KR101081667B1

KR101081667B1 - 경구 투여용 보툴리눔 독소 제형

Info

Publication number: KR101081667B1
Application number: KR1020057007894A
Authority: KR
Inventors: 스테픈 도노반
Original assignee: 알러간, 인코포레이티드
Priority date: 2002-11-05
Filing date: 2003-11-03
Publication date: 2011-11-09
Also published as: CA2504956A1; US20070269463A1; EP1558269B1; BR0316027A; CN1711096B; WO2004043430A2; US20040086532A1; ES2325882T3; KR20050084932A; JP2006508121A; JP2014065728A; WO2004043430A3; CN1711096A; NZ539307A; AU2003287463B2; CA2504956C; AU2003287463A1; US9265722B2; JP2011219491A; ATE429923T1

Abstract

위장 장애가 있는 환자에 경구 투여하기 위한 보툴리눔 독소의 약제학적 조성물.

Description

경구 투여용 보툴리눔 독소 제형{BOTULINUM TOXIN FORMULATIONS FOR ORAL ADMINISTRATION}

본 발명은 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 경구투여를 위한 보툴리눔 독소의 약제학적 조성물에 관한 것이다.

약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 피하 또는 흡입 투여 및 다른 경로(즉, 관장, 비강내, 초내 등)로 투여하도록 제형될 수 있다. 경구적으로 투여되는 약제(용액, 현탁액, 정제, 캅셀제 등)의 장점은 신속한 치료 효과 및 환자의 편의성을 포함한다.

환자의 순환계(즉, 제산제, 하제)로 흡수될 때 약제학적 조성물의 활성 성분에 의한 치료효과와 대조적으로, 위장관 내에서 표적 부위에 직접적인 효과를 나타내는 약제를 경구적으로 투여하는 것이 알려져 있다. 점막부착(mucoadhesion), 부유(flotaton), 침전(sedimentation), 팽창(expansion) 메카니즘에 의해서, 또는 위가 비워지는 것을 지연시키는 약리학적 제제를 동시에 투여하여, 고체 투여형태 약제가 위내에 정체되는 것을 제어할 수 있다.

점막부착은 합성 및 천연 거대분자(macromolecules)가 신체의 점막 표면에 부착되는 프로세스이다. 이러한 물질들이 약제학적 제형와 병합되는 경우, 점막 표면에 의한 약물 흡수가 향상되거나, 그 부위에서 약물이 장기간에 걸쳐 방출된다. 키토산, 카르보폴(carbopols) 및 카르보머(carbomers)과 같은 합성 폴리머의 경우, 생/점막부착(bio/mucoadhesion)의 메카니즘은 많은 상이한 물리화학적 상호작용의 결과이다. 식물 렉틴과 같은, 생물학적 생/점막부착제는 세포 표면 및 뮤신과 특이적인 상호작용을 나타내며, '제 2 세대' 생부착제로 생각된다. Woodley, J. , Bioadhesion : new possibilities for drug administration? Clin Pharmacokinet 2001 ; 40 (2): 77- 84. 따라서, 점막부착은, 경구 투여 투여형태에, 위벽의 강한 추진력에 저항할 수 있는 능력을 부여하도록 작용한다. 연동 수축 및 위 내용물의 희석을 통해 소실되는 점액을 대체하기 위한 위 점막의 계속적인 점액 생성은 위정체 힘(gastroretentive force)으로서의 점막 부착을 사용하여 극복될 수 있다.

리포좀 및 폴리머 나노입자를 포함하는, 점막부착성 나노입자 시스템을 평가하였다. 표면을 키토산 및 카르보폴과 같은 점막부착성 폴리머로 코팅하면, 입자시스템에 점막부착 능력이 주어질 수 있다. 이러한 표면 변형 가능성은 제타 포텐셜을 측정하여 확인하였다. 평가 방법은 폴리머-코팅된 리포좀에 대한 Coulter 카운터를 사용한 입자 카운팅 방법을 포함한다. 점막부착성 나노입자를 펩티드 약물의 경구 투여에 사용하는 경우, 비-코팅 시스템과 비교하여, 작용기간이 더 길고, 효과도 더 큰 것으로 나타났다. Takeuchi H. , et al, Mucoadhesive nanoparticulate systems for peptide drug delivery, Adv Drug Deliv Rev 2001 Mar 23 ; 47 (1) : 39-54.

종래의 투여형태와 비교할때, 점막부착성 약물 송달 장치는 체내로의 약물 방출을 제어하여, 약물의 치료 효과를 최적화할 수 있다는 점을 포함하는 몇가지 장점을 제공한다. 다양한 형태의 폴리(아크릴산)(PAA) 하이드로젤이 티로신과 같은 위장 효소의 가수분해 활성을 억제하여, 약물의 생체이용률을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다. 점막부착성 송달 시스템이 점막에 대한 부착하도록 아크릴계 폴리머를 사용할 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)와 같은 점막친화성 코폴리머(mucophilic copolymer)를 폴리머의 백본 사슬에 그래프팅하여 변형된 폴리머 하이드로젤이 부착 프로세스를 촉진시킬 수 있다. 이는 이러한 그래프트된 사슬이 네트워크로부터 점막층으로 확산할 수 있기 때문이다. UV-개시되는 유리-라디칼 용액 중합을 사용하여 P(AA-g-EG) 필름을 합성할 수 있다. AA 대 PEG의 몰 공급비를 달리하여, 상이한 형태의 하이드로젤을 합성할 수 있다. PEG 그래프트된 사슬이 점막부착에 미치는 효과를 정량하기 위하여, 폴리머 하이드로젤은 점막부착 특성을 가진다. 신장 장치(tensil apparatus)를 사용하여 생부착성(bioadhesive) 결합 강도를 결정하여, 부착정도를 계산할 수 있다. 40% AA 및 60% PEG를 포함하는 하이드로젤(40:60 AA/EG)이 가장 큰 점막부착을 나타낼 수 있다. 이러한 결과는 두가지 모노머 모두의 시너지 효과에 기여할 수 있다. AA 기능기는 폴리머가 다중 수소 결합을 형성할 뿐아니라 크게 부풀게 할 수 있다. PEG 사슬들(tethers)은 점막부착성 프로모터로서 작용하였다. 이들은 점막을 뚫고 들어가 베이스 하이드로젤과 점액을 연결(bridge)하였다. 이러한 결과는 또한 점막부착에 있어서의 표면 적용범위 및 사슬 길이 효과에 대한 최근의 Huang-Peppas 모델(2002)로 설명할 수 있 다.

정체 메카니즘으로서의 부유(flotation)는 투여형태가 부유할 수 있는 액체의 존재를 필요로 하며, 또한, 누운 자세에서는 유문이 위 본체의 위쪽에 위치하여 부유물질이 비워지는 것을 촉진할 수 있기 때문에, GRI 동안 환자가 똑바로 서있는 자세를 유지할 것으로 가정한다. 따라서, 부유는 경구용 제형의 위 정체를 위한 기본 원리일 수 있다.

침전(sedimentation)은 똑바로 선 자세에서 가장 낮게 위치하는 부분인, 유문부 근처 위 본체의 주름(rugae) 또는 접힌부분에 유지되기에 충분히 작은 펠렛을 위한 정체 메카니즘으로서 성공적으로 사용되었다. 주름에 갖힌 고밀도 펠렛(약 3g/㎤)은 또한 위벽의 연동운동을 견디어내는 경향이 있다. 팽창(expansion)이 잠재적인 신뢰할만한 정체 메카니즘인 것으로 나타났다. 투여후 장치에서 생성된 이산화탄소에 의해서 연장하고, 펼치고, 또는 부푸는 특징을 가지는 몇가지 장치가 개시되었다. 이러한 투여 형태는 팽창상태에서 지름이 약 12-18mm을 초과하는 경우, 유문 괄약근을 통과할 수 없다. 다양한 메카니즘이 팽창의 완전한 가역성을 보장한다.

약제학적 조성물을 경구 투여하여 처치할 수 있는 위장 장애로는 비정상적인 장기능, 복부팽만, 변비, 콘 질환(cohn's disease), 설사, 지방흡수부전, 음식 알러지, 위장루(gastrointestinal fistula), 당 불내성, 글루텐 불내성, 소화 및 흡수 감소, 유당 불내증, 제한된 소화관 기능, 흡수부전 증후군, 췌장 장애, 단장 증후군(short bowel syndrome), 볼륨 불내증(volume intolerance), 구토, 메스꺼움, 가슴앓이, 충수염, 게실 질환(diverticular disease), 담석, 위장 역류, 염증 질환, 펩신성 궤양, 치질, 탈장 및 비만이 포함된다.

위장 운동성(gstrointestinal motility)은 소화계의 운동, 및 소화계 안의 내용물의 통행으로 정의될 수 있다. 소화관의 어떤 위치에서 신경 또는 근육이 강하게 공동작용하는 방식으로 기능하지 못하는 경우, 운동성 문제와 관련된 증상이 발현된다. 이러한 증상은 가슴앓이(heartburn)로부터 변비까지 포함할 수 있다. 다른 증상들로는 또한 복부팽만, 메스꺼움, 구토 및 설사를 포함한다.

경구용 제형은 특정 기간에 걸쳐 미리결정된 속도로 약제를 소화관(GI tract)으로 송달하도록 제조할 수 있다. 일반적으로, 경구용 제형으로부터의 약물의 방출속도는 경구용 제형 물질 및 병합된 약물의 물리화학적 성질에 대한 함수이다. 전형적으로, 경구용 제형은 숙주 반응(host response)을 전혀 또는 거의 유도하지 않는 비활성 물질로 된 캐리어를 포함한다.

경구용 제형은 캐리어 물질에 병합된 생물학적 활성이 있는 약물을 포함할 수 있다. 캐리어는 폴리머 또는 바이오세라믹 물질일 수 있다. 경구용 제형은 원하는 치료 효능을 나타낼 수 있는 방법 또는 양으로 약물을 방출하도록 복용할 수 있다.

폴리머 캐리어 물질은 분산, 화학 반응 또는 용매 활성화로 인해서 뿐아니라, 자기(magnetic), 초음파 또는 온도 변화 인자들에 영향을 받아서 약물을 방출할 수 있다. 분산은 저장소 또는 매트릭스로부터 일어날 수 있다. 화학적 제어는 폴리머 분해(degradation) 또는 폴리머로부터 약물의 분리로 인한 것일 수 있다. 용매 활성화는 폴리머의 팽창 또는 삼투효과를 포함할 수 있다. 예를 들어, Science 249 ; 1527-1533: 1990 참조.

막 또는 저장소(reservoir) 경구용 제형은 폴리머 막을 가로지르는 생물활성 제제의 분산에 의존적이다. 매트릭스 경구용 제형은 생물활성 제제가 균일하게 분포된 폴리머 메트릭스를 포함하여 구성된다. 팽창-제어된 방출 시스템은 보통 생물학적 유액의 존재하에 또는 특정 환경적 자극의 존재 하에 팽창이 진행되는, 친수성, 유리질 폴리머에 기초한다.

경구용 제형은 실질적으로 비-독성, 비-발암성, 및 비-면역원성인 캐리어를 포함할 수 있다. 안정한 경구용 제형 물질은 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트)(p-HEMA), 폴리(N-비닐 피롤리돈)(p-NVP)+, 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리디메틸 실록산(PDMS), 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체(EVAc), 폴리비닐피롤리돈/메틸아크릴레이트 공중합체, 폴리(락트산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리안하이드라이드, 폴리(오르도 에스테르), 콜라겐, 셀룰로오스 유도체와 같은 폴리머, 및 히드록시아파타이트(HPA), 트리칼슘 포스페이트(TCP) 및 알루미노칼슘 포스페이트(ALCAP)와 같은 바이오세라믹을 포함한다. 락트산, 글리콜산, 콜라겐 및 이의 공중합체를 사용하여 생분해가능한 경구용 제형을 제조할 수 있다.

생분해가능한 경구용 제형을 사용하여 비생분해성 경구용 제형의 명백한 결점들을 극복할 수 있다. 예를 들어, U. S. patents numbers 3,773, 919 및 4,767, 628 참조. 생분해가능한 폴리머는, 대량의 또는 균일한 분해를 나타내는 폴리머와 대조적으로, 표면 침식성 폴리머(surface eroding polymer)일 수 있다. 표면 침식 성 폴리머는, 외부 표면부터로만 분해되며, 따라서 약물 방출이 폴리머 침식 속도에 비례한다. 적합한 이러한 폴리머는 폴리머안하이드라이드일 수 있다. 경구용 제형은 고체 실린더형 경구용 제형, 펠렛 마이크로캡슐, 또는 마이크로스피어의 형태일 수 있다. Drug Development and Industrial Pharmacy 24 (12); 1129-1138 : 1998. 생분해가능한 경구용 제형은 생물활성 표면의 막 또는 매트릭스 방출에 기초할 수 있다. 경구 투여를 위한 생분해가능한 마이크로스피어는 디스크 또는 펠렛으로 가압성형하여 제형할 수 있다.

경구용 제형은 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 폴리머와 같은, 생분해가능한 물질로 제조할 수 있다. 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤 및 콜레스테롤이 공지되어 있다.

생분해가능한 폴리머로 구성된 마이크로스피어를 포함하는, 폴리머 마이크로스피어를 제조하는 적어도 세가지 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, Joumal of Controlled Release 52 (3); 227-237: 1998 참조. 즉, 고체 약물 제제를 유기 용매 중의 생분해가능한 폴리머로 구성된 연속상으로 분산시킬 수 있으며, 또는, 약물의 수용액을 폴리머-유기상으로 에멀젼화할 수 있다. 그리고 나서, 스프레이-건조, 상분리 또는 더블 에멀젼 기술에 의해서, 마이크로스피어를 형성할 수 있다.

보툴리눔 독소

클로스트리디움 속은 127 종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신 경독인, 보툴리눔 독을 제공한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된, 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은채로 장 내막을 통과하여 말초 운동 뉴런을 공격할 수 있는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 죽음으로 증상이 진행될 수 있다.

보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 마우스에서 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 타입 A(정제된 신경독 복합체)(캘리포니아 어바인 소재 Allergan, Inc.사제, 상표명 BOTOX

100 유닛 바이알)의 LD₅₀은 약 50 피코그램이다(즉, 1 유닛). BOTOX

1 유닛은 약 50 피코그램(약 56 아토몰)의 보툴리눔 독소타입 A 복합체를 포함한다. 흥미롭게도, 몰을 기준으로 할때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브로톡신 (cobrotoxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이다. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, page 63-84(chapter 4) of Natural Toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York(1976)(보툴리눔 독소 타입 A의 상기한 LD₅₀0.3ng이 1U과 동일하다는 것은 약 0.05ng의 BOTOX®가 1유닛이라는 사실에 의해 보정된다). 보툴리눔 독소 1 유 닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사를 통한 LD₅₀로서 정의할 수 있다.

면역학적으로 구별되는 7개의 보툴리눔 신경독은, 타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는 각각 신경독 세로타입(serotype) A, B, C₁, D, E, F 및 G로 특징지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 일으키는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 래트에서 발생하는 마비율로 측정할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 보툴리눔 독소 타입 B에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는, 보툴리눔 독소 타입 A 영장류 LD₅₀의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. Moyer E et al., Botulinum Toxin Type B : Experimental and Clinical Experience, being chapter 6, pages 71-85 of"Therapy With Botulinum Toxin", edited by Jankovic, J. et al. (1994), Marcel Dekker, Inc. 참조. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨진다.

세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫번째 단계에서는, 중쇄(H 사슬)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스전 막에 결합한다; 이 수용체는 보툴리눔 독소 타입 및 파상풍 독소 타입 각각에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 H 사슬의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.

두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 H 사슬의 아미노 말단 단편, H_N에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소(또는 최소한 경쇄)는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다 .

보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 중쇄, H 사슬과 경쇄, L 사슬을 연결하는 디설파이드 결합의 환원을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 및 파상풍 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 L 사슬에 포함되며; L 사슬은 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아제이다. 파상풍 신경독, 보툴리눔독소 타입 B,D,F 및 G는 시냅토브레빈(또는 소포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 세포질 표면에 존재하는 VAMP은 대부분 이러한 분해작용 중 하나의 결과로 제거된다. 세로타입 A 및 E는 SNAP-25를 절단한다. 세 로타입 C₁은 원래 신택신을 절단하는 것으로 여겨졌으나, 신택신 및 SNAP-25를 절단하는 것으로 밝혀졌다. 동일한 결합을 절단하는 타입 B(및 파상풍 독소)를 제외하고는, 각각의 독소는 상이한 결합을 특이적으로 절단한다.

모든 보툴리눔 독소 세로타입이 신경근육 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 보인다 하더라도, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용하며, 및/또는 이 단백질을 상이한 부위에서 절단한다. 예를 들어, 보툴리눔 타입 A 및 E는 모두 25kD 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)을 절단하지만, 이 단백질의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위를 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C₁은 신택신 및 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 보인다. 이러한 작용 메카니즘의 상이성은 여러 보툴리눔 독소 세로타입들의 작용에 의한 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 미칠 것이다. 특히, 보툴리눔 독소의 기질을 여러 상이한 세포 타입에서 발견할 수 있다. 예를 들어, GONELLE-GISPERT, C., et al., SNAP-25A AND-25B ISOFORMS ARE BOTH expressed in insulin-secreting cells and can function in insulin secretion, Biochem J. 1; 339 (pt 1): 159-65: 1999, 및 Boyd R. S. et al., The effect of BOTULINUM NEUROTOXIN-B ON INSULIN RELEASE FROM A 3-CELL LINE, 및 Boyd R. S. et al., The insulin secreting ∃-cell line, HIT-15, contains SNAP-25 which is a target for botulinum neurotoxin-A, both published at MOV DISORD, 10 (3) : 376 : 1995 참조 (췌장 섬 B 세포는 적어도 SNAP-25 및 시냅토브레빈을 포함함).

보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 흥미롭게도, 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 보툴리눔 독소는 관련된 비독성 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900k, 500Dk 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C₁은 700kD 또는 500kD 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500kD 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 두가지 비독소 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 포함하는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클수록(분자량이 약 150kD 이상), 보툴리눔 독소 복합체가 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다.

클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 의해서, 모든 보툴리눔 독소 세로타입이 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는 비활 성 단일 사슬 단백질로서 생성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C₁, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 아마도 알려진대로 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B은 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다.

보툴리눔 독소 및 보툴리눔 독소 복합체를, 예를 들어, List Biological Laborotories, Inc., Campbell, Califonia; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako(Osaka, Japan), Metabiologics(Madison, Wisconsin) 및 Sigma Chemicals of St Louis, Missouri로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물로는 사용전에 0.9% 염화 나트륨으로 재구성하는, 동결건조 분말 형태의 100 유닛 바이알로 된, Allergan, Inc., Irvine, califonia으로부터 입수가능한 BOTOX®(사람 혈청 알부민 및 염화나트륨이 있는 보툴리눔 독소 타입 A 신경독 복합체), 사용전에 0.9% 염화나트륨으로 재구성하는 분말형태인, lpsen Limited, Berkshire, U.K.로부터 입수가능한 Dysport®(사람 혈청 알부민 및 락토오즈가 있는 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소 헤마글루티닌 복합체 제제) 및 MyoBloc™(보툴리눔 독소 타입 B, 사람 혈청 알부민, 소디움 숙시네이트 및 염화 나트륨을 약 pH5.6으로 포함하는 주사액으로서, Elan Corporation, Dublin, Ireland로부터 입수가능)을 포함한다.

보툴리눔 독소 타입 A가 다양한 임상 조건을 처치하는데 성공함에 따라 다른 보툴리눔 독소 세로타입도 관심을 끌었다. 또한, 순수한 보툴리눔 독소를 사람을 처치하는 데 사용하였다. 예를 들어, KOHL A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (Suppl 3): 165 참조. 한편, 순수한 보툴리눔 독소를 사용하여 약제학적 조성물을 제조할 수 있다.

타입 A 보툴리눔 독소는 pH 4-6.8의 묽은 수용액에 용해되는 것으로 알려져 있다. 약 7 이상의 pH에서는 비독성 안정화 단백질이 신경독으로부터 분리되어, 그 결과 독성이 점차 소실되며, 특히 pH 및 온도가 상승할 때 그러하다. SCHANTZ E.J., et al. PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF botulinum toxin type A for human treatment (in particular pages 44-45), being CHAPTER 3 OF JANKOVIC, J., et al, THERAPY WITH BOTULINUM TOXIN, MARCEL DEKKER, Inc (1994) 참조.

독소 타입 A 복합체와 같은, 보툴리눔 독소 복합체(약 300-900kDa)뿐아니라, 보툴리눔 독소 분자(약 150kD)도 또한 표면 변성, 열, 및 알칼리 조건으로 인하여 극히 변성되기 쉽다. 비활성화 독소는 면역원성일 수 있는 톡소이드 단백질을 형성한다. 그 결과로 얻어진 항체로 인해, 환자에 독소를 주사하기 어려울 수 있다.

in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가, 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린(Habermann E. 등, Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J Neurochem 51(2);522-527:1988), CGRP, 물질 P 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다(Sanchez-Prieto, J. 등, Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem 165;675-681:1897). 따라서, 적당한 농도로 사용하는 경우, 보툴리눔 독소에 의해서 대부분의 신경전달물질의 자극-유발 방출이 억제된다. Pearce, L. B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science; and Medicine, Toxicon 35 (9); 1373-1412 AT 1393; Bigalke H.등., Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Chorlinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360 ; 318- 324: 1985; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin Of the release of [³H] Noradrenalin and [³H]GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44; 224-226: 1988, Bigalke H.등, Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316; 244- 251: 1981, and; Jankovic J. 등, Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, INC., (1994), page 5. 참조.

보툴리눔 독소 타입 A는 발효조에서 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 만들어 배양한 다음, 발효 혼합물을 공지의 방법으로 수확 및 정제하여 얻을 수 있다. 처음에는 모든 보툴리눔 독소 세로타입이, 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는, 비활성 단일 사슬 단백질로서 합성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C₁, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온 도에 따라 다르다. 그러므로, 아마도 알려진대로 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B은 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 동일한 투여량 레벨에서 보툴리눔 독소 타입 B는 보툴리눔 독소 타입 A에 비하여, 근육 주사시, 활성의 지속시간이 더 짧고 또한 효력이 떨어지는 것으로 알려져 있다.

클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A 종(Hall A strain)으로부터 ≥3 X 10⁷U/mg이고, A₂₆₀/A₂₇₈이 0.60 이하이고, 겔 전기영동에서 독특한 밴드 패턴을 보이는 특징을 가지는, 질 높은 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻을 수 있다. Shantz, E.J. et al., Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56:80-99:1992에 기재된 바와 같은, 공지의 산츠 프로세스(Shantz process)를 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 적절한 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A를 배양한 혐기성 발효물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 공지의 프로세스는 또한, 예를 들어: 분자량이 약 150 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 10⁸ LD₅₀ U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 A를 정제하거나; 분자량이 약 156 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 10⁸ LD₅₀ U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 B를 정제하거 나; 분자량이 약 155 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 10⁷ LD₅₀ U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 F를 정제하는 등의, 비독소 단백질들로부터 순수한 보툴리눔 독소들을 분리하여 얻는데 사용할 수 있다.

순수 보툴리눔 독소(즉, 150kD 보툴리눔 독소 분자) 또는 독소 복합체를 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다. 분자 및 복합체 모두 표면 변성, 열, 및 알칼리 조건으로 인한 변성에 민감하다. 비활성화된 독소는 면역원성일 수 있는 톡소이드 단백질을 형성한다. 그 결과로 얻어진 항체로 인해, 환자에 독소를 주사하기 어려울 수 있다.

일반적으로 효소에서 그렇듯이, 보툴리눔 독소들(이들은 세포내 펩티다아제임)의 생물학적 활성은, 적어도 일부분, 그들의 3차원적 구조에 따라 달라진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A는 열, 다양한 화학물질, 표면 긁힘 및 표면 건조에 의해서 독성이 제거될 수 있다. 또한, 공지의 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어진 독소 복합체를 아주 아주 낮은 독소 농도로 희석하여 약제학적 조성물 제제에 사용하는 경우, 적합한 안정화제가 없으면, 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다. 대량으로 희석하면 특이적 독성이 빠르게 손실되기 때문에, 수 밀리그램 양의 독소를 밀리리터당 수 나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은 상당히 어렵다. 독소를 함유하는 약제학적 조성물을 제조한 후, 수개월 또는 수년동안 사용할 수 있기 때문에, 독소는 알부민 및 젤라틴과 같은 안정화제를 사용하여 안정화하여야만 한다.

상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물이 BOTOX®(Allergan, Inc., of Irvine, Califonia으로부터 입수가능)라는 상표로 시중에 유통되고 있다. BOTOX®는 정제된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 알부민 및 염화나트륨으로 구성되며, 살균, 진공건조 형태로 포장된다. 보툴리눔 독소 타입 A는, N-Z 아민 및 효모 추출물을 함유하는 배지에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 홀 종(Hall strain)의 배양물로부터 제조한다. 배양물 용액으로부터 일련의 산 침전을 통하여, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 활성 고분자량 독소 단백질 및 관련 적혈구응집소 단백질로 구성되는 결정형 복합체로 정제한다. 결정형 복합체를 염수 및 알부민을 포함하는 용액에 재-용해하고, 살균 여과(0.2미크론)한 후, 진공건조한다. 진공건조된 제품은 냉동고에서 -5℃이하로 보관한다. 근육내 주사 전에, BOTOX®는 살균된, 방부제없는 염수로 재구성(reconstitute)될 수 있다. 각각의 BOTOX® 바이알은 방부제없는, 살균된, 진공-건조 형태로서, 약 100 유닛(U)의 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A 정제된 신경독 복합체, 0.5 밀리그램의 사람 혈청 알부민 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨을 함유한다.

진공-건조된 BOTOX®를 재구성하기 위해서, 방부제없는, 살균된 일반 염수; (0.9% 염화 나트륨 주사액)을 사용하여, 적정량의 희석제를 알맞은 크기의 주사기에 넣는다. BOTOX®는 거품내기 또는 유사한 격렬한 교반에 의해서 변성되므로, 희석제는 서서히 바이알에 주입한다. 살균 때문에, BOTOX®는 바이알을 냉동고에서 꺼내어 재구성한 후 4시간 내에 투여하는 것이 바람직하다. 이 4시간 동안, 재구성된 BOTOX®는 냉장고(2 내지 8℃)에 보관한다. 재구성되어 냉장보관된 BOTOX ®는 적어도 4주간 효능을 유지하는 것으로 보고되었다.(Neurology, 48: 249-53: 1997).

보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애의 치료를 위해 임상 세팅에 사용되고 있다. 보툴리눔 독소 타입 A (BOTOX®)는 1989년에 미국 식품의약청에 의해서, 12세 이상 환자에 대한 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 승인되었다. 2000년에, FDA는 타입 A(BOTOX®) 및 타입 B 보툴리눔 독소(MyoBloc™)의 상업적 제제를 경부 디스토니아의 처치에 대하여 승인하였고, 2002년에는, FDA가 타입 A 보툴리눔 독소(BOTOX®)를 특정한 운동과잉 (미간) 안면 주름의 미용적 처치에 대해 승인하였다. 말초 근육내 주사된 보툴리눔 독소 타입 A의 임상 효과는 보통 주사 후 일주일 이내에 나타나며, 때때로, 몇시간 이내이다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육내 주사에 의한 증상 구제(즉, 이완된 근육 마비)의 전형적인 지속시간은 약 3 개월이나, 다한증과 같은 선(gland)의 치료에 사용되는 경우, 어떤 케이스에서는 보툴리눔 독소의 효과가 몇년동안 지속된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 A는 12개월 이상 효과가 있을 것으로 알려져 있으며 (Naumann M. , ET AL., BOTULINUM TOXIN TYPE A IN THE TREATMENT OF FOCAL, AXILLARY AND PALMAR hyperhidrosis and OTHER HYPERHIDROTIC CONDITIONS, European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S115 : 1999), 어떤 경우에는 27개월 정도로 길다. RAGONA, R. M., et al, MANAGEMENT OF PAROTID SIALOCELE WITH BOTULINUM toxin, The Laryngoscope 109: 1344-1346: 1999 참조. 그러나, BOTOX®의 근육내 주사의 일반적인 지속시간은 전형적으로 약 3 내 지 4개월이다.

예를 들어, 하기와 같이, 다양한 임상 세팅에서 보툴리눔 독소 타입 A를 사용하는 것이 보고되었다:

(1) 여러 근육부위에 1회 근육내 주사당 약 75-125 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 경부 디스토니아(cervical dystonia)를 처치;

(2) 1회 근육내 주사당 5-10 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 미간 주름(이마 주름)을 처치(5 유닛을 비근근에 근육내 주사하고, 10 유닛을 각각의 추미근에 근육내 주사)

(3) 치골직장근에 약 30-80 유닛의 BOTOX®를 괄약근내 주사하여 변비를 처치

(4) 윗눈꺼풀의 측면연골전 안윤근 및 아래 눈꺼풀의 측면연골전 안윤근에, 근육당 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 안검경련을 처치

(5) 외안근에 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 사시를 치료, 주사량은 주사하는 근육의 크기 및 원하는 근육마비 정도(즉, 원하는 디옵터 교정 정도)에 따라 달라짐.

(6) 하기와 같이, 상이한 5부위의 상지 굴근에 BOTOX®를 근육내 주사하여 졸중 후의 상지 경련을 처치

(a) 심지굴근 : 7.5 U 내지 30 U

(b) 천지굴근 : 7.5 U 내지 30 U

(c) 척측수근굴근 : 10 U 내지 40 U

(d) 요측수근굴근 : 15 U 내지 60 U

(e) 상완이두근 : 50 U 내지 200 U

한번에 각각 상기한 5가지 근육에 주사하여, 각 처치 때마다 환자의 상지 굴근에 90 U 내지 360 U의 BOTOX®를 근육내 주사.

(7) 25 U의 BOTOX®를 두부 주위에 주사(미간, 전두근 및 측두근에 대칭적으로 주사)하여 편두통을 처치

25 U을 주사한 후 3개월간 편두통의 발생빈도, 최대강도, 수반되는 구토 및 급성의 약물사용의 감소정도로 측정할 때, 편두통의 예방처치로서 비히클에 견줄만한 상당한 장점을 제공함.

또한, 보고된 결과가 인상적이지는 않지만, 근육내 보툴리눔 독소를 파킨슨병이 있는 환자에서 진전의 처치에 사용하였다. Marjama-Lyons, J. et al, Tremor-Predominant Parkinson's Disease, Drugs & Aging 16(4);273-278:2000.

특정 위장 및 평활근 장애의 처치에 보툴리눔 독소를 사용하는 것이 공지되어 있다. 예를 들어, U. S. patents 5,427, 291 및 5,674, 205 (Pasricha) 참조. 또한, 보툴리눔 독소를 방광 괄약근에 경요도 주사하여, 배뇨장애를 처치하는 것이 공지되어 있고(예를 들어, Dykstra, D. D., et al, Treatment of detrusor-sphincter dyssynergia with botulinum A toxin : A double-blind study, Arch Phys Med Rehabil 1990 Jan ; 71: 24-6 참조), 보툴리눔 독소를 전립선에 주사하여, 전립선 비대증을 치료하는 것이 공지되어 있다. 예를 들어, U. S. patent 6,365, 164 (Schmidt) 참조.

U. S. patent 5,766, 605 (Sanders)는 침흘림 및 비염과 같은 다양한 자율신경계 장애의 처치에 보툴리눔 독소를 사용하는 것을 제안한다.

또한, 다한증 및 두통과 같은, 보툴리눔 독소로 처치가능한 다양한 질환들이 WO 95/17904(PCT/US94/14717)(Aoki)에서 논의되었다. EP 0 605 501 B1 (Graham)는 보툴리눔 독소를 사용한 뇌 마비의 처치를 논하였고, U. S. patent 6,063, 768 (First)는 보툴리눔 독소를 사용한 신경성 염증의 처치를 논하였다.

말초 부위에서 약리학적 작용을 하는 것 외에, 보툴리눔 독소는 또한 중추 신경계에서 억제 효과를 나타낼 수 있다. Weigand et al, (¹²⁵I) -LABELLED BOTULINUM A NEUROTOXIN : PHARMACOKINETICS in cats after intramuscular injection, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292,161-165), 및 Habermann, (¹²⁵I-LABELLED NEUROTOXIN FROM CLOSTRIDIUM botulinum A : preparation, binding to synaptosomes and ascent to the spinal cord, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281,47-56)은 역행 수송에 의해서 보툴리눔 독소가 척수 영역으로 올라갈 수 있다는 것을 보여준다. 이와 같이, 말초 부위에 주사된, 예를 들어, 근육내 주사된, 보툴리눔 독소가 척수로 역행 수송될 수 있다.

in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가, 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린 모두의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타 메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다.

미국 특허 5,989,545호는, 척수에 제제를 투여하는 방법으로, 특정 표적 잔기에 화학적으로 접합 또는 재조합적으로 융합된 변형 클로스트리디움 신경독 또는 이의 단편, 바람직하게 보툴리눔 독소를 동통 처치에 사용할 수 있음을 개시하였다.

보툴리눔 독소는 또한 다한증 처치(과도한 땀분비, U.S. patent 5,766,605), 두통 (U.S. patent 6,458,365), 편두통(U.S. patent 5,714, 468), 수술후 통증 및 장기통증(U.S. patent 6,464,986), 척수내 투여시의 통증(U.S. patent 6,113,915), 파킨슨 병에서 두개내 투여(U.S. patent 6,306,403), 머리카락 성장 및 머리카락 유지 (U.S. patent 6,299,893), 건선 및 피부염 (U.S. patent 5,670,484), 근육손상 (U.S. patent 6,423,319) 다양한 암 (U.S. patents 6,139,845), 췌장 질환(U.S. patent 6,143,306), 평활근 장애 (U.S. patent 5,437,291, 상부 및 하부 식도, 유문 및 항문 괄약근에 보툴리눔 독소를 주사하는 것을 포함), 전립선 장애(U.S. patent 6,365,164), 염증, 관절염 및 통풍(U.S. patent 6,063, 768), 소아뇌성마비(U.S. patent 6,395,277), 내이 질환(U.S. patents 6,265,379), 갑상선 질환(U.S. patents 6,358,513), 부갑상선 질환(U.S. patents 6,328,977)에 사용하는 것이 제안되었다. 또한, 제어 방출되는 독소 임플란트가 공지되어 있다(U. S. patents 6,306,423 및 6,312,708 참조).

쥐에 보툴리눔 독소를 정맥내 주사하여, 펜타가스트린(pentagastrin) 자극된 산 및 펩신 분비를 감소시킬 수 있다는 것이 보고되었다. KONDO T., et al., MODIFICATION OF THE ACTION OF PENTAGASTRIN ON ACID SECRETION BY botulinum toxin, Experientia 1977 ; 33: 750-1. 또한, 보툴리눔 독소를 사용하여, 위의 분비와 같은 위장의 분비를 감소시킬 수 있다고 여겨졌다. WO 95/17904, pages 16-17 참조. 또한, 보툴리눔 독소는 장의 신경계 질환에서, 위장 근육 장애의 처치를 위해서 뿐아니라(U. S. patent 5,437,291), 다양한 자율신경계 질환의 처치를 위해 제안되었다(U. S. patent 5,766,605). 개 위의 기저부에 보툴리눔 독소를 주사하였다. WANG Z., et al., EFFECTS OF BOTULINUM TOXIN ON GASTRIC MYOELECTRICAL AND vagal activities in dogs, Gastroenterology 2001 Apr; 120 (5 Suppl 1): A-718. 또한, 위 전정부에 보툴리눔 독소를 근육내 주사하여 비만을 처치하는 것이 제안되었다. 예를 들어, Gui D., et al., Effects of botulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions. A possible tool for correction of obesity ?, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002 JUN; 365 (SUPPL 2): R22; ALBANESE A. , ET AL., THE USE OF BOTULINUM TOXIN ON SMOOTH MUSCLES, EUR J NEUROL 1995 NOV; 2 (SUPP 3): 29-33, 및; Gui D., et al., BOTULINUM toxin injected in the gastric wall reduces body weight and food intake in rats, Aliment Pharmacol Ther 2000 Jun; 14 (6): 829-834 참조. 또한, 보툴리눔 독소 타입 A를 위에서의 분비를 제어하기 위해 치료학적으로 적용하는 것이 제안되었다. ROSSI S., et al., IMMUNOHISTOCHEMICAL LOCALIZATION OF SNAP-25 protein in the stomach of rat, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002; 365 (SUPPL 2): R37 참조.

특히, 이완불능증의 결과인 식도 궤양의 형성을 처치하기 위하여 보툴리눔 독소를 하부 식도 괄약근에 주사하는 것이 보고되었다. EAKER, E. Y., et al., UNTOWARD EFFECTS OF esophageal botulinum toxin injection in the treatment of achalasia, Dig Dis Sci 1997 Apr; 42 (4): 724-7. 유문 근육이 열릴 수 있게 하기 위하여, 유문전(prepyloric) 궤양이 있는 환자의 경련성 유문 괄약근에 보툴리눔 독소를 주사하는 것이 공지되어 있다. Wiesel P. H. et al., Botulinum toxin forrefractory postoperative pyloric spasm, Endoscopy 1997 ; 29 (2): 132.

파상풍 독소(tetanus toxin)뿐아니라, 이의 유도체(즉, 비-천연 표적 모체를 가진), 단편, 하이브리드 및 키메라를 또한 치료에 사용할 수 있다. 파상풍 독소는 보툴리눔 독소와 많이 유사하다. 즉, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 가깝게 연관된 종의 클로스트리디움(각각, 클로스트리디움 테타니 및 클로스트리디움 보툴리눔)에 의해 생성되는 폴리펩티드이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 단일 디설파이드 결합에 의해서 중쇄(분자량 약 100kD)에 공유 결합된 경쇄(분자량 약 50kD)로 구성된 2중 사슬 단백질이다. 그리고, 파상풍 독소 및 각각 7가지 보툴리눔 독소(비-복합체)의 분자량은 약 150kD이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 모두에서, 경쇄는 세포내 생물학적(프로테아제) 활성을 가지는 도메인을 포함하는 반면에, 중쇄는 수용체 결합(면역원성) 및 세포 막 전위 도메인을 포함한다.

또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 시냅스전 콜린성 뉴런 표면의 갱글리오사이드 수용체에 대하여 크고, 특이적인 친화도를 나타낸다. 말초 콜린성 뉴런에 의한, 파상풍 독소의, 수용체 매개 엔도시토시스로 인하여, 축색돌기 역행수송, 중앙 시냅스로부터의 억제성 신경전달물질 방출 차단 및 경련성 마비가 나타난다. 이에 반하여, 말초 콜린성 뉴런에 의한, 보툴리눔 독소의 수용체 매개 엔도시토시스는 역행 수송, 중독된 말초 운동 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스의 억제 및 이완성 마비를 거의 일으키지 않는다.

끝으로, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 생합성 및 분자 구성 모두에 있어 서로 닮았다. 즉, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 타입 A는 단백질 서열이 전체에 걸쳐 34% 동일하며, 몇몇 기능성 도메인에서는 서열이 62%나 동일하다. Binz T. et al., The Complete Sequence of Botulinum NEUROTOXIN Type A and Comparison with Other Clostridial Neurotoxins, J Biological Chemistry 265 (16); 9153-9158: 1990 참조.

아세틸콜린

전형적으로 포유류 신경계에서는, 각각의 형태의 뉴런에 의해서 단일 형태의 작은 분자 신경전달물질만이 방출된다. 이 신경전달물질 아세틸콜린은 뇌의 여러 부위의 뉴런, 특히, 운동피질의 큰 피라미드 세포, 대뇌핵의 몇가지 상이한 뉴런, 골격근에 분포하는 운동 뉴런, 자율신경계(교감신경계 및 부교감신경계 모두)의 신경절이전 뉴런에 의해서, 부교감신경계의 신경절이후 뉴런에 의해서 및 교감신경계의 신경절이후 뉴런 몇가지에 의해서 분비된다. 본래, 대부분의 교감신경계의 신경절이후 뉴런은 신경전달물질인 노르에피네프린을 분비하는데 비하여, 땀샘, 기모 근 및 몇몇 혈관으로의 신경절이후 교감신경 섬유만이 콜린성이다. 대부분의 경우, 아세틸콜린은 흥분효과를 나타낸다. 그러나, 아세틸콜린이 몇몇 말초 부교감신경 말단에서는 억제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 미주신경에 의한 심장박동의 억제).

자율신경계의 원심성 신호는 교감신경계 또는 부교감신경계를 통하여 몸에 전달된다. 교감신경계의 신경절이전 뉴런은 척수의 중간외측각에 위치하는 신경절이전 교감 뉴런 세포체로부터 뻗어나온다. 세포체로부터 뻗어나온 신경절이전 교감신경 섬유는, 척추주위 교감 신경절 또는 척추전 신경절에 위치하는 신경절이후 뉴런과 시냅스를 이룬다. 교감신경계 및 부교감신경계의 신경절이전 뉴런은 모두 콜린성이므로, 신경절에 아세틸콜린을 적용하면 교감 및 부교감 신경절이후 뉴런을 흥분시킬 것이다.

아세틸콜린은 두가지 형태의 수용체, 무스카린성 수용체 및 니코틴성 수용체를 활성화시킨다. 무스카린성 수용체는 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 콜린성 뉴런에 의해서 자극된 모든 효과기(effector) 세포에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 부신 수질뿐아니라, 교감신경계 및 부교감신경계 모두의 신경절이전과 신경절이후 뉴런 사이의 시냅스에서 신경절이후 뉴런의 세포 표면에 있는 자율신경절 내에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 또한 많은 비자율신경말단, 예를 들어, 신경근육 접합부의 골격근 섬유의 막에서 발견된다.

아세틸콜린은, 작은, 투명한, 세포내 소포가 시냅스전 뉴런성 세포막과 융합될 때, 콜린성 뉴런으로부터 방출된다. 부신수질(또한, PC12 세포라인) 및 췌장의 섬세포과 같은, 광범위한 비-뉴런성 분비 세포는 큰 고밀도 중심 소포(large dense-core vesicle)로부터 각각 카테콜아민 및 부갑상선 호르몬을 방출한다. PC12 세포라인은 교감신경부신 발달(sympathoadrenal develpoment) 연구를 위한 조직 배양 모델로서 광범위하게 사용되는 래트 크롬친화성세포종 세포의 클론이다. 탈신경된 세포에 독소를 투과가능하게 하거나(전기충격법 등에 의해서), 직접주사하면, 보툴리눔 독소는 in vitro에서 두가지 세포종류 모두에서 두가지 화합물 종류의 방출을 모두 억제한다. 보툴리눔 독소는 또한 피질의 시냅토솜 세포 배양물로부터 신경전달물질 글루타메이트가 방출되는 것을 억제하는 것으로 알려져 있다.

신경근육 접합부는 근육세포의 주변 축색돌기에 의해서 골격근에서 형성된다. 신경계를 통하여 전달된 신호는 말단 축색돌기에서 작용 포텐셜이 되고, 이온 채널을 활성화하며, 그 결과로 예를 들어, 신경근육 접합부의 운동 종판에서, 뉴런내 시냅스성 소포로부터 신경전달물질인 아세틸콜린이 방출된다. 아세틸콜린은 세포외 공간을 가로질러 근육 종판 표면의 아세틸콜린 수용체 단백질과 결합한다. 일단 충분하게 결합되면, 근육 세포의 작용 포텐셜이 특이적인 막 이온 채널 변화를 일으키고, 그 결과로 근육세포가 수축한다. 그리고 나서, 아세틸콜린은 근육세포로부터 방출되어, 세포외 공간에서 콜린에스테라아제에 의해서 대사된다. 대사생성물은 다시 아세틸콜린으로 재생하기 위해서 말단 축색돌기로 다시 회수된다.

따라서, 보툴리눔 독소의 생체적합성, 경구용 제형이 필요하다.

개요

본 발명은 이러한 요구를 충족시키며, 생체적합성, 보툴리눔 독소 경구용 제형을 제공한다.

본 발명에 따르면, 보툴리눔 독소는 위장 장애가 있는 환자의 위 또는 십이지장에서 독소 활성 성분을 방출하는 경구용 제형(oral formulation)으로서 조성된다. 보툴리눔 독소의 경구용 제형은 동결건조된 보툴리눔 독소 분말과, 밀가루, 설탕 또는 젤라틴과 같은 캐리어를 혼합한 다음, 혼합물을 압착하여 먹을 수 있는 정제로 만들면 쉽게 얻을 수 있다. 캐리어 및 압착량은, 결과로서 얻어진 정제(또는 이와 달리, 캐리어와 함께, 또는 캐리어 없이 치료학적인 양의 독소를 함유하는 캅셀을 형성할 수 있다)를 복용할 수 있게 선택되고, 캐리어가 위에서 신속히 용해되어 보툴리눔 독소 활성 성분을 방출하는 캐리어 및 캐리어의 특성을 가지는 것으로 선택된다.

본 발명은 위장 장애를 처치하기 위하여, 보툴리눔 독소의 반복 볼루스(repetitive bolus) 또는 피하주사와 관련된 공지된 문제점, 어려움 및 결함을 극복한 보툴리눔 독소 경구용 제형을 제공한다.

본 발명의 범주에 속하는 보툴리눔 독소 경구용 제형은 캐리어 및, 캐리어와 조합된 보툴리눔 독소를 포함할 수 있다. 독소는 캐리어와 혼합 및 캐리어로 캡슐화하여 캐리어와 조합함으로써, 보툴리눔 독소 송달 시스템, 즉, 보툴리눔 독소 경구용 제형을 형성할 수 있다. 경구용 제형은 경구 투여시 환자의 위장관에서 캐리어로부터 치료학적인 양의 보툴리눔 독소를 방출할 수 있다.

캐리어는 다수의 폴리머 마이크로스피어(즉, 폴리머 매트릭스)를 포함할 수 있으며, 상당량의 보툴리눔 독소가, 보툴리눔 독소를 캐리어와 조합하기 전에는, 보툴리눔 톡소이드로 전환되지 않는다. 따라서, 보툴리눔 독소를 캐리어와 조합하기 전의 보툴리눔 독소의 독성과 비교할 때, 캐리어와 조합된 보툴리눔 독소의 상당량이 실질적으로 변화되지 않은 독성을 가진다.

본 발명에 따라, 위장관에서 캐리어로부터 보툴리눔 독소가 방출될 수 있으며, 캐리어는 실질적으로 생분해가능한 물질로 구성된다. 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A,B,C₁,D,E,F 및 G 중의 하나이며, 보툴리눔 독소 타입 A가 바람직하다. 보툴리눔 독소는 약 1 유닛 내지 약 10,000 유닛의 양으로 캐리어와 조합될 수 있다. 바람직하게, 캐리어와 조합되는 보툴리눔 독소의 양은 약 10 유닛 내지 약 2,000 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A이다. 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 B인 경우, 바람직하게, 캐리어와 조합되는 보툴리눔 독소의 양은 약 500 유닛 내지 약 10,000 유닛의 보툴리눔 독소 타입 B이다.

본 발명의 상세한 실시형태는 폴리머 캐리어로 캅셀화된, 생분해가능한 폴리머와 약 10 유닛 내지 약 10,000유닛의 보툴리눔 독소를 포함하여, 서방형 시스템을 형성하고, 환자의 위장관에서 치료학적인 양의 보툴리눔 독소가 캐리어로부터 방출될 수 있다.

본 발명의 범주에 속하는 경구용 제형을 제조하는 방법은: 폴리머를 용매에 용해시켜 폴리머 용액을 형성하는 단계; 보툴리눔 독소를 폴리머 용액에 혼합 또는 분산시켜 폴리머-보툴리눔 독소 혼합물을 형성하는 단계, 및; 폴리머-보툴리눔 독소 혼합물을 응고 또는 경화시켜 보툴리눔 독소를 방출하는 경구용 제형을 만드는 단계로 이루어질 수 있다. 이러한 방법은 혼합단계 후에 용매를 증발시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 범주에 속하는 보툴리눔 독소 경구용 제형을 사용하는 방법으로, 보툴리눔 독소를 포함하는 폴리머 경구용 제형을 복용하여, 콜린성 신경분포에 영향을 받는 위장 장애를 처치할 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태는 폴리락타이드(polylactides) 및 폴리글리콜리드(polyglicolides)로 구성된 폴리머 그룹에서 선택된 폴리머를 포함하는 캐리어와, 캐리어와 조합된 안정화된 보툴리눔 독소를 포함하여, 보툴리눔 독소 송달 시스템을 형성하고, 사람환자가 경구용 제형을 경구 섭취시 위장관에서 치료학적인 양의 보툴리눔 독소가 캐리어로부터 방출될 수 있다. 캐리어는 다수의 분리된 세트의 폴리머성, 보툴리눔 독소 병합 마이크로스피어를 포함할 수 있으며, 각각의 세트의 폴리머는 상이한 폴리머 조성을 가진다.

본 발명에 따른 경구용 제형에 사용되는 보툴리눔 독소는: 생리학적 조건 하에서 뉴런 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 요소를 포함하는 제 1 구성요소, 뉴런 세포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 이동을 용이하게 할 수 있는 전위 요소를 포함하는 제 2 구성요소, 및 뉴런의 세포질에 존재할 때, 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스를 억제할 수 있는 치료 요소를 포함하는 제 3 구성요소를 포함할 수 있다. 치료 요소는 SNARE 단백질을 절단하여, 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스를 억제할 수 있고, SNARE 단백질은 신택신, SNAP-25 및 VAMP로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 일반적으로, 보툴리눔 독소에 의해 공격받는 뉴런은 예를 들어, 위장관 근육(평활위장근, 횡문위장근 및 평활근 및 횡문근이 혼합된 위장근) 또는 위장관 분비선 조직에 신경분포하는, 시냅스전, 콜린성 뉴런이다. 콜린성 뉴런은 보툴리눔 독소에 대하여 높은 친화도를 나타낼 수 있지만(즉, 독소에 대한 수용체를 통하여), 근육 세포 및 선 세포는 낮은 친화도 메카니즘을 통하여 독소를 직접적으로 흡수할 수 있다(즉, 음세포작용). 따라서, 뉴런 및 비-뉴런 세포가 모두 보툴리눔 독소의 표적일 수 있다.

본 발명의 범주에 속하는 지속적인 방출 시스템에 의해서 투여되는 보툴리눔 독소의 양은, 약 10^-3 U/kg 내지 약 35 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 A 및 약 2000 U/kg 이하의 다른 보툴리눔 독소, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B일 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 A 또는 보툴리눔 독소 타입B와 같은 특정 신경독의 치사량에 근접하기 때문에, 각각 35 U/kg 또는 2000 U/kg이 상한이다. 즉, 약 2000 유닛/kg의 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 타입 B 제제가 타입 B 보툴리눔 독소의 영장류 치사량에 근접한다는 것이 보고되었다. Meyer K. E. et al, A Comparative Systemic Toxicity Study of Neurobloc in Adult Juvenile Cynomolgus Monkeys, Mov. Disord 15 (Supp 2); 54; 2000.

바람직하게, 소정기간 동안 경구용 제형으로 투여되는 타입 A 보툴리눔 독소의 양은 약 10^-2 U/kg 내지 약 25 U/kg이다. 약 1000 U/kg 이하의 타입 B 보툴리눔 독소를 전신적이 효과없이 영장류에 근육내 투여할 수 있는 것으로 보고되었기 때문에, 바람직하게, 경구용 제형으로 투여되는 타입 B 보툴리눔 독소의 양은 약 10^-2 U/kg 내지 약 1000 U/kg이다. 동일문헌 참조. 더욱 바람직하게, 타입 A 보툴리눔 독소는 약 10^-1 U/kg 내지 약 15 U/kg의 양으로 투여된다. 가장 바람직하게, 타입 A 보툴리눔 독소는 약 1 U/kg 내지 약 10 U/kg의 양으로 투여된다. 많은 경우에, 약 1 유닛 내지 약 500 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A의 투여는 효과적이고 오래 지속되는 치료적 구제를 제공한다. 더욱 바람직하게, 약 5 유닛 내지 약 300 유닛의 보툴리눔 독소, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 A를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게, 약 10 유닛 내지 약 200 유닛의 신경독, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 A를 위장관 표적 조직에 국부 투여하여 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서는, 약 1 유닛 내지 약 100 유닛의 보툴리눔 독소, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 A를 본 발명의 경구용 제형을 경구투여함으로써 위장관 조직에 국부 투여하여 치료학적으로 효과적인 결과를 얻을 수 있다.

보툴리눔 독소는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 생성될 수 있다. 또한, 보툴리눔 독소는 변형 보툴리눔 독소, 즉, 천연 또는 와일드형 보툴리눔 독소와 비교할 때, 적어도 하나의 아미노산이 삭제, 변경 또는 치환된 보툴리눔 독소일 수 있다. 또한, 보툴리눔 독소는 재조합 제조된 보툴리눔 독소 또는 이의 유도체 또는 단편일 수 있다.

특히, 보툴리눔 독소에 의해 처치된 선 조직이, 독소 주사 후 27 개월 동안이나 길게, 감소된 분비 활성을 나타낼 수 있다는 것이 보고되었다. Laryngoscope 1999; 109: 1344-1346, Laryngoscope 1998 ; 108: 381-384.

본 발명은 신경독의 위장내 방출을 위한 경구용 제형 및 이러한 경구용 제형을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 경구용 제형은 보툴리눔 독소를 함유하는 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 경구용 제형은 경구투여시 효과적인 레벨의 신경독을 투여하도록 디자인된다.

또한, 본 발명은 생물학적으로 활성인 안정화된 신경독을 제어 방출하기 위한, 조성물 및 조성물의 제조 및 사용방법에 관한 것이다. 본 발명의 서방형(controlled release) 조성물은 생체적합성 폴리머의 폴리머 매트릭스, 및 생체적합성 폴리머 내에 분산된 생물학적으로 활성인, 안정한 신경독을 포함할 수 있다.

정의

본 명세서에서 하기의 정의가 적용된다.

"약"은 정량된 값의 ±10%를 의미한다.

"생체적합성(biocompatible)"은 경구용 제형의 섭취시 염증 반응이 미미한 것을 의미한다.

"생물학적으로 활성인 화합물"은 투여된 대상에서 이로운 변화를 일으킬 수 있는 화합물을 의미한다. 예를 들어, "생물학적으로 활성인 화합물"은 신경독을 포함한다.

생물학적으로 활성인 화합물에 적용되는 경우, "유효량"은 일반적으로 대상에서 원하는 변화를 일으키기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 예를 들어, 원하는 효과가 이완근육마비인 경우에, 화합물의 유효량은, 심각한 전신 중독 반응을 일으키지 않으면서, 마비를 원치않는 주변 근육의 심각한 마비를 야기하지 않으면서, 원하는 근육의 적어도 실질적인 마비를 야기하는 양이다.

경구용 제형의 비-활성 성분(매트릭스를 형성하기 위한 폴리머 또는 코팅 조성물과 같은)에 적용되는 경우, "유효량"은 생물학적으로 활성인 제제를 원하는 속도로 원하는 기간동안 방출하는 데에 긍정적인 영향을 주기에 충분한 비-활성 성분의 양을 의미한다. 예를 들어, 원하는 효과가 단일 경구 제형을 사용한 근육마비인 경우, "유효량"은 약 60일 내지 6년의 기간에 걸쳐 방출을 연장시키기에 용이할 수 있는 양이다. 이러한 "유효량"은 본 상세한 설명 및 당해 기술분야의 일반적인 지식에 기초하여 결정될 수 있다.

경구용 제형의 표면적의 양에 적용되는 경우, "유효량"은 근육 마비와 같은 원하는 효과를 달성하거나, 선(gland)의 분비 활성을 감소시키도록, 생물학적으로 활성인 화합물의 융해(flux)에 영향을 주기에 충분한 경구용 제형 표면적의 양이다. 특정 활성 화합물의 방출을 측정하여, 필요 면적을 결정 및 직접 조절할 수 있다. 경구용 제형 또는 경구용 제형 코팅의 표면적은 생물학적으로 활성인 화합물을 완전히 캡슐화하기 위해 필요한 막의 양이다. 표면적은 경구용 제형의 외형에 따라 달라진다. 바람직하게, 경구용 제형의 크기를 감소시켜, 가능한한 표면적을 최소화한다.

"경구용 제형(oral formulation)"은 약물 송달 시스템을 의미한다. 경구용 제형은 생물학적 활성이 있는 분자를 위한, 캐리어를 포함하거나 캐리어로서 작용할 수 있는 생체적합성 폴리머 또는 천연 물질로 구성된다. 경구용 제형은 사람 환자에 의해서 삼켜질 수 있도록 한다.

"신경독"은 신경근육 또는 신경선(neuroglandular) 접합부를 가로지르는 신경 임펄스 전달을 방해하거나, 신경전달물질의 뉴런 엑소시토시스를 차단 또는 감소시키거나, 뉴런의 나트륨 채널 전압 게이트에서 작용 포텐셜을 변경할 수 있는 제제를 의미한다. 신경독의 예로는, 보툴리눔 독소류, 파상풍 독소류, 색시톡신류 및 테트로도톡신이 있다.

"처치"는 포유류의 질병에 대한 어떤 처치를 의미하며: (i) 질병 발생 방지 또는; (ii) 질병억제, 즉, 진행을 정지; (iii) 질병의 구제, 즉, 증상 발생을 감소시키거나 질병의 역행을 야기하는 것을 포함한다.

신경독의 제어된 방출을 위한 본 발명의 범주에 속하는 경구용 제형의 제조방법은 생체적합성 폴리머를 폴리머 용매에 용해시켜 폴리머 용액을 형성하고; 생물학적으로 활성인 안정화된 신경독 입자를 폴리머 용액에 분산시키고, 폴리머를 응고시켜 신경독 입자가 분산된 폴리머 매트릭스를 형성하는 것을 포함한다.

본 발명은 보툴리눔 독소 및 보툴리눔 독소와 조합되어 고체 형태 보툴리눔 독소 경구용 제형을 형성하는 캐리어를 포함하는, 고체 형태 보툴리눔 독소 경구용 제형을 포함한다. 캐리어는 환자의 위장관에서 용해되어, 치료학적인 양의 보툴리눔 독소를 환자의 위장관에 방출하도록 조성될 수 있다. 또한, 점막부착, 부유, 침전, 팽창으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법에 의해서, 또는 위가 비워지는 것을 지연시키는 약리학적 제제를 동시 투여하여, 고체 형태 보툴리눔 독소 제형이 위 정체를 나타낼 수 있다. "위 정체(gstric retention)"는 점막부착, 부유, 침전, 팽창의 특성을 나타내도록 처치되지 않고, 또는 위가 비워지는 것을 지연시키는 약리학적 제제를 동시 투여하지 않고, 전형적으로 섭취된 음식물 또는 영양소의 위장관 체류 시간보다, 경구용 제형이 더 큰 체류 시간을 가지는 것을 의미한다.

바람직하게, 경구용 제형은 보툴리눔 독소를 캐리어와 조합하기 전에 보툴리눔 톡소이드로 전환된 상당량의 보툴리눔 독소를 포함하지 않는다. 따라서, 경구용 제형은 바람직하게 보툴리눔 독소를 캐리어와 조합하기 전의 보툴리눔 독소의 독성과 비교할 때, 독소가 실질적으로 변화되지 않은 독성을 가진, 캐리어와 조합된 보툴리눔 독소를 포함한다.

경구용 제형의 캐리어는 밀가루, 설탕 및 젤라틴으로 구성된 그룹에서 선택된 생체적합성, 생분해가능성 물질을 포함할 수 있다. 경구용 제형의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A,B,C₁,D,E,F 및 G로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A가 바람직하다. 캐리어와 조합되는 보툴리눔 독소의 양은 약 1 유닛 내지 약 10,000 유닛의 보툴리눔 독소 또는 약 10 유닛 내지 약 2,000 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A이다.

보툴리눔 독소는 생리학적 조건 하에서 뉴런 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 요소를 포함하는 제 1 구성요소; 뉴런 세포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 이동을 용이하게 할 수 있는 전위 요소를 포함하는 제 2 구성요소; 및 뉴런의 세포질에 존재할 때, 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스를 억제할 수 있는 치료 요소를 포함하는 제 3 구성요소를 포함할 수 있다. 치료 요소는 SNARE 단백질을 절단하여, 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스를 억제할 수 있다. SNARE 단백질은 신택신, SNAP-25 및 VAMP로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

본 발명의 범주에 속하는 다른 보툴리눔 독소 경구용 제형은 보툴리눔 독소 타입 A 및, 보툴리눔 독소 타입 A와 조합되어 보툴리눔 독소 경구용 제형을 형성하는 캐리어를 포함할 수 있으며, 캐리어는 심각한 면역계 반응없이 펩신성 궤양이 있는 환자의 위장관에서 치료학적으로 효과적인 양의 보툴리눔 독소 타입 A를 방출하도록 조성되고, 캐리어는 생체적합성, 생분해가능한 물질을 포함하며, 점막부착, 부유, 침전, 팽창으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법에 의해서, 또는 위가 비워지는 것을 지연시키는 약리학적 제제를 동시 투여하여, 고체 형태의 제어된 위 정체를 달성할 수 있다.

또한, 본 발명의 범주에 속하는 제형은, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소, 및 보툴리눔 독소와 조합된 생체적합성, 생분해가능성 및 비-독성 캐리어를 포함하는, 환자 위장관에 경구 투여하기 위한 보툴리눔 독소 제형을 포함할 수 있으며, 캐리어는 환자의 위장계에서 신속히 분해되는 특성을 가져서, 섭취된 보툴리눔 독소에 대한 심각한 면역계 반응 없이, 환자의 위장계에서 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 치료학적인 양으로 방출한다.

경구용 제형의 캐리어는 다수의 폴리머 마이크로스피어를 포함할 수 있다. 또는, 캐리어는 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 본 발명의 범주에 속하는 방법은 보툴리눔 독소의 경구용 제형을 경구 섭취하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소 경구용 제형을 사용하는 방법을 포함할 수 있다.

본 발명의 범주에 속하는 상세한 실시형태는,

(a) 폴리락타이드, 폴리글콜리드 및 폴리안하이드라이드로 구성된 폴리머 그룹에서 선택된 폴리머를 포함하는 캐리어;

(b) 캐리어와 조합되어 보툴리눔 경구용 제형을 형성하는 안정화된 보툴리눔 독소를 포함하며, 환자의 위장관에서 캐리어로부터 치료학적인 양의 보툴리눔 독소가 방출될 수 있는 보툴리눔 독소 경구용 제형일 수 있다.

상세한 설명

본 발명은 보툴리눔 독소의 치료학적으로 효과적인 경구용 제형을 알아낸 것에 기초한다. 즉, 본 발명자는 적합한 캐리어와 혼합된, 보툴리눔 독소 타입 A와 같은, 보툴리눔 독소를 경구 섭취하면, 이들이 위장관에서 용해되어, 치료학적인 양의 생물활성 보툴리눔 독소를 위장 장애 부위로 또는 그 근처로 송달할 수 있다는 것을 알아내었다. 전형적으로, 그후 며칠 이내에 위장 장애에 있어서 틀림없는 치유의 신호(완화)가 나타나며, 경구용 보툴리눔 독소 제형 투여후 몇 주 이내에 완전히 치료할 수 있다. 부작용으로서 위장근육의 운동성 감소 및 체중 감소를 포함할 수 있다.

치료학적인 양의 경구 투여 보툴리눔 독소는, 소화관 내막(gut lining)을 통해 순환계로 흡수될 수 있는 보툴리눔 독소로 인하여, 아주 적거나 대수롭지않은 전신적 효과를 나타낸다. 따라서, 전신적인 중독을 야기하지 않으면서, 200 유닛의 보툴리눔 독소를 당뇨병성 위마비(diabetic gastroparesis) 환자의 유문(위 하부) 괄약근에 주사할 수 있다. Crowell, M. D., et al., Botulinum toxin reduces pyloric dysfunction in patients with diabetic gastroparesis, Gastroenterology 2002 Apr; 122 (4 Supp 1): A451-A452. 보툴리눔 독소가 기형을 발생시킨다는 증거는 없지만, 본 명세서에 기재된 본 발명의 범주에 속하는 방법을 임신 중인, 수유 중인 또는 치료 기간 동안 임신계획이 있는 환자에게는 적용하지 않으려고 한다.

이론에 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 효능에 대한 생리학적 메카니즘을 제안할 수 있다. 즉, 보툴리눔 독소가, GI 근육의 운동성과 관련된 위장관의 콜린성 신경을 포함한, 콜린성 신경에 작용한다는 것은 잘 알려져 있다. Pasricha, P.J., Botulinum toxin for spastic gastrointestinal disorders, Bailliere's Clin Gastroenterol 1999; 13 (1) : 131-143. 또한, 위벽 세포(gastric parietal cells)에 의한 가스트린 분비 및 HCl 생성은, 위장관에서 신경선 접합부(neuroglandular junctions)에 작용하는, 미주신경 및 장근 섬유의 콜린성 활성에 강하게 의존적이다. Rossi S. , et al., Immunohistochemical localization of SNAP-25 protein in the stomach of rat, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002; 365 (Suppl 2): R37. 게다가, 보툴리눔 독소 타입 A BTX-A에 대한 세포내 기질(SNAP-25)이 위벽 세포에 존재한다. Gui D. , et al., Effects of botulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions. A possible tool for correetion of obesity ?, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002 Jun; 365 (Suppl 2): R22. 따라서, 보툴리눔 독소의 경구용 제형을 사용하여, 콜린성으로 신경분포된 위장관 근육의 운동성을 감소시키거나, 콜린성으로 신경분포된 위장관 선의 과도한 분비를 감소시켜, 많은 상이한 위장 장애들을 처치할 수 있다.

경구로 투여된 보툴리눔 독소는 위장관의 가혹한 환경에서도 생물활성이 남아있을 것으로 여겨진다. 즉, 보툴리눔 독소는 클로스트리디움계 박테리아에 의해, 많은 비-독소 단백질 분자로 둘러싸인 약 150kDa의 단일 사슬 단백질 독소 분자를 포함하는 복합체로서 분비된다. 특히, 비 독성 단백질은, 복합체가 위장관을 통과하는 동안, 산 가수분해 및 효소 변성으로부터 독소를 보호하는 작용을 하므로, 독소 복합체가 극단적인 pH 및 단백가수분해 효소의 가혹한 조건에서도 살아남아서, 여전히 매우 강력한 신경독으로서 기능할 수 있다. 보툴리눔 독소 분자와 복합체를 형성하는 비-독성 단백질이 위장관에서 소화성 산으로부터 150kDa 독소 분자를 보호하는 작용을 한다는 것이 입증되어 있다. Hanson, M. A. et al., Structural view of botulinum neurotoxin in numerous functional states, being chapter 2, pages 11-27 of Brin M. F. et al, editors, Scientific and therapeutic aspects of botulinum Toxin, Lippincott, Williams & Wilkins (2002).

본 발명의 범주에 속하는 보툴리눔 독소 경구용 제형은 치료학적인 양의 보툴리눔 독소를 위장 장애가 있는 환자의 위장관으로 방출할 수 있다. 방출된 보툴리눔 독소의 양은 (보툴리눔 독소 타입 A에 대하여) 약 10유닛(즉, 유아의 위장 운동성 장애를 치료하기 위해서)만큼 적은 것부터 500유닛(즉, 큰 성인의 다중 과다 분비 GI 선을 처치하기 위하여)만큼 많은 것까지 포함할 수 있다. 치료학적 효과를 위해 필요한 보툴리눔 독소의 양은 상이한 보툴리눔 독소 세로타입의 알려진 임상적 효능에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 A를 사용하여 달성할 수 있는 생리학적 효과와 비교할 때, 전형적으로 보툴리눔 독소 타입 B를 사용하면 몇 단위 더 큰 유닛이 필요하다.

본 발명의 범주에 속하는 경구용 제형에 의해서 치료학적 유효량으로 방출되는 보툴리눔 독소는 바람직하게, 실질적으로 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소이다. 다시 말해, 본 발명의 경구용 제형으로부터 방출되는 보툴리눔 독소는 높은 친화도로 콜린성 뉴런에 결합할 수 있으며, 적어도 일부가, 뉴런 막을 가로질러 전위될 수 있고, 뉴런 시토졸에서의 활성을 통해 뉴런으로부터 아세틸콜린의 엑소시토시스를 억제할 수 있다. 본 발명은 톡소이드의 면역원성으로 인한 항체의 발현(면역반응)을 통하여 보툴리눔 독소에 대한 면역을 부여하기 위해서, 항원으로서 보툴리눔 톡소이드를 의도적으로 사용하는 것은 그 범주에서 배제한다. 본 발명의 목적은 위장관에서 경구용 제형으로부터 보툴리눔 독소가 소량 방출되도록 함으로써, in vivo 환자의 위장관에서 엑소시토시스를 억제하여 원하는 치료 효과, 예를 들어, 근육 경직 또는 근육 긴장의 감소, 근육 수축 방지, 위장관내 콜린성 영향을 받는 분비 세포 또는 선으로부터의 과도한 분비의 감소를 달성하는 것이다.

보툴리눔 독소가 생분해가능한 캐리어에 실질적으로 균일하게 분산되도록 경구용 제형를 제조한다. 본 발명의 범주에 속하는 다른 경구용 제형은 생분해가능한 코팅제로 코팅된 캐리어를 포함할 수 있으며, 코팅의 두께나 코팅 물질은 다양하게 할 수 있다.

경구용 제형의 두께를 조절하여 본 발명의 조성물에 의한 물의 흡수, 즉, 신경독의 방출 속도를 제어할 수 있으며, 두꺼운 정제 및 캅셀제는 얇은 것들에 비하여 더욱 천천히 폴리펩티드를 방출한다.

신경독 서방형 조성물의 신경독은 또한 다른 부형제, 예를 들어, 벌크제 또는 동결건조동안 신경독을 안정화시키기 위한 완충제와 같은 부가적인 안정화제와 혼합될 수 있다.

캐리어는 바람직하게 비-독성, 비-면역학적, 생체적합성 물질을 포함한다. 적합한 경구용 제형 물질은 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트)(p-HEMA), 폴리(N-비닐 피롤리돈)(p-NVP)+, 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리디메틸 실록산(PDMS), 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체(EVAc), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리비닐피롤리돈/메틸아크릴레이트 공중합체, 폴리(락트산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리안하이드라이드, 폴리(오르도 에스테르), 콜라겐 및 셀룰로오스 유도체와 같은 폴리머, 및 히드록시아파타이트(HPA), 트리칼슘 포스페이트(TCP) 및 알루미노칼슘 포스페이트(ALCAP)와 같은 바이오세라믹을 포함할 수 있다.

생분해가능한 캐리어는 폴리(락타이드), 폴리(글리콜리드), 콜라겐, 폴리(락타이드-코-글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르아미드, 폴리안하이드라이드, 폴리(아미노산), 폴리오르도에스테르, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리(p-디옥산온), 폴리(알킬렌옥살레이트), 생분해가능한 폴리우레탄과 같은 폴리머, 이의 블렌드 및 코폴리머로부터 제조할 수 있다. 특히 바람직한 캐리어는 폴리(락트-코-글리콜산)("PLGA")와 같은 폴리머 또는 코폴리머로서 형성되며, 여기서, 락타이드:글리콜리드의 비는 원하는 캐리어 분해 속도에 따라 달라질 수 있다.

생분해가능한 PLGA 폴리머는 재흡수성 봉합사(resorbable sutures) 및 골판(bone plate)을 형성하는 데 사용되고 있으며, 몇몇 상업적인 마이크로입자 제형에서 사용되고 있다. PLGA는 대량 침식(bulk erosion)을 통하여 락트산 및 글리콜산을 생성하며, 다양한 분자량 및 폴리머 말단 그룹(예를 들어, 라우릴 알콜 또는 유리산)을 가진 것들이 상업적으로 입수가능하다.

폴리안하이드라이드(polyanhydrides)는 사람에 사용하는 것이 승인된 다른 그룹의 폴리머로서, 단백질 및 항체를 송달하는 데 사용되었다. PLGA와 달리, 폴리안하이드라이드는 표면 침식에 의해서 분해되어, 그 안에 잡혀있던 신경독을 캐리어 표면에서 방출한다.

적합한 경구용 제형을 제조하기 위하여, 캐리어 폴리머를 메틸렌 클로라이드 또는 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매에 용해시킨 다음, 폴리머 용액에 보툴리눔 독소를 혼합할 수 있다. 종래의 마이크로스피어 형성 방법은 용매 증발법 및 용매(코아세르베이션)법이다. 워터-인-오일-인-워터(W/O/W) 더블 에멀젼법이 PLGA 마이크로스피어 안으로 단백질 항체를 캡슐화하는 방법으로서 널리 사용된다.

보툴리눔 독소의 수용액을 또한 경구용 제형을 제조하는 데 사용할 수 있다. 신경독의 수용액을 폴리머 용액(적합한 유기 용매에 미리 용해시킨 폴리머)에 가한다. 유기(폴리머)용매의 부피에 대한 (신경독)수용액의 부피는, 마이크로스피어의 방출 특성을 결정하는 데 있어서, 그리고, 신경독의 캡슐화 효능(이론치 대 실험치 단백질 부하의 비)과 관련하여, 중요한 파라미터이다.

캡슐화 효능(encapsulation efficiency)은 또한 폴리머 용액의 운동학적 점도를 증가시킴으로써 증대될 수 있다. 폴리머 용액의 운동학적 점도는 조작 온도(operating temperature)를 감소시키거나, 및/또는 유기 용매 중의 폴리머 농도를 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다.

따라서, 수상(신경독) 대 유기상(폴리머)의 부피비가 작으면(즉, 수상 부피:유기상 부피가 ≤0.1ml/ml이면), 본질적으로 100%의 신경독이 마이크로스피어에 의해서 캡슐화될 수 있으며, 마이크로스피어는 3상태 방출: 최초 폭발(제 1 펄스), 방출되는 신경독이 거의 없거나 전혀없는 지체 단계 및 제 2 방출단계(제 2펄스) 를 나타낼 수 있다.

폴리머 조성물 및 분자량에 따라 달라지는 폴리머 분해 비율에 따라, 지체 단계의 길이가 달라진다. 따라서, 제 1 (폭발) 펄스 및 제 2 펄스 사이의 지체 단계는 락타이드 내용물이 증가됨에 따라 증가하거나, 락타이드:글리콜리드 비가 동일하게 유지되는 경우 폴리머 분자량이 증가함에 따라 증가한다. 수상(신경독) 부피가 낮은 것 외에, 상기한 바와 같이, 조작 온도가 낮으면(2-8℃), 캡슐화 효능이 증가할 뿐아니라, 최초 폭발이 감소되고, 온도적 비활성화에 대한 신경독의 안정성이 증가되는 것을 촉진한다.

in vivo에서 보툴리눔 독소와 같은 신경독을 제어 방출하기 위한, 본 발명의 범주에 속하는 적합한 경구용 제형은, 경구용 제형이 위장관에서 신경독을 방출하도록 제조될 수 있다.

바람직하게, 경구용 제형은 무시할 만한 독소 혈청 레벨로 보툴리눔 독소를 방출한다. 본 발명의 범주에 속하는 경구용 제형은 또한 경구 섭취를 위한 현탁액으로 제형될 수 있다. 이러한 현탁액은 예를 들어, 적합한 메쉬 스크린(예를 들어, 120 메쉬)이 끼워진 초원심분리기 밀에서 폴리락타이드/폴리펩티드 혼합물을 밀링하고, 선택적으로 종래의 점도 증가제 또는 현탁제, 오일 또는 경구 섭취를 위한 다른 공지의 적합한 액체 비히클과 함께, 주사용 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 물)에 밀링, 스크린된 입자를 현탁하여, 약제학 분야에 공지된 일반적인 기술로 제조할 수 있다.

바람직하게, in vivo에서 생물학적으로 활성인 신경독의 방출은 신경독의 방출기간동안 유의미한 면역계 반응을 야기하지 않는다.

바람직하게, 보툴리눔 독소 경구용 제형은 생분해가능한 폴리머 마이크로스피어로부터 보툴리눔이 생물학적으로 활성인 형태로, 즉, 실질적으로 변화되지 않은 독소 구조를 가지고 방출된다. 신경독을 안정화하기 위하여, 신경독을 경구용 제형 매트릭스를 형성할 수 있는 적합한 폴리머와 혼합하는데 사용할 수 있도록 만든 상태(즉, 동결건조된 신경독을 분말로 만듦)일 때 뿐아니라, 신경독이 선택된 폴리머의 매트릭스내에 존재 또는 병합된 동안, 다양한 약제학적 부형제를 사용할 수 있다. 적합한 부형제는 녹말, 셀룰로오스, 탈크, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 몰트, 라이스, 밀가루, 초크, 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 소디움 클로라이드, 알부민 및 탈지분유를 포함할 수 있다. 신경독 경구용 제형 내의 신경독은 부형제, 벌크제 및 안정화제, 및 동결건조 동안 신경독을 안정화시키는 완충제와 혼합될 수 있다.

안정화된 신경독은 +2가 이상의 적어도 한가지 형태의 다가 금속 양이온과 착물을 형성하는 생물학적으로 활성인, 비-응집(non-aggragated) 신경독을 포함할 수 있다는 것을 알아내었다.

적합한 다가 금속 양이온은 생체적합성 금속 양이온 성분에 포함된 금속 양이온을 포함한다. 금속 양이온 성분은, 양이온 성분이 사용량에서 수용자에 대해 비-독성이고, 또한 수용자의 신체에 심각한 해롭거나 부적당한 효과, 예를 들어, 제형의 경구투여시의 면역학적 반응이 없는 경우에, 생체적합성이 있다.

바람직하게, 신경독을 안정화하는 금속양이온에 대하여, 금속 양이온 성분 대 신경독의 몰비는 약 4:1 내지 약 100:1이며, 더욱 전형적으로 약 4:1 내지 약 10:1이다.

보툴리눔 독소는 아연 엔도펩티다아제로 알려져 있기 때문에, Zn++을 보툴리눔 독소를 안정화하기 위한 금속 양이온으로 사용하는 것이 바람직하다. 보툴리눔 독소는 2가 아연 엔도펩티다아제로 알려져 있기 때문에, 2가 아연 양이온이 바람직하다. 더욱 바람직한 실시형태에서, Zn++ 양이온을 포함하는, 금속 양이온 대 신경독의 성분의 몰비는 약 6:1이다.

해당 기술분야의 당업자라면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전 집중법(isoelectric focusing), 역상 크로마토그래피, HPLC과 같은 다양한 안정성 표시 기술 및 동결건조 후, 및 마이크로입자로부터 방출 지속기간동안 신경독의 효능을결정하는, 금속 양이온을 포함하는 신경독 동결건조 입자에 대한 효능 테스트를 실시하여 신경독을 안정화하기 위해 어떤 금속 양이온이 적합한 지 결정할 수 있다. 안정화된 신경독에 있어서, 신경독과 폴리머 용액이 접촉하기 전에, 적어도 한가지의 금속양이온과 신경독이 착물을 형성하므로, 신경독이 in vivo의 수화(hydration) 동안 마이크로입자 내에서 응집하거나, 및/또는 수화로 인해, 또는 서방형 조성물(sustained release composition)을 형성하는 프로세스로 인해, 또는 서방형 조성물의 화학적 특성으로 인해 생물학적 활성 또는 효능을 손실하는 경향이 감소된다.

본 발명에 있어서, 안정화된 신경독은 제어된 방출 기간 전체에 걸쳐, in vivo에서의 상당한 응집에 대하여 안정화된다. 상당한 응집(significant aggregation)은 약 15% 이상의 폴리머 캡슐화된 또는 폴리머 매트릭스 병합된 신경독이 응집되는 응집량으로서 정의된다. 바람직하게, 응집은 신경독의 약 5% 이하로 유지된다. 더욱 바람직하게, 응집은 폴리머 내에 존재하는 신경독의 약 2% 이하로 유지된다.

또다른 실시형태에서, 신경독 서방형 조성물은 또한 안정화된 신경독 입자에 포함되지 않고, 캐리어 내에 분산되는 제 2 금속 양이온 성분을 포함한다. 바람직하게 , 제 2 금속 양이온 성분은 안정화된 신경독에 포함되는 것과 동일한 종류의 금속 양이온을 포함한다. 이와 달리, 제 2 금속 양이온 성분은 하나 이상의 상이한 종류의 금속 양이온들을 포함할 수 있다.

제 2 금속 양이온 성분은 금속양이온의 저장소로 작용하여 금속 양이온에 의해 신경독이 안정화되는 기간을 더 연장시켜서 조성물 중의 신경독의 안정성을 향상시킴으로써, 경구용 제형의 폴리머 매트릭스로부터 신경독이 방출되는 것을 조절하는 작용을 한다.

방출을 조절하는 데 사용되는 금속 양이온 성분은 전형적으로 적어도 한가지의 다가 금속 양이온을 포함한다. 신경독 방출을 조절하는 데 적합한 제 2 금속 양이온 성분의 예로는, Mg(OH)₂, MgCO₃ (예를 들어, 4MgCO₃Mg(OH)₂5H₂0), ZnCO₃ (예를 들어, 3Zn(OH)₂2ZnC0₃), CaCO₃, Zn₃(C₆H₅0₇)₂, Mg(OAc)₂, MgS0₄, Zn(OAc)₂, ZnS0₄, ZnCl₂, MgCl₂ 및 Mg₃(C₆H₅0₇)₂이 포함된다. 제 2 금속 양이온 성분-대-폴리머의 적합한 비율은 중량으로 약 1:99 내지 약 1:2이다. 최적 비율은 사용되는 폴리머 및 제 2 금속 양이온 성분에 따라 다르다.

본 발명의 신경독 경구용 제형은 필름, 펠렛, 실린더, 디스크 또는 마이크로스피어와 같은 여러가지 형태로 형성될 수 있다. 마이크로스피어는, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 지름이 약 1 밀리미터 이하이고, 안정화된 신경독이 분산된 캐리어 성분을 포함한다. 마이크로스피어는 구형, 비-구형 또는 불규칙한 모양일 수 있다. 마이크로스피어는 모양이 구형인 것이 바람직하다. 전형적으로, 마이크로스피어는 경구 섭취를 위해 적합한 액체에 현탁된 것일 수 있다. 마이크로스피어의 바람직한 크기 범위는 지름이 약 1 내지 약 180 미크론이다.

생물학적으로 활성인, 비-응집 신경독의 위장 방출용 조성물을 형성하기 위한 본 발명의 방법에서는, 적합한 양의 생물학적으로 활성인, 안정화된 신경독 입자가 캐리어 중에 분산된다.

적합한 폴리머 캐리어 용매는, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 폴리머는 용해될 수 있으나, 안정화된 신경독은 실질적으로 용해되지 않으며, 비-반응성인 용매이다. 적합한 폴리머 용매의 예로는, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 아세톤과 같은, 극성 유기 액체가 포함된다.

생물학적으로 활성인, 안정화된 신경독을 제조하기 위하여, 금속이온과 신경독이 착물을 형성하기에 적합한 pH 조건하에서, 적어도 하나의 적합한 금속 양이온 성분을 가지는 적합한 수성 용매와 신경독을 혼합한다. 전형적으로 착물이 된 신경독은 용매 중에 현탁된 뿌연 침전물의 형태로 될 것이다. 그러나, 착물화된 신경독은 또한 용액 내에도 있다. 훨씬 더 바람직한 실시형태에서, 신경독은 Zn++과 착물이 된다.

신경독의 착물을 형성하기에 적합한 pH 조건은 전형적으로 약 5.0 내지 약 6.9의 pH 값을 포함한다. 적합한 pH 조건은 전형적으로 용매로서, 중탄산나트륨과 같은, 수성 완충용액을 사용하여 달성할 수 있다.

적합한 용매는, 수성 중탄산나트륨 완충용액과 같이, 신경독과 금속 양이온 성분을 각각 적어도 약간은 용해할 수 있는 것들이다. 수용액에 있어서 사용되는 물은 탈이온수 또는 주사용수(WFI)가 바람직하다.

신경독은 금속 양이온 성분과 접촉되기 전에, 고체 상태 또는 용해된 상태일 수 있다. 이와 달리, 금속 양이온 성분이 신경독과 접촉되기 전에, 고체 상태 또는 용해된 상태일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 신경독의 완충된 수용액이 급속 양이온 성분의 수용액과 혼합된다.

전형적으로, 착물이 된 신경독은 용매 중에 현탁된 뿌연 침전물 형태일 것이다. 그러나, 착물이 된 신경독은 또한 용액 상태일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 신경독은 Zn++과 착물이 된다.

그리고 나서, Zn++ 착물 신경독을, 예를 들어, 동결건조로, 건조하여, 안정화된 신경독의 입자를 형성할 수 있다. 현탁된 또는 용액 중의 Zn++ 착물 신경독은 대량으로 동결건조하거나, 작은 부피로 나누어 동결건조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, Zn++ 착물 신경독 현탁액을, 예를 들어, 초음파 노즐을 사용하여, 미분하고, 안정화된 신경독 입자를 형성하도록 동결건조한다. Zn++ 착물 신경독 혼합물을 동결건조하기 위한 허용가능한 방법은 해당 기술분야에서 공지된 것들을 포함한다.

또다른 실시형태에서는 또한, 안정화된 신경독 입자 중에 포함되지 않은 제 2 금속 양이온 성분을 폴리머 용액 중에 분산시킬 수 있다.

제 2 금속 양이온 성분 및 안정화된 신경독을 순차적으로, 순서를 반대로, 단속적으로, 개별적으로 또는 동시에 첨가하여 폴리머 용액 중에 분산시킬 수 있는 것으로 이해된다. 이와 달리, 폴리머, 제 2 금속 양이온 성분 및 안정화된 신경독을 순차적으로, 순서를 반대로, 단속적으로, 개별적으로 또는 동시에 첨가하여 폴리머 용매 중에 혼합할 수 있다. 이러한 방법에서는, 그 다음에, 폴리머 용매를 고체화하여 안정화된 신경독이 분산된 폴리머 매트릭스를 형성한다.

폴리머 용액으로부터 신경독 경구용 제형을 형성하는 데 적합한 방법으로 U. S. patents 3,737, 337; 3,523, 906; 3,691, 090; 및 4,389, 330에 기재되어 있는 용매 증발법이 있다. 신경독 경구용 제형을 형성하는 방법으로서 용매 증발을 사용할 수 있다.

용매 증발법에서는, 안정화된 신경독 입자가 분산된 폴리머 용액을 연속상(continuous phase)과 혼합하거나 흔들어서(이때, 폴리머 용매가 일부 섞일 수 있다), 에멀젼을 형성한다. 연속상은 보통 수성 용매이다. 에멀젼을 안정화하기 위하여 연속상에 종종 에멀젼화제가 포함된다. 그리고 나서, 수시간 이상 폴리머 용매를 증발시켜서, 폴리머를 고체화하여 안정화된 신경독 입자가 분산되어 그 안에 포함된 폴리머 매트릭스를 형성한다.

폴리머 용액으로부터 신경독 서방형 마이크로스피어를 형성하는 바람직한 방법이 U. S. patent 5,019, 400에 기재되어 있다. 상분리와 같은 다른 방법들과 비교하여, 이러한 마이크로스피어 형성 방법은, 특정 신경독 성분을 가지는 경구용 제형을 제조하는 데 필요한 신경독의 양을 추가적으로 감소시킨다.

이러한 방법에서, 안정화된 신경독이 분산된 폴리머 용액은 드롭렛(droplet)을 생성하도록 처리되며, 이러한 드롭렛의 상당 부분은 폴리머 용액 및 안정화된 신경독을 포함한다. 그리고 나서, 이러한 드롭렛을 마이크로스피어를 형성하는 데 적합한 방법으로 동결한다. 폴리머 용액 분산물이 드롭렛을 형성하도록 처리하는 방법의 예로는 초음파 노즐, 압력 노즐, 레일리 제트(Rayleigh jet)를 통해 분산시키는 것, 또는 용액으로부터 드롭렛을 생성하는 공지된 방법이 포함된다.

동결된 마이크로드롭렛 중의 용매를 고체 및/또는 액체로서 비-용매로 추출하여, 안정화된 신경독 함유 마이크로스피어를 형성한다. 헥산 또는 펜탄과 같은, 다른 비-용매와 함께 에탄올을 혼합하면, 에탄올 단독 사용시 달성되는 것 이상으로, 폴리(락타이드-코-글리콜리드)폴리머와 같은 특정 폴리머로부터의 용매 추출비를 증가시킬 수 있다.

폴리머 용액으로부터, 신경독 경구용 제형을 형성하는 또다른 방법은 필름 또는 형상을 형성하는, 몰드에서와 같은, 필름 캐스팅을 포함한다. 예를 들어, 안정화된 신경독이 분산된 폴리머 용액을 몰드에 넣은 후에, 불변 건조 중량의 필름 또는 형상이 얻어질 때까지, 공지된 방법으로 폴리머 용매를 제거하거나, 폴리머 용액의 온도를 감소시킨다.

생분해가능한 폴리머 경구용 제형의 경우, 폴리머의 분해로 인해 신경독이 방출된다. 분해 비율(rate of degradation)은 폴리머의 수화 비율에 영향을 주는 폴리머의 속성을 변경하여 제어할 수 있다. 이러한 속성에는 예를 들어, 락타이드 및 글리콜리드와 같은, 폴리머를 구성하는 상이한 모노머들의 비율; 라세미 혼합물 대신에 모노머의 L-아이소머 사용여부; 및 폴리머의 분자량이 포함된다. 이러한 속성은 폴리머의 수화 비율을 제어하는 친수성(hydrophilicity) 및 결정도(crystallinity)에 영향을 줄 수 있다. 또한, 염분, 탄수화물 및 계면활성제와 같은 친수성 부형제를 또한 병합하여, 수화를 증가시킬 수 있으며, 폴리머의 침식 비율을 변경할 수 있다.

생분해가능성 폴리머의 성질을 변경함으로써, 신경독 방출에 영향을 미치는 확산 및/또는 폴리머 분해를 제어할 수 있다. 예를 들어, 폴리(락타이드-코-글리콜리드)폴리머의 글리콜리드 성분을 증가시키고, 폴리머의 분자량을 감소시켜서 폴리머의 가수분해를 향상시킬 수 있으며, 그에 따라, 폴리머 침식으로 인한 신경독 방출을 향상시킬 수 있다. 또한, 마이크로스피어를 형성하는 데 사용되는 폴리머 용액에 산성 또는 염기성 부형제를 첨가하여 폴리머 침식 속도를 변경할 수 있다.

앞서 설명한 다양한 의학적 질환을 신경독을 사용하여 치료하기 위하여 공지의 파라미터들에 기초한 원하는 투여량의 신경독을 제공하도록, 본 발명의 범주에 속하는 경구용 제형을 사람에 투여할 수 있다.

투여하기 적합한 경구용 제형의 특정 투여량은 상기한 인자들에 따라 해당분야의 당업자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 투여량은 또한 처치 또는 탈신경화할 조직 덩어리의 크기, 및 상업적 독소 제제의 종류에 따라 달라질 수 있다. 또한, 다른 조직을 효과적으로 탈신경화하는 데 필요한 보툴리눔 독소량의 결정으로부터 외삽하여, 사람에 적합한 투여량을 추정할 수 있다. 즉, 주사될 보툴리눔 A의 양은 처치할 조직의 크기 및 활성레벨에 비례한다. 일반적으로, 원하는 근육 마비를 효과적으로 달성하기 위해서는, 보툴리눔 독소 타입 A의 경우, 환자 체중 1kg당 약 0.01 유닛 내지 약 35 유닛의 보툴리눔 독소가, 유닛 기간당(즉, 일정기간에 걸쳐 또는 2-4개월에 한번) 본 발명의 경구용 제형에 의해서 방출될 수 있다. 약 0.01 U/kg 이하의 보툴리눔 독소는 근육에서 유의미한 치료학적 효과를 나타내지 않으며, 약 35 U/kg 이상의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A와 같은 신경독의 중독 투여량에 근접한다. 경구용 제제는 조심스럽게 제조하여, 상당량의 보툴리눔 독소가 전신적으로 나타나는 것을 방지한다. 더욱 바람직한 투여량 범위는 약 0.01 U/kg 내지 약 25 U/kg의 보툴리눔 독소, 예를 들어 BOTOX®로 제형된 것이다. 투여될 보툴리눔 독소의 실제 U/kg 양은 처치할 조직의 범위(크기) 및 활성 레벨 및 선택된 투여 경로와 같은 인자들에 따라 달라진다. 보툴리눔 독소 타입 A는 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 보툴리눔 독소 세로타입이다.

바람직하게, 본 발명의 범주에 속하는 방법을 실시하기 위해 사용되는 신경독은 보툴리눔 독소 세로타입 A,B,C,D,E,F 또는 G와 같은, 보툴리눔 독소이다. 바람직하게, 사람에서의 효능이 크고, 쉽게 입수할 수 있으며, 근육내 주사로 국부 투여하여 골격근 및 평활근 장애를 처치하기 위한 안전하고 효과적인 사용방법이 공지되어 있는 보툴리눔 독소 타입 A를 보툴리눔 독소로서 사용한다.

본 발명은 그 범주 내에, 운동 장애 또는 콜린성 신경분포에 영향을 받는 고통을 처치하는 데 사용할 때, 지속시간이 긴 치료학적 효과를 가지는 신경독의 용도를 포함한다. 예를 들어, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 부티리쿰 또는 클로스트리디움 베라티와 같은 독소 생성 클로스트리디움계 박테리아의 어떤 종에서 생성되는 신경독을 사용하거나, 본 발명의 방법에 사용하도록 개조할 수 있다. 또한, 보툴리눔 세로타입 A, B, C, D, E, F 및 G 모두를 본 발명의 실시에 유리하게 사용할 수 있으나, 상기한 바와 같이 타입 A가 가장 바람직한 세로타입이다. 본 발명을 실시하면 1개월 내지 약 5 또는 6년간 효과적인 구제를 제공할 수 있다.

본 발명의 범주에는: (a) 박테리아 배양, 독소 추출, 농축, 방부, 동결 건조 및/또는 재조합에 의해 얻어지거나 처리된, 순수 신경독 및 신경독 복합체; 및 (b) 공지의 화학적/생화학적 아미노산 변형 방법에 의해서, 또는 공지의 숙주세포/재조합 벡터 재조합 기술을 사용하여, 하나이상의 아미노산 또는 아미노산 서열을 고의로 제거, 변형 또는 치환한, 변형 또는 재조합 신경독, 및 이렇게 만들어진 신경독의 유도체 또는 단편이 포함되며, 세포에 존재하는 세포 표면 수용체에 대한 하나 이상의 표적 잔기가 부착된 신경독이 포함된다.

본 발명에 따라 사용되는 보툴리눔 독소는 동결건조 또는 진공건조된 상태로 진공하에서 용기내에 보관할 수 있다. 동결건조하기 전에, 보툴리눔 독소를 알부민과 같은, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 안정화제 및/또는 캐리어와 혼합할 수 있다. 동결건조 또는 진공 건조된 물질은 염수 또는 물로 재구성할 수 있다.

본 발명은 또한 그 범주 내에 GI 장애로부터의 치료학적 구제를 제공하기 위한 경구용 제형의 용도를 포함한다. 따라서, 신경독은 삼킬 수 있는 적합한 폴리머 매트릭스에 끼워지거나, 흡수되거나 넣어질 수 있다.

적합한 투여량을 결정하는 방법은 일반적으로 주치의에 의해 케이스별로 결정된다. 이러한 결정은 해당 기술분야의 당업자에게는 일상적인 것이다(예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine(1998), edited by Anthony Fauci 등, 14th edition, published by MaGraw Hill 참조). 따라서, 본 발명의 범주에 속하는 경구용 제형은 삼켜서 투여할 수 있다.

마이크로스피어에 캡슐화될 때, 동결건조된 파상풍 톡소이드의 상당량의 수분이 고체상 응집 및 톡소이드 불활성화를 야기할 수 있다. 즉, 5%의 수분이 있는 경우 약 5% 의 톡소이드만 응집하는 반면에, 10%(단백질 100그램당 물 10그램)의 파상풍 톡소이드 수분이 있는 경우, 약 25%의 독소가 응집될 수 있다. 예를 들어, Pages 251, Schwendeman S. P. et al., Peptide, Protein, and Vaccine Delivery From Oral formulationable Polymeric Systems, chapter 12 (pages 229-267) of Park K. , Controlled Drug Delivery Challenges and Strategies, American Chemical Society (1997) 참조. 특히, BOTOX®의 제조공정을 통해서는 수분이 약 3% 미만인 동결건조된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 얻으며, 이러한 수분 레벨에서는 무시할 만한 정도의 고체상 응집을 기대할 수 있다.

생분해가능한 보툴리눔 독소 경구용 제형의 일반적인 제조방법은 다음과 같다. 경구용 제형은 약 25% 내지 약 100%의 폴리락타이드(락트산 단독 폴리머)를 포함할 수 있다. 경구용 제형중 락타이드의 양을 증가시키면 경구용 제형의 생분해가 시작하기 전의 기간을 증가시킬 수 있으며, 따라서 경구용 제형으로부터 보툴리눔 독소의 방출되는 시간이 증가된다. 경구용 제형은 또한 락트산과 글리콜산의 코폴리머일 수 있다. 락트산은 라세미혼합물 또는 광학활성형일 수 있으며, 벤젠에 용해되며 0.093(클로로포름 100ml 당 1g) 내지 0.5(벤젠 100ml 당 1g)의 고유 점도를 가지거나, 아니면, 벤젠에 용해되지 않으며 0.093(클로로포름 100ml 당 1g) 내지 4(클로로포름 또는 디옥신 100ml 당 1g)의 고유 점도를 가질 수 있다. 경구용 제형은 또한 캐리어 폴리머에 균일하게 분산된 0.001% 내지 50%의 보툴리눔 독소를 포함할 수 있다.

일단 경구용 제형이 물을 흡수하기 시작하면, 두가지의 연속적이고, 일반적으로 구별되는 단계의 신경독 방출이 나타날 수 있다. 제 1 단계에서, 신경독은 경구용 제형의 외측 표면과 통하는 수용성 신경독 부분의 최초 확산을 통해 방출된다. 제 2 단계는 생분해가능한 캐리어(즉, 폴리락타이드)가 분해된 결과, 신경독이 방출할 때 나타난다. 확산 단계 및 분해-유도 단계는 시간적으로 구별할 수 있다. 경구용 제형이 수용성 생리학적 환경에 놓이게 되면, 폴리머 매트릭스 안으로 물이 확산되고, 신경독과 폴리락타이드가 분할되어 수용성 신경독 영역이 형성된다. 연속된 수용성 신경독 영역이 경구용 제형의 외측 표면과 통하기에 충분한 레벨에 도달할 때까지, 물의 흡수가 증가하면 수용성 신경독 영역(aqueous neurotoxin region)이 증가한다. 따라서, 실질적으로 남아있는 신경독이 모두 방출될 때까지 제 2 단계가 지속되는 동안, 수용성 신경독 영역으로부터 형성된 수용성 폴리펩티드 채널을 통하여 경구용 제형으로부터 신경독이 방출되기 시작한다.

또한, 본 발명의 범주에는 신경독 캡술화된 마이크로스피어를 적합한 액체, 예를 들어, 생리식염수에 현탁하여 제조한 현탁액 형태의 경구용 제형이 포함된다.

하기의 실시예들은 본 발명에 속하는 특정한 조성물 및 방법을 설명하는 것으로서, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

경구 섭취용 보툴리눔 독소 정제의 제조방법

보툴리눔 독소를 위 및 십이지장에서 독소 활성 성분을 방출시키는 경구용 제형으로 조성할 수 있다. 막자와 막자사발을 사용하여, 재구성되지 않은 BOTOX®와 같은 상업적으로 입수가능한 동결건조된 보툴리눔 독소 분말 50 유닛(또는 DYSPORT® 분말 200유닛)을 밀가루 또는 설탕과 같은 생분해가능한 캐리어와 혼합함으로써(실온에서 물 또는 염수를 첨가하지 않고) 쉽게 달성할 수 있다. 이와 달리, 분말화된 독소가 캐리어 내에 미세하게 분산되도록, 균질화하거나 초음파처리하여 보툴리눔 독소를 혼합할 수 있다. 그리고 나서, 혼합물을 정제 제조 장치(Scheu & Kniss, 1500 W. Ormsby Ave, Louisville, KY 40210로부터 입수 가능한 정제 프레스와 같은)로 압착하여 경구섭취가능한 정제로 만든다. 이와 달리, 공지된 방법에 따라 독소를 젤라틴과 함께 조성하여 경구 섭취가능한 젤탑(geltab)을 만들 수 있다.

실시예 2

비만 처치 방법

실시예 1의 보툴리눔 독소 경구용 제형을 투여하여 42세 남자 비만 환자를 처치하였다. 환자는 1개의 50유닛 타입 A 정제를 매일 4일간 복용하였다. 확실한 위장 운동성이 감소로 인하여, 2주 내에 환자는 10 파운드를 감량하였고, 네째주가 끝날 때는 20 파운드까지 감량하였다.

실시예 3

생분해가능한 보툴리눔 독소 경구용 제형의 제조방법

적당한 양의 안정화된 보툴리눔 독소 제제(즉, 재구성되지 않은 BOTOX®)를 디클로로메탄과 같은, 휘발성 유기용매 중의 생분해가능한 폴리머로 구성된 연속상에 분산시켜 보툴리눔 독소 및 적합한 캐리어 폴리머를 포함하는 생분해가능한 경구용 제형을 제조할 수 있다. PLGA 및 폴리안하이드라이드는 모두 물에 녹지 않으 므로, 마이크로캡슐화 프로세스에서 유기용매를 사용할 필요가 있다.

마이크로스피어 제조를 용이하게 하기 위하여, 폴리머를 메틸렌 클로라이드 또는 에틸 아세테이트와 같은 유기용매에 용해시킨다. 그리고 나서, 수용성 단백질 용액을 사용하는 경우 에멀젼으로서, 또는 고체 단백질 제형을 폴리머-유기용매 용액과 혼합하는 경우 현탁액으로서, 폴리머/유기용매중에 독소가 미세하게 분산되도록 균질화 또는 초음파 처리하여 보툴리눔 독소를 혼합한다. 종래의 마이크로스피어 형성방법은 용매 증발법 및 용매(코아세르베이션)법이다. 마이크로스피어는 미리 형성된 단백질 약물 현탁액을 폴리머-유기용매와, 에멀젼화제(즉, 폴리비닐 알콜)를 포함하는 물과 혼합하여 형성할 수 있다. 그리고 나서, 추가로 물을 가하여 마이크로스피어로부터 유기용매를 제거하여 고형화되는 것을 용이하게 할 수 있다. 최종 마이크로스피어를 건조하여 자유 유동 분말(free flowing powder)을 생성한다.

사용되는 폴리머는 PLA, PGA 또는 이들의 코-폴리머일 수 있다. 이와 달리, 보툴리눔 독소 병합 폴리머는 신경독의 수용액(즉, 재조합된 BOTOX®)을 폴리머-유기상에 에멀젼화하여(W/O 에멀젼을 얻음) 제조할 수 있다. 고속 교반기 또는 초음파를 사용하여, 독소를 폴리머와 균질하게 혼합할 수 있다. 에멀젼을 뜨거운 공기의 스팀으로 분무하여, 용매 증발을 통한 입자형성을 유도함(스프레이-건조 기술)으로써, 1-50㎛ 지름의 마이크로입자를 형성할 수 있다. 이와 달리, 비-용매 첨가, 예를 들어, 실리콘 오일(상 분리 기술)을 통해, 또는 W/O/W 에멀젼을 제조(더블 에멀젼 기술)하여, 폴리머의 코아세르베이션으로 입자를 형성할 수 있다.

약 pH 7 이상의 pH에서는 신경독 안정화 단백질이 보툴리눔 독소로부터 분리되어 독성이 점차 손실될 수 있기 때문에, 보툴리눔 독소가 혼합되는 캐스팅 또는 다른 용액의 pH는 pH 4.2-6.8로 유지한다. 바람직하게, pH는 약 5-6 사이이다. 또한, 용액/혼합물을 약 40℃이상으로 가열하면 독소가 독성을 잃기 쉽기 때문에, 혼합물/용액의 온도는 약 35℃를 초과해서는 안된다.

드롭렛을 동결하여 마이크로스피어를 형성하는 방법으로는, 드롭렛을 액화 아르곤 및 액화질소와 같은 액화 가스 안으로 또는 그 근처로 향하게 하여 동결된 마이크로드롭렛을 형성한 다음, 액화 가스로부터 분리하는 것을 포함한다. 그리고 나서, 에탄올, 또는 헥산 또는 펜탄과 혼합된 에탄올과 같은 액상 비-용매에 동결 마이크로드롭렛을 노출시킬 수 있다.

다양한 크기의 보툴리눔 독소 경구용 제형 마이크로입자를, 예를 들어, 초음파 노즐 지름을 변경하여, 드롭렛 크기를 변화시킴으로서 제조할 수 있다. 매우 큰 마이크로스피어가 필요한 경우, 실린지를 통하여 곧바로 차가운 액체 속으로 마이크로입자를 압출성형할 수 있다. 또한, 폴리머 용액의 점도를 증가시키면 마이크로입자의 크기가 증가된다. 이러한 방법으로, 예를 들어, 지름 범위가 약 1000 이상 내지 약 1 마이크로미터인 마이크로입자를 제조할 수 있다. 그리고 나서, 경구 섭취가능한 캡슐을 보툴리눔 독소 병합 마이크로입자로 충진하고 밀봉하여 보툴리눔 독소 경구용 제형을 제조할 수 있다.

이와 달리, 캡슐을 충진하기에 충분한 물질의 부피를 제공하기 위한, 밀가루 또는 설탕과 같은, 비활성 캐리어 적당량과 혼합된, 재구성되지 않은 BOTOX(마이크 로스피어로 가공하지 않음) 분말 적당량으로 충진할 수 있다.

실시예 4

폴리안하이드라이드 보툴리눔 독소 경구용 제형의 제조방법

폴리-카르복시페녹시프로판과 세바식 산(sebacic acid)의 20:80 비율 코폴리머로서 생분해가능한 폴리안하이드라이드 폴리머를 제조할 수 있다. 폴리머 및 보툴리눔 독소(재구성되지 않은 BOTOX®와 같은)를 실온에서 메틸렌 클로라이드에 공-용해하고, 실시예 3의 기술을 사용하여 마이크로스피어로 스프레이-건조할 수 있다. 진공 데시케이터에서 남아있는 메틸렌 클로라이드를 모두 증발시킬 수 있다.

필요한 경구용 제형의 크기, 그에 따른 보툴리눔 독소의 양에 따라서, 적합한 양의 마이크로스피어를 몰드에서 약 8000 p.s.i로 5초간 또는 3000 p.s.i로 17초간 압착하여 신경독을 캡슐화한 경구용 제형 디스크를 형성할 수 있다. 따라서, 마이크로스피어를 지름 1.4cm 및 두께 1.0mm의 디스크로 프레스하여 압착 몰딩하고, 질소대기 하에서 알루미늄 호일 파우치로 포장하고, 2.2 X 10⁴ Gy 감마선 조사로 멸균할 수 있다.

실시예 5

생분해가능한 보툴리눔 독소 경구용 제형을 제조하기 위한 워터 인 오일법

폴리글리콜산과 폴리락트산의 80:20 코폴리머를 실온에서 부드럽게 저으면서 10% w/v의 디클로로메탄에 용해하여, 보툴리눔 독소 경구용 제형을 제조할 수 있다. 그리고 나서, 트윈 80(폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노올레이트, Acros Organics N. V., Fairlawn, NJ에서 입수가능)과 Span 85(소르비탄 트리올레이트)의 1:5 혼합물 1부 및 75 유닛의 BOTOX®(보툴리눔 독소 타입 A 복합체)와 Quil A(보조제)의 수성 혼합물 11부에 폴리머 용액 88부를 가하여 워터-인-오일 타입 에멀젼을 제조할 수 있다. 고속 블렌더를 사용하여 혼합물은 휘저은 다음, 60/100/120 노즐이 장착된 Drytec Compact Laboratory Spray Dryer를 사용하여 분무압 15psi, 입구 온도 65℃에서 즉시 스프레이-건조한다. 얻어진 마이크로스피어는 지름이 약 20㎛이고, 자유-유동 분말로서 수집된다. 진공 증발시켜 남아있는 흔적량의 유기 용매를 제거한다.

실시예 6

생분해가능한 보툴리눔 독소 경구용 제형의 저온 제조 방법

독소 변성을 방지하기 위하여, 하기와 같이 보툴리눔 독소 경구용 제형을 저온에서 제조할 수 있다. 저온(2-8℃)에서 메틸렌 클로라이드 또는 에틸 아세티이트 1ml 당 0.3g의 PLGA를 폴리머-유기용액 1ml 당 0.1ml의 신경독 용액과 혼합한다. 실시예 1에서 설명한 바와 같이(폴리머를 메틸렌 글로라이드에 용해시켜 폴리머 용액을 형성한다), 고유 점도(dL/g)가 약 0.62인 75:25 락타이드:글리콜리드 폴리머(MTI로부터 입수가능)로부터 보툴리눔 독소 병합 마이크로스피어를 제조하였고, 이는 환자의 위장관에서 분해될 수 있다.

본 명세서에 기재한 본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 하기한 많은 이점을 가진다:

1. 단일 경구용 제형을 사용하여 치료학적으로 효과적이고 1년 이상의 기간 에 걸쳐 지속되는 신경독 투여를 제공할 수 있다.

2. 상당량의 신경독이 전신적으로 나타나지 않으면서, 신경독을 국부 조직으로 송달할 수 있다.

3. 환자의 추적 조사 관리(follow up care)의 필요성이 감소된다.

4. 신경근육 장애와 같은 질환을 처치하기 위하여 신경독을 주기적으로 주사할 필요가 감소된다.

5. 주사할 필요가 없으므로, 환자의 편의성이 증대된다.

6. 환자의 복약이행성(compliance)이 향상된다.

본 발명의 신경독 경구용 제형의 장점은 위장 표적 조직에 신경독을 일정한 치료 레벨로 신속하게 송달하는 것을 포함한다. 장점은 또한 환자의 복약이행성 및 허용성(acceptance)의 증가를 포함한다.

본 명세서에서 인용한 모든 참조문헌, 기사, 공보 및 특허 및 특허 출원이 온전히 본 명세서에 참조로 병합되어 있다.

본 발명을 바람직한 방법에 관련하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범주 내에서 다른 실시형태, 개조 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 광범위한 종류의 신경독을 본 발명의 방법에 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 경구용 제형을 통하여 두가지 이상의 보툴리눔 독소를 동시에 또는 연속하여 투여되는 경구용 제형을 포함한다. 예를 들어, 임상적인 반응이 손실되거나, 항체 발현이 중성화될 때까지 경구용 제형을 통하여 보툴리눔 독소 타입 A를 투여한 다음, 보툴리눔 독소 타입 B 또는 E의 적합한 경구용 제형을 투여할 수 있다. 이와 달리, 바람직 한 치료결과의 개시 및 지속시간을 제어하기 위하여 둘 이상의 보툴리눔 세로타입 A-G의 혼합물을 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 보툴리눔 독소와 같은 신경독이 치료 효과를 발휘하기 전에 탈신경화의 향상된 또는 더욱 신속한 개시와 같은 부가 효과를 얻기 위해, 경구용 제형을 통한 신경독 투여 전에, 동시에 또는 후에 비신경독 화합물을 투여할 수 있다.

본 발명의 범주에는 또한 보툴리눔 독소와 같은 신경독을 사용하여, 위장 장애를 처치하기 위한 경구용 제형 의약품을 제조하는 방법이 포함된다.

따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안된다.

Claims

(a) 보툴리눔 독소, 및;

(b) 보툴리눔 독소와 조합되어 고체형 보툴리눔 독소 경구용 제형을 형성하는 캐리어를 포함하며,

(i) 캐리어는 환자의 위장관에서 용해되어, 환자의 위장관에 치료학적인 양의 보툴리눔 독소를 방출하는 것을 특징으로 하는, 고체형 보툴리눔 독소 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 보툴리눔 독소와 캐리어를 조합하기 전에 상당량의 보툴리눔 독소가 보툴리눔 톡소이드로 전환되지 않는 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 캐리어와 조합된 보툴리눔 독소의 상당량이, 보툴리눔 독소와 캐리어를 조합하기 전의 보툴리눔 독소의 독성과 비교하여, 실질적으로 변화되지 않은 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 캐리어가 밀가루, 설탕 및 젤라틴으로 구성된 그룹에서 선택된 생체적합성, 생분해가능한 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F 및 G로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A임을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 캐리어와 조합된 보툴리눔 독소의 양이 1 유닛 내지 10,000 유닛의 보툴리눔 독소인 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 보툴리눔 독소의 양이 10 유닛 내지 2,000 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 1 항에 있어서, 보툴리눔 독소가

(a) 생리학적 조건 하에서 뉴런 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 결합요소,

(b) 뉴런 세포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 이동을 용이하게 할 수 있는 전위요소, 및

(c) 뉴런의 세포질에 존재할 때, 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스를 억제할 수 있는 치료요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
(a) 보툴리눔 독소 타입 A, 및;

(b) 상기 보툴리눔 독소 타입 A와 조합되어, 보툴리눔 독소 경구용 제형을 형성하는 캐리어를 포함하고, 상기 캐리어는 위궤양이 있는 환자의 위장관에서 심각한 면역계 반응없이 치료학적인 양의 상기 보툴리눔 독소 타입 A를 방출하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 경구용 제형.
환자 위장관에 경구 투여하기 위한 보툴리눔 독소 제형으로서,

(a) 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소, 및;

(b) 보툴리눔 독소와 조합된 생체적합성, 생분해성 및 비-독성 캐리어를 포함하며, 캐리어는 보툴리눔 독소 섭취에 따른 심각한 면역계 반응없이 환자의 위장계에서 신속히 분해되어 치료학적인 양의 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 환자의 위장계로 방출하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 경구용 제형.
제 11 항에 있어서, 캐리어가 복수의 폴리머 마이크로스피어를 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 경구용 제형.
제 11 항에 있어서, 캐리어가 폴리머 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 경구용 제형.
제 11 항에 있어서, 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A, B, C₁, D, E, F 및 G로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 11 항에 있어서, 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A임을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 11 항에 있어서, 캐리어와 조합된 보툴리눔 독소의 양이 1 유닛 내지 10,000 유닛의 보툴리눔 독소인 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 11 항에 있어서, 보툴리눔 독소의 양이 10 유닛 내지 2,000 유닛의 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 11 항에 있어서, 보툴리눔 독소의 양이 100 유닛 내지 30,000 유닛의 보툴리눔 독소 타입 B인 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
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(a) 폴리락타이드, 폴리글리콜리드 및 폴리안하이드라이드로 구성된 폴리머 그룹에서 선택된 폴리머를 포함하는 캐리어;

(b) 캐리어와 조합되어 보툴리눔 경구용 제형을 형성하는, 안정화된 보툴리눔 독소를 포함하며, 환자의 위장관에서 치료학적인 양의 보툴리눔 독소가 캐리어로부터 방출될 수 있는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 경구용 제형.
제 20 항에 있어서, 보툴리눔 독소가

(a) 생리학적 조건 하에서 뉴런 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 결합요소,

(b) 뉴런 세포 막을 가로지르는 폴리펩티드의 이동을 용이하게 할 수 있는 전위요소, 및

(c) 뉴런의 세포질에 존재할 때, 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스를 억제할 수 있는 치료요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 21 항에 있어서, 치료요소가 SNARE 단백질을 절단하여 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 경구용 제형.
제 22 항에 있어서, SNARE 단백질이 신택신, SANP-25 및 VAMP로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 경구용 제형.