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KR101097547B1 - 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 - Google Patents

마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 Download PDF

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KR101097547B1
KR101097547B1 KR1020117006546A KR20117006546A KR101097547B1 KR 101097547 B1 KR101097547 B1 KR 101097547B1 KR 1020117006546 A KR1020117006546 A KR 1020117006546A KR 20117006546 A KR20117006546 A KR 20117006546A KR 101097547 B1 KR101097547 B1 KR 101097547B1
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KR
South Korea
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wild type
antibody
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치치 후앙
마이클 쥐. 쉐파드
수에메이 카오
가브리엘 지바르트
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화이자 프로덕츠 인크.
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Abstract

본 발명은 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 NS3 도메인에서의 돌연변이로 인해, 야생형 NS3에 대해 발생된 모노클로날 항체에 의한 인식은 상실되지만, 바이러스 RNA 복제 및 감염성 바이러스의 생성은 유지되는 소 바이러스성 설사 바이러스에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신을 생산하는데, 또는 예방접종된 동물과 감염되었거나 예방접종되지 않은 동물을 구별하는데 유용하다.

Description

마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신{MARKED BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS VACCINES}
본 발명은 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 NS3 도메인에서의 돌연변이로 인해, 야생형 NS3에 대해 발생된 모노클로날 항체에 의한 인식은 상실되지만, 바이러스 RNA 복제 및 감염성 바이러스의 생성은 유지되는 소 바이러스성 설사 바이러스에 관한 것이다.
소 바이러스성 설사 바이러스 (BVD 바이러스, 또는 BVDV)는 페스티바이러스(Pestivirus) 속, 플라비비리다에(Flaviviridae) 과의 소형 RNA 바이러스이다. 이는 양에서의 보더병(border disease) 및 돼지에서의 콜레라(classical swine fever)의 원인 물질인 바이러스에 밀접하게 관련된다. BVDV에 의해 야기되는 질환은 널리 퍼져있고, 경제적으로 파괴적일 수 있다. BVDV 감염으로 소에서 번식 문제가 초래될 수 있고, 유산 또는 조산이 야기될 수 있다. BVDV는 임신한 소의 태반을 교차할 수 있고, 결과적으로 지속적으로 감염된 (PI: persistently infected) 송아지가 태어날 수 있으며, 이는 바이러스에 대해 면역내성이고, 이의 나머지 일생 동안 지속적으로 바이러스혈증성이다 ([Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc. 152:763-768 (1968)]; [Ross, et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188:618-619 (1986)]). 감염된 소는 체온 상승, 설사, 기침 및 소화 점막의 궤양을 특징으로 하는 "점막 질환"을 또한 나타낼 수 있다 ([Olafson, et al., Cornell Vet. 36:205-213 (1946)]; [Ramsey, et al., North Am. Vet. 34:629-633 (1953)]). 이러한 지속적으로 감염된 동물들은 점막 질환의 추가적인 발발을 위한 무리 내에서의 바이러스의 전염에 대한 공급원을 공급하고 ([Liess, et al., Dtsch. Tieraerztl. Wschr. 81:481-487 (1974)]), 장 질환 또는 폐렴을 야기하는 것을 담당하는 미생물로의 감염에 대해 고도로 소인성이다 ([Barber, et al., Vet. Rec. 117:459-464 (1985)]).
BVD 바이러스는 2가지 생물형 중 하나로 분류된다. "cp" 생물형의 것들은 배양된 세포 상에서 세포변성 효과를 유도하는 반면, "ncp" 생물형의 바이러스는 이를 유도하지 않는다 ([Gillespie, et al., Cornell Vet. 50:73-79 (1960)]. 또한, 2가지 주요 유전자형 (제1형 및 제2형)이 인식되고, 양쪽 모두 다양한 임상 증후군을 야기하는 것으로 나타났다 ([Pellerin, et al., Virology 203:260-268 (1994)]; []Ridpath, et al., Virology 205:66-74 (1994)]). BVD 비리온은 직경이 40 내지 60 ㎚이다. BVDV의 뉴클레오캡시드는 RNA의 단일 분자 및 캡시드 단백질 C로 구성된다. 뉴클레오캡시드는 2개의 당단백질 E1 및 E2가 고정된 지질 막으로 둘러싸인다. 제3의 당단백질인 Erns는 외피와 느슨하게 회합된다. BVDV의 게놈은 길이가 약 12.5 kb이고, 5' 비-번역 영역 (NTR)과 3' 비-번역 영역 사이에 위치한 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다 ([Collett, et al., Virology 165:191-199 (1988)]). 약 438 kD의 다기능단백질(polyprotein)이 이러한 오픈 리딩 프레임으로부터 번역되고, 세포성 및 바이러스성 프로테아제(pretease)에 의해 11개 이상의 바이러스성 구조 및 비-구조 (NS) 단백질로 프로세싱된다 ([Tautz, et al., J. Virol. 71:5415-5422 (1997)]; [Xu, et al., J. Virol. 71:5312-5322 (1997)]; [Elbers, et al., J. Virol. 70:4131-4135 (1996)]; 및 [Wiskerchen, et al., Virology 184:341-350 (1991)]). BVDV의 게놈 순서는 p20/Npro, p14/C, gp48/Erns, gp25/E1, gp53/E2, p54/NS2, p80/NS3, p10/NS4A, p32/NS4B, p58/NS5A 및 p75/NS5B이다. P20/Npro ([Stark, et al., J. Virol. 67:7088-7093 (1993)]; [Wiskerchen, et al., Virol. 65:4508-4514 (1991)])는 자신을 나머지 합성된 다기능단백질로부터 절단하는 시스(cis)-작용성의 파파인-유사 프로테아제이다. p14로 또한 지칭되는 캡시드 단백질 (C)은 염기성 단백질이고, 게놈 RNA의 패키징 및 외피보유 비리온의 형성에서 기능한다. P14/C는 상이한 페스티바이러스들 간에 보존된다. gp48/Erns, gp25/E1 및 gp53/E2의 3가지 외피 단백질은 대량으로 글리코실화된다. Erns는 디술피드에 의해 공유결합으로 연결된 이종이량체를 형성한다. 소수성 막 고정 영역의 부재는 Erns가 외피와 느슨하게 회합된다는 것을 시사한다. Erns는 감염된 소에서 높은 항체 역가를 유도하지만, 항혈청은 바이러스-중화 활성이 제한된다. E1은 디술피드 결합을 통해 gp53/E2에 공유결합으로 연결된 비리온 내에서 발견된다. E1은 단백질을 막에 고정시키는데, 그리고 전위를 개시시키기 위한 신호 펩티드로서 작용하는 2개의 소수성 영역을 함유한다. E1은 감염된 소에서 현저한 항체 응답을 유도하지 않아, 이것이 비리온의 표면 상에 노출되지 않을 수 있다는 것을 시사한다. E1과 유사하게, E2 또한 이의 C-말단에 막 고정 영역을 갖는다. 그러나, E1과 다르게, E2는 매우 항원성이어서, BVDV의 가장 면역지배적인 단백질들 중 하나이다. E2에 결합하는 항체가 바이러스 감염을 효율적으로 중화시킬 수 있어, E2가 바이러스 진입에서 수반될 수 있다는 것을 시사한다. 구조 단백질 하류의 다기능단백질 영역은 비-구조 단백질을 코딩하고, 2개의 바이러스성 단백질분해 효소에 의해 프로세싱된다. NS2-NS3 이음부는 NS2 내에 코딩되는 아연-의존적 프로테아제에 의해 절단된다. NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B를 코딩하는 BVDV 다기능단백질의 C-말단 부분은 NS3의 N-말단 도메인에 의해 코딩되는 세린 프로테아제에 의해 프로세싱된다. NS3는, 감염된 소에서 이에 대한 강력한 체액 응답이 발달되기 때문에, 또다른 주요 BVDV 면역원이다. 반면에, BVDV-감염 소에서 다른 비-구조 단백질들에 대한 혈청 항체가 발견되지 않았고, 오직 NS4A에 대한 약한 체액 면역 응답만이 검출될 수 있었다.
NS3는 세포변성 BVDV 단리물에서만 발견되고, 이러한 단백질을 코딩하는 영역은, BVDV 아형들 및 기타 페스티바이러스들 간의 비교를 기초로, BVDV 게놈에서 가장 보존되는 것들 중 하나이다. NS3의 C-말단 부분은 RNA-의존적 NTP분해효소/헬리케이즈(helicase)를 코딩하고, 고도로 보존된 헬리케이즈 아미노산 모티프들의 서열 비교를 기초로, BVDV 헬리케이즈는 헬리케이즈 수퍼패밀리(superfamily)-2 (SF2)로 분류되었다. 이러한 수퍼패밀리 내에는, 돼지 콜레라 바이러스 NS3 헬리케이즈, 및 기타 플라비바이러스(flavivirus), 예컨대 웨스트 나일(West Nile 바이러스, 황색열 바이러스, C형 간염 바이러스 (HCV) 및 일본 뇌염 바이러스로부터의 RNA 헬리케이즈를 포함하여, 포티바이러스(potyvirus), 플라비바이러스, 및 페스티바이러스로부터의 유사한 단백질들이 있다. HCV NS3의 프로테아제 및 헬리케이즈 도메인의 분자 구조가 해석되었다 ([Yao, et al., Nat Struct Biol. 4:463-7 (1997)]; [Jin and Peterson, Arch Bioxchem Biophys 323:47-53 (1995)]). 프로테아제 도메인은 키모트립신 세린 프로테아제 패밀리의 구성원들 사이에서 공통으로 보이는 이중 β-배럴(barrel) 폴드(fold)를 함유한다. 헬리케이즈 도메인은 2개의 구조적으로 관련된 β-α-β 서브도메인, 및 헬리케이즈 α-나선형 서브도메인으로 일반적으로 지칭되는, 7개의 나선 및 3개의 짧은 β 가닥의 제3의 서브도메인을 함유한다. 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 및 RNA-결합 부위, 뿐만 아니라 헬리케이즈 활성 부위는 표면에 노출되는 반면, 프로테아제 활성 부위는 그렇지 않고, 헬리케이즈 도메인을 향해 배향된다. 프로테아제 및 헬리케이즈 도메인은 짧은 표면-노출 짧은 가닥에 의해 공유결합으로 연결되고, 넓은 표면 영역 (~900 Å2)에 걸쳐 상호작용한다. 그러나, 헬리케이즈 활성 부위는 이러한 상호작용 영역으로부터 멀리 배향된다.
현재 이용가능한 BVDV 백신 중에는, 화학적으로 불활성화된 야생형 바이러스를 함유하는 것들이 있다 ([McClurkin, et al., Arch. Virol. 58:119 (1978)]; [Fernelius, et al., Am. J. Vet. Res. 33:1421-1431 (1972)]; 및 [Kolar, et al., Am. J. Vet. Res. 33:1415-1420 (1972)]). 이러한 백신들은 전형적으로 다중 용량의 투여를 필요로 하고, 일시적인 면역 응답이 초래된다; 또한 이들은 바이러스의 태아 전파에 대해 보호하지 않는다 ([Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11:615-625 (1995)]). 양에서, 정제된 E2 단백질을 기초로 하는 서브유닛 백신이 보고되었다 ([Bruschke, et al., Vaccine 15:1940-1945 (1997)]). 이러한 백신이 태아를 감염되는 것으로부터 보호하는 것으로 여겨지지만, 바이러스의 상동성 균주에만 보호가 제한되고, 항체 역가와 보호 사이에 상관관계가 없다.
소 또는 돼지 세포에서의 반복된 계대 ([Coggins, et al., Cornell Vet. 51:539 (1961)]; 및 [Phillips, et al., Am. J. Vet. Res. 36:135 (1975)])에 의해 또는 바이러스 상에 온도-감응성 표현형을 부여하는 화학적으로 유도된 돌연변이 ([Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 45:2498 (1984)]; 및 [Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 47:557-561 (1986)])에 의해 약독화된 바이러스를 사용하여 변형 생(生) 바이러스 (MLV) BVDV 백신이 생산되었다. 단일 용량의 MLV BVDV 백신이 감염으로부터의 보호를 제공하는데 충분한 것으로 증명되었고, 예방접종된 소에서 수년 동안 면역 기간이 연장될 수 있었다 ([Coria, et al., Can. J. Con. Med. 42:239 (1978)]). 또한, MLV 백신을 사용하여 교차-보호가 보고되었다 ([Martin, et al., In "Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases", 75:183 (1994)]). 그러나, 안정성 고려사항 - 백신 균주의 태아 전파 포함 -이 이러한 변형 생 바이러스 백신의 사용에 관련된 주요 관심사이다 ([Bolin, Vet. Clin. NorthAm. Food Anim. Pract. 11:615-625 (1995)]).
상기를 기초로, BVDV의 확산을 제어하기 위한 새롭고 더욱 효과적인 백신이 요구된다는 것이 명백하다. 이같은 백신은 미래의 국가적 또는 지역적 BVDV 박멸 프로그램에서 매우 소중할 수 있고, 또한 다른 마킹된(marked) 소 백신과 조합될 수 있어, 축산업에서 실질적인 진보를 나타낸다. 이같은 백신은 "마킹된" 백신이다. 이같은 백신에는 야생형 바이러스에 존재하는 항원성 결정인자가 결여된다. 야생형 바이러스로 감염된 동물에서는 "마커" 면역원성 결정인자에 대한 면역 응답이 개시되는 반면, 감염되지 않은, 예방접종된 동물에서는, 마킹된 백신 내에 결정인자가 존재하지 않는 것의 결과로서, 이러한 면역 응답이 개시되지 않는다. 마커 결정인자에 대해 지시된 면역학적 분석법의 사용을 통해, 감염된 동물을 예방접종된, 감염되지 않은 동물로부터 구별해낼 수 있다. 감염된 동물을 추려냄으로써, 시간이 경과함에 따라 무리에 BVD가 없게 될 수 있다. BVD 질환의 위협을 제거하는 이점에 더하여, BVD가 없는 것으로 무리가 증명되는 것은 무역 경제 이점의 직접적인 특권을 갖는다.
발명의 개요
본 발명은 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 NS3 도메인에서의 돌연변이로 인해, 야생형 NS3에 대해 발생된 모노클로날 항체에 의한 인식은 상실되지만, 바이러스 RNA 복제 및 감염성 바이러스의 생성은 유지되는 소 바이러스성 설사 바이러스에 관한 것이다.
또한 본 발명은 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 NS3가 NS3에 대한 표준 모노클로날 항체, 예컨대, 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8; 및 24.8에 의해서는 인식되지 않지만, 바이러스 RNA 복제 및 감염성 바이러스의 생성은 유지되는 소 바이러스성 설사 바이러스를 포함하는 신규한 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신에 관한 것이다.
또한 본 발명은 동물이 예방접종되었는지, 또는 예방접종되지 않았거나 BVDV에 감염되었는지 여부를 결정하는 분석법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 NS3의 헬리케이즈 도메인에서의 돌연변이로 인해, 야생형 소 바이러스성 설사 바이러스로부터의 NS3에 대해 발생된 모노클로날 항체에 의한 인식은 상실되지만, 바이러스 RNA 복제 및 감염성 바이러스의 생성은 유지되는 소 바이러스성 설사 바이러스가 제공된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 NS3이, 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8; 및 24.8로 구성된 군으로부터 선택된 NS3에 대한 모노클로날 항체에 의해서는 인식되지 않지만, 바이러스 RNA 복제 및 감염성 바이러스의 생성은 유지되는 소 바이러스성 설사 바이러스가 제공된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 바이러스 백신은 단일 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 바이러스 백신은 IGR 루프(loop) 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1841에서 IGR 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1843에서 IGR 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1845에서 IGR 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 KHP 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1867에서 KHP 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1868에서 KHP 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1869에서 KHP 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 SES 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1939에서 SES 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1942에서 SES 루프 내의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 2개, 3개 또는 4개의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 2개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 IGR 루프 내의 2개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1843 및 1845에서 IGR 루프 내의 2개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 SES 루프 내의 2개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1939 및 1942에서 SES 루프 내의 2개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 3개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 KHP 루프 내의 3개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1867, 1868, 및 1869에서 KHP 루프 내의 3개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1845, 1868, 및 1939에서 IGR, KHP 및 SES 루프 내의 3개의 헬리케이즈 도메인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 특히 바람직한 실시양태에서, 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 NS3의 헬리케이즈 도메인에서의 돌연변이로 인해, 야생형 소 바이러스성 설사 바이러스로부터의 NS3에 대해 발생된 모노클로날 항체에 의한 인식은 상실되지만, 바이러스 RNA 복제 및 감염성 바이러스의 생성은 유지되는 소 바이러스성 설사 바이러스를 포함하는, 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신이 제공된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 설사 바이러스에 감염된 동물을 소 설사 바이러스 백신으로 예방접종된 동물로부터 구별하는 방법이 제공된다. 이러한 실시양태에서, 소 설사 바이러스 백신은 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하는 마킹된 백신이고, 방법은 하기의 단계들을 포함한다;
테스트 동물로부터 테스트 샘플을 수득하는 단계;
테스트 샘플 내의 소 설사 바이러스를 검출하는 단계; 및
소 설사 바이러스가 돌연변이를 함유하는지 여부를 결정하는 단계.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 소 설사 바이러스를 검출하는 방법은 1가지 이상의 모노클로날 항체를 사용하는 것을 이용한다.
바람직한 방법은 NS3의 헬리케이즈 도메인 내의 마킹된 백신 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함한다.
예를 들어, 이러한 구별 분석법의 실시양태는 하기의 단계들을 포함할 수 있다:
야생형 소 설사 바이러스를 검출할 수 있거나 또는 돌연변이된 소 설사 바이러스를 검출할 수 있는 표지된 항체를, 테스트 동물로부터의 체액을 함유하는 테스트 샘플에 첨가하는 단계; 및
야생형 소 설사 바이러스 또는 돌연변이된 소 설사 바이러스에 1가지 이상의 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 야생형 소 설사 바이러스 또는 돌연변이된 소 설사 바이러스에 대한 표지된 항체의 결합 친화력을 측정하는 단계; 및
야생형 BVDV 대 돌연변이된 NS3가 있는 BVDV에 대해 지시된 모노클로날 항체를 사용하여 결합 친화력의 결과를 비교함으로써 테스트 동물의 예방접종 상태를 결정하는 단계.
바람직한 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
돌연변이된 NS3 이외의 도메인에 대해 지시된 표지된 제1항체를 첨가하는 단계; 및
NS3의 돌연변이된 부분에 대해 지시된 표지된 제2항체를 첨가하는 단계.
이러한 방법의 한 실시양태에서, 제1항체는 야생형 바이러스에 대해 지시된다.
이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 제2항체는 NS3의 돌연변이된 부분에 대해 지시된다.
이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 제2항체는 NS3에 대해 지시되고, 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8; 및 24.8로 구성된 군으로부터 선택된다.
이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 제2항체는 IGR 루프, KHP 루프, 및 SES 루프로 구성된 군으로부터 선택된 NS3의 1개 이상의 돌연변이된 부분에 대해 지시된다.
이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 1841, 1843 및 1845로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 IGR 루프 내의 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함한다.
이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 1867, 1868 및 1869로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 KHP 루프 내의 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함한다.
이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 1939 및 1942로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 SES 루프 내의 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함한다.
이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 소 바이러스성 설사 바이러스는 아미노산 잔기 1845, 1868 및 1939에서 IGR 루프, KHP 루프 및 SES 루프 내의 1개 이상의 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함한다.
정의
하기의 정의들이 본 발명의 실시양태의 기술(記述)에서 사용된 용어들에 적용될 수 있다. 하기의 정의들은 거명에 의해 본원에 포함된 각각의 개별적인 참고문헌에 함유된 임의의 모순되는 정의를 대체한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 함께 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 수 있고, 복수 용어는 단수를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것들, 뿐만 아니라 추후에 변형되는 것들, 예를 들어, 히드록시프롤린, 카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체 (예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산 예컨대 α 및 α-2치환 아미노산, N-알킬아미노산, 락트산, 및 기타 비통상적인 아미노산이 또한 본 발명의 다기능펩티드의 적절한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사 아미노산 및 이미노산이 포함된다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 탄소를 갖는 화합물을 지칭한다. 대표적인 아미노산 유사체에는, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 및 메티오닌 메틸 술포늄이 포함된다. 이같은 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 필수 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학 화합물을 지칭한다.
아미노산은 이의 통상적으로 공지된 3문자 기호에 의해 또는 <IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission>에서 권장하는 1문자 기호로 본원에서 지칭될 수 있다.
아미노산 1문자 코드 3문자 코드 완전한 명칭
G
V
L
A
I
S
D
K
R
H
F
Y
T
C
M
E
W
P
N
Q
X		 Gly
Val
Leu
Ala
Ile
Ser
Asp
Lys
Arg
His
Phe
Tyr
Thr
Cys
Met
Glu
Trp
Pro
Asn
Gln
Xaa		 글리신
발린
류신
알라닌
이소류신
세린
아스파르트산
라이신
아르기닌
히스티딘
페닐알라닌
타이로신
트레오닌
시스테인
메티오닌
글루탐산
트립토판
프롤린
아스파라긴
글루타민
특정화되지 않은 아미노산
본원에서 사용된 용어 "동물 대상"은 BVDV 감염에 걸리기 쉬운 임의의 동물, 예컨대 소, 양 및 돼지를 포함하도록 의도된다. "치료" 또는 "예방접종"은 BVDV의 병독성 균주에 의한 감염 위험을 방지하거나 감소시키는 것, BVDV 감염의 증상을 완화시키는 것, 또는 BVDV 감염으로부터의 회복을 가속화시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 BVD "바이러스", "바이러스 단리물" 또는 "바이러스 균주"는 바이러스 게놈, 회합된 단백질, 및 기타 화학적 구성물 (예컨대 지질)로 구성된 BVD 바이러스를 지칭한다. 일반적으로, BVD 바이러스는 RNA 형태의 게놈을 갖는다. RNA는 클로닝에서의 사용을 위해 DNA로 역전사될 수 있다. 따라서, 핵산 및 BVD 바이러스 서열에 대해 본원에서 이루어진 언급은 바이러스 RNA 서열 및 바이러스 RNA 서열로부터 유래된 DNA 서열 모두를 포함한다. 편의를 위해, 하기의 서열 목록에서 도해된 BVD의 게놈 서열은 폴리펩티드 서열, 및 대표적인 돌연변이를 만드는데 사용된 프라이머 DNA 서열을 지칭한다. 각각에 대한 상응하는 RNA 서열은 당업자에게 쉽게 명백하다.
다수의 제I형 및 제II형 BVD 바이러스가 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, <American Type Culture Collection>을 통해 입수가능하다.
본원에서 사용된 용어 "보존적 아미노산 치환"은 측쇄가 관련된 아미노산들의 패밀리 내에서 일반적으로 일어나는 치환이다. 특히, 본원에서 사용된 보존적 아미노산 치환은 야생형에서 유래된 펩티드와 비교하여 소정의 펩티드의 항체 인식에 대한 효과가 없는 치환이다. 유전학적으로 코딩되는 아미노산은 하기의 4개의 군으로 일반적으로 분류된다: (1) 산성 = 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 전하를 띠지 않는 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 방향족 아미노산으로 또한 함께 분류된다.
따라서, 본원에서 사용된 용어 "비-보존적 아미노산 치환"은, 특히 항체 인식과 관련하여, 상이한 성질을 가질 수 있는 것들이다. 따라서, 비-보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 야생형에서 유래된 펩티드에 대해 발생된 항체에 의한 인식의 상실과 같은 차별적인 면역 응답을 일으킬 것이다.
본원에서 사용된 용어 "면역원성"은 제I형 또는 제II형 BVD 바이러스에 대해, 또는 제I형 및 제II형 BVD 바이러스 모두에 대해 동물에서 면역 응답을 유발하는 것에서의 돌연변이된 또는 야생형 BVD 바이러스의 능력을 의미한다. 면역 응답은 세포독성 T-세포에 의해 주로 매개되는 세포성 면역 응답, 또는 헬퍼 T-세포에 의해 주로 매개되고, 차례로 헬퍼 T-세포가 B-세포를 활성화시켜 항체 생산에 이르는 체액성 면역 응답일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "네이키드(naked) DNA"는 본 발명의 작용제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이의 생산을 제어하는 짧은 프로모터 영역과 함께 포함하는 플라스미드를 지칭한다. 이는 플라스미드가 어떠한 전달 비히클 내에도 담지되지 않기 때문에 "네이키드" DNA로 칭해진다. 이같은 DNA 플라스미드가 숙주 세포, 예컨대 진핵생물 세포 내로 진입하면, 이것이 코딩하는 단백질이 세포 내에서 전사 및 번역된다.
본원에서 사용된 용어 "플라스미드"는 발현가능한 유전자를 코딩하는 임의의 핵산을 지칭하고, 선형 또는 원형 핵산 및 이중 또는 단일 가닥 핵산을 포함한다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 변형된 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 메틸화 또는 보호기 또는 캡(cap)- 또는 꼬리 구조의 포함과 같은 수단에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "백신"은 감염 위험을 방지하거나 감소시키거나 또는 감염 증상을 완화시키는 조성물을 지칭한다. 병원체에 대한 백신 조성물의 보호 효과는 대상에서 면역 응답 (세포-매개 면역 응답 또는 체액성 면역 응답 또는 양쪽 모두의 조합)을 유도하는 것에 의해 보통 달성된다. 일반적으로, BVDV 감염의 폐지 또는 발병률 감소, 증상 완화, 또는 감염된 대상으로부터의 바이러스의 가속화된 제거가 백신 조성물의 보호 효과를 가리킨다. 본 발명의 백신 조성물은 BVD 바이러스에 의해 야기되는 감염에 대해 보호 효과를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 한 환경에서 또다른 환경으로의 핵산의 전달을 허용하거나 용이하게 하는 도구를 의미한다. 본 발명에 따라, 그리고 예를 들어, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 일부 벡터는 핵산, 예컨대 DNA의 절편 (예컨대 이종성 DNA 절편, 예를 들어, 이종성 cDNA 절편)이 핵산을 복제시키고/시키거나 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 발현시키려는 목적으로 숙주 또는 표적 세포 내로 전달되도록 한다. 재조합 DNA 기술에서 사용되는 벡터의 예로는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 및 바이러스가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
하기의 상세한 설명은 본 발명을 실행하는데 있어서 당업자를 돕기 위하여 제공된다. 그렇다 하더라도, 본 발명의 발견의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 본원에서 논의된 실시양태에서의 변형 및 변동이 당업자에 의해 이루어질 수 있기 때문에, 이러한 상세한 설명은 본 발명을 과도하게 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에서 인용된 각각의 참고문헌의 내용 (이러한 1차 참조문헌 내에 인용된 참조문헌의 내용 포함)은 거명에 의해 본원에 포함된다.
표준 절차를 사용하여 본 발명에서 유용한 플라스미드를 증식시키고 정제할 수 있다. 플라스미드 증식에 바람직한 원핵생물 숙주 세포는 대장균 GM2163 세포주이지만, 일부 다른 세포 유형이 또한 사용될 수 있다. 플라스미드로부터 전사된 RNA가 바이러스 생산을 지지할 수 있는 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 MDBK 세포 내로 형질감염에 의해 도입될 수 있다. 바이러스가 이같은 숙주 세포 내에서 생산될 수 있고, 공지된 분리 기술 예컨대 수크로스 구배 원심분리를 사용하여 고도로 정제된 형태로 숙주 세포로부터 단리될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 상기 기술된 돌연변이 BVD 바이러스 중 1가지 이상이 포함된 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 상기 기술된 바와 같은 돌연변이 BVD 바이러스의 단리된 게놈 핵 분자에 관한 것이다. 본원에서 사용된 핵산 분자는 RNA 및 DNA 모두를 포함한다.
이러한 실시양태에서, BVD 바이러스의 단리된 게놈 핵 분자는 NS3 도메인의 적어도 일부분이 헬리케이즈 도메인에서 돌연변이된 제I형 바이러스의 게놈 서열을 함유한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 BVD 바이러스의 게놈 핵산 서열이 혼입된 벡터를 제공한다. 이같은 벡터는, 대량의 게놈 핵산 분자의 생산을 위해 또는 자손 돌연변이 BVD 바이러스의 생산을 위해, 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 벡터 증식, 단리 및 서브클로닝을 용이하게 하기 위한 기타 서열 요소를 함유할 수 있다; 예를 들어, 박테리아 및 숙주 세포에서의 증식 및 선별을 허용하는 선별가능 마커 유전자 및 복제 기원. 특히 바람직한 본 발명의 벡터는 p15aDI이다 (도 5 참조).
본 발명의 또다른 실시양태는 본 발명의 돌연변이된 BVD 바이러스의 게놈 핵산 분자가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "숙주 세포"는 돌연변이된 BVD 바이러스의 게놈 핵산 분자 (바람직하게는 적합한 벡터에 의해 제공됨)로 형질전환된 임의의 원핵생물 세포를 포함한다. 본원에서 사용된 "숙주 세포"는 돌연변이된 BVD 바이러스로 감염되었거나 또는 돌연변이된 BVD 바이러스의 게놈 핵산 분자를 다른 방식으로 보유하는 임의의 진핵생물 세포를 또한 포함한다. 플라스미드 증식에 바람직한 원핵생물 숙주 세포는 대장균 GM2163 세포주이지만, 다른 세포 유형 또한 사용될 수 있다. 바람직한 진핵생물 숙주 세포에는 포유류 세포 예컨대 MDBK 세포 (ATCC CCL 22)가 포함된다. 그러나, 기타 배양 세포 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 이같은 숙주 세포에서 생산된 자손 바이러스를 추가로 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 바이러스는 면역원성 조성물에서 사용하기 전에 세포 배양에서의 연속 계대에 의해 또는 화학적 불활성화에 의해 약독화될 수 있다. 약독화 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 추가적인 활성 성분 예컨대 BVDV에 대한 또다른 면역원성 조성물, 예를 들어, 공동 계류 중인 미국 특허 출원 일련 번호 08/107,908, 미국 특허 번호 6,060,457, 미국 특허 번호 6,015,795, 미국 특허 번호 6,001,613, 및 미국 특허 번호 5,593,873 (이들 모두는 전체적으로 거명에 의해 포함됨)에 기술된 것들을 또한 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 1가지 이상의 수의학상 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "수의학상 허용가능한 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 보강제, 안정화제, 희석제, 방부제, 항균 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등이 포함된다. 희석제에는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장화제에는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토스가 특히 포함될 수 있다. 안정화제에는 알부민이 특히 포함된다. 보강제에는 RIBI 보강제 시스템 (Ribi inc.), 백반, 수산화알루미늄 젤, 수중유 에멀션, 유중수 에멀션, 예를 들어, 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보강제, 블록 공중합체 (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN® 보강제, 사포닌, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), 또는 기타 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘(Avridine) 지질-아민 보강제, 대장균으로부터의 열-불안정 장독소 (재조합 또는 기타 방식), 콜레라 독소, 또는 무라밀 디펩티드가 특히 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 면역원성 조성물은 1가지 이상의 기타 면역조절제, 예를 들어, 인터류킨, 인터페론 또는 기타 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 주사용 용도에 적절한 무균성 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 사용하여 동결건조된 형태로 제조될 수 있다. 동결건조된 면역원성 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되고, 보강제와 함께 또는 보강제 없이, 무균성 용액, 예를 들어, 염수 또는 및 HEPES에서 재구성될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 BVD 바이러스에 대한 면역 응답을 유도하기 위해 동물 대상에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 실시양태는 유효량의 상기 기술된 본 발명의 면역원성 조성물을 동물 대상에게 투여함으로써 BVD 바이러스에 대한 면역 응답을 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 동물 대상에게 투여하기 위한 바람직한 면역원성 조성물은 돌연변이된 BVD 바이러스를 포함한다. 돌연변이된 바이러스, 바람직하게는 화학적 불활성화 또는 연속 계대 배양에 의해 약독화된 바이러스를 함유하는 면역원성 조성물이 바람직하게는 비경구 경로를 통해 소에게 투여되지만, 기타 투여 경로, 예를 들어, 경구, 비내, 근육내, 림프절내, 피내, 복강내, 피하, 직장 또는 질 투여, 또는 경로들의 조합에 의한 투여 경로가 또한 사용될 수 있다.
당업계에 주지된 절차를 사용하여 면역화 프로토콜을 최적화할 수 있다. 단일 용량이 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 별법적으로 2회 이상의 접종이 2주 내지 10주의 간격으로 일어날 수 있다. 소에서 유도되는 면역 응답의 정도 및 성질을 다양한 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 접종된 동물로부터 혈청을 수집하여, BVD 바이러스에 특이적인 항체의 존재에 대해, 예를 들어, 통상적인 바이러스 중성화 분석법에서, 테스트할 수 있다. 림프 조직에서의 응답 CTL의 검출이 세포성 면역 응답의 유도를 가리키는 T 세포 증식과 같은 분석법에 의해 달성될 수 있다. 관련 기술이 당업계에, 예를 들어, [Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons Inc. (1994)]에 잘 기술되어 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 백신 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 1가지 이상의 상기 기술된 돌연변이된 BVD 바이러스를 유효량으로 포함한다. 정제된 돌연변이된 바이러스가 직접적으로 백신 조성물에서 사용될 수 있거나, 또는 돌연변이된 바이러스가 시험관내에서의 연속 계대 또는 화학적 불활성화에 의해 추가로 약독화될 수 있다. 전형적으로, 백신은 약 1×106 내지 약 1×108 개 사이의 바이러스 입자를 수의학상 허용가능한 담체와 함께 0.5 내지 5 ㎖ 사이의 부피로 함유한다. 보호 효과를 제공하는데 효과적인 백신 조성물 내의 바이러스의 정확한 양은 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다. 백신 조성물에서 사용하기에 적절한 수의학상 허용가능한 담체는 본원에서 상기 기술된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 돌연변이된 바이러스의 핵산 분자를 포함한다. BVD 바이러스 게놈의 전체 또는 일부를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자 모두 백신에서 사용될 수 있다. DNA 또는 RNA 분자는 "네이키드" 형태로 존재할 수 있거나, 또는 세포 흡수를 용이하게 하는 작용제 (예를 들어, 리포솜 또는 양이온성 지질)와 함께 투여될 수 있다. 전형적인 투여 경로는 약 0.1 내지 약 5 ㎖의 백신의 근육내 주사일 것이다. 백신 내의 전체 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 약 0.1 μ/㎖ 및 약 5.0 ㎎/㎖ 사이여야 한다. 폴리뉴클레오티드는 현탁액, 용액 또는 에멀션의 일부로 존재할 수 있지만, 수성 담체가 일반적으로 바람직하다. 핵산 (DNA 또는 mRNA)을 사용하는 백신 및 예방접종 절차는 당업계에, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,703,055, 미국 특허 번호 5,580,859, 미국 특허 번호 5,589,466 (이들 모두는 거명에 의해 본원에 포함됨)에 잘 기술되어 있다.
본 발명의 백신 조성물은 추가적인 활성 성분 예컨대 BVDV에 대한 또다른 백신 조성물, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,060,457, 미국 특허 번호 6,015,795, 미국 특허 번호 6,001,613, 및 미국 특허 번호 5,593,873에 기술된 것들을 또한 포함할 수 있다.
예방접종은 단일 접종에 의해 또는 다중 접종을 통해 달성될 수 있다. 원한다면, 접종된 동물로부터 혈청을 수집하여, BVD 바이러스에 대한 항체의 존재에 대해 테스트할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 본 발명의 백신 조성물은 BVDV 감염을 치료하는데 사용된다. 따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 돌연변이된 BVD 바이러스를 동물에게 투여함으로써 BDV 바이러스에 의해 야기된 동물 대상에서의 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
당업자는 유전자 조작된 바이러스가 투여 전에 약독화될 필요가 있는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 본 발명의 돌연변이된 바이러스는 추가적인 약독화 없이 동물 대상에게 직접 투여될 수 있다. 바이러스의 치료적 유효량은 사용된 특정 바이러스, 소의 상태 및/또는 감염 정도에 따라 변할 수 있고, 수의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법의 실행에서, 본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 비경구 경로를 통해 소에게 투여되지만, 기타 투여 경로, 예를 들어, 경구, 비내, 근육내, 림프절내, 피내, 복강내, 피하, 직장 또는 질 투여, 또는 경로들의 조합에 의한 투여 경로가 또한 사용될 수 있다. 부스팅(boosting) 요법이 필요할 수 있고, 투여량 처방계획은 최적의 면역화를 제공하도록 조정될 수 있다.
본 발명의 추가적인 양상은 동물 대상에 존재하는 BVD 바이러스의 기원으로서 이전 예방접종의 약독화된 바이러스를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 돌연변이 BVD 바이러스는 게놈 조성 및 발현된 단백질 모두에서 야생형 BVD 균주로부터 구별된다. 이같은 차이는 예방접종된 동물과 감염된 동물이 구별되도록 하고, 백신-관련 발병 혐의의 경우 BVDV의 확인을 허용한다. 예를 들어, 특정 실험실 테스트에서 BVDV에 대해 양성으로 테스트된 동물이 병독성 또는 병원성 BVD 바이러스를 보유하는지, 또는 예방접종을 통해 이전에 접종된 본 발명의 돌연변이 BVD 바이러스를 단순히 보유하는지 여부에 관한 결정이 이루어질 수 있다.
다양한 분석법이 결정을 이루는데 사용될 수 있다. 예를 들어, BVDV에 대해 양성으로 테스트된 동물 대상으로부터 바이러스를 단리할 수 있고, 핵산-기재 분석법을 사용하여, 이전의 예방접종에서 사용된 BVD 바이러스를 가리키는 돌연변이 BVD 바이러스 게놈의 존재를 결정할 수 있다. 핵산-기재 분석법에는 써던(Southern) 또는 노던(Northern) 블롯(blot) 분석, PCR, 및 서열분석이 포함된다. 별법적으로, 단백질-기재 분석법을 사용할 수 있다. 단백질-기재 분석법에서, 감염이 의심되는 세포 또는 조직을 BVDV에 대해 양성으로 테스트된 동물로부터 단리할 수 있다. 이같은 세포 또는 조직으로부터 세포 추출물을 만들 수 있고, 야생형 BVDV의 존재에 대립적으로, 이전에 접종된 돌연변이 바이러스의 존재를 구별하여 확인할 수 있는 바이러스 단백질에 대한 적합한 항체를 사용하여, 예를 들어, 웨스턴(Western) 블롯에 적용할 수 있다.
제형 및 투여
비경구 투여
본 발명의 화합물은 또한 혈류 내로, 근육 내로, 또는 내부 기관 내로 직접 투여될 수 있다. 적절한 비경구 투여 수단에는 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개골내, 근육내 및 피하 투여가 포함된다. 비경구 투여를 위한 적절한 장치에는 바늘 (미세바늘 포함) 주사기, 무침 주사기 및 주입 기술이 포함된다.
전형적으로 비경구 제형은 부형제 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 3 내지 9의 pH로 완충)를 함유할 수 있는 수성 용액이지만, 일부 용도에 대해서는, 무균성 비-수성 용액으로 또는 발열원이 없는 무균성 물과 같은 적절한 비히클과 함께 사용될 건조 형태로서 더욱 적절하게 제제화될 수 있다.
예를 들어, 동결건조에 의한, 무균성 조건 하에서의 비경구 제형의 제조는 당업자에게 주지된 표준 제약 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.
비경구 용액의 제조에서 사용된 화학식 I의 화합물의 용해도는 적합한 제제화 기술, 예컨대 용해도-증강제의 혼입을 사용함으로써 증가될 수 있다.
비경구 투여용 제형은 즉각 및/또는 변형 방출되도록 제제화될 수 있다. 변형 방출 제형은 지연 방출, 지속 방출, 펄스형 방출, 제어 방출, 표적화 방출 및 프로그래밍 방출을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 활성 화합물의 변형 방출을 제공하는 이식된 데포(depot)로서 투여하기 위한 요변성(thixotropic) 액체, 고체 또는 반고체로서 제제화될 수 있다. 이같은 제형의 예로는 약물-코팅 스텐트(stent) 및 폴리(dl-락트-코글리콜)산 (PGLA) 마이크로스피어가 포함된다.
국소 투여
본 발명의 화합물은 국소적으로 피부 또는 점막에 투여될 수 있고, 즉 진피 또는 경피 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위한 전형적인 제형에는 젤, 히드로젤, 로션, 용액, 크림, 연고, 살포 분말, 드레싱(dressing), 폼(foam), 필름, 피부 패치(patch), 웨이퍼(wafer), 이식물, 스폰지, 섬유질, 붕대 및 마이크로에멀션이 포함된다. 리포솜이 또한 사용될 수 있다. 전형적인 담체에는 알콜, 물, 미네랄 오일, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜이 포함된다. 투과 증강제가 혼입될 수 있다 - 예를 들어, [Transdermal Penetration Enhancers: Applications, Limitations, and Potential J. Pharm Sci, 88 (10), 955-958, Finnin and Morgan (October 1999)] 참조.
기타 국소 투여 수단에는 전기천공, 이온삼투요법, 음파영동, 초음파영동 및 미세바늘 또는 무침 (예를 들어 Powderject™, Bioject™ 등) 주사에 의한 전달이 포함된다.
국소 투여용 제형은 즉각 및/또는 변형 방출되도록 제제화될 수 있다. 변형 방출 제형은 지연 방출, 지속 방출, 펄스형 방출, 제어 방출, 표적화 방출 및 프로그래밍 방출을 포함한다.
흡입/ 비내 투여
또한 본 발명의 화합물은, 전형적으로, 적절한 추진제, 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판을 사용하는 또는 이를 사용하지 않는, 가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기 (바람직하게는 미세한 안개가 생산되도록 전기유체역학을 사용하는 분무기) 또는 연무기로부터의 에어로졸 스프레이로서 또는 건식 분말 흡입기로부터 건식 분말 (단독, 혼합물 (예를 들어, 락토스와의 건식 블렌드), 또는 혼합 성분 입자 (예를 들어, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린과 혼합됨))의 형태로, 비내 투여되거나 흡입에 의해 투여될 수 있다. 비내 사용을 위해, 분말은 생체결합성 작용제, 예를 들어, 키토산 또는 시클로덱스트린을 포함할 수 있다.
가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기 또는 연무기는 에탄올, 수성 에탄올, 또는 활성물질을 분산시키거나, 용해시키거나 이의 방출을 연장시키기 위한 적절한 별법적인 작용제, 용매로서의 추진제(들) 및 선택적인 계면활성제, 예컨대 소르비탄 트리올레에이트, 올레산, 또는 올리고락트산을 예를 들어 포함하는 본 발명의 화합물(들)의 용액 또는 현탁액을 함유한다.
건식 분말 또는 현탁액 제형에서 사용하기 전에, 약물 제품이 흡입에 의한 전달에 적절한 크기 (전형적으로 5 마이크론 미만)로 미분화된다. 이는 임의의 적합한 분쇄 방법, 예컨대 나선형 제트 제분, 유동층 제트 제분, 나노입자를 형성시키기 위한 초임계 유체 프로세싱, 고압 균질화, 또는 스프레이 건조에 의해 달성될 수 있다.
흡입기 또는 취분기에서 사용하기 위한 캡슐 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스로부터 제조됨), 블리스터 및 카트리지는 본 발명의 화합물의 분말 믹스, 적절한 분말 베이스 예컨대 락토스 또는 전분, 및 성능 개질제 예컨대 l-류신, 만니톨 또는 스테아르산마그네슘을 함유하도록 제제화될 수 있다. 락토스는 무수성이거나, 또는 1수화물의 형태일 수 있고, 후자가 바람직하다. 기타 적절한 부형제에는 덱스트란, 글루코스, 말토스, 소르비톨, 자일리톨, 프룩토스, 수크로스 및 트레할로스가 포함된다.
미세한 안개가 생산되도록 전기유체역학을 사용하는 분무기에서 사용하기 위한 적절한 용액 제형은 1회 구동 당 1 ㎍ 내지 20 ㎎의 본 발명의 화합물을 함유할 수 있고, 구동 부피는 1 ㎕ 내지 100 ㎕로 변할 수 있다. 전형적인 제형은 화학식 I의 화합물, 프로필렌 글리콜, 무균수, 에탄올 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 프로필렌 글리콜 대신 사용될 수 있는 별법적인 용매에는 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
적절한 풍미제, 예컨대 멘톨 및 레보멘톨, 또는 감미료, 예컨대 사카린 또는 사카린 소듐이 흡입/비내 투여를 위한 이러한 본 발명의 제형에 첨가될 수 있다.
흡입/비내 투여용 제형은 즉각 및/또는 변형 방출되도록 제제화될 수 있다 (예를 들어 PGLA를 사용). 변형 방출 제형은 지연 방출, 지속 방출, 펄스형 방출, 제어 방출, 표적화 방출 및 프로그래밍 방출을 포함한다.
건식 분말 흡입기 및 에어로졸의 경우, 투여량 유닛은 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 유닛은 10 ng 내지 100 ㎍의 화학식 I의 화합물을 함유하는 "퍼프(puff)" 또는 계량된 용량을 투여하도록 전형적으로 정렬된다. 전체적인 일일 용량은 전형적으로 1 ㎍ 내지 100 ㎎의 범위일 것이고, 이는 단일 용량으로, 또는, 더욱 일반적으로는, 하루에 걸친 분할 용량으로 투여될 수 있다.
직장/ 질내 투여
본 발명의 화합물은, 예를 들어, 좌약, 질 좌제 또는 관장제의 형태로, 직장에 또는 질에 투여될 수 있다. 코코아 버터가 전통적인 좌약 베이스이지만, 다양한 대체물들이 적합하게 사용될 수 있다.
직장/질 투여용 제형은 즉각 및/또는 변형 방출되도록 제제화될 수 있다. 변형 방출 제형은 지연 방출, 지속 방출, 펄스형 방출, 제어 방출, 표적화 방출 및 프로그래밍 방출을 포함한다.
안내/이내 투여
또한 본 발명의 화합물은, 전형적으로 pH가 조정된 등장성의 무균성 염수 내의 미분화 현탁액 또는 용액의 점적물의 형태로, 눈 또는 귀에 직접 투여될 수 있다. 안내 및 이내 투여에 적절한 기타 제형에는 연고, 생물분해성 (예를 들어 흡수성 젤 스폰지, 콜라겐) 및 비-생물분해성 (예를 들어 실리콘) 이식물, 웨이퍼, 렌즈 및 미립자 또는 소포성 시스템, 예컨대 니오솜 또는 리포솜이 포함된다. 가교 폴리아크릴산, 폴리비닐알콜, 히알루론산, 셀룰로스성 중합체, 예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스 또는 메틸 셀룰로스, 또는 이종다당류 중합체, 예를 들어, 젤란 검과 같은 중합체가 방부제, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드와 함께 혼입될 수 있다. 이같은 제형은 이온삼투요법에 의해 또한 전달될 수 있다.
안내/이내 투여용 제형은 즉각 및/또는 변형 방출되도록 제제화될 수 있다. 변형 방출 제형은 지연 방출, 지속 방출, 펄스형 방출, 제어 방출, 표적화 방출 및 프로그래밍 방출을 포함한다.
부품 키트
예를 들어, 특정 질환 또는 상태를 치료하는 목적을 위해, 활성 화합물들의 조합물을 투여하는 것이 바람직할 수 있는 한, 2가지 이상의 제약 조성물 (이중 1가지 이상이 본 발명에 따른 백신을 함유함)이 조성물들의 공동-투여에 적절한 키트의 형태로 편리하게 조합될 수 있다는 것은 본 발명의 범주 내에 속한다.
따라서, 본 발명의 키트는 2가지 이상의 별도의 제약 조성물 (이중 1가지 이상이 본 발명에 따른 백신을 함유함), 및 상기 조성물들을 별도로 유지하기 위한 수단, 예컨대 용기, 분리된 병, 또는 분리된 호일 패킷을 포함한다. 이같은 키트의 예는 주사기 및 바늘 등이다.
본 발명의 키트는 상이한 투여 제형, 예를 들어, 경구 및 비경구 제형을 투여하는데, 별도의 조성물들을 상이한 투여 간격으로 투여하는데, 또는 별도의 조성물들을 서로에 대해 적정하는데 특히 적절하다. 수의사를 돕기 위해, 키트는 전형적으로 투여 지침을 포함한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 어떠한 방식으로도 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 BVD 바이러스에 의해 야기되는 감염에 대해 보호 효과를 제공한다.
본 발명의 이러한, 그리고 또다른 특색, 양상 및 장점이 하기의 상세한 설명, 첨부된 청구항 및 동봉된 도면을 참조로 설명될 것이다.
도 1은 NS3의 도메인들을 도해한다.
도 2는 BVDV 및 HCV 헬리케이즈 도메인들의 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 BVDV 헬리케이즈의 분자 모델의 삽화를 나타낸다
도 4는 스캐닝(scanning) 돌연변이체의 위치를 나타낸다.
도 5는 완전한 전장(全長) BVDV 전구체 및 BVDV 서브바이러스(subviral) 레플리콘(replicon) 구조의 도메인 지도를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 소 바이러스성 설사 바이러스로부터의 프로세싱되지 않은 전장 다기능단백질의 펩티드 서열이다. 이러한 서열에서의 잔기의 번호매김이 본원에 기술된 돌연변이에 상응한다. 예를 들어, "K1845A"로 기술된 돌연변이는 서열 1의 위치 1845에서의 라이신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 것을 의미한다;
서열 2는 대표적인 돌연변이체를 생성시키기 위한 p15aDI 클로닝 부위의 5' 말단에 플랭킹(flanking)된 DNA 플라스미드 단편의 서열이다;
서열 3은 대표적인 돌연변이체를 생성시키기 위한 p15aDI 클로닝 부위의 3' 말단에 플랭킹된 DNA 플라스미드 단편의 서열이다;
서열 4는 본원에 기술된 I1841A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 5는 본원에 기술된 I1841A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 6은 본원에 기술된 R1843A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 7은 본원에 기술된 R1843A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 8은 본원에 기술된 K1845A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 9는 본원에 기술된 K1845A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 10은 본원에 기술된 K1867A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 11은 본원에 기술된 K1867A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 12는 본원에 기술된 H1868A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 13은 본원에 기술된 H1868A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 14는 본원에 기술된 P1869A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 15는 본원에 기술된 P1869A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 16은 본원에 기술된 E1939A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 17은 본원에 기술된 E1939A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 18은 본원에 기술된 R1942A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 5' 프라이머의 서열이다;
서열 19는 본원에 기술된 R1942A 돌연변이를 도입하기 위한 DNA 3' 프라이머의 서열이다;
서열 20은 번역된 BVDV의 NS3 영역의 도메인 1 (헬리케이즈) 및 2 (NTP분해효소)의 펩티드 서열이다;
서열 21은 번역된 C형 간염 바이러스 (HCV)의 NS3 영역의 도메인 1 (헬리케이즈) 및 2 (NTP분해효소)의 펩티드 서열이다.
실시예
실시예 1. NS3 도메인의 에피토프 지도작성
에피토프 지도작성 방법을 적용하여, 모노클로날 항체의 패널에 의해 NS3 단백질에서 인식되는 특정 에피토프를 확인하였다. 방법은 각각의 테스트 단편을 PCR 증폭시킨 후, 말단절단된 단백질을 시험관내에서 번역시키고, 최종적으로 다양한 모노클로날 항체와 이의 반응성을 테스트하는 것을 수반하였다. NS3 상의 항원 영역을 예비적으로 확인하기 위해, 영역을 나타내는 7개의 DNA 단편의 셋트를 증폭시켰다 (도 1). 각각의 단편은 이의 5' 말단에 개시 코돈이 이어지는 T7 프로모터를 함유하였고, 3' 말단에 정지 코돈을 함유하였다. 이러한 DNA 단편들을 TnT® 토끼 망상적혈구 용해물 시스템 (Promega; Madison, WI) 및 방사선-표지 메티오닌 및 시스테인을 사용하는 시험관내 전사/번역에 의한 S35-표지 단백질 단편의 생성을 위한 주형으로 사용하였다. 생성된 번역된 단백질 단편은 전장 NS3 단백질, 헬리케이즈, 및 프로테아제, 뿐만 아니라 헬리케이즈의 개별적인 서브도메인을 포함하였다. (프로테아제, 헬리케이즈 및 헬리케이즈 서브도메인의 경계는 BVDV 및 HCV NS3 단백질의 서열 정렬을 기초로 확인되었다.) 소에서의 BVDV 감염의 검출을 위해 진단 실험실에서 사용된 여러개를 포함하는, BVDV NS3을 인식하는 모노클로날 항체 12개의 패널을 사용하여, 번역된 단백질을 면역침전시켰다. 이러한 모노클로날 항체는 당업계에 공지되어 있고, [Deregt et al., Mapping of two antigenic domains on the NS3 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus, Veterinary Microbiology　 (2005),　 108(1-2),　 13-22]에서 "기존에 제조"된 것으로 기술된다.　 그후, 면역침전물을 SDS-PAGE 및 형광촬영법에 의해 분석하였다.
면역침전의 결과가 표 1에 요약된다. 12개의 모노클로날 항체 모두 및 폴리클로날 혈청 (POLY)은 전장 NS3, 및 1개 이상의 헬리케이즈 서브도메인을 인식한 반면, 어느 것도 프로테아제 단편을 인식하지 않았다. 3개의 모노클로날 항체 (1.11.3, 21.5.8, 및 24.8)은 전장 헬리케이즈 및 도메인 1-도메인 2 (d1-d2) 단편을 면역침전시켰지만, d2-d3 단편은 면역침전시키지 않았고, 이는 이러한 3개의 항체가 헬리케이즈 단백질의 도메인 1을 인식한다는 것을 시사한다. 모노클로날 항체 21.5.8 및 24.8 모두 d1 단편에 결합하였지만, 모노클로날 항체 1.11.3은 그렇지 않았고, 이는 1.11.3 항체가 21.5.8 및 24.8 모노클로날 항체보다 에피토프 입체구조에 더욱 민감하였음을 시사한다. 모노클로날 항체 2.32.5는 전장 헬리케이즈 및 어느 정도로 d1-d2 단편을 인식하였지만, d2-d3 단편은 인식하지 않았고, 이는 이러한 항체 또한 도메인 1을 인식할 수 있다는 것을 시사한다. d1-d2 단편의 약한 결합은 2.32.5에 의해 인식되는 에피토프가 d1-d2 단편과 전장 헬리케이즈 간에 상이하다는 것을 가리킬 수 있다. 모노클로날 항체 4.11.4 및 16.1.5는 전장 NS3 및 헬리케이즈 모두에 결합하였지만, d1-d2 및 d2-d3 단편에는 오직 약하게만 결합하였고, 이는 이들이 헬리케이즈의 제2도메인 내의 에피토프에 대해 특이적일 수 있다는 것을 시사한다. 4개의 모노클로날 항체, 5.2.1, 9.10.4, 12.7.3 및 15.14.6은 전장 NS3 및 헬리케이즈 모두를 인식하였다. 또한 이들은 d2-d3 단편에 결합하였지만, d1-d2 단편에는 결합하지 않았고, 이는 이들이 도메인 3 내에 위치한 에피토프를 인식한다는 것을 시사한다. 이들 중 어느 것도 단일 d3 단편에 결합하지 않았고, 이는 d3의 적절한 폴딩이 다른 서브도메인의 부재 하에 발생하지 않을 수 있다는 것을 시사한다. 모노클로날 항체 19.7.6은 NS3 및 전장 헬리케이즈에 결합하였지만, 어떠한 다른 단편에도 결합하지 않았다. 이러한 항체에 의한 인식은 무손상 헬리케이즈 단백질의 존재를 필요로 할 수 있다. 모노클로날 항체 20.10.6은 NS3, 전장 헬리케이즈, 및 d1-d2 및 d2-d3 단편 모두에 매우 잘 결합하였다. 또한 이는 단일 d2 단편을 인식하였고, 이는 이러한 항체에 의해 인식되는 도메인 2 내의 에피토프가 도메인 1 및 3의 부재에 영향을 받지 않는다는 것을 시사한다. 12개의 모노클로날 항체 중 어느 것도 전장 프로테아제에 결합하지 않았다는 것은, BVDV에 감염된 암소로부터의 폴리클로날 혈청 (POLY)도 본 발명가들의 실험에서 프로테아제를 인식하지 않았기 때문에, 놀랍지 않았고, 이는 프로테아제가 그다지 항원성이지 않다는 것을 강력하게 시사한다. 이는 헬리케이즈와 NS4A 단백질 사이에 프로테아제가 배향되어 항체 결합에 대해 접근가능한 이의 표면 구조를 매우 적게 남긴다는 점에서, HCV 내의 프로테아제, 헬리케이즈 및 NS4A (프로테아제 보조인자) 단백질의 분자 배향과 일치한다. 이러한 결과를 기초로, 도메인 1이 마킹된 바이러스가 초래되는 돌연변이(들)의 도입을 위한 대표적인 표적이다.
Figure 112011020824563-pat00001
실시예 2. BVDV 및 HCV 헬리케이즈의 서열 정렬
BVDV 헬리케이즈의 도메인 1 내의 돌연변이를 기초로 마킹된 바이러스를 생성시키기 위하여, 이러한 도메인 내의 에피토프의 추가적인 정련이 바람직하다. 헬리케이즈의 기능을 현저하게 변화시키지 않으면서 면역지배적 에피토프를 제거하는 것이 바람직하다. 돌연변이시킬 후보 에피토프의 확인을 용이하기 하기 위하여, BVDV 헬리케이즈의 분자 모델이 매우 유용할 것이다. HCV 헬리케이즈의 결정 구조가 공지되어 있기 때문에, 이를 모델링을 위한 주형으로 사용할 수 있다. 도메인 1의 분자 모델을 생성시키는 프로세스를 시작하기 위하여, BVDV 및 HCV 헬리케이즈의 도메인 1의 아미노산 서열을 정렬하였다. 이들 간의 1차 서열 동일성은 약 34％이다. BVDV 헬리케이즈 도메인 1의 2차 구조를 해명하기 위해, 다양한 BVDV 단리물 및 기타 페스티바이러스로부터 유래된 47개의 NS3 서열을 <Genetics Computer Group> 소프트웨어 패키지 (University of Wisconsin; Madison, WI)로부터의 파일업(Pileup) 프로그램, 및 원형 서열로서의 NADL BVDV 균주를 사용하여 정렬하였다. 정렬된 서열들로부터, 다중 서열 파일 (MSF)이 생성되었고, PHD 예측 방법 ([Rost and Sander, J. Mol. Biol. 235:13-26 (1993)])을 사용하는 2차 구조 예측을 위해 JPred 서버 ([Cuff, et al., Bioinformatics, 14:892-893 (1998)])에 제출되었다. <Silicon Graphics Indigo2 Impact 10000> 워크스테이션 (Silicon Graphics; Mountain View, CA)을 모든 분자 모델링 연구에 사용하였다. <Molecular Operating Environment (MOE)> 버젼 2001.01 (Chemical Computing Group, Inc.; Montreal, Quebec) 및 SYBYL 6.7 소프트웨어 (Tripos Associates Inc.; St. Louis, MO)를 분자 모델링 및 가시화에 사용하였다. HCV (서열 21) 및 BVDV (서열 20) NS3 단백질로부터의 도메인 1 및 2의 아미노산 서열이 1차 서열 상동성 및 2차 구조 예측을 기초로 정렬되었다 (도 2). 그 후, HCV 단백질의 상응하는 영역을 주형으로 사용하여, BVDV NS3 도메인 1 및 2의 예비 분자 모델이 생성되었다. 도 3에 제시된 바와 같이, α1-β2 (루프 IGR), α2-β3 (KHP), β4-β5 (DMA) 및 α3-β7 (SES)를 포함하여, 알파 나선과 베타 가닥 사이의 여러 루프 및 회전이 존재하는 것은 헬리케이즈 촉매 중심 및 헬리케이즈-프로테아제 상호작용성 표면 모두로부터 떨어진 곳에서 노출된 표면이 형성되도록 한다. 이러한 영역은 고도로 항원성인 영역일 가능성을 갖는다. 확인된 루프들 중 3개인 루프 KHP, 루프 IGP, 및 루프 SES가 돌연변이유발 연구용 표적으로 선택되었다.
실시예 3. 스캐닝 돌연변이유발에 의한 모노클로날 항체 결합 부위의 위치
다양한 모노클로날 항체에 의해 결합되는 도메인 1 내의 에피토프를 추가로 한정하기 위해, 스캐닝 돌연변이유발 방법을 사용하였다. 간략하게, BVDV 헬리케이즈 도메인 1 서열 (서열 20)의 짧은 절편들을 PCR 증폭을 사용하여 상응하는 HCV 서열 (서열 21)로 치환시킨 후, 생성된 단편의 제한 효소 소화 및 결찰로 도 4에 지시된 "스캐닝 돌연변이체"가 생성되었다. 시험관내 전사 및 번역, 뿐만 아니라 면역침전은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 다양한 모노클로날 항체와 돌연변이체의 반응성의 요약이 표 2에 제시된다.
Figure 112011020824563-pat00002
실시예 4. 알라닌 치환 돌연변이유발에 의한 모노클로날 항체 결합 부위의 상세한 분석
다양한 모노클로날 항체에 의해 결합되는 도메인 1의 에피토프를 추가로 한정하기 위해, 그리고 항체 결합을 위한 이러한 영역 내의 결정적인 잔기들을 확인하기 위해, I1841-R1846, K1867-S1872 및 S1938-I1941의 3개의 영역에서의 총 16개의 단일 아미노산 (알라닌) 치환 돌연변이체가 생성되어, 항체 결합에 대해 테스트되었다. 아미노산 잔기 좌표는 서열 1에 따른 것이다. 따라서, "I1841A"는 서열 1에서 번호매겨진 바와 같은 좌표 1841에서의 이소류신의 알라닌으로의 치환을 나타낸다. 물론, 기타 BVDV 단리물에서, 상이한 특정 아미노산이 대표 서열의 특정 좌표에 존재할 수 있다. 따라서, 변이체 BVD 바이러스, 또는 변이체 BVD 바이러스를 발현하도록 구축된 플라스미드의 헬리케이즈 도메인의 동일한 유전자좌에서의 돌연변이로 변형되지 않은 변이체 바이러스 펩티드에 대해 발생된 항체에 의한 인식의 동등한 상실이 초래될 것이다. 치환 돌연변이체는 당업계에 공지된 PCR 중첩 확장 기술을 사용하여 구축되었다 (예를 들어, [Ho et al., Gene, 77(1):51-9 (1989)] 참조). 간략하게, PCR을 사용하여, 각각 헬리케이즈의 도메인 1 및 2를 코딩하는 알라닌 치환 단편을 생성시켰다. 각각의 단편은 이의 5' 말단의 T7 프로모터 서열 및 번역 개시 코돈, 및 3' 말단의 정지 코돈을 코딩하였다. 먼저, 2개의 별도의 반응을 수행하여 치환 영역의 5' 및 3' 절반을 코딩하는 중첩 단편들을 생성시켰다. 중첩 영역 내에, PCR에서 사용된 돌연변이유발성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 양쪽 단편의 서열 내로 단일 알라닌 치환이 도입되었다. 각각의 PCR 생성물을 아가로스 젤에서의 전기영동에 의해 분리하고, 정확한 크기의 단일 밴드를 각각의 반응으로부터 정제하였다. 정제된 DNA 단편들을 혼합하고, 제2 PCR의 주형으로 사용하여, 단일 치환 단편을 생성시켰다. 이러한 전체 절차를 반복하여, 각각의 원하는 치환 단편을 생성시켰다. 각각의 단편의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 상기 기술된 바와 같은 시험관내 전사/번역을 통해 이러한 단편을 주형으로 사용하여 S35-표지 단백질 단편이 생성되었다. 모노클로날 항체를 사용한 면역침전에 이어서 SDS-PAGE 분석을 사용하여, 돌연변이된 에피토프가 여전지 항체에 의해 인식되었는지 여부를 결정하였다.
E1939A 및 R1942A는 모노클로날 항체 1.11.3에 의한 결합을 완전히 파괴하였고, 이는 이러한 2개의 잔기가 항체 결합에 결정적이라는 것을 시사한다. 이러한 2개의 아미노산이 동일한 α3-β7 (SES) 루프 (도 3) 상에 존재한다는 것은 이러한 항체에 의해 인식되는 에피토프가 이러한 루프에 의해 형성된다는 것을 시사한다. 헬리케이즈 분자의 2개의 별도의 영역 (α1-β2 (IGR) 및 α2-β3 (KHP) 루프) 상에 위치한 2개의 다른 돌연변이체 I1841A 및 K1867A는 모노클로날 항체 21.5.8에 의한 결합이 현저하게 감소된 것을 나타냈지만, 다른 항체에 대해서는 그렇지 않았다. 이러한 결과들로부터 유추될 수 있는 한가지 결론은 이러한 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프가 천연 분자 내에서 아주 근접하게 위치하는 2개의 상이한 루프를 포함할 수 있다는 것일 것이다. 이는 도 3에 제시된 분자 모델과 일치한다. 돌연변이체 R1843A는 모노클로날 항체 24.8에 의한 결합을 파괴하였지만, 다른 항체의 결합에 대해서는 효과가 없었다. 또다시, 이는 이러한 잔기가 α1-β2 (IGR) 루프 상에 위치하는 주요 에피토프의 일부라는 것을 시사할 것이다. 모노클로날 항체 24.8의 결합에 대한 R1942A 돌연변이체의 부분적인 효과는 α3-β7 (SES) 루프가, α1-β2 (IGR) 루프와 함께, 이러한 항체에 의해 인식되는 에피토프를 구성한다는 것을 시사한다. 결론적으로, 3개의 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프가 BVDV 헬리케이즈의 도메인 1 내에 정확하게 지도로 작성되었다. 1차 서열의 3개의 별도의 영역 내에 위치하지만 3차 구조 내에서 아주 근접하게 위치하는 이러한 에피토프들 내의 주요 잔기가 확인되었다. 이러한 에피토프들의 기능이 BVDV 서브바이러스 레플리콘의 정황에서 추가로 시험되었다.
Figure 112011020824563-pat00003
실시예 5. 서브바이러스 BVDV 레플리콘의 정황에서의 헬리케이즈 도메인 1 돌연변이의 구축
서브바이러스 레플리콘의 구축
성공적인 바이러스 백신의 생산을 위한 바람직한 특성은 높은 역가의 바이러스 수율을 수득하는 능력이다. 따라서, 마커 돌연변이가 바이러스 복제를 현저하게 방해하지 않아야 한다. 헬리케이즈 활성이 BVDV RNA의 복제에 필수적이기 때문에, 본 발명가들은 항체 인식의 상실에 대해서뿐만 아니라, 또한 촉매적 헬리케이즈 활성의 보존에 대해서 모든 도메인 1 점 돌연변이체를 평가하고자 하였다. 플라스미드가 증식 동안 불안정하기 때문에, 대장균에서의 전장 BVDV 프로바이러스성(proviral) 분자 클론의 증폭 및 유전자 조작이 어렵다. 따라서, NS3를 발현하고 바이러스 RNA 복제를 지지하는 말단절단된 서브바이러스 레플리콘을 함유하지만, 바이러스 구조 유전자가 결여된 p15aDI를 생성시켜, 돌연변이체의 스크리닝을 용이하게 하였다. p15aDI는 전장 BVDV 게놈을 함유하는 감염성 프로바이러스 어버이 플라스미드 (pNADLp15a)로부터 유래되었다. 대부분의 구조 유전자 및 NS2 코딩 영역이 결여되었기 때문에 더욱 조작성이면서, NS3의 상류에 위치한 유일한 서열은 N 단백질의 일부와 소 유비퀴틴 사이의 융합물로 구성된다 (도 5). 이러한 레플리콘으로부터 발현된 NS3 단백질은 효율적인 RNA 복제가 전사물의 증폭에 이르러 바이러스 단백질 발현에서의 증가가 초래되는 경우에만 면역조직화학에 의해 검출가능하다. 따라서, NS3의 검출은 효율적인 RNA 복제 및 촉매적 헬리케이즈 활성의 간접적인 확증으로 작용한다
BVDV 헬리케이즈 도메인 1 돌연변이체의 생성
12개의 상이한 헬리케이즈 도메인 1 돌연변이체의 셋트가 서브바이러스 레플리콘의 정황에서 생성되었고, 바이러스 RNA 복제 및 에피토프 인식의 상실에 대해 분석되었다. 이러한 돌연변이체들 중 8개는 단일 아미노산 변화만을 함유하였고, 하기의 것들을 포함하였다: IGR 루프 내에서, I>A (아미노산 잔기 1841), R>A (1843), 및 K>A (1845); KHP 루프 내에서, K>A (1867), H>A (1868), 및 P>A (1869); SES 루프 내에서, E>A (1939), 및 R>A (1942). 2개의 돌연변이체에는 2개의 아미노산에서의 변화가 있었다: IGR 루프 내에서, R>A (1843) 및 K>A (1845), 및 SES 루프 내에서, E>A (1939) 및 R>A (1942). 2개의 돌연변이체는 3개의 변화를 함유하였다: K>A (1867), H>A (1868) 및 P>A (1869) (모두 IGR 루프 내), 및 K>A (1845), H>A (1868) 및 E>A (1939) (다중 루프에 영향을 미침). 편의를 위해 알라닌이 대표적인 돌연변이에서 사용되었지만, 비-보존적 아미노산 치환이 적합한 돌연변이로 사용될 수 있다. 각각의 돌연변이체가 상기 기술된 중첩 PCR 전략을 사용하여 생성되었다. 특정 셋트의 중첩 프라이머가 각각의 원하는 돌연변이에 대해 고안되었다 (표 4). 스크리닝 목적을 위해, 각각의 프라이머 셋트는 추가적인 침묵 뉴클레오티드 변화를 또한 함유하였고, 이는 돌연변이 부위 근처에서 독특한 신규 제한 효소 절단 부위의 생성을 초래할 것이다. 중첩 PCR 단편이 오직 2개의 외부 프라이머만을 사용하여 수행된 제2 라운드의 증폭에서 주형으로 작용하였다. 다중 아미노산 변화를 함유하는 단편을 생성시키기 위해, 이전의 돌연변이 단편을 주형으로 사용하여, 증폭 반응을 반복하였다. 그후, 완전하게 돌연변이된 단편을 PCR 공정 동안 생성된 2개의 독특한 제한 효소 부위 (BsmBI 및 SmaI)에 의해 서브바이러스 레플리콘 골격 내로 클로닝하였다. 돌연변이체 PCR 단편 및 서브바이러스 레플리콘 골격을 모두 BsmBI 및 SmaI로 소화시키고, 알칼리서 포스파타제 (NEB, Inc.)로 처리하고, 아가로스 젤 전기영동에 의해 정제하고, 하룻밤 동안 16℃에서 T4 DNA 결찰효소 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)를 사용하여 결찰시켰다. STBL2 대장균 세포 (Invitrogen; Carlsbad, CA)를 분취량의 결찰된 반응물로 형질전환시키고, 선택 배지 상에 플레이팅하였다. 콜로니들을 플라스미드 DNA의 정제에 의해 스크리닝한 후, 제한 효소로 소화시켰다. 예상된 크기의 플라스미드들을 서열 분석에 의해 추가로 확인하였다.
Figure 112011020824563-pat00004
Figure 112011020824563-pat00005
실시예 6. 돌연변이체 서브바이러스 레플리콘의 특징화
시험관내 전사 및 RNA 형질감염
RNA 전사물을 시험관내에서 T7 RNA 중합효소 및 메가스크립트(MEGAscript)™ (Ambion; Austin, TX)을 사용하여 합성하였다. DNA 주형을 KspI로 선형화시키고, T4 DNA 중합효소로 처리하여, 3' 돌출부(overhang)를 제거하였다. 전사 반응 생성물을 형질감염 전에 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다. 1-5 ㎍의 RNA를 6 ㎍의 리포펙틴(Lipofectin) (Invitrogen)을 함유하는 200 ㎕의 Opti-MEM (Invitrogen)에 첨가하고, 10 내지 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 동시에, 6-웰 플레이트 (35 ㎜ 직경)에서 성장된 매딘 다비 소 신장 (MDBK:Madin Darby Bovine Kidney) 세포의 단층 (50 내지 60％ 조밀도)을 RNA분해효소가 없는 PBS로 2회, 그리고 Opti-MEM으로 1회 세정하였다. 최종 세정 후, 형질감염 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 이어서 10분 동안 실온에서 부드럽게 진동시키면서 인큐베이션하였다. 그후, 1 ㎖의 Opti-MEM을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가로 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그후, 2-3％ 소 공여체 송아지 혈청을 함유하는 Opti-MEM 3 ㎖을 각각의 웰에 첨가하였다.
RNA 복제 및 항체 인식의 분석
37℃에서의 24-48시간 동안의 인큐베이션 후, 형질감염된 세포를 80％ 아세톤으로 고정하고, 제조업자의 설명서에 따라 벡타스테인 엘리트(Vectastain Elite) ABC 키트 (Vector Laboratories; Burlingame, CA)를 사용하여 면역조직화학 분석법 (IHC)에 적용하였다. 헬리케이즈 도메인 2를 인식하는 모노클로날 항체 20.10.6을 사용하여, 효율적인 RNA 복제의 지표로서 NS3에 대해 양성인 세포를 가시화시켰다. 야생형 BVDV RNA, 뿐만 아니라 다수의 돌연변이체 레플리콘으로 형질감염된 세포들은 모노클로날 항체 20.10.6으로의 강한 염색을 나타냈고, 이는 이러한 개별적인 돌연변이 바이러스성 헬리케이즈들이 효율적인 vRNA 복제를 지지하였음을 가리킨다. 오직 돌연변이체 K1867A/H1868A/P1869A만이 검출가능한 NS3 단백질을 생산하는데 실패하였고, 이는 이러한 셋트의 돌연변이가 바이러스 RNA 복제를 현저하게 방해하였음을 시사한다.
야생형 또는 돌연변이체 레플리콘으로 형질감염된 모든 세포들을 모노클로날 항체 1.11.3, 21.5.8, 및 24.8로 또한 테스트하였다 (표 5). 각각의 루프에서의 돌연변이로 3개의 항체들 중 하나에 의한 인식의 상실이 초래되었기 때문에, 각각의 루프가 이러한 3개의 항체들 중 하나에 의해 인식되는 것으로 보였다. 특히, 루프 IGR 내의 잔기 R1843A 및 K1845A의 돌연변이 (개별적으로 및 함께)로, 모노클로날 항체 24.8에 의한 인식의 완전한 상실이 초래되었다. 동시에, 모노클로날 항체 20.10.6, 1.11.3 및 21.5.8에 의한 인식은 영향을 받지 않았다. 루프 KHP에서, 돌연변이 K1867A로, 다른 3개의 항체에 의한 인식에는 영향을 미치지 않으면서, 모노클로날 항체 21.5.8에 의한 인식이 폐지되었다. 또한, 루프 SES에서의 점 돌연변이 모두는 모노클로날 항체 1.11.3에 의한 인식의 상실에 이르렀고, 이중 돌연변이체도 마찬가지였다. 추가적으로, 삼중 돌연변이체 (K1845A/H1868A/E1939A)에서는 1.11.3 및 24.8 모노클로날 항체 모두에 의한 인식의 상실이 초래되었지만, 모노클로날 항체 20.10.6 및 21.5.8에 의한 항체 인식은 영향을 받지 않았다.
요약하면, 모노클로날 항체 인식 및 결합의 폐지가 초래된 3개의 헬리케이즈 루프에서의 여러 돌연변이가 확인되었다. 또한, 헬리케이즈 기능을 여전히 유지하면서 2개의 항체에 대한 인식 부위를 동시에 파괴하는 것이 실행가능하다는 것이 발견되었다. 따라서, 각각의 이러한 개별적인 돌연변이, 또는 이들의 조합이 헬리케이즈 영역 내에 돌연변이(들)을 함유하는 마킹된 BVDV 백신으로서 작용할 수 있다.
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실시예 7. 마킹된 바이러스의 생성 및 분석
바이러스 복제 및 감염력에 대한 NS3 단백질 내에서의 지시된 돌연변이의 효과(들)을 평가하기 위해, 돌연변이를 전장 BVDV 서열을 함유하는 프로바이러스 플라스미드 (pNADLp15A) 내로 이동시키는 것이 필요하였다. 추가적인 연구를 위해 선택된 3개의 돌연변이된 서열은 하기와 같았다: K1845A-H1868A-E1939A, R1942A, 및 E1939A. 각각의 개별적인 당해 돌연변이된 서열을 함유하는 DNA 단편을 다시 한번 독특한 BsmBI 및 SmaI 제한 부위를 사용하여 pNADLp15A 내로 클로닝하였다. 결찰 혼합물을 대장균 GM2163 세포 (New England Biolabs, Inc.; Beverly, MA) 내로 형질전환시킨 후, 선별 배지 상에 플레이팅하였다. 하룻밤 동안의 인큐베이션 후, 콜로니들을 올바른 서열을 함유하는 플라스미드의 존재에 대해 스크리닝하였다. 각각의 돌연변이를 나타내는 1개의 클론을 선별하고 (R1942A; E1939A; 및 K-H-E), 이러한 클론들로부터, 바이러스성 RNA를 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조하였다. MDBK 세포를 각각의 RNA 제제로 형질감염시키고, 37℃에서 64시간 동안 인큐베이션하였다. RD 세포 (ATCC; Rockville, MD)의 이중 형질감염을 각각의 돌연변이체에 대해 설정하였다. 형질감염된 세포의 한 셋트는 실시예 6에 기술된 바와 같이 IHC 염색을 위해 고정하였고, 두번째 셋트로부터, 세포를 파종된 플라스크로부터 긁어내어, -80℃에서 추후의 증식을 위한 스톡으로 저장하였다.
3개의 클론에 의해 생산된 바이러스를 추가로 평가하기 위해, 형질감염 실험으로부터 수확된 배양액을 신선한 RD 세포 단층 상에 통과시켰다. 흡착 및 하룻밤 동안의 인큐베이션 후, 세포를 IHC 분석을 위해 고정시켰다. 이러한 분석의 결과가 표 6에 제시된다. 야생형 및 돌연변이 바이러스 모두 모노클로날 항체 20.10.6 (대조군 항체)에 의해 인식되었다. 야생형 바이러스는 모노클로날 항체 1.11.3 및 24.8에 의해 또한 인식되었다. 돌연변이체 E1939A는 모노클로날 항체 24.8에 의해 결합되었지만, 1.11.3에 의해서는 그렇지 않았다. 돌연변이체 K-H-E는 모노클로날 항체 20.10.6에 의해서만 인식되었고, 1.11.3 또는 24.8에 의해서는 인식되지 않았다. 돌연변이체 R1942A는 모노클로날 항체 24.8과의 반응성을 나타냈지만, 1.11.3과는 그렇지 않았다.
Figure 112011020824563-pat00007
각각의 마킹된 바이러스의 성장 동역학을 또한 평가하였다. 각각에 대한 스톡 바이러스 역가를 표준 바이러스 적정 프로토콜을 사용하여 미리 결정하였다. 경시적인 연구에서, RD 세포의 신선한 단층을 조직 배양 플라스크에 파종하고, 하룻밤 동안 인큐베이션하고, 다음 날 미리 결정된 양의 각각의 바이러스로 감염시켰다. 흡착 및 세정 후, 샘플의 초기 셋트를 수집하였다 (시간 "0"). 이어서 샘플을 감염 14시간 후, 19시간 후, 24시간 후, 39시간 후, 43시간 후, 47시간 후, 및 65시간 후에 수집하였다. 바이러스 역가를 스피어맨-카버(Spearman-Karber) 방법 ([Hawkes, R. A. In E. H. Lennette (ed.), Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, p. 33-35; 7th ed. American Public Health Association Publications, Washington, D.C.])를 사용하여 결정하고, TCID50/㎖로 나타냈다. 야생형 (어버이) BVD 바이러스와 비교하여, 모든 돌연변이체들은 야생형과 유사하거나, 일부 경우에는 이보다 약간 더 양호한 속도로 성장하였다 (표 7).
Figure 112011020824563-pat00008
생성된 돌연변이들 중 일부에서는, 모노클로날 항체의 패널에 의해 결정된 바와 같이, 면역학적으로 상이한 특정 에피토프들의 변동이 초래되었다. 항체 인식이 감염성 바이러스 입자의 정황에서 분석되었을 때 유사한 결과가 수득되었다. 감염성 바이러스의 생성에 영향을 미치지 않았지만 모노클로날 항체에 의한 인식의 상실에 이른 돌연변이를 함유하는 클론들은 효과적인 마킹된 BVDV 백신 균주로 작용하는 신규 균주를 나타낸다.
실시예 8. 어린 송아지 모델에서의 백신 효율 테스트
BVDV 음성의 건강한 송아지를 수득하고, 연구 군으로 무작위로 할당하고, 주치 수의사의 감독하에 유지시켰다. 테스트 백신을 무균성 보강제와 조합하고, 근육내 (IM) 또는 피하 (SC) 주사에 의해 투여하였다. 2회 용량의 백신을 21일 내지 28일 간격으로 투여하였다. 이어서 동물들을 최종 예방접종 21일 내지 28일 후에 BVDV의 제I형 또는 제2형 균주로 공격(challenge)하였다. 공격 접종물은 콧구멍 당 2 ㎖씩 4 ㎖ 분할 용량으로 비내 제공되었다. 예방접종되지 않고 공격되지 않은 동물 및/또는 예방접종되지 않고 공격된 동물로 구성된 대조군이 또한 연구 전반에 걸쳐 유지되었다.
직장 온도, 우울증, 식욕부진 및 설사를 포함하는 임상 파라메터들을 매일 모니터링하였다. BVDV 제1형 또는 제2형 균주와 조합된 혈청의 일련의 희석물을 사용하여, 소 세포 배양물에서 바이러스는 일정하고 혈청이 감소되는 분석법에 의해 혈청 중화 역가를 결정하였다. 소 세포 배양물에서의 BVDV의 공격후 단리를 말초혈로부터 시도하였다. BVDV-양성 세포 배양물을 간접적인 면역형광에 의해 결정하였다. 공격 후의 보호를 증명하기 위해, 대조군에 비해 감염 발생률에서의 감소가 예방접종된 군에서 증명되어야 한다.
실시예 9. 임신한 암소-송아지 모델에서의 백신 효율 테스트
BVDV-음성 암소 및 번식 적령기의 미경산우를 수득하고, 예방접종 테스트 군 또는 위약 군 (대조군)으로 무작위로 할당하였다. 암소들에게 21일 내지 28일 간격으로 백신 또는 위약을 근육내 (IM) 또는 피하 (SC) 주사에 의해 2회 접종하였다. 두번째 예방접종 후, 모든 암소에게 IM 프로스타글란딘 주사를 제공하여, 발정기를 동기화시켰다. 발정기를 나타내는 암소들을 인증된 BVDV-음성 정액의 인공 정액주입에 의해 교배시켰다. 임신 약 60일에, 암소의 임신 상태를 직장 촉진에 의해 결정하였다. 약 6주 후, 임신이 확인된 암소들을 각각의 테스트 군으로부터 무작위로 선택하였다. 이러한 암소들 각각을 BVDV 제1형 또는 제2형의 비내 접종에 의해 공격하였다. BVDV 단리의 목적으로 공격 당일에 및 공격 후 여러 간격으로 혈액 샘플을 수집하였다.
공격 28일 후, 좌측 옆구리 개복술을 수행하고, 각각의 암소로부터 양수를 추출하였다. 수술 직전, 혈액 샘플을 각각의 암소로부터 혈청 중화 분석을 위해 수집하였다. 제왕절개 분만 후, 혈액 샘플을 각각의 태아로부터 수집하였다. 그후, 태아를 안락사시키고, BVDV 단리의 목적으로 조직을 무균적으로 수집하였다. 자발적인 유산이 발생한 경우, 유산이 검출되었을 때 및 2주 후에 혈액 샘플을 어미로부터 취하였다. 쌍을 이룬 혈액 샘플 및 유산된 태아에 혈청학적 테스트 및 바이러스 단리를 적용하였다. 백신 효율은 태아 감염 및 말기 유산의 결여에 의해 증명된다.
실시예 10. 마킹된 BVDV 백신에 대한 진단 분석법
다양한 연령의 소에 NS3가 돌연변이된 (마킹된) 생-약독화 또는 불활성화 BVDV 백신을 제공된 설명서에 따라 예방접종할 수 있다. 혈청 샘플을 예방접종 2-3주 이상 후에 수집할 수 있다. 마킹된 BVDV 백신이 제공된 소와 BVDV의 야생형 균주로 감염된 것들을 구별하기 위해, 혈청 샘플을 차별적 진단 분석을 통해 테스트할 수 있다. 에피토프-특이적 아미노산 돌연변이가 있는 NS3 단백질은, 마킹된 백신의 정황에서 소에게 제시되었을 때, NS3 단백질의 돌연변이된 에피토프에 결합하지만 야생형 바이러스 상에 존재하는 돌연변이되지 않은 에피토프에는 결합하지 않을 특정 항체의 생산을 유발한다. 야생형 바이러스의 정황에서는, 반대이다 - 특정 항체가 NS3 단백질 상의 야생형 에피토프를 인식할 수 있지만, 돌연변이된 형태는 인식할 수 없다. 항체 결합 특이성 및 친화력을 분석하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, ELISA, 경쟁적 면역분석법, 방사선면역분석법, 웨스턴 블롯, 간접 면역형광 분석법 등과 같은 면역분석법 포맷이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
경쟁적 ELISA는 간접 또는 직접 분석법일 수 있다. 직접적인 경쟁 분석법의 한 예가 본원에서 기술된다. NS3 단백질 (천연 또는 합성 유래)을 포함하는, 전체 또는 부분적 야생형 바이러스 항원이 항원 공급원으로 사용될 수 있다. ELISA 플레이트를 알칼리성 조건 하에 항원으로 코팅한 후, 소 혈청 샘플 및 희석물을 에피토프-특이적 모노클로날 항체의 최적화된 희석물과 함께 첨가하고, 30-90분 동안 인큐베이션한다. 양고추냉이 과산화효소 또는 알칼리성 포스파타제가 모노클로날 항체에 접합되어 있어, 결합이 비색법에 의해 검출되도록 한다. 플레이트를 세정한 후, 효소-특이적 발색성 기질을 첨가하고, 최종 인큐베이션 단계 후, 각 웰의 광학 밀도를 사용된 기질에 적합한 파장에서 측정한다. 소 혈청과 플레이트를 코팅한 NS3 단백질의 반응성의 수준에 따라, 표지된 모노클로날 항체의 결합이 억제될 수 있다. 모노클로날 항체에 의한 결합의 결여는 야생형-특이적 에피토프를 인식하는 소 혈청 내의 항체의 존재를 가리키고, 이는 천연 (야생형) 감염을 가리킨다. 반면에, 에피토프 특이적 돌연변이(들)이 있는 마킹된 백신으로 면역화된 소로부터의 혈청은 플레이트를 코팅한 NS3 단백질에 결합하는 항체를 함유하지 않을 것이다. 따라서, 모노클로날 항체가 NS3 단백질에 결합할 것이고, 이어서 발색이 초래될 것이다.
수많은 변형이 상기의 개시내용의 견지에서 당업자에게 발생할 것이다. 예를 들어, BVDV의 기타 세포변성 균주가 NADL 균주에 의해 본원에서 예시된 것들과 유사한 방식으로 NS3의 헬리케이즈 도메인 내에서 돌연변이될 수 있다. 본원에서의 대표적인 돌연변이는 알라닌을 사용하였지만, 기타 비-보존적 아미노산 치환, 또는 복제는 유지되지만 야생형 NS3에 대해 발생된 항체에 의한 인식은 상실되는 기타 돌연변이가 본 발명의 범위 내에 속한다. 이들은 다만 대표적인 것일 뿐이다.
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Claims (23)

  1. 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)에 감염된 비-인간(non-human) 동물을, 1개 이상의 NS3 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하는 마킹된 백신인 BVDV 백신으로 예방접종된 비-인간 동물로부터 구별하는 방법으로서, 상기 돌연변이는 서열 1의 아미노산 잔기 1841, 1843 및 1845로 구성된 군으로부터 선택된 IGR 루프 내의 아미노산 잔기에 존재하며, 상기 방법은
    a) 비-인간 테스트 동물로부터 테스트 샘플을 얻는 단계;
    b) 야생형 BVDV를 검출할 수 있거나 또는 돌연변이된 BVDV를 검출할 수 있는 표지된 항체를, 비-인간 테스트 동물로부터의 체액을 함유하는 테스트 샘플에 첨가하는 단계;
    c) 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 1종 이상의 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 대한 상기 표지된 항체의 결합 친화력을 측정하는 단계; 및
    d) 야생형 BVDV 대 돌연변이된 NS3가 있는 BVDV에 대해 지시된 모노클로날 항체를 사용한 결합 친화력의 결과를 비교함으로써 테스트 동물이 돌연변이된 BVDV로 예방접종되었는지 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)에 감염된 비-인간 동물을, 1개 이상의 NS3 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하는 마킹된 백신인 BVDV 백신으로 예방접종된 비-인간 동물로부터 구별하는 방법으로서, 상기 돌연변이는 서열 1의 아미노산 잔기 1867, 1868 및 1869로 구성된 군으로부터 선택된 KHP 루프 내의 아미노산 잔기에 존재하며, 상기 방법은
    a) 비-인간 테스트 동물로부터 테스트 샘플을 얻는 단계;
    b) 야생형 BVDV를 검출할 수 있거나 또는 돌연변이된 BVDV를 검출할 수 있는 표지된 항체를, 비-인간 테스트 동물로부터의 체액을 함유하는 테스트 샘플에 첨가하는 단계;
    c) 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 1종 이상의 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 대한 상기 표지된 항체의 결합 친화력을 측정하는 단계; 및
    d) 야생형 BVDV 대 돌연변이된 NS3가 있는 BVDV에 대해 지시된 모노클로날 항체를 사용한 결합 친화력의 결과를 비교함으로써 테스트 동물이 돌연변이된 BVDV로 예방접종되었는지 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)에 감염된 비-인간 동물을, 1개 이상의 NS3 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하는 마킹된 백신인 BVDV 백신으로 예방접종된 비-인간 동물로부터 구별하는 방법으로서, 상기 돌연변이는 서열 1의 아미노산 잔기 1939 및 1942로 구성된 군으로부터 선택된 SES 루프 내의 아미노산 잔기에 존재하며, 상기 방법은
    a) 비-인간 테스트 동물로부터 테스트 샘플을 얻는 단계;
    b) 야생형 BVDV를 검출할 수 있거나 또는 돌연변이된 BVDV를 검출할 수 있는 표지된 항체를, 비-인간 테스트 동물로부터의 체액을 함유하는 테스트 샘플에 첨가하는 단계;
    c) 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 1종 이상의 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 대한 상기 표지된 항체의 결합 친화력을 측정하는 단계; 및
    d) 야생형 BVDV 대 돌연변이된 NS3가 있는 BVDV에 대해 지시된 모노클로날 항체를 사용한 결합 친화력의 결과를 비교함으로써 테스트 동물이 돌연변이된 BVDV로 예방접종되었는지 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)에 감염된 비-인간 동물을, 1개 이상의 NS3 헬리케이즈 도메인 아미노산 돌연변이를 포함하는 마킹된 백신인 BVDV 백신으로 예방접종된 비-인간 동물로부터 구별하는 방법으로서, 상기 돌연변이는 서열 1의 IGR 루프, KHP 루프 및 SES 루프 내의 아미노산 잔기 1845, 1868 및 1939에 존재하며, 상기 방법은
    a) 비-인간 테스트 동물로부터 테스트 샘플을 얻는 단계;
    b) 야생형 BVDV를 검출할 수 있거나 또는 돌연변이된 BVDV를 검출할 수 있는 표지된 항체를, 비-인간 테스트 동물로부터의 체액을 함유하는 테스트 샘플에 첨가하는 단계;
    c) 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 1종 이상의 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 상기 야생형 BVDV 또는 상기 돌연변이된 BVDV에 대한 상기 표지된 항체의 결합 친화력을 측정하는 단계; 및
    d) 야생형 BVDV 대 돌연변이된 NS3가 있는 BVDV에 대해 지시된 모노클로날 항체를 사용한 결합 친화력의 결과를 비교함으로써 테스트 동물이 돌연변이된 BVDV로 예방접종되었는지 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 돌연변이된 NS3 이외의 도메인에 대해 지시된 표지된 제1항체를 첨가하는 단계; 및
    b) NS3의 돌연변이된 부분에 대해 지시된 표지된 제2항체를 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제1항체가 야생형 BVDV에 대해 지시되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 제2항체가 NS3의 돌연변이된 부분에 대해 지시되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제2항체가 NS3에 대해 지시되고, 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8; 및 24.8로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 제2항체가 IGR 루프, KHP 루프, 및 SES 루프로 구성된 군으로부터 선택된 NS3의 1개 이상의 돌연변이된 부분에 대해 지시되는 것인 방법.
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