KR101087973B1 - 신규한 락토바실루스 헬베티쿠스, 이의 배양 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실루스 헬베티쿠스, 이의 배양방법 및 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 베타 아밀로이드 단백질의 생성을 억제하는 산물을 생산하는 신규한 락토바실루스 헬베티쿠스, 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 치매 또는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물은 치매 예방 또는 치료, 인지기능 증진이나 인지기능장애 예방 또는 치료에 효과적이다.

락토바실루스 헬베티쿠스, 치매, 인지기능장애, 베타아밀로이드, 알츠하이머

Description

신규한 락토바실루스 헬베티쿠스, 이의 배양 방법 및 용도{Novel Lactobacillus helveticus, culture method thereof and use thereof}

본 발명은 신규한 락토바실루스 헬베티쿠스, 이의 배양방법 및 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 베타 아밀로이드 단백질의 생성을 억제하는 산물을 생산하는 신규한 락토바실루스 헬베티쿠스, 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 치매 또는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 배양방법에 관한 것이다.

대한 치매학회의 정의에 따르면 치매(dementia)는 여러 원인 질환들에 의해 사람의 지적능력과 사회적 활동을 할 수 있는 능력이 소실되어 일상생활의 장애를 가져오는 일종의 증후군이다. 즉, 치매는 신경세포의 손상 및 손실에 의해 나타나는 뇌 질환으로서 기억, 집중, 언어 및 인지 등에 심한 장애가 오랜 시간 동안 점진적으로 진행되어 궁극적으로는 사망에 이르게 하는 질환이다. 원인 질환들로는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(Vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병 (Huntington's disease), 크루츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease), 픽스씨 병(Pick's disease) 등이 알려져 있다.

이들 원인 질환들 중 가장 높은 발병 비율을 차지하는 것은 알츠하이머병으로 전체 치매 환자의 50~70%를 차지한다. 알츠하이머병은 원인에 따라 산발성(sporadic type)과 가족성(familial type)으로 구별되어 지며 80% 이상이 산발성으로 발병 원인이 알려져 있지 않으며 대부분 65세 이후에 발병하는 것으로 알려져 있다(Physiol Rev 2001, 81:741-66). 가족성은 전체의 20% 미만을 차지하며 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein 이하 APP), presenilin 1(PS1) 및 presenilin 2(PS2)등의 유전자들의 변이가 주원인으로 100% 발병되며 발병 시기도 빨라 65세 이하에서 일어난다. 알츠하이머병은 노인반(senile plaque) 및 신경원 섬유 농축체(neurofibrillary tangle)가 각각 신경세포 외부 및 내부에 축적되는 병리학적인 특징을 보인다. 노인반은 대체적으로 구형으로 변연계(limbic system)나 신피질(neocortex)에서 주로 발견되며 베타 아밀로이드(β-amyloid, 이하 Aβ)라는 펩티드가 서로 결합 및 침착하여 핵을 형성하고 주위에는 퇴화된 신경섬유 축색돌기(axon), 수지상결정(dendrites), 활성화된 아교세포(microglia)와 성상세포(astrocyte)들이 모여 있는 형태이다. 신경원 섬유 농축체는 타우(tau)라는 단백질이 비정상적으로 많이 인산화된 후 서로 결합하여 형성된 신경세포 내의 물질로 알츠하이머병 치매 환자의 여러 뇌조직에서 관찰된다.

알츠하이머병을 포함한 치매 환자 수는 인구의 고령화로 인해 지속적인 증가세를 보이고 있다. 알츠하이머병 환자는 2008년 현재 전 세계적으로 약 2,600만 명 으로 알려져 있으며 노령인구의 증가로 2050년에는 약 1억 명 이상이 될 것으로 전망(Carlsson, J Alz Dis, 2008, 15:327-338) 되고 있으며, 한국보건사회연구원 조사 자료에 의하면 2005년 기준 65세 이상 노인 인구의 약 8.3%인 35만 여명이 치매환자이고 향후에도 노인 인구의 증가에 따라 꾸준히 증가하여 2015년에는 약 53만 명이 될 것으로 예측하고 있다. 비록 치매 환자 수가 전체 인구에서 차지하는 비율은 낮지만 치매가 관심을 받고 있는 이유는 치매 환자를 보살피는데 사회경제적으로 막대한 부담이 따르기 때문이다. 중증 치매환자 1인의 1년 치료 및 간병 비용이 최소 1억 원 이상의 많은 비용이 소요된다고 하며 이는 2005년 기준으로 모든 환자가 치매 치료를 받는다면 약 35조 원의 막대한 비용이 필요하다는 것이다. 이와 같은 엄청난 경제적 부담뿐 아니라 치매 환자 가족들의 사회생활도 많은 지장을 받게 된다. 일반적으로 치매 환자 1인을 보살피기 위해서는 2인 이상의 간병인이 필요하다고 하며 이는 가족들의 사회생활의 제한을 가져오고 더 나아가서는 경제활동인구의 감소로 이어져 국가적으로도 큰 손실을 가지고 온다. 이러한 이유들로 미국을 비롯한 선진국들에서는 국가 차원에서 치매 치료를 위한 많은 연구가 수행되고 있으며 국내에서도 최근 치매 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재까지 연구 결과들에 의하면 알츠하이머병의 주요 원인 물질은 노인반을 구성하는 Aβ로 이들이 신경세포의 손상을 일으켜 알츠하이머병을 일으키는 것으로 알려져 있다. Aβ는 가족성 알츠하이머병의 주요 발병 유전자들 중 하나인 APP가 β- 및 γ-세크레타제에 의해 분해 되어 형성된 펩티드로 40~42개의 아미노산으로 구성되어 있다(Nature, 1999, 402:533-7). 이러한 작용기전에 기초하여 Aβ의 생성 을 억제하는 β- 및 γ-세크레타제의 저해제, α-세크레타제 활성 촉진제 등의 개발 연구가 진행되고 있고 이외에도 Aβ의 축적을 억제하거나 축적된 Aβ분해를 촉진하는 약물들도 개발 중에 있다(Nat Rev Neurosci, 2004, 5:677-85). 최근에는 Aβ를 백신으로 개발하려는 노력 또한 다국적 제약사에 의해 시도되고 있다. 그러나 작용기전에 기초한 치매 치료제는 상품화되기에는 많은 시간이 필요한 단계이고 현재 시판 중인 것들은 기억개선과 단기적인 완화효과를 보이는 아세틸콜린 에스터라아제 저해제인 코그넥스(Tacrine), 아리셉트(Donepezyl), 엑셀론(Rivastigmin), 레미닐(Galantamine)과 NMDA 수용체 길항체인 메만틴(Ebixa) 등이 있다. 여기에 니세로골린, 엘카르니틴, 은행잎 추출물 등의 혈액 순환 개선제도 간접적으로 혈관성 치매에 효과가 있다고 확인되어 사용되고 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이 현재 치매 치료제는 주로 초기 치매 증상을 완화하는 역할을 하지만 치료 효과가 미약하고 작용기전에 기초한 신약은 아직 개발 및 출시에 많은 시간이 요구되며 후보 약물들이 부작용이 있으며 기대만큼 치료 효능이 나타나지 않아 임상에서 실패를 하고 있다(J Alz Dis. 2008, 15;327-338). 이러한 이유들로 알츠하이머병 예방 목적으로 발병기전을 억제하며 부작용이 없어 장기 복용이 가능한 약물 또는 건강기능식품 등 대체 물질 개발 요구도 지속적으로 증가하고 있다.

유산균은 오랜 기간 동안 사용되어왔으며 유산균 발효식품을 상시 복용하는 불가리아 사람이 건강한 상태로 장수 하는 비율이 높다고 인정되고 있다. 또한 메치니코프의 연구에 의하면 장내 유해 세균에 의해 생성되는 유해 물질이 혈액 속으 로 유입되어 건강을 위협하는 것으로 보고 된 이후 장내 균총을 유익한 유산균으로 대체하는 시도로부터 유산균의 기능에 대한 많은 연구가 이루어져 정장 작용, 항암 효과, 면역 증강 효과 및 노화 억제 효과 등 많은 유익한 기능들이 보고 되었고 (Trends Biotechnol, 1997, 15;270-274) 현재 유산균 및 발효물들이 의약품 또는 건강식품으로 널리 사용되고 있다.

이러한 유익한 유산균의 기능을 더욱 확대하고 최근 심각한 경제 사회 문제를 야기하고 있는 치매의 예방 목적에 활용하고자 유산균의 치매 보호효과에 대한 연구를 수행하였다. 연구 수행에 앞서 유산균의 치매 관련 문헌 및 특허에 대한 조사 결과 관련된 자료들을 확인할 수 없었다.

본 발명자들은 치매 치료를 위한 새로운 물질에 관하여 연구하던 중 배양액에 치매 발병 원인 중 하나인 β-세크레타제의 작용을 억제하여 베타 아밀로이드 생성 억제효과를 보이는 물질이 함유된 유산균주를 발견하고 이의 배양액이 치매 또는 인지기능장애 예방 또는 치료 효과를 보임을 동물실험으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 베타 아밀로이드 단백질의 생성을 억제하는 산물을 생산하는 락토바실루스 헬베티쿠스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 유원료가 포함된 배지에 락토바실루스 헬베티쿠스를 접종하여 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에서 유산균을 제거하는 단계; (c) 유산균이 제거된 배양물을 아세톤 또는 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 치매 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 베타 아밀로이드 단백질의 생성을 억제하는 산물을 생산하는 락토바실루스 헬베티쿠스(기탁번호 :KCTC-11332BP)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 유원료가 포함된 배지에 락토바실루스 헬베티쿠스를 접종하여 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에서 유산균을 제거하는 단계; (c) 유산균이 제거된 배양물을 아세톤 또는 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 치매 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 제조 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 균주는 모유 영양아의 분변으로부터 분리된 신규한 미생물이다.

상기 본 발명의 미생물은 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 락토바실루스(Lactobacillus)속에 속하는 균주로 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)의 표준균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되어 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801(Lactobacillus helveticus IDCC 3801)로 명명하고, 특허출원을 위한 국제미생물 기탁기관인 한국미생물 보존센터(www.kccm.or.kr)에 2008년 5월 8일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC-11332BP).

본 발명의 발명자들에 의하여 락토바실루스 헬베티쿠스의 배양물에 β-세크레타제의 작용을 억제하여 베타 아밀로이드의 생성을 억제하는 효능이 있음이 밝혀졌고 이 배양물은 치매 예방 또는 치료 효과가 우수한 것으로 동물실험 결과 확인되었다. 이러한 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 치매 예방 또는 치료 효과는 본 발명에 의해 최초로 알려진 효과이다.

상기 본 발명에 따른 락토바실루스 헬베티쿠스는 통상적인 락토바실루스 속 미생물의 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지 또는 유성분을 이용한 유청배지, 탈지유 배지 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 탄소원으로 이용 가능한 것은, 글루코스, 수크로스, 말토스, 프럭토스, 락토스, 자일로스, 갈락토스, 아라비노스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 수크로스, 프럭토스, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 글루코스이다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 질소원으로 이용 가능한 것은, 효모 추출물, 소이톤(soytone), 펩톤, 비프 추출물(beef extract), 트립톤, 카시톤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 효모 추출물, 펩톤, 트립톤 및 소이톤으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직 하게는 효모 추출물 또는 소이톤이다.

한편, 본 발명은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 치매 또는 인지기능 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 배양물은 락토바실루스 헬베티쿠스를 배양한 배양액으로 균체를 제거하여 사용할 수도 있다. 상기 락토바실루스 헬베티쿠스는 동종의 유산균은 어떤 것이든 가능하며, 그 범위는 락토바실루스 헬베티쿠스(helveticus) 종의 모든 아종 또는 변종을 포함한다. 바람직하게는 수탁번호 KCTC-11332BP의 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801일 수 있다.

베타 아밀로이드의 생성을 억제하는 효능을 가진 본 발명의 배양액 제조를 위하여 상기 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스를 유원료가 포함된 배양액으로 배양 할 수 있다. 유원료는 포유류로부터 나온 젖 성분으로 상기 유원료는 액체 상태에서 멸균하여 그대로 사용하거나 동결건조 등의 방법으로 분말화한 상태로 사용이 가능하다. 유원료는 동물에서 직접 채취하거나 상업적으로 판매하는 제품을 구입하여 사용 할 수 있다. 유원료의 예로는 이에 제한되지 아니하나, 우유, 산양유, 염소유, 낙타유 또는 이들의 탈지유, 전지유 등이 있다.

베타아밀로이드 단백질의 생성을 억제하는 락토바실루스 헬베티쿠스 균주 배양물을 제조하기 위하여 예를 들어, 글루코스 및 우유가 첨가된 액체 배지를 사용 할 수 있다. 배양은 통상의 유산균 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 37℃에서 약 24시간 동안 정치 배양할 수 있다. 배양액 중의 균체를 회수하고 배양배지를 분리하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조 하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 예를 들어 글리세롤 성분을 포함하여 영하 80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결건조 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.

본 발명의 베타아밀로이드 단백질의 생성을 억제하는 배양물은 효능을 높이고 약품 조성물로 사용가능하게 하기 위하여 정제되어 사용 될 수 있다. 정제 과정은 본 발명의 배양물의 활성이 유지되는 한 어떠한 방법으로도 가능하며 바람직하게는 원심분리, 여과 및 한외여과 과정을 거쳐 불순물을 제거 한 후 유기용매에 의한 침전으로 활성성분이 포함되는 분획을 침전시킬 수 있다. 사용되는 유기용매는 본 발명의 배양물에서 활성성분을 침전시킬 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 가능하며, 바람직하게는 아세톤 또는 탄소수 1 내지 6개의 알코올일 수 있다. 침전에 사용되는 유기용매의 양은 배양물의 활성이 유지되는 범위 내이면 어떠한 양이어도 상관이 없으며 침전용매의 종류에 따라 달라질 수 있으나 바람직하게는 침전용매가 아세톤 혹은 주정인 경우 배양물 부피 대비 1배 초과 4배 이하로 가하여 혼합하고, 원심분리하여 활성성분을 분리할 수 있다. 유기용매를 이용한 침전은 1회 수행 되 거나 유기용매의 종류를 같거나 다르게 하여 또는 그 배양물과의 부피비를 같거나 다르게 하여 1회 이상 반복하여 수행될 수 있다. 반복 수행 시 그 대상은 이전 침전과정에서 나온 침전물을 용해한 용해액이거나 이전 침전과정의 상등액일 수 있다. 침전된 활성성분은 그 자체 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

한편 본 발명은 (a) 유원료가 포함된 배지에 락토바실루스 헬베티쿠스를 접종하여 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에서 유산균을 제거하는 단계; (c) 유산균이 제거된 배양물을 아세톤 또는 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 치매 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 제조 방법을 제공한다.

(a) 단계에서는 유원료가 포함된 배지에 락토바실루스 헬베티쿠스를 접종하고, 이를 배양하여 발효시킨다. 상기 락토바실루스 헬베티쿠스는 동종의 유산균은 어떤 것이든 가능하며, 그 범위는 락토바실루스 헬베티쿠스(helveticus) 종의 모든 아종 또는 변종을 포함한다. 바람직하게는 수탁번호 KCTC-11332BP의 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801일 수 있다. 락토바실루스 헬베티쿠스의 접종은 배양 조건하에서 락토바실루스 헬베티쿠스가 충분히 증식할 수 있도록 전배양된 락토바실루스 헬베티쿠스를 적당한 양으로 배양배지에 첨가함으로써 수행된다. 접종하는 락토바실루스 헬베티쿠스의 양은 전배양된 락토바실루스 헬베티쿠스 배양액을 배양배지에 1 내지 5%(v/v)정도로 첨가할 수 있다. 락토바실루스 헬베티쿠스의 배양 및 발효는 당업계에 알려진 유원료 포함 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다.

또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 호기상태를 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수도 있다. 배양시의 온도는 보통 25 ℃ 내지 40 ℃, 바람직하게는 35 ℃ 내지 40 ℃이며, 7시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다.

(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 배양되어 발효된 발효물에서 유산균을 제거한다. 배양 종료 후에 배양물에서 유산균 균체를 분리, 제거하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 이 때, 균체의 제거는 통상적인 균체의 제거를 위한 방법을 통해 유산균 균체가 실질적으로 제거된 것을 나타낸다.

(c) 단계는 상기 기재된 바에 따라 침전, 분리될 수 있다.

한편, 본 발명의 유산균 배양물의 제조방법은 활성성분의 원활한 분리 및 농 축을 위하여 분자량 5,000이하의 물질을 한외여과(ultrafiltration)하여 한외여과액을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이에 본 발명의 제조방법은 (a) 유원료가 포함된 배지에 락토바실루스 헬베티쿠스를 접종하여 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에서 원심분리하여 유산균을 제거하는 단계; (c) 유산균이 제거된 배양물에서 분자량 5,000이하의 물질을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 물질에 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 치매 예방 및 치료 효과를 가지는 락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 제조 방법일 수 있다.

(a), (b), 및 (d) 단계는 상기에서 기재된 바에 따라 수행될 수 있다.

상기에서 (c) 단계에서는 (b) 단계를 통해 유산균이 제거된 배양물에서 분자량 5,000이하의 물질을 수득한다. 이는 바람직하게는 분자량 5,000이하의 물질만을 통과(filter)시키는 필터를 이용하여 한외여과(ultrafiltration)하여 한외여과액을 수득하는 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 모유영양아의 분변으로부터 9종의 유산균을 분리하여 MRS 배지에서 전배양하여 10%의 탈지분유와 0.5%의 글루코스가 함유된 SG배지를 이용하여 37℃, 25시간 동안 정치배양 하여 배양물을 얻었다. 배양물을 15,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하는 방법으로 균주를 제거한 후 0.22um 시린지 필터로 일차 여과하고 분자량 5,000이하를 여과시키는 필터 막을 이용하여 한외여과하였다. 여과된 액을 아세톤 또는 주정을 부피 대비 1배를 가한 후 원심분리하는 방법으로 1배 침전물을 확보하고 남은 상층액에 다시 한외여과액의 1배 부피를 첨가하여 동일한 방법으로 2배 침전물을 확보하였다. 동일한 방법으로 4배 침전물도 확보하였다. 회수된 침전물은 0.5% TFA(trifluoroacetic acid)에 용해하여 사용하였다(실시예 1-1, 1-2 참조).

회수된 아세톤 침전물(한외여과액 대비 2배의 아세톤을 가하여 얻은 침전물)을 β-세크레타제와 야생형 APP695 유전자를 주입하여 이들이 과발현되는 HEK293 세포주인 BA-3에 처리하여 배양한 후 그 배양액 및 군체 내에서 APPα와 APPβ의 양을 측정하는 방법으로 β-세크레타제 활성 억제 효능을 가지는 유산균주를 선별하였다(실시예 1-3 참조). 그 결과 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 균주가 β-세크레타제 활성을 억제하는 효능이 뛰어난 것을 확인하고 상기 균주를 동정한 결과 락토바실루스 헬베티쿠스 종에 속하는 것을 확인하여 2008년 5월 8일자로 한국미생물 보존센터에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC-11332BP)(실시예 1-4 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 β-세크레타제 활성을 억제하는 배양물을 수득하기 위한 조건을 조사하였다. 그 결과 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스를 유산균 배양배지인 MRS에서 배양하는 것 보다 탈지분유가 포함된 SG 배지에서 배양되는 경우 β-세크레타제 활성을 억제하는 효능이 있음을 확인하였으며, 아세톤에 비하여 인체에 무해한 주정을 이용하여서도 침전이 가능하며, 특히 배양물 대비 2배 부피의 주정을 첨가하여 침전하는 경우 침전물의 β-세크레타제 활성이 가장 잘 억제되는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 배양물이 치매나 이와 관련된 질환인 알츠하이머병에 효과적인지 확인하기 위하여 알츠하이머병 동물 모델을 이용하여 Y-미로를 통한 기억 시험 및 뇌 조직 내의 Aβ40의 양을 확인하였다. 그 결과, Y-미로 시험 결과 본 발명의 발효산물의 처리 시 약 44%의 기억력 개선 효과를 보임을 알 수 있었으며, Aβ40는 약 20% 정도 감소됨을 확인하였다. 이와 같은 결과로 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스의 배양물이 알츠하이머병 치매 동물모델의 치매 개선효과를 보임을 알 수 있었다(실시예 4 참조).

한편, 본 발명은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 락토바실루스 헬베티쿠스는 본 발명에서 밝혀낸 베타 아밀로이드 단백질 생성을 억제하는 동종의 유산균은 어떤 것이든 가능하며, 그 범위는 락토바실루스 헬베티쿠스(helveticus) 종의 모든 아종 또는 변종을 포함한다. 바람직하게는 수탁번호 KCTC-11332BP의 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801일 수 있다.

본 발명의 치매란 성장기에는 정상적인 지적 수준을 유지하다가 후천적으로 인지기능의 손상 및 인격의 변화가 발생하는 질환을 말한다. 치매는 다양한 원인에 의해 뇌신경이 파괴됨으로써 기억력장애, 언어능력 장애, 변뇨실금, 편집증적 사 고, 실어증과 같은 정신기능의 전반적인 장애가 나타나며, 진행되는 과정에서 우울증이나 인격장애, 공격성 등의 정신의학적 증세가 동반되기도 한다. 치매로 분류되는 질환은 이에 한정되지 아니하나 알츠하이머형 치매, 혈관성 치매, 파킨슨씨병형 치매, 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병(Huntington's disease)형 치매, 크루츠펠트-야콥병형 치매 및 픽스씨 병형 치매, 노인성 치매 및 두부손상에 의한 치매가 포함된다.

본 발명의 조성물은 β-세크레타제의 활성을 저해하며, α-세크레타제의 활성을 촉진하여 궁극적으로 베타 아밀로이드의 생성을 억제하는 활성을 가지며 이러한 점은 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀졌다.

알츠하이머병은 Aβ와 타우 단백질이 주요 원인 물질로 노인반 및 신경섬유를 각각 신경세포 외부 및 내부에서 형성시켜 뇌조직의 위축과 기억 장애 등을 유발한다. Aβ와 타우 중 직접적인 신경세포 사멸과 밀접한 관련이 있는 것은 Aβ로 알츠하이머병은 어떤 원인에 의해 APP에서 Aβ가 생성되는 경로의 활성화가 초기 증상을 유도하고 이후 병의 가속화에 타우 단백질이 관련되는 것으로 예상 (Small and Duff, Neuron, 2008, 5:591-598) 하고 있다. 따라서 알츠하이머병의 예방, 증상 개선 또는 치료를 위해서는 우선 Aβ 생성 경로의 차단이 중요하게 여겨지고 있다. Aβ는 β-세크레타제에 의해 APP가 APPβ와 Aβ 아미노산 서열을 포함하는 C-말단 절편β(C-terminal fragment β; CTFβ)로 잘라진 다음 CTFβ에 γ-세크레타 제가 작용하여 ACID(APP intracellular domine)와 Aβ가 형성되므로 β-세크레타제의 활성을 저해하는 것이 알츠하이머병의 예방, 개선 또는 치료의 한 방법이 된다. 또한 α-세크레타제는 β-세크레타제와 경쟁적으로 APP를 분해하여 Aβ의 생성을 억제하고 α-세크레타제에 의하여 분해된 산물 중 하나인 APP는 APPα생성을 유도하므로 α-세크레타제의 활성을 증가시키는 것이 알츠하이머병의 예방, 개선 또는 치료의 또다른 한 방법이 된다.

본 발명의 조성물은 Aβ 생성 경로를 효과적으로 차단하며 신경세포 보호효과를 보이는 APPα생성을 촉진하는 상기의 알츠하이머병 치료제 개발 목적과 부합되는 Aβ 생성 차단제이다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 조성물은 APPα의 생성을 촉진하며, APPβ의 생성을 억제하는 것을 세포실험을 통하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다(실시예2 참조).

본 발명의 다른 일 실시예에서는 본 발명의 조성물이 치매 동물 모델에서 뇌의 베타아밀로이드 수준을 감소시키는 것을 동물실험을 통하여 베타아밀로이드 정량 키트로 확인하였다(실시예 4-2 참조). 또한 본 발명의 조성물이 치매 동물 모델에서 치매의 주 증상 중 하나인 기억 및 인지기능 저하를 개선 또는 치료 하는 것을 본 발명의 조성물을 투여한 치매 유도 쥐를 대상으로 한 Y자형 미로 시험을 통하여 확인하였다(실시예 4-1 참조).

이로서 본 발명의 조성물은 Aβ 생성 경로를 효과적으로 차단하며 신경세포 보호효과를 보이는 APPα생성을 촉진하며 치매 예방, 개선 또는 치료에 탁월한 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 락토바실루스 헬베티쿠스는 인지기능장애 증상에 효능을 보이는 동종의 유산균은 어떤 것이든 가능하며, 그 범위는 락토바실루스 헬베티쿠스(helveticus) 종의 모든 아종 또는 변종을 포함한다. 바람직하게는 수탁번호 KCTC-11332BP의 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801일 수 있다.

인지기능장애(cognitive impairment)라 함은 뇌질환, 뇌상해, 중독 등으로 인한 정신적, 행동적 장애 및 내분비이상(endocrine disorder), 대사영양적 이상(metabolic or nutritional abnormalities), 약물 등으로 인한 정신질환을 포괄하는 것으로, 증상의 정도에 따라 일시적 단기기억장애에 해당하는 건망증(anmesia)뿐만 아니라 지남력과 판단력의 전반적인 장애를 일으키는 치매(dementia)에서도 나타나는 뇌질환의 일종이다.

인지적 결함 또는 인지기능장애에는 인지 기능 또는 인지적 영역, 예컨대 작 업 기억, 주의력 및 경계(vigilance), 언어 학습 및 기억, 시각 학습 및 기억, 추론 (reasoning) 및 문제해결 예컨대 실행 기능, 처리속도 또는 사회 인지의 저하가 포함된다. 특히, 인지적 결함 또는 인지기능 장애는 주의력 결핍, 와해된 사고, 느린 사고, 이해 곤란, 집중력 불량, 문제해결 장애, 기억 불량, 생각을 표현함에 있어서의 곤란 및/또는 생각, 감정 및 행동을 통합함에 있어서의 곤란, 또는 무관한 생각들의 소멸의 곤란을 가리킬 수 있다. "인지적 결함" 및 "인지기능 장애"라는 용어들은 동일한 것을 가리키는 것으로 의도된 것으로서, 상호교환가능하게 사용된다.

인지기능 장애로 분류되는 질환은 이에 한정되지 아니하나 정신분열증과 연관된 인지 결함, 연령-유도성 기억 손상 또는 정신이상과 연관된 인지 결함, 당뇨병과 연관된 인지 결함, 후-졸중과 연관된 인지 결함, 저산소증과 연관된 기억 결함, 노인성 치매와 연관된 인지 및 주의 결함, 경증 인지 손상과 연관된 기억력 문제, 치매와 연관된 손상된 인지 기능, 알츠하이머병과 연관된 손상된 인지 기능, 파킨슨병과 연관된 손상된 인지 기능, 맥관 치매와 연관된 손상된 인지 기능, 뇌 종양과 연관된 인지 문제, 픽스씨 병(Pick's disease), 자폐증으로 인한 인지 결함, 전기경련 요법 후 인지 결함, 외상성 뇌 손상과 연관된 인지 결함, 기억상실 장애 및 정신착란일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 조성물이 우수한 인지기능 개선효과를 보이는 것을 본 발명의 조성물을 투여한 스코폴아민 유도 기억 손상 동물 모델을 대상으로 한 수중미로 및 수동 회피 시험에서 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 500mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 100mg일 수 있다. 그러나 상기 조성물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 조성물을 치매의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한 본 발명은 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 증진용 식품조성물을 제공한다.

상기 락토바실루스 헬베티쿠스는 인지기능장애 증상에 효능을 보이는 동종의 유산균은 어떤 것이든 가능하며, 그 범위는 락토바실루스 헬베티쿠스(helveticus) 종의 모든 아종 또는 변종을 포함한다. 바람직하게는 수탁번호 KCTC-11332BP의 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801일 수 있다.

상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 유산균 발효물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균 발효물을 기타의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식 물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 유산균 발효물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 유산균 발효물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 유산균 발효물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 0.01 내지 10중량%를 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 치매 또는 인지기능장애 예방 또는 치료에 효과적이다. 특히 본 발명의 조성물은 베타아밀로이드의 생성의 억제와 함께 신경세포 보호 작용이 있는 APPα의 생성을 촉진하는 효과가 뛰어나 알츠하이머병 같은 치매 또는 인지기능장애의 예방 또는 치료에 우수한 효능을 가진다. 또한 본 발명의 배양물 제조 방법은 본 발명의 균주를 이용하여 본 발명의 치매 또는 인지기능장애의 예방 또는 치료에 우수한 효능을 가지는 배양물 제조에 효과적이다. 따라서 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 상기 배양물의 제조방법은 치매 또는 인지기능장애가 발생하였거나 발생하기 쉬운 연령의 사람을 대상으로 한 예방 또는 치료용 의약품 제조 등 다양한 분야에 이용 될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

β-세크레타제 활성 억제 유산균주 선별

<1-1> 유산균 발효 산물 시료 조제 방법

서울, 경기 소재 산후 조리원에서 생후 2주 이내의 모유 영양아로부터 분변을 채취하고 LBS 평판배지 (pH4.0, 0.3% bile 함유, LBS agar, Becton, Dickson and Company, USA)에 도말하여 총 9종의 유산균을 분리하여 이들 균주로 배양한 발효 산물을 APPβ억제 활성이 있는지 조사하였다.

<1-2> 유산균 발효 산물 시료 조제

실시예 <1-1>에서 분리한 유산균주를 MRS 배지(de Man-Rogosa-Sharpe media)에 계대 배양 또는 전 배양 하였다. 전배양액을 탈지 분유를 주성분으로 하는 SG(10% 탈지분유, 0.5% glucose, pH 6.8) 배지나 우유에 3% (v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양하는 방법으로 배양액을 얻었다. SG배지나 우유에서 배양 후 배양상태는 유산균 발효유처럼 커드 형성이 있었고 유청과 분리되는 현상을 보였다. MRS 배지를 3% 첨가한 배지를 동일조건으로 유지하여 대조군으로 사용하였다. 각 배양액을 15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하고 이를 먼저 0.22㎛ syringe filer로 여과하였다. 다음에 분자량 5,000이하를 여과시키는 filter membrane으로 한외여과(ultrafiltration) 하였다. 이어서 아세톤 또는 주정을 한외여과액 부피 대비 먼저 1배를 가하여 섞어준 후 다시 15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 1배 침전물을 확보하고 남은 상층액에 다시 한외여과액의 1배 부피를 첨가하여 동일한 방법으로 2배 침전물을 확보하였다. 동일한 방법으로 4배 침전물도 확보하였다. 각 침전물을 회수 및 건조하여 중량 측정 후 0.5% TFA(trifluoroacetic acid)에 적절한 농도로 현탁하여 시험에 사용하였다.

<1-3> β-세크레타제 활성 억제 유산균주 선별

실시예 <1-2>에서 수득한 9종 균주 배양물의 아세톤 침전물(한외여과액 대비 2배의 아세톤을 가하여 얻은 침전물)을 이용하여 β-세크레타제 활성 억제 효능을 가지는 유산균주를 선별하였다. 대조군으로는 유산균을 접종하지 아니한 SG 배지 배양액만을 동일 방법으로 아세톤 침전한 침전물을 사용하였다.

유산균 발효 산물 시료가 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein; 이하 APP라 함)의 대사에 미치는 영향을 조사하기 위해 β-세크레타제와 야생형 APP695 유전자를 주입하여 이들이 과발현되는 HEK293 세포주(이하, ‘BA-3’이라 함, Yeon et al, Peptides, 2007, 28:838-844)를 사용하였다.

BA-3은 β-세크레타제의 과발현으로 APPβ를 많이 생성하여 β-세크레타제 활성에 직간접적으로 영향을 미치는 유효성분의 탐색에 유용하다. BA-3을 80% 이상의 밀도로 10% FBS가 포함된 DMEM을 사용하여 6-well plate에 분주하여 1일 동안 배양하였다. 배지를 제거한 다음 37℃로 가온한 우태아혈청(FBS)이 없는 free DMEM 0.9ml을 넣은 후 0.1ml free DMEM에 현탁한 실시예 <1-2>의 아세톤 또는 주정 침전물 시료를 100ug/ml 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 각 시료가 처리된 배지 0.2ml을 회수하여 8% SDS-PAGE에 전기영동한 후 APPα 및 APPβ의 항체인 MAB1560(monoclonal, CHEMICON, USA) 및 Rb53(polyclonal, Cephalon, USA) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 배양액 내의 APPα 및 β를 측정하였다.

세포 내의 APPα및 APPβ를 확인하기 위해서는 세포들을 모아 인산완충식염수(PBS)에 현탁 후 원심 분리하여 상층액을 제거하고 단백분해효소 저해제들이 포함된 세포용해완충용액(lysis buffer; 50 mM Tris-HCl, pH7.6, 180 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100)을 첨가하여 얼음 위에 30분 방치하였다. 간단히 초음파분해(sonication)을 하고 4℃에서 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하고 단백질 정량 한 다음 상기와 동일한 방법으로 MAB1560 및 Rb53 항체를 사용하여 웨스턴 블롯하였다.

그 결과 대조군 보다 APPβ의 생성을 억제하는 유산균주가 있는지 조사하여 APPβ의 생성을 저해하는 효과를 보이는 IDCC 3801을 확보하였다.

유산균 이외에 다른 균에서도 유사한 결과가 나타나는지 Bacillus subtilis와 E.coli 배양액을 대상으로 조사하였으나 APPβ의 생성을 전혀 억제하지 않았다.

SG 배양 유산균 시료의 APPβ생성 저해 효과.

균 주	APPβ저해율(%)	균 주	APPβ저해율 (%)
IDCC2053	0.0	IDCC2581	0.0
IDCC2097	0.0	IDCC3301	0.0
IDCC2135	3.1	IDCC3801	100.0
IDCC2145	0.0	Bacillus subtilis	0.0
IDCC2510	29.6	E. coli	0.0
IDCC2581	32.4

<1-4> 선별된 유산균주의 동정

발효물의 APPβ 생성 저해효과가 가장 우수한 유산균인 IDCC 3801 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 서열 비교를 통한 계통유전학적 분석(Phylogenetic analysis)을 수행하였다.

블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program : National Institute of Biotechnology Information)을 이용하여 IDCC 3801 균주의 16S rRNA와 락토바실루스 헬베티쿠스 표준균주인 ATCC 15009의 16S rRNA의 염기서열을 비교하였다. 그 결과 98.9%의 상동성을 나타냄을 확인하였다.

또한 GenBank에 등록된 9 개의 속(Genus)과 84 개의 락토바실루스 종(Species), 그리고 87 개의 아시도필루스 계열 균주들(Strains)의 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후 계통수(phylogenic tree)에서의 위치를 판별하였다. 다중 서열 정렬 프로그램(multiple sequence alignment program)은 ClustalX를 사용하였다. 계통수 상에서 IDCC 3801 균주의 16S rRNA 유전자는 락토바실루스 헬베티쿠스에 가장 가까운 위치에 배치되었다. 또한 AY369116, AM113779, DQ123580, AB362629, EF536362, EU377824, FJ172346, EU420177, FJ459815, GQ131286 등 락토바실루스 헬베티쿠스로 등록된 10주의 16S rRNA 유전자 서열과 상동성 검색 결과 평균 99.1%의 높은 동일성을 나타내었다.

상기와 같이 IDCC 3801 균주를 분자생물학적으로 동정한 결과 이 균주는 락토바실루스 헬베티쿠스으로 분류되었다. 따라서 내산성 및 내담즙산성 등 프로바이오틱 특성이 우수하고 APPβ 생성 저해효과가 높은 상기 균주를 “락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801”로 명명하고, 한국미생물 보존센터(www.kccm.or.kr)에 2008년 5월 8일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC-11332BP).

<실시예 2>

락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801의 β-세크레타제 활성 억제 효능 및 α-세크레타제 활성 촉진 효능 시험

락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 균주 배양물의 APPβ생성 저해효과를 아세톤 침전 시료를 대상으로 시험하였다. SG에서 배양하여 얻은 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양 여액의 한외여과액의 아세톤 침전 시료는 25ug/ml에서도 APPβ생성 저해효과를 보이는 것을 확인하였다(도 1 참조).

SG 배양 여액 아세톤 침전물은 용매로 인하여 의약품으로 적용하기 어려워 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 균주를 대상으로 용매를 주정으로 대체하는 시험을 하였다.

실시예 <1-2>에서 얻은 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC3801 SG 배양 여액의 주정 침전물을 100ug/ml 농도로 처리하여 실시예 <1-3>의 방법으로 APPβ의 생성을 억제하는지, APPα의 생성을 촉진하는지 여부를 조사하였다. 대조군으로는 유산균을 접종하지 아니한 SG 배지 배양액만을 동일 방법으로 주정 침전한 침전물을 사용하였다.

그 결과 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 균주 배양액의 주정 침전물을 처리 시에는 배양 여액 대비 4배의 주정으로 침전한 침전물에서도 APPβ 생성저해 효과가 있었지만 2배의 주정으로 침전한 침전물에서 아세톤 침전물과 다르게 100% 억제효과를 보이는 것을 확인하였다. 이처럼 2배의 주정침전물이 높은 저해활성을 보이는 것은 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 균주의 배양 산물 내 활성 성분이 2배의 주정 처리에 의해 특이적으로 침전 및 농축된다는 것을 의미한다. 또한 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 균주의 주정 침전물 시료는 세포 내 APPα의 축적을 증가시키는 것을 확인하였다.(도 2 참조).

이상의 결과를 종합하면 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 주정침전물의 활성성분은 APPβ의 생성을 선택적으로 저해하지만 세포 내 APPα의 축적을 유도하는 특성을 갖는 것을 확인하였다.

<실시예 3>

락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 SG 배양액의 주정 침전물의 독성 시험

락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 SG 배양액의 주정 침전물을 경구 투여 시 독성 유발을 확인하기 위해 단회 투여 독성시험을 수행하였다. 6주령, 웅성 ICR 생쥐 5마리를 대상으로 3,000mg/kg 용량으로 단회 경구투여한 후 7일 동안 관찰 하였다.

그 결과 독성시험 생쥐가 사망하지 않았으며 장기 이상 소견도 발견되지 않아 독성은 없는 것으로 판단되었다(결과미도시).

<실시예 4>

In vivo 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 SG 배양액의 주정 침전물의 치매 개선 효능 시험

<4-1> Y-미로 시험

알츠하이머병 동물 모델인 Tg2576(Swedish mutant APP 과발현 mouse, 4마리, 9개월, female)을 사용하여 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 SG 배양 한외여과액 주정 침전물의 간이 효능을 배지 한외여과액 주정 침전물을 대조군으로 사용하여 평가하였다. 투여는 각 시료를 1% 카르복시메틸셀룰로스 (carboxymethylcellulose; CMC)에 현탁하여 500mg/kg 용량으로 주3회, 8주간 경구 투여하는 방법을 적용하였다.

시험은 3개의 통로(arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지의 길이가 25cm, 높이 14cm, 폭 5cm 이고 동일한 각도로 위치한 Y자형 미로 측정장치를 이용하여 수행하였다. Y자형 미로의 한 통로의 끝에 실험동물의 머리 부분이 향하도록 두고 8분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 하였다. 치매 쥐의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것(arm entry)으로 인정하는 방법으로 움직임을 교차횟수(alternation)로 기록하였으며 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때를 실제 교차횟수(actual alternation)로 하여 1점을 부여하였고 실제 교차 회수를 최대 가능한 교차횟수(즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비로 산출한 자발적인 교차행동량(alternation behavior, %)을 구하였다.

Y-미로를 시료처리 전 1회, 시료 처리 종료 후 1회 수행하여 시험 전 후 기억개선 효과가 있는지 비교한 결과, Y-미로 시험 결과 시료 처리 전과 비교하여 시료 처리 후 약 44%의 기억력 개선 효과를 보였다(도 3 참조). 대조군인 배지 처리 군은 시험전과 큰 차이를 보이지 않았다.

<4-2> 알츠하이머 모델 쥐에서 IDCC 3801 SG 배양물의 주정 침전물의 Aβ 억제 효과

실시예 <3-1>의 시험이 끝난 후 생쥐의 뇌 조직을 적출하여 Aβ40을 정량 비교하는 방법으로 IDCC 3801 배양물의 주정 침전물의 Aβ 억제 효과를 측정하였다.

시험 종료 후 PBS로 관류(perfusion)하여 뇌조직 내 혈액을 제거하고 뇌를 적출하여 중량을 측정하였다. 중량 대비 8배의 solution A(5M guanidine HCl, 50 mM Tris HCl, pH 8.0)를 첨가하여 실온에서 3시간 방치 후 차갑게 유지한 solution B (PBS, 5% BSA, 0.03% Tween-20, 단백분해효소 저해제 용액)를 부피 대비 20배 첨가하였다. 4℃에서 15,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하여 단백질을 정량하고 ELISA kit(the GENETICS Company, Switzerland)를 사용하여 추출액 내 Aβ40을 정량 비교하였다.

그 결과 뇌 조직 부피 대비 Aβ40 측정값이 대조군에서는 302.1± 2.1pg/ml인 반면 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물의 주정 침전물 투여 군에서는 245.2± 3.2pg/ml으로 대조군과 비교하여 약 20% 정도 Aβ40이 감소하는 것으로 나타났다(도 4 참조).

이상의 Y-미로 시험과 Aβ40 정량시험 결과 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 SG 배양 여액 한외 여과액의 주정침전물은 알츠하이머병 치매 동물모델의 치매 개선효과를 보이는 것을 확인하였다.

<실시예 5>

In vivo IDCC 3801 SG 배양물의 주정 침전물의 인지 기능 개선 효능 시험

인지기능 개선 시험을 위해 9주령 우성 ICR 생쥐를 각 처리군당 5마리씩 사용하였다. 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물 및 배지 주정 침전물은 1% 카르복시메틸셀룰로스에 현탁하여 투여 시료를 조제하였고 대조약물인 도네페질은 생리식염수에 녹여 사용하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물 및 배지 주정 침전물을 500mg/kg, 도네페질은 2mg/kg 용량으로 주 7회 2주간 경구로 반복 투여하였고 시험 시작 60분전에 스코폴아민(scopolamine)을 1mg/kg로 경구 투여하여 기억 손상을 유발 한 후 수중 미로(water maze) 및 수동회피(passive avoidance) 시험을 실시하였다. 비히클로는 약물 대신 생리식염수를 2주간 투여 후 스코폴아민을 처리한 군과 생리식염수만 처리한 군을 사용하였다.

<5-1> 수중미로시험

수중미로시험 중 참조기억(reference memory) 시험은 시험 시작 하루 전에 플랫폼이 없는 수조에서 60초 동한 자유롭게 수영하게 하여 적응한 후 실시하였다. 시험은 5일 동안 매일 4~5회 물에 잠겨 있는 플랫폼을 찾아 올라갈 때까지의 시간 (escape latency, 단위: 초)을 측정하는 방법으로 수행하였고 최대 허용 시간은 60초로 제한하였다. 시험 2일 차 까지는 플랫폼의 위치를 찾지 못하면 제한 시간인 60초 이내에 플랫폼을 찾도록 인도하였으며 플랫폼에 올라가면 10초간 머무르게 하였다.

참조기억 시험이 종료되고 24시간 후 수조 내 플랫폼을 치우고 60초 동안 자유롭게 수영하게 하여 플랫폼이 있던 위치에 머무르는 시간을 측정하는 방법으로 탐침 검사(probe test)를 수행하였다.

그 결과 참조기억 시험에서는 스코폴아민을 투여한 생리 식염수 처리군은 시험기간 동안 플랫폼을 찾는 시간의 개선이 없었고 배지 주정 침전물 처리군은 학습효과가 매우 약하였다. 이와는 다르게 대조약물로 사용한 도네페질 처리군은 시험 2일차부터 플랫폼을 찾는 시간이 뚜렷하게 줄어들어 스코폴아민 비투여군과 유사한 개선 효과를 보였다. 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물의 주정 침전물 처리군은 시험 기간이 경과 될수록 플랫폼을 찾는 시간이 단축되었으며 시험 5일차에 생리식염수 투여 후 스코폴아민 처리군의 50.0± 3.3초 비하여 30.5± 6.2초로 유의성(p<0.05) 있게 최대 차이를 보였다. 또한 배지 주정 침전물과 비교 시에도 3일 (배지 주정 침전물 투여군 51.0± 4.0초, 락토바실러스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물 주정 침전물 35.3± 7.1초. p<0.05) 및 4일(배지 주정 침전물 투여군 49.0± 4.2초, 락토바실러스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물 주정 침전물 36.9± 4.6초. p<0.05)에서 유의성 있는 차이를 보여 락토바실러스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물 주정 침전물이 기억개선 효과를 보이는 것을 확인하였다(도 5 참조). 탐침검사에서는 락토바실러스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물 주정 침전물 처리군이 전체 유영회수 중 플랫폼이 있던 자리를 지나간 회수가 1.6± 0.6 (36.5%)로 생리식염수 처리군의 0.8± 0.3(17.3%) 보다 통계적으로 유의성 있게 2.1배 (p<0.05) 이상 높은 것으로 나타났다.

<5-2> 수동회피시험

수동회피 시험은 실험장치는 칸막이 문(guillotine door)으로 2개의 구획으로 구분된 셔틀박스(shuttle box)를 이용하여 수행하였다. 한쪽 구획은 조명을 비추어 밝게 하고 다른 구획은 조명이 없고 검은 천으로 감싸 어둡게 하였다. 첫날, 치매 쥐를 밝은 방에 놓고 30초의 탐색시간을 준 후 칸막이 문을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 한 후 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간(acquisition latency time)을 측정하고 어두운 방에 들어가면 칸막이 문을 닫고 격자 바닥을 통해 0.5mA의 전기 충격을 3초간 가해 쥐가 전기 자극을 기억하게 하였다. 24시간 후 치매 쥐를 밝은 방에 두고 30초의 탐색시간을 준 후 칸막이 문을 열어 어두운 방으로 쥐의 모든 발이 어두운 방으로 들어가는데 걸리는 시간(retention latency time)을 최대 300초까지 측정하였다. Retention latency time이 클수록 학습을 통한 수동 회피에 대한 기억이 잘 유지되는 것으로 판단하였다.

각 처리군을 전기 자극 학습 후 어두운 방으로 들어가는 시간(retention latency time)을 측정한 결과 생리식염 수 투여 후 스코폴아민 처리군은 123.7± 11.0초, 배지 주정 침전물 처리군은 80.3± 35.9초이었고 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물의 주정 침전물 처리군은 276.1± 21.5초로 락토바실러스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물의 주정 침전물 처리군이 유의성 있게 생리식염수 처리군에 비해 232%이상(p<0.01), 배지 주정 침전물 처리군에 비해 343% 이상 (p<0.01) 기억개선 효과를 보였다. 또한 락토바실루스 헬베티쿠스 IDCC 3801 배양물의 주정 침전물 처리군은 현 시험 조건에서 대조 약물인 도네페질 처리군 보다 우수한 효과를 보였다(도 6 참조).

이로서 본 발명의 조성물은 치매에 의한 기억력 및 인지기능 개선에 탁월한 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 주정 침전물 20 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 주정 침전물 10 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

<제제예 3> 캅셀제의 제조

락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 주정 침전물 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 3 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

<제제예 4> 주사제의 제조

락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 주정 침전물 1 ㎎

만니톨 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 2793 ㎎

Na2HPO4·12H2O 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

<제제예 5> 액제의 제조

락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 주정 침전물 2 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

<제제예 6> 건강 식품의 제조

락토바실루스 헬베티쿠스 배양액의 주정 침전물 500㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제제예 7> 건강 음료의 제조

락토바실루스 헬베티쿠스 배양액의 주정 침전물 100㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 적량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 치매 또는 인지기능장애 예방 또는 치료에 효과적이다. 특히 본 발명의 조성물은 베타아밀로이드의 생성의 억제와 함께 신경세포 보호 작용이 있는 APPα의 생성을 촉진하는 효과가 뛰어나 알츠하이머 병 같은 치매 또는 인지기능장애의 예방 또는 치료에 우수한 효능을 가진다. 또한 본 발명의 배양물 제조 방법은 본 발명의 균주를 이용하여 본 발명의 치매 또는 인지기능장애의 예방 또는 치료에 우수한 효능을 가지는 배양물 제조에 효과적이다. 따라서 본 발명의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 상기 배양물의 제조방법은 치매 또는 인지기능장애가 발생하였거나 발생하기 쉬운 연령의 사람을 대상으로 한 예방 또는 치료용 의약품 제조 등 다양한 분야에 이용 될 수 있어 산업상 이용 가능성이 높다.

도 1은 웨스턴 블롯으로 IDCC 3801 유산균 배양액의 β-세크레타제 억제효과를 확인한 결과이다(Media: 침전물 투여 없이 배양배지만을 사용하여 BA-3세포주를 배양한 배양물에서의 APPα/β의 밴드; IDCC 3801: 배양배지에 IDCC 3801의 배양물의 아세톤 침전물을 투여하여 BA-3세포주를 배양한 배양물에서의 APPα/β의 밴드).

도 2는 웨스턴 블롯으로 배양물과 침전용 유기용매의 부피비에 따른 활성성분 침전 정도를 비교한 결과이다(Media: 침전물 투여 없이 배양배지만을 사용하여 BA-3세포주를 배양한 배양물/세포용해물에서의 APPα/β의 밴드; IDCC 3801: 배양배지에 IDCC 3801의 배양물의 주정침전물을 투여하여 BA-3세포주를 배양한 배양물/세포용해물에서의 APPα/β의 밴드).

도 3은 치매 생쥐의 Y 미로 시험을 통하여 IDCC 3801 유산균 배양물의 치매 모델 생쥐에서 기억개선 효과를 알아보기 위하여 자발적인 교차 행동량(alternation behavior, %)을 비교 측정한 결과 그래프이다(배지: IDCC 3801 침전물 대신 SG 배지를 투여한 생쥐; IDCC 3801: IDCC 3801 침전물을 투여한 생쥐; 초기: 경구투여 방법으로 IDCC 3801의 배양물을 치매 모델 생쥐에게 투여할 당시의 측정값; 최종: 8주간의 경구투여 기간이 종료되는 시점의 측정값).

도 4는 치매 모델 생쥐에서 IDCC 3801 유산균 배양물 투여에 따른 뇌 속의 베타 아밀로이드 양의 변화를 ELISA 킷을 이용하여 측정한 결과 그래프이다(배지: IDCC 3801 침전물 대신 SG 배지를 투여한 생쥐; IDCC 3801: IDCC 3801 침전물을 투여한 생쥐).

도 5는 스코폴아민 유도 기억 손상 모델 생쥐의 수중 미로 시험에서 IDCC3801 유산균 배양물의 기억개선 효과를 알아보기 위하여 플랫폼을 찾는 시간을 비교 측정한 결과 그래프이다(탈출시간(Escape latency time)(s): 플랫폼을 찾아가는데 걸린 시간(초); 식염수+식염수: 약물 대신 생리식염수를 2주간 투여 후 스코폴아민 대신 생리식염수 처리군; 식염수+스코폴아민: 약물 대신 생리 식염수 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군; 도네페질+스코폴아민: 도네페질 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군; 배지+스코폴아민: 배지 주정 침전물 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군; 유산균+스코폴아민: 유산균 주정 침전물 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군).

도 6은 스코폴아민 유도 기억 손상 모델 생쥐의 수동회피 시험에서 IDCC3801 유산균 배양물의 기억개선 효과를 알아보기 위하여 어두운 방으로 들어가는데 걸린 시간을 측정한 결과 그래프이다(대기 시간(Retention Latency time) (s): 어두운 방으로 들어가는데 걸린 시간(초); Sal+Sal: 약물 대신 생리식염수를 2주간 투여 후 스코폴아민 대신 생리식염수 처리군; Sal+Sco: 약물 대신 생리 식염수 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군; Do+Sco: 도네페질 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군; M+Sco: 배지 주정 침전물 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군; 3801+Sco: 유산균 주정 침전물 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군).

Claims (12)

1. 베타 아밀로이드 단백질의 생성을 억제하는 산물을 생산하는 락토바실루스 헬베티쿠스(기탁번호 : KCTC-11332BP).
2. 제1항의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항의 락토바실루스 헬베티쿠스 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 증진용 식품 조성물.
5. 삭제
6. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물은 유원료가 포함된 배양액으로 배양한 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 유원료는 탈지유, 우유, 염소유, 낙타유 및 산양유로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 이들의 혼합물인 조성물.
8. 제2항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)형 치매, 혈관성 치매(Vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease)형 치매, 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병(Huntington's disease)형 치매, 크루츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease)형 치매 및 픽스씨 병(Pick's disease)형 치매로 이루어진 군에서 선택된 치매인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제3항에 있어서, 상기 인지기능 장애는 정신분열증과 연관된 인지 결함, 연령-유도성 기억 손상 또는 정신이상과 연관된 인지 결함, 당뇨병과 연관된 인지 결함, 후-졸중과 연관된 인지 결함, 저산소증과 연관된 기억 결함, 노인성 치매와 연 관된 인지 및 주의 결함, 경증 인지 손상과 연관된 기억력 문제, 치매와 연관된 손상된 인지 기능, 알츠하이머병과 연관된 손상된 인지 기능, 파킨슨병과 연관된 손상된 인지 기능, 맥관 치매와 연관된 손상된 인지 기능, 뇌 종양과 연관된 인지 문제, 픽스씨 병(Pick's disease), 자폐증으로 인한 인지 결함, 전기경련 요법 후 인지 결함, 외상성 뇌 손상과 연관된 인지 결함, 기억상실 장애 및 정신착란으로 이루어진 군에서 선택된 인지기능 장애인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. (a) 유원료가 포함된 배지에 제1항의 락토바실루스 헬베티쿠스를 접종하여 배양하는 단계;

    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 배양물에서 락토바실루스 헬베티쿠스를 제거하는 단계;

    (c) 상기 (b) 단계에서 락토바실루스 헬베티쿠스가 제거된 배양물을 아세톤 또는 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 치매 예방 또는 치료 효과를 가지는 락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 제조 방법.
11. (a) 유원료가 포함된 배지에 제1항의 락토바실루스 헬베티쿠스를 접종하여 배양하는 단계;

    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 배양물에서 원심분리하여 락토바실루스 헬베티쿠스를 제거하는 단계;

    (c) 상기 (b) 단계의 락토바실루스 헬베티쿠스가 제거된 배양물에서 분자량 5,000이하의 물질을 수득하는 단계; 및

    (d) 상기 수득된 물질에 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 및 치료 효과를 가지는 락토바실루스 헬베티쿠스 배양물의 제조 방법.
12. 삭제

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