다.

배양 조건에 의해 제어되는 전사의 부가적인 유리점을 갖는 다른 프로모터들은 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련 있는 분해성 효소, 및 상기한 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용성에 책임이 있는 효소들에 대한 프로모터 대역이다. 효모와 양립가능한 프로모터, 복제 오리진 및 종결 서열을 함유하는 플라스미드 벡터이면 어느 것이든 적합하다.

미생물에 더해, 다세포 생명체로부터 유래된 세포 배양체도 숙주로서 사용될 수 있다. 이론상, 척추동물 기원의 배양체건 무척추동물 기원의 배양체건간에, 이러한 여하한 세포 배양체는 모두 실시가능하다. 그러나, 척추동물의 세포가 가장 크게 주목되어 왔으며, 척추동물 배양체 (조직 배양체)의 확산은 일반적인 절차가 되어버렸다 (Tissue Culture, 1973). 이러한 유요한 숙주세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293 및 MDCK 세포주를 들 수 있다.

이러한 세포를 위한 발현 벡터들은 (필요한 경우) 복제 오리진, 발현시키고자 하는 유전자 전방에 위치한 프로모터, 여하한 모든 리보좀 결합 자리, RNA 스플라이스 자리, 폴리아데닐화 자리, 및 전사 종결 서열을 포함한다.

포유류 세포에서 사용되기 위해, 발현 벡터 상의 콘트롤 기능이 종종 바이러스성 물질에 의해 제공된다. 예컨대, 흔히 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 및 가장 흔하게는 Simian Virus 40 (SV40)으로부터 유래된다. SV40 바이러스의 초기 및 말기 프로모터가 특히 유용한데, 이는 이들 두가지 모두 SV40 바이러스 복제 오리진도 함유하는 단편으로서 이 바이러스로부터 쉽게 얻을 수 있기 때문이다 (Fiers 외, 1978). 바이러스 복제 오리진 내에 위치하는 HindIII 자리로부터 Bgl I 자리로 뻗어있는 대략 250 bp 서열이 포함되어 있기만 하다면, 더 작거나 더 큰 SV 40 단편도 이용가능하다. 또한, 이러한 콘트롤 서열이 숙주 세포 시스템과 양립가능하다면, 소망되는 유전자 서열과 일반적으로 결합된 프로모터 또는 콘트롤 서열을 이용하는 것도 가능하며 때로는 더 바람직하다.

복제 오리진은 SV 40이나 다른 바이러스 (예컨대 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)로부터 유래할 수 있는 것과 같은, 외래 오리진을 포함하는 벡터를 제작함으로써, 또는 숙주세포의 염색체 복제 메카니즘에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합될 경우, 종종 후자이면 충분하다.

폴리펩타이드 모노머 구조물이 생산되면, 폴리펩타이드에 비-단백질성 기능을 도입하거나, 이 물질을 적절한 리폴딩 조건에 처하게 하거나 (예컨대 WO 94/18227호에서 제시된 바와 같은 일반적으로 적용가능한 전략을 이용함으로써), 또는 모노머의 바람직하지 못한 펩타이드 부분을 절단시켜버림으로써 (예컨대 최종 산물 중에서 원치 않는 펩타이드 단편을 증강시키는 발현) 폴리펩타이드를 추가로 가공하는 것이 필요할 수 있다.

숙주 세포 또는 세포주에서 본 발명에 따른 핵산을 지니고/또는 복제할 수 있는 벡터가 본 발명의 일부이듯, 상기 내용에 비추어 볼 때, 본 발명의 모노머 폴리펩타이드 구조물을 재조합적 방식으로 생산하는 방법 역시 본 발명의 일부이다. 본 발명에 따라, 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 미니크로모좀 또는 파지일 수 있다. 특히 주목할 만한 것은 숙주에 도입된 후 숙주 세포/세포주 게놈에 통합되는 벡터이다.

본 발명의 또 다른 부분은 본 발명의 핵산 단편을 담지하고 복제할 수 있는 형질전환된 세포들이다 (상기 방법에 유용함); 이 숙주 세포는 ㅅ균, 효모 또는 프로토조아 유래의 것일 수 있으며, 또는, 곰팡이, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 포유류 세포와 같이 다세포 유기체로부터 유래하는 세포일 수도 있다. 특히 흥미로운 것은 세균 종인 에스케리치아 (Escherichia), 바실러스 (Bacillus), 및 살모넬라 (Salmonella)이며, 바람직한 세균은 E. coli이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 구조물의 폴리펩타이드 부분을 생산하는 안정한 세포주에 관한 것으로, 바람직하게는, 이 세포주가 본 발명의 핵산을 담지 및 발현하는 것이다.

리셉터 결합

*본 발명에 따른 구조물의 능력은 천연 아포리포단백질 A-I, A-II 또는 A-IV에 결합할 수 있는 리셉터 또는 HDL 단백질에 결합할 수 있는 이 구조물의 능력을 측정함으로써 분석할 수 있다. 이러한 리셉터 및 단백질들로는 큐빌린, 메갈린, 스캐빈져 리셉터 클래스 B 타잎 1 (SR-B1: Scavenger recepter class B type 1), ATP-결합 카세트 1 (ABC1: ATP-binding cassette 1), 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (LCAT: lecithin:cholestero acyltransferase), 콜레스테릴-에스테르 전달 단백질 (CETP: Cholesteryl-ester transfer protein), 인지질 전달 단백질 (PLTP; phospholipid transfer protein)을 들 수 있다. 큐빌린과 천연 아포리포단백질 AI간의 복합체의 해리 상수 Kd는 20 nM이다. 본 발명에 따른 아포리포단백질 A I 트라이머가 큐빌린에 더 강력하게 결합한다는 것이 실험적으로 측정된 바 있다 (도 12).

친화도 태그 ( Affinity tags )

본 발명에 따른 단백질 구조물은 또한 이 구조물의 정제시 사용되도록 친화도 태그를 포함할 수 있다. 이러한 태그는 폴리히스티딘 서열을 함유하는 것이 좋다. 이 서열은 Ni^{2 +} 컬럼 상에서 생성물의 정제에 유리하게 이용될 수 있는데, 이것은 폴리히스티딘 서열에 결합함으로써 전체 단백질에 결합하게 된다. 컬럼으로부터 용출된 후 폴리히스티딘 서열은 단백질 구조물과 폴리히스티딘 서열 간의 구조물 내에 만들어진 특정 서열을 인식하는 트롬빈과 같은 프로테이나제에 의해 절단되어 제거될 수 있다.

친화도 태그의 다른 예로는 항원성 태그 또는 GST 태그와 같은 잘 알려진 태그를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 태그와 태그를 절단하기 위한 구조물 사이에 단백질 분해 절단 부위를 삽입할 수 있다.

시그날 펩타이드

본 발명에 따른 구조물을 E. coli 또는 효모에서 발현시킬 경우, 발현된 단백질을 세포내에서 세포로부터 분리하는 번거로운 공정 대신, 세포 주변의 매질로부터 발현된 단백질을 분비시켜 수확할 수 있도록, 발현 구조물에 시그날 펩타이드를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 효모 및 E. coli에서의 발현을 위한, 본 발명에서 사용될수 있는 시그날 펩타이드의 특정 예는, 효모에서 Apo-AI 및 Apo-AIM을 발현시키기 위한 시그날 펩타이드를 설명하고 있는 WO 90/12879 (Sirtori 외), 및 E. coli에서 Apo-AI 및 Apo-AIM을 발현시키기 위한 시그날 펩타이드가 설명되어 있는 WO 94/13819 (Kabi Pharmacia)를 들 수 있다.

apo -A- TTSE 의 제조

아포리포단백질 부분과 TTSE를 포함하는 구조물을 제조하기 위해, 아포리포단백질 부분을 코딩하는 cDNA를 TTSE를 코딩하는 cDNA의 3' 말단과 5' 말단에 접합시킨다. 추가의 TTSE 유닛과 아포리포단백질 유닛을 더 많이 접합시킬 수도 있다. 효소 절단 부위를 코딩하는 서열을 TTSE를 코딩하는 서열의 3' 말단에 접합시킨 후 마지막으로 폴리히스티딘을 코딩하는 서열도 접합시킨다. 이것은 통상적인 PCR 기술에 의해 수행될 수 있다. 결합된 cDNA를 발현 벡터에 삽입하여 숙주 세포내로 형질전환시킨다.

E. coli에서 발현 후, 폴리히스티딘 서열을 이용하여 Ni2+ 컬럼 상에서 이종 단백질을 포획한다. 용출 후, 폴리히스티딘 테일 (tail)은 TTSE와 폴리히스티딘 서열 사이에 삽입된 특정 자리에서 이종 단백질을 절단하는 Fx와 같은 프로테이나제에 의해 제거될 수 있다. 얻어진 apo-A-TTSE 펩타이드는 이어서 다른 또는 동일한 apo-A-TTSE 펩타이드로 트라이머화됨으로써 더욱 수식될 수 있다. E. coli에서의 발현을 향상시키기 위해, 구조물을 후에 절단될 수 있는, 예컨대 유비퀴틴과의 융합 단백질로서 발현시키는 것이 유리할 수 있다.

약학적 조성물 제조를 위한 apo -A 구조물의 용도

약학적 조성물의 제조에 apo-A 구조물을 이용할 수도 있다. 이 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 어쥬번트, 첨가제, 예컨대 인지질, 콜레스테롤 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있다.

이 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 경피적, 폐속 (pulmonary), 피하, 피내, 경막내 (intrathecally)로, 또는 뺨, 항문, 질, 결막, 또는 비강내 조직을 통해, 또는 종양 조직과 같은 조직내로 접종하거나 또는 이식에 의해, 또는 경구적으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 조제는 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 이 기술은 약학적으로 허용되는 부형제, 어쥬번트 또는 인지질, 콜레스테롤 또는 트리글리세라이드와 같은 첨가제를 첨가하는 단계를 포함한다.

apo -A 구조물의 투여

본 발명에 따른 apo-A 구조물은 콜레스테롤, 인지질 및 트리글리세라이드와 관련된 질병, LDL 및 HDL 장애 예컨대 과콜레스테롤혈증, 및 동맥경화증성 질병, 예컨대 동맥경화증 및 심근경색을 예방 및/또는 치료하기 위해 투여될 수 있다. 그 밖의 다른 증상으로는 협심증, 플라크성 협심증, 불안정성 협심증, 예컨대 경동맥 협착, 파행(跛行), 또는 뇌동맥협착과 같은 동맥 협착을 들 수 있다. 또한, 아포리포단백질 구조물은 내독소를 제거하는데도 이용될 수 있다.

한가지 구체예에서, 이러한 투여는 약 0.5 g/L의 혈장 농도가 달성될 수 있도록 매주 이 구조물을 적어도 50 mg 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는 구조물을 주사, 좌약, 이식물 등을 통하는 것처럼 비경구적으로 투여하는 것이 좋다. 바람직하게는 조성물을 1주일에 적어도 50 mg의 아포리포단백질 구조물을 포함하는 양으로, 예컨대 적어도 100 mg/주일, 예컨대 적어도 250 mg/주일, 예컨대 적어도 500 mg/주일, 예컨대 적어도 750 mg/주일, 예컨대 적어도 1000 mg/주일, 예컨대 적어도 1250 mg/주일, 예컨대 적어도 1500 mg/주일, 예컨대 적어도 2000 mg/주일, 예컨대 적어도 2500 mg/주일, 예컨대 적어도 5000 mg/주일의 양으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 매일, 2일 또는 3일에 한번, 일주일에 한번, 2주일에 한번, 또는 3주일에 한번, 또는 4주일에 한번 행할 수 있다.

또 다른 구체예에서는, 이 구조물을 협심증 및 플라스성 협심증 또는 불안정한협심증의 신속한 치료를 위해 헐씬 많은 양으로 1회, 2회 또는 3회 투여한다. 이러한 투여는 1일, 2일 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일 또는 10일까지 실시할 수 있다. 이러한 양은 적어도 10 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 20 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 30 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 40 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 50 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 60 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 70 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 75 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 90 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 100 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 125 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 150 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 200 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 250 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 300 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 400 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 500 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 600 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 700 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 800 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 900 mg/kg 체중, 예컨대 적어도 1000 mg/kg 체중의 양일 수 있다.

본 발명의 구조물은 경구투여될 수도 있다. 이 투여경로의 경우, WO 99/46283, US 5,922,680, US 5,780,434 또는 US 5,591,433, US 5,609,871 또는 US 5,783,193호에 설명된 기술을 본 발명에 따른 단백질 구조물에 적용시킬 수 있다. 이러한 참고문헌은 본 명세서에 그 전체로 참고되었다.

세포 군락 ( cell population )

본 발명은 또한 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 유전자 치료법에 이용하는 것도 포함한다.

유전자를 마크로파지 군락에 옮긴 다음 치료를 요하는 환자에게로 옮긴다. 이렇게 함으로써, 마크로파지는 혈관 중에서 제한된 수명을 갖기 때문에 유전자의 일시적인 발현이 얻어진다.

영구적인 트랜스펙션은 간 세포를 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다.

이하에, 본 발명의 특정 구체예와 함께 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이들 실시예는 어디까지나 설명목적을 위한 것으로 본 발명의 범위가 아래 실시예로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 추가 구조물을 디자인 하는 것은 관련기술분야의 당업자나 실무자들의 일반적인 기술 수준 범위에 속한다.

실시예 1: Apo A-I의 클로닝

표준 PCR 기술을 이용하여 인간의 간 cDNA 라이브러리 (Clontech)로부터, Apo A-I을 코딩하는 cDNA를 증폭시켰다. Ubi-A-I의 제작을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같았다: 5'-CAC GGA TCC ATC GAG GGT AGG GGT GGA GAT GAA CCC CCC CAG AGC-3' 및 5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'. 이 산물을 Bam HI 및 Hind III 클로닝 자리를 이용하여 Ellgaard L. 외, Eur. J. Biochem. 1997; 244(2):544-51)에 설명된 바와 같이 pT7H6Ubi 벡터 내로 클로닝시켰다. Trip-A-A-I의 제작을 위해 사용된 프라이머는 5'-AAG GGA TCC GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC-3' 및 5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3' 이었다. 이 PCR 산물을 Bam HI 및 Hind III 클로닝 자리를 이용하여 WO 98/56906에 설명된 pT7H6tripa 벡터 내로 클로닝시켰다. Trip-A-I-del43의 제작을 위해 사용된 프라이머는 5'-AGG GGA TCC CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG G-3' 및 5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'이었다. 이 PCR 산물을 Bam HI 및 Hind III 클로닝 자리를 이용하여 WO 98/56906에 설명된 pT7H6tripa 벡터 내로 클로닝시켰다. Ubi-Cys-A-I의 제작을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같았다: 5'-GGT GGA TCC ATC GAG GGT AGG GGT GGA TGT GAT GAA CCC CCC C-3' 및 5'-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'. 이 산물을 Bam HI 및 Hind III 클로닝 자리를 이용하여 Ellgaard L. 외, Eur. J. Biochem. 1997; 244(2):544-51)에 설명된 바와 같이 pT7H6Ubi 벡터 내로 클로닝시켰다. 제조된 플라스미드를 도 4, 5, 6 및 7에 나타내었다.

실시예 2: E. coli 중에서 아포리포단백질 A-I ( apo A-I)의 발현

Ubi-A-I 및 Trip-A-I 뿐만 아니라 도면에 도시된 다른 구조물들은 E. coli AV-1 세포 (Stratagene Inc.)에서 쉽게 발현된다. 다른 세포주도 사용가능하다. 세포 배양 및 발현 유도는 WO 98/56906에 설명된 바와 같이 수행하였다.

실시예 3: 단백질의 분리 및 수식

WO 98/56906에 테트라넥틴에 대해 설명된 바와 같이 페놀 추출함으로써 분리하였다. 발현 배양체 6 리터로부터 재용해된 펠릿을 원심분리하여 용해되지 않은 물질을 분리한 다음 뱃치를 WO 98/56906에서 설명된 바와 같이 준비한 50 ml Ni^{2 +}-NTA-세파로스에 흡수시켰다. 컬럼 재료를 컬럼에 충전한 다음 500 ml 8M 유리아, 500 mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 8.0, 이어서 200 ml의 6M 구아니디늄-HCl, 50mM Tris-HCl pH 8.0 및 최종적으로 500 mM NaCl 300 ml, 50mM Tris-HCl pH 8.0으로 세정하였다. 단백질을 500 mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 8.0 및 10mM EDTA로 추출하였다. 단백질을 Factor Xa 0.5 mg와 혼합하고 실온에서 하룻밤 절단시켰다. 이 목적을 위해 트롬빈을 사용할 수도 있다. 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 완충액 중 단백질을 G-25 세파덱스 (Pharmacia) 컬럼상에서 겔여과시켰다. 단백질 용액을 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0에서 미리 세정한 Ni^{2 +}-NTA-세파로스 컬럼을 통해 통과시킨 다음 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0으로 세정함으로써 절단되지 않은 단백질을 제거하였다. 절단되지 않은 단백질을 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 및 10 mM EDTA로 용출시켰다. Sp 세파로스 이온 교환을 이용하여 추가 정제를 수행할 수 있다.

실시예 4: 단백질로부터 지질의 제거

단백질을 10 mM (NH4)2CO3 pH 8.8 용액으로 겔여과한 다음 동결건조시켰다. 동결건조된 단백질을 25 ml의 차가운 1:1 메탄올/클로로포름에 재현탁시키고 얼음에서 30분간 인큐베이션시킨 다음 3000 g에서 20분간 원심분리하였다. 펠릿을 25 ml의 차가운 1:2 메탄올/클로로포름에 재현탁시키고, 얼음에서 30분간 평형시킨 다음 다시 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 펠릿을 간단히 공기-건조시킨 다음 6M 구아니딘-HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0에서 밤새 재용해시켰다.

가교

멀티머화는 멀티머의 가교를 측정한 다음 분석적 SDS-PAGE를 수행함으로써 측정할 수 있다.

소망온도까지 30분간 평형화시킨 150 mM Na-보레이트 pH 9.0에 용해시킨 0.2 mg/ml 단백질 60 μl을 5 μl의 20 mg/ml 디메틸수베리미데이트에 첨가한 다음 소망온도에서 30분간 인큐베이션시킨다. 5 μl 3M Tris-HCl pH 9.0을 첨가함으로써 가교를 중단시켰다.

디메틸수베리미데이트는 라이신 잔기를 서로 단거리에 위치하도록 함으로써 공유 결합을 형성시킨다. 그 결과 멀티머를 형성한 단백질들이 서로 공유결합한다. 멀티머의 분자량은 후속적인 SDS-PAGE에 의해 평가할 수 있다.

가교산물을 8-16% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 지질과 같은 어쥬번트를 임의로 가교 혼합물에 포함시킬 수 있는데 이 경우 단백질을 어쥬번트와 예비-인큐베이션시켰다.

분석적 겔여과

멀티머화는 또한 분석적 겔여과에 의해 측정할 수도 있다.

*단백질을 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 완충액에 용해시킨 다음 실온, 0.25 ml/분의 유속에서 소망 완충액으로 Superdex 200 HR 10/30 컬럼상에서 겔여과시켰다. 표중 공정의 경우 완충액은 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0이었다.

도 13으로부터 Apo A-I이 약 14.5 및 16.5 mL에 중심을 둔 메인 피크인 복합체 피크로서 용출됨을 확인할 수 있다. 분자량이 68 kDa인 BSA는 약 14.5 ml에서 용출됨으로, 16.5 ml에서의 Apo A-I 피크가 모노머 Apo A-I에 해당하는 반면, 다른 메인 피크는 apo A-I 자기-결합 복합체에 대응함을 가리킨다. 트라이머화 도메인에 융합된 구조물은 모두 약 10.7 ml의 메인 피크와 14 ml의 마이너 피크에서 용출된다. 14 ml에서의 피크는 아마도 구조물의 트라이머화 형태에 대응할 것인 반면, 10.7 ml에서의 메인 피크는 고분자량 생성물에 해당한다. 이 생성물은 트라이머의 결합에 의해 형성되는 것으로 추정된다. 이것은 apo A-I이 트라이머화 도메인에 융합하는 것이 트라이머를 결과시킬 뿐만 아니라, 천연 apo A-I이 다른 Apo A-I 분자와 상호반응할 수 있는 것처럼, Apo A-I 유닛이 다른 apo A-I 유닛과 상호반응할 수 있는 대형 복합체 형성을 만들어냄을 가리킨다.

실시예 6: 단백질 구조물과 디미리스토일 포스파티딜콜린 ( DMPC )의 결합의 운동학

디미리스토일 포스파티딜콜린 (DPMC)에의 결합과 같은 공지 분석법을 이용함으로써 본 발명에 따른 구조물의 지질에 결합 능력을 간편하게 측정할 수 있다.

이 분석법은 Bergeron J. 외 (1997), Biochem. Biophys. Acta, 1344, 139-152에 설명된 바와 같이 수행하였다. 건조한 DPMC를 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 및 0.25 mM EDTA에, 0.5 mg/ml의 농도로 그의 전이 온도보다 높은 온도에서 현탁시켰다. 단백질 샘플, 완충액 및 DMPC 현탁액을 24 에서 10분간 인큐베이션한 다음, DMPC의 최종농도가 0.5 mg/ml, 단백질의 농도는 5.2 M (모노모의 농도)가 되도록 혼합하였다. 325 nm에서 혼합물의 흡광도를 측정하자 지질-단백질 결합 증가를 반영하는 혼합물의 탁도 감소가 관찰되었다. 이 분석은 apo AI, Trip-A-AI 및 Trip-A-FN-AI에 대해 4회, 단백질 첨가없이 1회 수행하였다.

도 11로부터, 모든 Apo A-I 구조물이 DMPC에 결합함을 볼 수 있다. 테스트에 참여한 세가지 구조물 모두 24시간이 지나자 탁도가 완전히 제거되어 맑아졌으며 이는, 융합 단백질의 DMPC에 대한 결합 능력이 융합 단백질에 존재함을 가리키는 것이다. 그러나, Trip-A-Apo A-I과 Trip-A-FN-Aop AI은 두가지 모두, 이 분석법이 기능하는 유일한 온도인 24℃ 에서 천연의 Apo A-I이 DMPC에 결합하는 것보다 느리게 결합하였다.

실시예 7: 유사체의 큐빌린에 대한 결합의 표면 플라즈몬 공명 분석

이 분석은 Kozyraki R, Fyfe J, Kristiansen M, Gerdes C, Jacobsen C, Cui S 등에 설명된 바와 같이 수행하였다. 고유 인자-비타민 B12 리셉터인 큐빌린은 고밀도 지질단백질의 엔도사이토시스를 용이하게 해주는 고-친화성 아포리포단백질 A-I이다. Nat Med 1999; 5(6): 656-661. 사용된 아포리포단백질 구조물의 농도는 0.5 M이었다. 결과 (도 12)는 Trip A-AI 및 apo A-I에 대해서만 나타나있다. Trip A-AI에 대해 관찰되 것과 유사한 결합이 TripA-FN-AI 및 TripA-TN-AI에서도 관찰되었다. 응답은 apo A-I의 트라이머화시, 특히 모노머와 비교해서 멀티머와 고정화된 표적간의 상호반응의 얻어진 "산염기도 (avidity)"에 기초한 오브-레이트 (of-rate)의 감소가 일어난 경우 특히 증가하였다 (다가의 보너스). apo A-I이 트라이머화 상태에서 큐빌린과 결합할 수 있는 것과, 두개 이상의 apo A-I이 큐빌린과 상호반응할 수 있는 배열에 있다는 것은 apo A-I 유닛이 트라이머화 구조물 내에서 정확한 폴딩을 하고 있다는 것을 가리키는 것이다.

실시예 8: 마우스에 있어서 아포리포단백질 A-I, TripA Apo -A-I 및 TripA 피브로넥틴-링커 Apo-A-I의 혈장 제거 평가

각각 5마리의 마우스로 이루어진 3 그룹에게 각각 apo A-I, Trip-A-AI 또는 Trip-A-FN-AI을 1 mg씩 주사하였다. 단백질을 다음 완충액에 0.33 mg/ml의 농도로 용해시켰다: 1 x PBS pH 7.4, 및 8.9 mg/ml 디팔미토일포스파티딜콜린. 주사 후 다음 시간대에서 각각의 마우스로부터 혈액샘플을 채혈하였다: 10분후, 4시간후, 24시간후 및 48시간 후.

아포리포단백질 A-I 및 유도체의 혈장 농도를 ELISA 분석법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다:

Nunc Immuno PolySorp 플레이트를 이용하였으며, 각각의 바이알을 매 첨가시마다 100 μl 첨가하였다. MB는 다음 완충액 조성에 해당한다: 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 10mM HEPES, 140 mM NaCl.

50 mM NaHCO₃ pH 9.6에 용해된 토끼로부터의 폴리클로날 항-인간 apo A-I (DAKO A/S) 4 μg/ml으로 플레이트를 하룻밤 동안 냉실에서 코팅하였다. MB+0.05% Tween-20 pH 7.8에서 플레이트를 세척하고 MB +0.05% Tween-20 +1% BSA pH 7.8에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 샘플을 MB + 0.05% Tween-20 + 1% BSA pH 7.8에 용해시킨 다음 1시간 인큐베이션시키고 MB + 0.05% Tween-20 + 1% BSA pH 7.8에서 1시간 동안 마우스로부터의 모노클로날 항-apo A-I (PerImmune Inc, 클론 10-A8)와 함께 MB + 0.05% Tween-20 + 1% BSA pH 7.8 1μg/ml의 농도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고 호스 래디쉬 퍼옥시다제에 연결된 2차 항-마우스 IgG 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 세척하고 OPD-태블릿 및 H₂O₂를 이용하여 디벨로핑시킨 후, 1M H₂SO₄를 이용하여 반응을 중단시켰다. 결과를 공지 농도의 apo A-I과 유도체에 기초한 표준결과와 각각 비교하였다. 마우스 혈장 중 Apo A-I의 희석 효과는 표준법에서 관찰되지 않았다.

도 14에 나타낸 결과는, 구조물 Trip A Apo A-I의 혈장 제거가 천연 Apo AI의 제거시간에 비해 적어도 3시간 증가됨을 나타낸다. 예비 데이터는 Trip A FN Apo A-I의 제거 시간이 Trip A Apo A-I과 적어도 같음을 가리킨다. 이러한 실험 데이터는 큐빌린 결합 데이터 및 DMPC 결합 데이터와 함께 본 발명에 따른 구조물이 본 출원에서 언급된 질환들을 치료할 강력한 후보가 될 수 있음을 문서화해주는 것이다.

실시예 9 플라스미드

본 발명에 따른 구조물은 후술하는 플라스미드를 이용하여 제조할 수 있다.

Trip -A-I으로의 링커 서열 삽입

즉, Apo A-I (및 링커 서열)의 PCR 증폭에 의해, 링커 없는 구조물의 경우처럼, 상술한 돌연변이와 함께 베이직 링커를 함유하는 구조물을 제작하여 pT7FxH6-Trip-A 플라스미드에 삽입하였다. 역방향 프라이머는 pT7H6FxTrip-A-AI의 구조물에 대해 사용한 것과 동일한 반면, 정방향 프라이머는 다음의 것을 사용하였다:

pT7H6FX-Trip-A-FN (-2)-AI :

5'-CGC GGATCC TCG GGT CAG GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC-3'

불행하게도 분리된 모든 클론들은 T로 돌인변이되는 상기 하이라이트처리된 G를 포함하였는데, 이는 프라이머의 서열이 잘못되었음을 가리키는 것이다.

pT7H6FX-Trip-A-TN-AI-Bam-S

5'-cgc gga tcc aag gtg cac atg aag gat gaa ccc ccc cag agc ccc-3'

상술한 돌연변이는 Stratagene 사의 QuickChange 키트와 다음의 프라이머 세트를 이용함으로써 자리-지향된 돌연변이에 의해 교정하였다.

pT7H6FX-Trip-FN-AI :

5'-acg gtc tcc ctg aag gga acc tcg ggt cag gat g-3'

5'-cat cct gac ccg agg ttc cct tca ggg aga ccg t-3'

pT7H6FX-Trip-A-TN-AI:

5'-acg gtc tcc ctg aag gga acc aag gtg cac atg aag g-3'

5'-cct tca tgt gca cct tgg ttc cct tca ggg aga ccg t-3'

Trip -A의 헤파린-결합 자리의 제거

이 구조물의 부가적인 유도로서, Trip-A 서열의 헤파린 결합 자리 (Lorentsen RH, Graversen JH 외, Biochemical Journal (2000), 347 pp 83-87)를, Stratagene사의 자리 지향 돌연변이 키트와 다음의 프라이머 세트를 이용하여 돌연변이시켰다:

Trip-A로부터의 라이신 9의 돌연변이:

5'-cca acc cag aag ccc aag gcg aat gta aat gcc-3'

5'-gtg ttc aca aca tct gcc ttg gca ttt aca atc-3'

Trip-A로부터의 라이신 15의 돌연변이:

5'-ggc att tac aat cgc ctt ggg ctt ctg ggt tgg-3'

5'-cca acc cag aag ccc aag gcg att gta aat gcc-3'

이러한 돌연변이는 관련있는 모든 Trip-A-apo-AI 유도체, 가능하게는 이들 모두에 대해 수행되도록 계획된다. trip-A 유도체의 이중 돌연변이 K9A, K15A를 생산하여 Trip-A-FN-AI-K9AK15A, TripA-TN-AI-K91K15A 및 TripA-AI-K91K15A로 명명하였다.

또한 N-말단의 트렁케이션 역시 트라이머화를 제거함이 없이 헤파린 친화성을 제거할 수 있었다. Holtet et al. Protein Science (1997), Lorentsen et al. Biochem. Journal (2000), Nielsen et al. FEBS (1997) and Nielsen et al Acta Cryst D. (2000) 참조. N-말단 잔기는 Val16과 Met22 사이에 위치하는 것이 바람직하다.

Hp - - AI 에 대한 발현 플라스미드의 제작

먼저 다음과 같이 플라스미드 pT7H6Fx-Hp (알파) (도 10H)를 제작하였다:

cDNA 라이브러리 (Clontech 태아 간)로부터 Hp-알파 서열을 다음의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시켰다:

넌센스 프라이머: 5'-cac aag ctt tcc get aga tct ctg cac tgg gtt age egg att ctt ggg-3'

센스 프라이머: 5'-ggt gga tcc ate gag ggt agg ggt gtg gac tca ggc aat gat gtc acg g-3'

PCR 산물은 유동 특성을 갖는다:

BamH I-자리-Hp 알파 서열 - BgI II 자리 - Hind III 자리.

Hp-알파 서열에서 HP의 베타-체인과의 시스테인 디설파이드 결합이 알라닌으로 돌연변이되었다.

이 생성물을 BamH I 및 HIn III로 절단하고 pT7H6FX 플라스미드 내로 삽입하여 서열을 결정하였다. pT7H6-Ubi-Fx-ApoAI 과 pT7H6Fx-TripAI을 만드는데도 이용되는 표준 넌센서 프라이머를 이용하여 인간의 Apo AI을 코딩하는 PCR 산물을 만들었다. 사용된 센스 프라이머는 pT7H6FX-TripA-AI의 제작시 사용된 센스 프라이머였다. PCR 산물에 다음 특징들을 부여하였다:

BamH I 자리 - Apo AI 서열 - Hind III 자리, 이 생성물을 BamH I 및 Hind III로 절단하여 Bgl II 및 HindIII로 절단시킨 상기 플라스미드 내로 삽입하였다/. 얻어진 플라스미드 pT7H6FX-Hp (alpha)-Apo AI의 서열을 분석하고 E. coli에서 발현 시험을 수행하였다.

pT7H6 TripA - apoAI(도 7):

이 플라스미드는 실시예 1에서와 같이 WO 98/56906에 설명된 플라스미드 pT7H6FxtripA를 포함한다.

발현은 T7 프로모터에 의해 좌우된다. 이 플라스미드는 또한 정제에 사용될 헥사-His 친화성 태그인 H6 서열을 포함한다. 그 후 Factor Xa 인식 서열 (IQGR)이 삽입된다

- SPGT는 후속적인 트라이머화 모듈에 대한 연결 서열이다. 이 서열은 Bgl II와 Kpan I로 DNA 스트랜드를 절단할 기회를 제공하기 때문에 합입되었다.

- Trip A는 테트라넥틴으로부터의 트라이머화 모듈이다.

GS는 Bam HI에 의한 절단 기회를 부여하는 또 다른 연결 서열이다.

마지막으로 이 플라스미드는 인간의 아포리포단백질 A-I으로부터의 아미노산 25-267를 코딩하는 인간 아포리포단백질 A-I cDNA를 포함한다. 발현되어 정제된 단백질은 SEQ ID NO 3에 해당한다.

pT7H6TripA - apoA1 - del43 (도 8):

이 플라스미드는 상기한 바와 같은 서열들을 포함하지만, 아포리포단백질 부분이 인간 아포리포단백질 A-I로부터의 아미노산 68-267을 코딩하는 cDNA로 대체되어 있다. 발현되어 정제된 단백질은 SEQ ID NO 4에 해당한다.

pT7H6UbiFxApoA (도 5):

이 베이직 플라스미드는 Ellgaard 등 (1997)에 설명된 바 있다.

이 플라스미드는 다음 서열들을 포함한다:

- 발현은 T7 프로모터에 의해 지배된다

- H6: 단백질 구조물의 정제를 위한 헥사- His 친화성 태그

- Ubi: E. coli에서 단백질을 안정화시키도록 삽입된 인간의 유비퀴틴을 코딩하는 cDNA.

- Fx: Factor Xa 에 대한 인식 서열

- Factor Xa에 의한 최적의 절단에 필요한, 2개의 Gly 잔기를 코딩하는 DNA

- Apo AI: 인간의 아포리포단백질 A-I으로부터의 아미노산 잔기 25-267을 코딩하는 cDNA

발현되어 정제된 단백질은 SEQ ID NO 1에 해당한다.

pT7H6UbiFXCysApoA (도 6):

상술한 바와 같이, 그러나 2개의 글라이신 단기를 코딩하는 서열 다음 및 시스테인 잔기를 코딩하는 아포리포단백질 A-I 서열 전에 삽입되었다. 발현되어 정제된 단백질은 SEQ ID NO 2에 해당한다.

pT7H6FXCysApoAI (도 9):

이 플라스미드는 다음 서열들을 포함한다:

- 발현은 T7 프로모터에 의해 지배된다.

- H6: 단백질 구조물의 정제를 위한 헥사- His 친화성 태그

- Fx: Factor Xa 에 대한 인식 서열

- Factor Xa에 의한 최적의 절단에 필요한, 2개의 Gly 잔기를 코딩하는 DNA

- 시스테인 잔기를 코딩하는 DNA

- Apo AI: 인간의 아포리포단백질 A-I으로부터의 아미노산 잔기 25-267을 코딩하는 cDNA

발현되어 정제된 단백질은 SEQ ID NO 2에 해당한다.

본 발명에 따른 아포리포단백질 구조물의 발현을 위한 추가적인 플라스미드의 예를, 첨부된 서열 목록에 개시된, 발현되어 정제된 단백질의 대응 아미노산 서열과 함께 도 10a 내지 g에 도시하였다.

참고문헌

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Asp Ala Leu Arg 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln <210> 2 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1) <223> N-Terminal Cys <220> <221> MISC FEATURE <222> (2)..(244) <223> Amino acid no 25 to 267 from human Apo A1 <400> 2 Cys Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala 1 5 10 15 Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser 20 25 30 Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu 35 40 45 Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln 50 55 60 Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr 65 70 75 80 Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala 85 90 95 Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu 100 105 110 Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln 115 120 125 Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro 130 135 140 Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu 145 150 155 160 Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala 165 170 175 Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu 180 185 190 Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala 195 200 205 Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu 210 215 220 Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys 225 230 235 240 Leu Asn Thr Gln <210> 3 <211> 301 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(58) <223> Trimerisation module from tetranectin <220> <221> MISC FEATURE <222> (59)..(301) <223> Mature Apo A1 <400> 3 Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn 1 5 10 15 Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln 35 40 45 Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Ser Asp Glu Pro Pro Gln Ser 50 55 60 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 65 70 75 80 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 85 90 95 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 100 105 110 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 115 120 125 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 130 135 140 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 145 150 155 160 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 165 170 175 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 180 185 190 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 195 200 205 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 210 215 220 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 225 230 235 240 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 245 250 255 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 260 265 270 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 275 280 285 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 290 295 300 <210> 4 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(58) <223> Trimerisation module from tetranectin <220> <221> MISC FEATURE <222> (59)..(258) <223> Amino acid 68-267 from human Apo A1 <400> 4 Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn 1 5 10 15 Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln 35 40 45 Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Ser Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 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MUTAGEN <222> (9) <220> <221> MUTAGEN <222> (15) <220> <221> MISC FEATURE <222> (59)..(301) <223> Apo-AI mature <400> 5 Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Ala Ile Val Asn 1 5 10 15 Ala Lys Ala Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln 35 40 45 Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Ser Asp Glu Pro Pro Gln Ser 50 55 60 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 65 70 75 80 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 85 90 95 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 100 105 110 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 115 120 125 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 130 135 140 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 145 150 155 160 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 165 170 175 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 180 185 190 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 195 200 205 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 210 215 220 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 225 230 235 240 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 245 250 255 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 260 265 270 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 275 280 285 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 290 295 300 <210> 6 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(58) <223> Trimerisation module from tetranectin <220> <221> MISC FEATURE <222> (59)..(61) <223> Linker <220> <221> MISC FEATURE <222> (62)..(304) <223> Mature Apo-Ai <400> 6 Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn 1 5 10 15 Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu 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Lys 245 250 255 Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu 260 265 270 Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val 275 280 285 Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 290 295 300 <210> 7 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(56) <223> Trimerisation module from tetranectin <220> <221> MISC FEATURE <222> (57)..(61) <223> Febronectin based linker <220> <221> MISC FEATURE <222> (62)..(304) <223> Mature Apo-AI <400> 7 Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn 1 5 10 15 Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln 35 40 45 Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Thr Ser Gly Gln Asp Glu Pro 50 55 60 Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val 65 70 75 80 Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp 100 105 110 Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val 115 120 125 Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg 130 135 140 Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro 145 150 155 160 Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr 165 170 175 Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg 180 185 190 Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu 195 200 205 Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu 210 215 220 Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu 225 230 235 240 Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys 245 250 255 Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu 260 265 270 Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val 275 280 285 Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 290 295 300 <210> 8 <211> 304 <212> PRT <213> Homo 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Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro 145 150 155 160 Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr 165 170 175 Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg 180 185 190 Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu 195 200 205 Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu 210 215 220 Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu 225 230 235 240 Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys 245 250 255 Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu 260 265 270 Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val 275 280 285 Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 290 295 300 <210> 9 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(58) <223> Trimerisation module from tetranectin <220> <221> MISC FEATURE <222> (59)..(63) <223> Linker <220> <221> DOMAIN <222> (64)..(306) <223> Mature Apo-AI <400> 9 Ser Pro Gly 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Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 210 215 220 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 225 230 235 240 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 245 250 255 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 260 265 270 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 275 280 285 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 290 295 300 Thr Gln 305 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(56) <223> Trimerisation module from tetranectin <220> <221> MISC FEATURE <222> (57)..(63) <223> Tetranectin based linker <220> <221> MISC FEATURE <222> (64)..(306) <223> Mature Apo-AI <400> 10 Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn 1 5 10 15 Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln 35 40 45 Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Asp 50 55 60 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 85 90 95 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 100 105 110 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 115 120 125 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 130 135 140 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 145 150 155 160 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 165 170 175 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 180 185 190 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 195 200 205 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 210 215 220 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 225 230 235 240 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 245 250 255 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 260 265 270 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 275 280 285 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 290 295 300 Thr Gln 305 <210> 11 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(56) <223> Trimerisation module from tetranectin <220> <221> MISC FEATURE <222> (57)..(63) <223> Tetranectin based linker <220> <221> MISC FEATURE <222> (64)..(306) <223> Mature Apo-AI <220> <221> MUTAGEN <222> (13) <220> <221> MUTAGEN <222> (19) <400> 11 Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Ala Ile Val Asn 1 5 10 15 Ala Lys Ala Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser 20 25 30 Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln 35 40 45 Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Asp 50 55 60 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 85 90 95 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu 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<222> (87)..(329) <223> Apo A-I <400> 14 Gly Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly Cys 1 5 10 15 Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg 20 25 30 Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val 35 40 45 Tyr Thr Leu Asn Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp 50 55 60 Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Val Ala Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala 65 70 75 80 Asn Pro Val Gln Arg Ser Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg 85 90 95 Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly 100 105 110 Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu 115 120 125 Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn 145 150 155 160 Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu 165 170 175 Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys 180 185 190 Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln 210 215 220 Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala 225 230 235 240 His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu 245 250 255 Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly 260 265 270 Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr 275 280 285 Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu 290 295 300 Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu 305 310 315 320 Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 325

Claims (105)

1. 다음 일반식을 가지는 아포리포단백질 구조물:
   apo-A-X
   - 여기서, apo-A는 도 1, 2aa, 2ab 또는 2b의 서열로 표시되는 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 AII, 아포리포단백질 AIV 중에서 선택된 아포리포단백질 성분이고,
   - 여기서, X는 서열번호 12의 아미노산 17-49를 포함하면서 서열번호 12의 아미노산 8-49와 92% 이상의 상동성을 가지며, 다른 테트라넥틴 트라이머화 모듈과 안정한 트라이머 복합체를 형성할 수 있는 테트라넥틴 트라이머화 모듈이고,
   여기서 상기 apo-A 성분과 X사이에 2 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 스페이서를 포함하고,
   여기서 이 구조물이 정확히 2개의 동일한 천연의 아포리포단백질로 구성된 경우에는 이들은 C-말단에서 N-말단으로 연결되어 있고,
   여기서 이 구조물은 야생형 아포리포단백질에 비해 증가된 혈장-반감기를 갖는다.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 스페이서가 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 60개의 아미노산, 적어도 70개의 아미노산, 적어도 80개의 아미노산, 적어도 90개의 아미노산, 또는 100개의 아미노산을 포함하는 것인 구조물.
3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 스페이서가 공유 결합을 통해 apo-A 성분과 X에 연결되어 있는 것인 구조물.
4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 스페이서가 본질적으로 비면역원성이거나, 단백질가수분해 절단되는 경향이 없거나, 또는 시스테인 잔기를 전혀 포함하지 않는 것인 구조물.
5. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 스페이서의 3차원 구조가 선형인 것인 구조물.
6. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 스페이서가 테트라넥틴으로부터의 아미노산 서열 GTKVHMK, 인간의 피브로넥틴으로부터의 연결 스트랜드 3으로부터의 아미노산 서열 PGTSGQQPSVGQQ 및 GTSGQ, 쥐의 IgG3의 상부 힌지 대역으로부터의 PKPSTPPGSS, SGGTSGSTSGTGST, AGSSTGSSTGPGSTT, 및 GGSGGAP으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 구조물.
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48. 제1항에서 정의된 구조물을 포함하는 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 플라크성 협심증, 불안정성 협심증 또는 동맥협착의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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94. 제1항에 정의된 아포리포단백질 구조물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
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97. 제94항의 핵산을 포함하는 벡터.
98. 제94항에서 정의된 핵산 서열을 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
99. 다음 단계를 포함하여 이루어지는, 제1항에서 정의된 아포리포단백질 구조물의 제조방법.
    - 제1항에 따른 단백질 구조물의 발현을 촉진시키는 조건 하에서, 형질전환된 숙주 세포를 배양하고,
    - 상기 단백질 구조물을 수득 및 회수한다.
100. 다음 단계를 포함하여 이루어지는, 제 1항에서 정의된 아포리포단백질 구조물의 제조방법:
     - 서열번호 12의 아미노산 17-49를 포함하면서 서열번호 12의 아미노산 8-49와 92% 이상의 상동성을 가지는 적어도 하나의 테트라넥틴 트라이머화 모듈을 화학적으로 합성한 후, 이어서
     - 상기 모듈을 적어도 하나의 아포리포단백질과 연결시키고,
     - 아포리포단백질 구조물을 얻은 후,
     - 얻어진 아포리포단백질 구조물을 분리한다.
101. 다음 단계를 포함하여 이루어지는, 제1항에서 정의된 아포리포단백질 구조물의 제조방법:
     - 핵산 단편에 의해 코딩된 아포리포단백질의 발현을 촉진시키는 조건 하에서, 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 이어서
     - 상기 아포리포단백질을 서열번호 12의 아미노산 17-49를 포함하면서 서열번호 12의 아미노산 8-49와 92% 이상의 상동성을 가지는 테트라넥틴 트라이머화 모듈에 공유적으로 연결시킨 다음,
     - 아포리포단백질 구조물을 얻고,
     - 얻어진 아포리포단백질 구조물을 분리한다.
102. 다음 단계를 포함하여 이루어지는, 제1항에서 정의된 아포리포단백질 구조물의 제조방법:
     - 핵산 단편에 의해 코딩된, 서열번호 12의 아미노산 17-49를 포함하면서 서열번호 12의 아미노산 8-49와 92% 이상의 상동성을 가지는 테트라넥틴 트라이머화 모듈의 발현을 촉진시키는 조건 하에서, 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 이어서
     - 상기 모듈을 적어도 하나의 아포리포단백질과 공유적으로 연결시킨 다음,
     - 아포리포단백질 구조물을 얻고,
     -얻어진 아포리포단백질 구조물을 분리한다.
103. 제94항에서 정의된 핵산 서열을 포함하는 유전자 치료법을 위한, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 플라크성 협심증, 불안정성 협심증 또는 동맥협착의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 적어도 하나의 세포 집단을 트랜스펙션 또는 감염시키는데 사용되는 조성물.
     
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