KR101042052B1 - 항-ｍｉｃｒｏＲＮＡ를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용조성물 - Google Patents

Abstract

고형암, 바람직하게는 자궁경부암에서 특이적으로 생성이 증가되는 특정 microRNA에 상보적으로 결합하는 항-microRNA를 항암제와 함께 투여하여 상승적 효과를 얻는 것을 특징으로 하는 고형암, 바람직하게는 자궁경부암의 예방, 또는 치료 기술이 제공된다.

Description

항-ｍｉｃｒｏＲＮＡ를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 조성물{Composition containing anti-microRNA for treating or preventing solid cancers}

본 발명은 고형암, 바람직하게는 자궁경부암에서 특이적으로 생성이 증가되는 특정 microRNA에 상보적으로 결합하는 항-microRNA와 항암제를 포함하며, 상승적 효과를 얻는 것을 수 있는, 고형암, 바람직하게는 자궁경부암의 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

암의 치료는 수술요법, 화학요법 및 방사선 요법이 시행되고 있는데, 이 중에서 수술 요법이 가장 좋은 완치법이라고 할 수 있으나, 암의 시기와 종류 및 발생 위치에 따라서 치료법의 적용에 한계가 있기 때문에 화학요법이나 방사선 요법과 같은 보조 요법이 동원된다. 1940년대부터 암치료에 도입된 화학요법은 암의 시기나 종류에 관계없이 비교적 쉽게 적용할 수 있다는 장점이 있어서 많은 관심이 집중되고 있으며, 여러가지 항암 화학요법제, 즉 항암제가 개발되어 있다. 현재 통상적으로 사용되고 있는 항암제는 약 40여종이 있으며, 크게 항대사성 항암제 (anti-metabolites), 항생제성 항암제 (antibiotics), 미세소관 억제제 (microtuble inhibitors), 스테로이드계열 항암제, 알킬화제 계열 항암제, 표적치료제 등으로 구분될 수 있다. 그러나, 현재까지 개발된 많은 항암제들은 암세포의 감수성 저하와 부작용 때문에 투여에 있어서 제한을 받고 있다.

이 중에서 알킬화제 계열 항암제는 가장 널리 사용되는 항암제 그룹으로, 암세포 내에 알킬기를 도입하여 구아닌의 N-7 위치와 다른 DNA 중요 부위에 결합함으로써, 염기쌍 결합, 크로스링크를 방해하여 단일가닥 및 이중가닥 파괴(break)를 유발한다.

시스플라틴은 알킬화제 계열 항암제에 속하는 것으로 백금(platinum)을 함유한 중금속 화합물로서 백금 원자를 중심으로 2개의 염소 원자와 2개의 암모니아 분자가 cis-형으로 결합되어 있으며, DNA 가닥상의 인접한 2개의 구아닌(guanine)과 결합하여 인터스트랜드 크로스링크(interstrand crosslink)를 형성하여 DNA 합성을 억제한다. 즉, 암세포의 핵 내에 존재하는 DNA 이중나선 구조에 부착되어 DNA 복제를 저해하여 암세포 성장 및 증식을 억제하고 암세포를 제거하여 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다. 시스플라틴은 현재 사용되고 있는 항암제 중에서 우선 순위로 사용되고 있는 항암제이지만, 암세포에서 시스플라틴에 대한 내성이 나타나는 등 최근 그 문제점이 나타나고 있다. 따라서 시스플라틴을 포함한 알킬화제 그룹계열의 항암 작용을 증가시킬 수 있는 제제 및 기법의 개발은 항암제의 개발과 더불어 암치료 방법의 주요 연구 문제라고 할 수 있다.

한편, MicroRNAs (miRNA)는 최근에 밝혀진 유전자 발현을 조절하는 small noncoding RNAs 종류이다. 성숙한 miRNAs는 18 내지 25개의 뉴클레오타이드를 가지 며 헤어핀 구조 전사체에 의하여 생성된다. microRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억제자로서 작용하며, mRNA 번역을 억제하여 유전자 발현을 억제하거나 mRNA 절단을 촉매하여 불안정화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 miRNAs의 특별한 역할은 세포 증식 및 대사 조절, 발생 시기, 세포 사멸, 조혈, 신경세포 발생, 인간 종양발생, DNA 메틸레이션, 및 염색질 변형을 포함한다.

miRNA 유전자 발현이 인간 암에서 통제된다는 증거가 많아지고 있다. 변형된 miRNA 발현 양상은 폐암, 유방암, 교모세포종, 간세포 암종, 갑상선 유두상 암종, 및 최근에는, 직장암에서도 보고되고 있다. 더욱이, miRNA 발현 signature가 특정 질병의 임상적 결과와 관련 있다는 보고도 있다. 이러한 데이터는 miRNAs가 다양한 인간 암에서 중요한 역할을 한다는 것을 제안하는 것이다.

그러나, miRNA-매개 유전자 조절의 분자적 기초는 아직 완전히 알려지지 않았으며, 이들의 종양발생에 있어서의 역할 역시 거의 알려지지 않았다.

본 발명은 기존의 항암제의 항암작용을 증가시킬 수 있는 특정 microRNA를 발굴하고, 이를 이용하여 효과적으로 고형암을 예방 또는 치료하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 구체예는 고형암, 바람직하게는 자궁경부암에서 특이적으로 생성이 증가되는 것으로 동정된 특정 microRNA 및 항암제를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 마이크로 RNA (microRNA)를 이용한 인간 암세포 증식 억제 기술에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명자들은 암세포에서 특정 microRNA의 생성이 증가하고, 상기 microRNA의 pri-microRNA (primary microRNA)에 상보적으로 결합하는 항-microRNA 올리고뉴클레오타이드 (anti-miRNA)가 암세포내로 도입되어 상기 microRNA의 생성을 감소시켰을 때 암세포 증식이 억제됨을 발견하고, 이를 기존의 항암제와 병용할 때 현저하게 상승된 효과를 얻을 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명의 한 구체예는 반응 감도 및 효율이 우수한 실시간 정량 PCR 어레이법을 이용하여 초기 침습 편평세포암종 (ISCCs)와 정상 자궁경부 상피 조직 세트에 있어서의 miRNA 통제를 분석하여 그 결과를 제시한다.

본 발명은 초기 ISCCs와 자궁경부의 정상 상피조직에서의 상이한 miRNA 발현을 처음 확인하고, 특히 miR-199a이 자궁경부암 상피조직에서 특이적으로 생성이 증가되는 것으로 확인하여, miR-199a이 자궁경부암 치료의 타겟이 될 수 있음을 제안하는 것이다.

이에, 본 발명은 miR-199a의 억제 물질 및 항암제를 혼용 또는 병용 투여하는 자궁경부암 치료 및/또는 예방 기술에 관한 것이다.

이를 위하여, 본 발명의 일례는 miR-199a의 억제 물질 및 항암제를 포함하는 자궁경부암 치료 및/또는 예방용 투약 제제 (dosage form) 또는 단위 투약 제제를 제공한다. 본 발명에 따른 투약 제제는 miR-199a의 억제 물질과 항암제가 함께 제제화된 형태, 또는 miR-199a의 억제 물질과 항암제가 각각 별개로 제제화된 형태의 것일 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명은 miR-199a의 억제 물질 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료 및/또는 예방용 조성물을 제공한다.

또 다른 예에서, 본 발명은 miR-199a의 억제 물질 및 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 자궁경부암 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 치료 및/또는 예방 방법은 miR-199a의 억제 물질 및 항암제를 함께 제제화하여 동시에 투여하거나, miR-199a의 억제 물질과 항암제가 별개로 제제화된 것을 각각 투여하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명은 miR-199a의 억제 물질 및 항암제를 포함하는 자궁경부암 치료 및/또는 예방용 투약 제제 (dosage form)의 제제화 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제제화 방법은 miR-199a의 억제 물질과 항암제를 함께 제제화하거나, miR-199a의 억제 물질과 항암제를 각각 별개로 제제화하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 miR-199a는 포유류 유래, 바람직하게는 인간 유래의 것이며, 서열번호 1 (5'­CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC­3')의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서의 miR-199a의 억제 물질은 miRNA-199a와 결합하여 그 활성을 억제하는 항 miRNA-199a 일 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 miR-199a의 억제 물질은 상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 중 연속하는 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2 (5'­GAACAGGUAGUCUGAACACUGGG­3')의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 항암제는 알킬화제 계열의 항암제일 수 있으며, 특히, 시스플라틴일 수 있다. 상기 알킬화제 계열의 항암제는 어떤 화합물에 알킬기(R-CH2)를 도입할 능력을 갖춘, 반응성이 매우 높은 물질로, 세포에 작용시키면 대부분은 DNA의 구아닌의 N7과 반응하여 DNA구조를 변형시키고, 사슬절단을 일으켜 항암효과 및 세포독효과를 나타낸다. 여기에 속하는 항암제로는 시스플라틴, 니트로겐 머스타드, 클로람부실, 멜팔란, 사이클로포스파마이드, 티오테파, 부설판, DTIC(다카바진), 프로카바진 등이 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 항암제는 시스플라틴, 니트로겐 머스타드, 클로람부실, 멜팔란, 사이클로포스파마이드, 티오테파, 부설판, DTIC(다카바진), 및 프로카바진로 이루어진 알킬화제 계열의 항암제군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 특히 시스플라틴일 수 있다.

상기 miR-199a 억제 물질의 함량 또는 사용량은 제제화되었을 때의 유효성분 을 기준으로, 0.001 내지 500 mg/kg(체중), 바람직하게는, 0.01 내지 100 mg/kg(체중)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 환자의 상태, 증상에 따라서 적절하게 조절될 수 있다. 상기 항암제의 함량 또는 사용량은 특별한 제한이 없으며, 각 항암제의 정해진 용량과 용법에 따를 수 있으며, 환자의 상태 또는 항암제 종류 및 효과 정도 등에 따라서 적절하게 조절될 수 있다. 예컨대, 시스플라틴의 경우 1 내지 100 mg/m²(체표면적), 바람직하게는 10 내지 50 mg/m²(체표면적)의 양으로 사용될 수 있으며, 바람직한 구체예에서, 15-20 mg/m²(체표면적)을 1일 1회, 5일간 연속투여하고, 적어도 2주간 휴약하는 것을 1쿠르(며칠동안 연속으로 항암제를 정맥 내로 점적주사하여 그 후 몇 주간 휴식기를 가지는, 항암제 투여 기간 단위)로하여, 환자의 점진적 상태에 따라 25-35 mg/m²(체표면적)을 1일 1회, 5일간 연속투여하고, 적어도 1주간 휴약하는 것을 1쿠르로 하여 투여를 계속하는 것을 원칙으로 하지만, 이에 제한되는 것은 아니며 환자의 상태나 항암제의 효과 정도에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명에 기술된 항-microRNA 분자는 통상적인 DNA 합성기에 의해 합성되어 직접 이용되거나, 발현 벡터 내로 클로닝된 것일 수 있다. 발현 벡터는 포유류 세포 또는 그 밖의 표적 세포 유형에 복제 및 발현에 이용되는, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 등으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 통상의 방법으로 본 발명에 기술된 항-microRNA서열을 암호화하는 유전자를 합성하여 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 상기한 바와 같이 합성되거나 발현 벡터에 클로닝된 항-microRNA 분자를 유효성분으로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 상기 항-microRNA 분자를 단독으로, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 약제학적 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 고팅, 항세균제 및 항균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하며, 보강 활성 화합물이 추가적으로 포함될 수 있다. 항-microRNA는 투여하고자 하는 경로에 적합하게 제형화 할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 정맥내, 혈액내, 복부, 피하, 흡입, 경피 (국부), 점막 및 직장 같은 비경구 투여 또는 경구 투여 경로로 투여할 수 있다. 투여 방법은 현재 통상적으로 사용되고 있는, 안정성 및 효율이 검증된 의,약학적 방법에 준한다.

본 발명에 따른 조성물의 독성 및 치료 효능은 LD₅₀ (시험군의 50%가 치사 되는 용량) 및 ED₅₀ (시험 군의 50%에 치료효과를 나타내는 용량)을 측정함으로써 세포 배양물 또는 실험 동물의 표준 약제학적 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량비가 치료 지수로 적용 및 표현될 수 있으며 LD₅₀/ED₅₀의 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 질환 치료제가 바람직하며, 비감염된 세포에 대한 손상을 가능한 한 최소로 하여 부작용을 감소시키기 위하여, 치료제에 의해 영향 받는 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계해야 한다.

본 발명의 항-microRNA를 포함하는 조성물의 적합한 용량은 조절되어야 하는 분자(pri-microRNA)의 발현 또는 활성에 의존한다. 항-microRNA가 환자에게 투여 되는 경우, 의사, 수의자, 또는 연구자는 먼저 낮은 용량을 처방한 후, 적합한 반응이 얻어질 때까지 용량을 증가시킬 수 있다. 또한 특정 대상에 대한 특정 용량 수준은 사용되는 항암제를 포함한 특정 화합물의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성병 및 식습관, 투여시간, 투여 경로, 배설율, 배합되는 약물, 및 조절되어야 하는 발현 또는 활성 정도를 포함하는 여러 가지 인자에 의존한다.

본 발명에 따른 조성물은 포유류, 바람직하게는 인간을 대상으로 투여할 수 있고, 투여량은 환자의 연령, 병의 경중 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 유효성분 중량을 기준으로, 0.001 내지 500 mg/kg, 바람직하게는, 0.01 내지 100 mg/kg일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 조성물의 투여는 통상적으로 사용되는 모든 투여방식에 의할 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 주사에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제, 또는 주사제 등의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

miRNA 발현의 조직 특이적 패턴은 최근 보고된 바 있는데, 이들은 발생학적 진화(embryologic development)를 반영하는 것으로 생각된다. 몇 몇 보고들은 특정 miRNAs의 과발현 또는 저발현이 특정 종양 유형에 따라서 상이하게 나타남이 보고되어 있다. 본 발명에서는 정상 자궁경부 상피 조직과 비교하여 ISCC에서는 특정 miRNAs의 과발현이 저발현보다 우세하게 나타남을 확인하였으며, 기존에 자궁경부암에서 과발현되는 miRNA에 대하여 보고된 바 없다. 본 발명에서 얻어진 결과 는, 다양한 조직유형의 종양을 이용한 대규모 프로파일링 연구에서 보여지는 바와 같이, miRNA 발현이 조직 특이적이라는 것에 의하여 설명 가능하다.

대부분의 인간 miRNAs는 단백질 코딩 유전자 사이에서 발현되고, 약 1/3은 annotated mRNA의 인트론들 내에 위치한다. 이들 인트론 miRNAs는 일반적으로 pre-mRNA와 동일한 방향을 갖기 때문에, 본래 mRNA 전사체를 조절하는 프로모터의 조절하에서 조절 가능하다. 지금까지 생물정보학적 접근에 의하여 90개 이상의 인트론 miRNAs이 동정되었지만, 이들 분자들의 대부분은 기능이 밝혀지지 않고 있다. 인트론 miRNAs는 일반적으로 그들의 숙주 유전자의 mRNA와 대등하게 발현한다. 본 발명에서는 생물 정보학적 분석에 의하여 DNM2 인트론 16이 miR-199a의 숙주 유전자임과, DNM2의 mRNA가 인트론 miRNA와 함께 발현함을 확인하였다 (도 1 참조).

암세포에서의 과발현된 miRNA의 녹다운 또는 침묵 miRNA의 발현은 종양세포사멸을 유도할 수 있다. 최근, 'antagomirs'라고 불리는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드의 신규한 종류는 내재 miRNAs를 생체내에서(in vivo) 효과적으로 침묵시킬 수 있다는 것이 보고되어 있다. 본 발명에서는 항-miR-199a가 자궁경부암 세포 (SiHa 및 ME-180) 성장을 감소시키고, 시스플라틴-유도 세포독성을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 2 참조). 시스플라틴에 의하여 유발되는 DNA 손상은 항-miR-199a의 성장 억제를 증가시킬 수 있다.

요약하면, 본 발명에서는, 항-miR-199a는 세포 성장을 억제하고 항암치료 (chemotherapeutic) 반응을 강화 (in vitro)시키는 것을 확인하였으며, 이는 miR-199a이 자궁경부암 치료를 위한 잠재적 치료 타겟이 될 수 있음을 결론 제안하는 것이라 할 수 있다.

이와 같은 microRNA는 암치료에 사용될 수 있으며, 더 나아가 각종 고형암 세포 내의 microRNA 발현 정도를 측정함으로써 암세포 증식에 대한 판단 기준으로 응용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 시료 채취

원발 ISCC (primary ISCC) 환자 (International Federation of Gynecology and Obstetrics stage of IB to IIA)로부터 신선한 동결된 종양 생검 표본 (n = 10)을 외과수술시에 얻었다. 골반 림프종 (pelvic lymph node) 절제를 포함하는 근치 자궁절제술 (radical hysterectomy)는 2002년 1월에서 2003년 10월 사이에 Department of Obstetrics and Gynecology, Samsung Medical Center에 의해서 수행되었다. 종양 표본을 -80℃에서 즉시 snap-frozen하였다. H&E 염색으로 단독 gynecologic pathologist에 의하여 시험하여, >90% 종양 세포를 90% 이상 포함하는 표본만을 분석에 사용하였다. 환자 특성을 정리하여 아래의 표 1에 나타내었다.

[표 1] 자궁 경부(uterine cervix)에 ISCC가 발병한 10명의 환자의 임상적 배경

No.	나이	세포유형	International Federation of Gynecology and Obstetrics stage	Tumor size (cm)	인유두종 바이러스	LN*	PM+	RM‡	Recur
1	54	ISCC	IB1	1.5 x 1.7	+	-	-	-	-
2	69	ISCC	IB1	2.4 x 2.6	+	+	-	-	-
3	46	ISCC	IB1	2.5 x 1.9	+	-	-	-	-
4	39	ISCC	IB2	4.5 x 3.7	+	+	-	-	-
5	38	ISCC	IB1	3.8 x 3.2	+	+	-	-	-
6	38	ISCC	IIA	5.7 x 5.0	-	+	-	-	-
7	40	ISCC	IB1	4.0 x 3.2	+	+	-	-	-
8	74	ISCC	IB1	3.9 x 2.7	+	-	-	-	-
9	40	ISCC	IB1	4.5 x 3.2	+	-	-	-	-
10	52	ISCC	IB1	2.3 x 1.6	+	+	-	-	-

* 림프절 전이

+ 자궁주위 침습 (Parametrial invasion)

‡ 절제면 수반 (Resection margin involvement)

대조군으로서, 양성 산부인과 질환으로 자궁절제술을 받은 환자로부터 정상 자궁경부 조직 (n = 10)을 얻었다. 신선한 자궁경부 생검을 외과적 시술 전에 수득하였다. 디스파제 II (2.4 units/mL; Roche)를 사용하여 간질 (stroma)을 포함하는 전체 자궁경부 조직으로부터 정상 상피 조직을 얻었다 (39). 이들 생검 표본을 멸균 PBS로 수 분간 세척하고 37℃에서 디스파제 II와 함께 1 시간 동안 배양하여 간질 부분을 침전시켰다. 얻어진 상피 박편을 간질층으로부터 조심스럽게 제거시키고, 멸균 PBS로 2회 세척한 후 전 RNA 추출하였다.

실시예 2: RNA 추출 및 역전사

easy-spin (genomic DNA-free) Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 전 RNA를 ISCC 및 정상 상피 조직으로부터 추출하였다. NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Nano-Drop Technologies)를 사용하여 농도를 정량화하였다. TaqMan MicroRNA 에세이 프로토콜 (PE Applied Biosystems; ref. 38)에 따라서 스템-루프 (stem-loop) 역전사 프라이머쌍 (ABI사 제공)을 이용하여 전 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

실시예 3: TaqMan MicroRNA 에세이를 이용한 miRNA 발현 프로파일링

miRNA 발현 프로파일링을 위하여, 7900HT Sequence Detection system (Applied Biosystems)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 157 개의 인간 성숙 miRNAs의 발현 수준을 Human Panel Early Access Kit (PN 4365381; Applied Biosystems)를 사용하여 측정하였다. 제조자 설명서에 따라서, 내부 대조군으로서 let-7a, 양성 대조군으로서 hsa-miR-16, 음성 대조군으로서 cel-lin-4, ath-miR159a, 및 cel-miR-2을 사용하여 데이터를 정상화하였다:

mature miRNA hsa-let-7a (UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU, 서열번호 3)

mature miRNA hsa-miR-16 (UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG, 서열번호 4)

mature miRNA cel-lin-4 (UCCCUGAGACCUCAAGUGUGA, 서열번호 5)

mature miRNA ath-miR159a (UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA, 서열번호 6)

mature miRNA cel-miR-2 (UAUCACAGCCAGCUUUGAUGUGC, 서열번호 7)

2-DDCT 법 (Livak KJ, SchmittgenTD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-컴C(T)) method.Methods 2001;25:402-8)을 이용하여 miRNA의 상대적 양을 계산하였다. 데이터를 단순하여 표현하기 위하여 상대적 발현치에 10⁶을 곱하였다.

실시예 4: DNM2 mRNA 발현에 대한 실시간 정량적 역전사 - PCR 분석

miR-199의 중복하는 전사물로서 DNM2 및 내부 대조군으로서 글리세랄데하이드-3-포스페이트 디하이드로지네이즈 (GAPDH)를 동일한 PCR 반응에 사용하여 실시간 정량적 역전사-PCR을 수행하였다. 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위하여, DNM2 및 GAPDH 증폭을 위한 프라이머와 프로브는 다음과 같은 두 개의 엑손 간의 접합부 (junction)에 혼성화 가능한 것으로 선택되었다:

DNM2 (Hs00191900, Applied Biosystems; NM_001005362, exon boundary 13-14, probe 5'-CATCCCCAATCAGGTGATCCGCAGG-3', 서열번호 8), 및

GAPDH (4310884E, Applied Biosystems).

[PCR 조건]

각 샘플로부터 얻어진 DNM2의 유전자 발현 DCt 값을 GAPDH로 정상화하여 계산하였고, 상대적 정량치를 플로팅하였다 (XiY, Shalgi R, FodstadO, PilpelY, JuJ. Differentially regulatedm icro-RNAs and actively translated messenger RNA transcripts by tumor suppressor p53 in colon cancer. Clin Cancer Res 2006;12:2014-24).

실시예 5: 항- miR -199a의 세포주 및 트랜스펙션

모든 세포 배양에 필요한 시약은 Invitrogen Life Technologies社로부터 구입하였다. 인간 자궁경부암 세포주인, SiHa와 ME-180를 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다. SiHa 세포는 10% 우태아혈청, 페니실린 (100 units/mL), 및 스트렙토마이신 (100 Ag/mL)이 보충된 MEM 배지에서 5% CO2 조건하의 37℃에서 배양하였다. ME-180 세포는 McCoy's 5A 및 RPMI 1640에 두었다.

상기 세포들을 항-miR-199a (Ambion) 100 nmol/L 또는 siPort Neo-FX (Ambion)를 이용하여 음성 대조군으로 트랜스펙션시켰다. 3일 후, 상기 세포로부터 얻은 전체 RNA를 분리하여 RNA-spin total extraction Kit (Intron Biotech)를 사용하여 miR-199a의 발현 수준을 조사하였다.

실시예 6: [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5- 디페닐 - 테트라졸륨브로마이드 ] 에세이에 의한 세포 생존률 측정

자궁경부암 세포 (SiHa 및 ME-180)를 4,000 cells/well으로 96-웰에 플레이팅하고, 3일동안 배양한 후, MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨브로마이드] 에세이를 수행하였다. 상기 MTT 에세이를 위하여, MTT 용액 (PBS에 용해된 10 mg/mL의 MTT 1 mL이 무혈청 배지 9 mL에 첨가됨) 1 mg/mL을 각각의 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 상기 세포들을 암조건하에서 3시간동안 배양하였다. formazan grain를 DMSO (Sigma)에 녹이고, ELISA plate reader (Bio-Rad)를 이용하 여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식에 대한 항-miR-199a의 효과를 추가로 조사하기 위하여, 상기 트랜스펙션된 세포를 시스플라틴 1.5 및 3 Ag/mL로 2일간 처리하였다.

<데이터 분석>

SPSS 소프트웨어 (version 10.0, SPSS Inc.)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 종양 조직 샘플과 비악성 조직 샘플 간의 유전자 발현 중요성을 측정하였다. 또한, 상기 얻어진 real time PCR 데이터는 시료당 3회 반복수행하여 얻은 각 miRNA 유전자의 발현값에 대하여　중간값을 얻어　log값으로 치환하였고, 피어슨 상관매트릭스를 고려하여 GeneSpring GX software (version 7.3.1, Agilent Technologies) 프로그램을 이용하여　Hierarchical average-linkage clustering 하였다.

실험예 1: ISCC 및 정상 자궁경부 상피 조직에서의 miRNA 발현 비교

ISCC 및 정상 자궁경부 상피 조직을 대상으로 총157개의 miRNA 발현 양상을 비교하였다. 그 결과 70개의 miRNA에서 두 조직간 차등 발현 양상을 보였다(유의수준 p<0.05). 68개의 mRNA는 ISCC 조직에서 발현 상승되었으며, 2개의 miRNA는 발현 감소되었다. 이들 중에서, ISCC조직에서 약 100배 이상 (P < 0.0001)의 현저한 과발현 양상을 보인 10개의 miRNAs는 다음과 같다: miR-199-s, miR-9, miR-199a*, miR-199a, miR-199b, miR-145, miR-133a, miR-133b, miR-214, 및 miR-127. 이와 대조적으로, 두 개의 miRNAs, 즉 miR-149 (2.974-fold change) 및 miR-203 (3.704- fold change)에서는 ISCC에서 현저하게 발현이 감소됨을 관찰하였다.

또한 unsupervised hierarchical clustering를 수행하여 ISCC시료의 임상적 기준에 대한 별도의 사전 정보 없이 상기 샘플들을 분류하였다(도 1 참조). 도 1은 miR-199a의 숙주 유전자인 DNM2 인트론 16의 mRNA 수준의 실시간 정량 PCR 분석 결과를 보여주는 것으로, X 축의 번호는 대상시료의 불특정 일련번호를 의미한다. 원발 ISCC (primary ISCC) 환자 (International Federation of Gynecology and Obstetrics stage of IB to IIA)로부터 신선한 동결된 종양 생검 표본 (Columns, n = 10) (표1 참조)과, 대조군으로서, 양성 산부인과 질환으로 자궁절제술을 받은 환자로부터 추출한 정상 자궁경부 조직 (Normal squamous Epithlium) (Columns, n = 10)에서 순수 분리한 mRNA의 발현 수준을 분석하였으며, ISCCs에서 DMM2 인트론 16이 현저하게 높게 나타남을 보여준다 (p < 0.0001). 이와 같은 과정 분석 수행 결과 ISCC시료간 miRNA 발현 양상은 임상적 유사성에 기초하여 2개의 큰 부류로 분류됨을 확인하였는데, 흥미롭게도 상기 두 클러스터 간 림프절전이에 있어서 차이점이 관찰되었다 (p = 0.052 using Pearson m2 test).

실험예 2: miR -199a의 숙주 유전자 조사

본 시험 예에서는 miR-199a는 숙주 유전자인 DNM2 유전자의 인트론 16에 위치하는 intronic miRNA임을 확인하였다. ISCC에서 과발현된 70개의 miRNA와 중복되는 염기서열을 갖는 중복 전사물 유전자의 염기서열을 Sanger miRNA registry (http://microrna.sanger.ac.uk)를 사용하여 조사하였다. 상기 조사에서 중복되는 전사물의 염색체 위치는 40 개 인트론, 22 개 유전자간 부위, 6 개의 3'-비번역 부 위, 2개의 엑손으로 나누어진다. 상위 10개의 miRNAs와 중복되는 전사물의 유전자 목록은 DNM, C1orf61, C20orf166, RP11-771D21.2, 및 RTL1이다.

조사 결과 miR-199-s, miR-199a*, 및 miR-199a의 중복 전사물은 DNM2 mRNA로 동정 확인되었고, DNM2 인트론 16에서의 뉴클레오타이드 서열이 miR-199a* 및 miR-199a의 서열과 상보적임을 발견하였다 (표 2 참조). Intronic miRNA는 이들의 숙주 유전자의 mRNA와 대등하게 발현하기 때문에, 실시간 정량 PCR을 사용하여 동일한 조직을 대상으로 DNM2의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. ISCC에서의 mRNA 수준이 정상 자궁 상피 조직과 비교하여 현저하게 발현 증가된 것을 확인하였다 (p < 0.0001; 도 1). 따라서, 이러한 결과들은 miR-199a*와 miR-199a이 숙주 mRNA, DNM2 인트론 16로부터 유래하는 인트론 miRNAs임을 제안하는 것이다.

[표 2] Mature hsa-mir-199 서열

Accession No.	ID	서열
MIMAT0000231	hsa-mir-199a	6 - cccaguguuCagacuaCcuguuc - 28
MIMAT0000232	hsa-mir-199a*	46 - uacaguagucugcacauugguu - 67
MIMAT0000263	hsa-mir-199b	26 - cccaguguuUagacuaUcuguuc - 48
Dead miRNA entry	hsa-mir-199-s	cccaguguuCagacuaCcuguu_

실험예 3: 항- miR -199a에 의한 자궁경부암 세포의 억제 시험

자궁경부암 형성에 있어서 특정 miRNAs의 역할을 조사하기 위하여, ISCCs에서 가장 발현이 증가하는 miR-199a를 선별하였다 (도 2의 A). TaqMan 실시간 PCR에 의하여 항-miR-199a이 자궁경부암 세포에서의 miR-199a 발현을 현저하게 감소시킴을 확인하였으며, 이는 항-miR-199a가 상기 세포에 효과적으로 도입되어 miR-199a을 넉다운시키는 작용을 한다는 것을 제안하는 것이다 (도 2의 B). 또한, 상 기 억제제가 세포 증식도 감소시킴이 확인되었다 (도 2의 C). 또한, 항-miR-199a-매개 세포 증식 억제 효과는 시스플라틴 용량 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다 (도 2의 D 및 E). 또한, 자궁경부암세포 ME-180및 SiHa에서 확인된 항-miR-199a과 시스플라틴 복합투여에 따른 세포 증식 억제 효과를 별도의 자궁경부암세포 Caski에서 추가 확인하였다. 총 3종의 자궁경부암세포에서 항-miR-199a와 시스플라틴 3ug/ml 복합 투여시 모든 세포주에서 동일하게 세포 증식 억제됨을 확인하였다(도 3).

도 1은 miR-199a의 숙주 유전자인 DNM2 인트론 16의 mRNA 수준의 실시간 정량 PCR 분석 결과를 보여주는 것으로, mRNA 수준이 ISCCs에서 현저하게 높게 나타남을 보여준다 (P < 0.0001).

도 2는 항-miR-199a 올리고뉴크레오타이드에 의한 자궁경부편평세포암종 세포 성장의 억제를 보여주는 것으로, A는 TaqMan real-time PCR (P < 0.0001)로 측정된 자궁경부 침습편평세포암종 조직 및 정상 자궁경부 편평 상피 세포에서의 miR-199a의 상대적 발현, B는 자궁경부 편평세포 (ME-180 및 SiHa)에서의 항-miR-199a에 의한 miR-199a 발현 억제, C는 항-miR-199a에 의한 세포 성장 억제, 및 D와 E는 항-miR-199a와 항암제인 시스플라틴의 복합투여시 시스플라틴 용량 증가에 따라 세포 성장 억제가 증가됨을 보여준다 (Columns, 3번의 독립적 실험의 평균값; bars, SE (*, p < 0.05; **, p < 0.01)).

도 3은 항-miR-199a 올리고뉴크레오타이드와 항암제인 시스플라틴의 복합투여에 의한 자궁경부편평세포 3종(Caski, ME-180, SiHa) 에서의 세포 성장의 억제를 보여주는 것으로, 도 2 D 와 E의 ME-180 과 SiHa 에서 확인된 항-miR-199a와 시스플라틴의 복합투여에 따른 세포 성장의 억제 증가 효과가 별도의 자궁경부편평세포 Caski에서도 동일하게 적용됨을 확인할 수 있다.

<110> Samsung Life Public Welfare Foundation Samsung Medical Center <120> Composition containing anti-microRNA for treating or preventing solid cancers <130> DPP20082560KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-199a <400> 1 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miRNA-199a <400> 2 gaacagguag ucugaacacu ggg 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA hsa-let-7a <400> 3 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA hsa-miR-16 <400> 4 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA cel-lin-4 <400> 5 ucccugagac cucaagugug a 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA ath-miR159a <400> 6 uuuggauuga agggagcucu a 21 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature miRNA cel-miR-2 <400> 7 uaucacagcc agcuuugaug ugc 23 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe of DNM2 <400> 8 catccccaat caggtgatcc gcagg 25

Claims (3)

1. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 올리고뉴클레오타이드와 시스플라틴을 포함하는 자궁경부암 치료 또는 예방용 투약 제제.
2. 삭제
3. 삭제

Images