KR101046630B1

KR101046630B1 - Ｓ-아데노실메티오닌을 유효성분으로 함유하는 암세포 특이적인 항암보조용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101046630B1
Application number: KR1020110034161A
Authority: KR
Inventors: 김근철; 박진아; 함명선; 김진욱; 정종우; 이주경
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-22
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2011-07-05
Anticipated expiration: 2031-04-13

Abstract

본 발명은 S-아데노실메티오닌(SAM)을 유효성분으로 함유하는 암세포 특이적인 항암보조용 약제학적 조성물 및 그 키트에 관한 발명이다.

Description

Ｓ-아데노실메티오닌을 유효성분으로 함유하는 암세포 특이적인 항암보조용 약제학적 조성물{Tumor-specific Pharmaceutical composition for reducing toxic effect of cytotoxic chemotheraphy comprising SAM}

본 발명은 S-아데노실메티오닌(SAM)을 유효성분으로 함유하는 암세포 특이적인 항암보조용 약제학적 조성물에 관한 발명이다.

암은 임상에서 관찰되는 경우의 대부분을 포함하는 암종(carcinoma)과 백혈병, 림프종, 중추신경계 종양 및 육종을 포함하는 조금 덜 빈번하게 발생하는 암의 두 카테고리로 나누어지는 악성 신생형성물의 그룹을 포함한다. 암종은 상피조직으로부터 발생하는 반면에 육종은 결합 조직 및 중배엽 조직으로부터 기원하는 조직으로부터 유래된다. 예를 들어,육종은 근육 또는 뼈에 영향을 미치며, 뼈, 방광, 신장, 간, 폐, 이하선(parotid) 또는 비장에서 발생할 수 있다.

암은 침습적(invasive)이며 새로운 위치로 전이되는 경향이 있다. 암은 직접 주변 조직으로 퍼지기도 하고, 또한 림프계 및 순환계를 통해 퍼지기도 한다.

국소적인 종양에 대한 수술과 방사선 치료 및 항암치료를 포함하는 다양한 치료 방법이 암의 치료에 사용되고 있다. 그러나, 다양한 유형의 암에 대한 사용 가능한 치료의 효능은 제한적이며, 따라서 임상적으로 유익한 새롭고 호전된 형태의 치료 방법이 요구된다. 특히, 이는 진행된 및/또는 전이된 암을 가진 환자에게 있어서 절실하다. 또한, 기존에 확립된 치료방법으로 치료받은 이후에 암이 재발한 환자의 경우에는 동일한 치료방법으로 다시 치료하는 경우 이미 암이 저항성을 획득하였거나 또는 연관되는 독성으로 인하여 치료를 적용하는 것이 제한되기 때문에 새로운 치료방법이 더욱 절실하다.

화학요법은 암 치료에 중요한 부분을 차지한다. 그 이유는 화학요법이 먼 부위로 전이된 진행된 암을 치료하거나 또는 수술 전에 종양을 감소시키는데 필요하기 때문이다. 현재 다양한 작용 형태에 따라 많은 항암제들이 개발되어 왔다.

몇 가지의 세포독성 약물 (예를 들어, 플루오로우라실 (5-FU), 독소루비신 및 캄프토테신)은 DNA를 손상시키거나 세포 대사 경로에 영향을 끼쳐서, 많은 경우에 세포 주기를 간접적으로 차단시킨다. 따라서, 이들 약제는 정상 세포 및 종양 세포 둘다에 대한 비가역적인 손상을 발생시킴으로써 상당한 독성 및 부작용을 초래한다.

구체적으로는, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil; 5-Fu)은 피리미딘 유도체로서 핵산대사를 억제하여 주로 유방암, 대장암, 위암, 췌장암 등에 항암효과를 나타내지만 골수억제, 구강, 소화기 궤양, 간 및 신장손상 등의 부작용 때문에 제약을 받고 있다(Katzung, B.G. Katzung's 임상약리학, 제8판, 대한의학서적, 서울, p977-1015, 2001).

따라서 화학치료제의 독성 부작용으로부터 인간을 포함한 동물들을 보호하는데 효과적인 새롭고 효율성 있는 세포보호 작용제들이 요구된다.

따라서 본 발명의 목적은 암 및 다른 증식성 질병의 치료 중에 사용되는 세포독성 약물의 세포독성 부작용으로부터 개체를 보호하기 위한 화합물, 접합체, 조성물 및 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 정상 세포에 대한 세포독성효과를 감소시키거나 제거하는 암 또는 다른 증식성 질병의 치료를 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 S-아데노실메티오닌(이하, 'SAM'이라 함)을 유효성분으로 함유하는 세포 독성제의 세포독성 부작용으로부터 개체를 보호하는 항암보조용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 S-아데노실메티오닌(SAM)을 유효성분으로 함유하는 5-플루오로우라실의 세포독성 부작용으로부터 개체를 보호하는 항암보조용 키트를 제공한다.

본 발명의 SAM(S-adenosyl-methionine)은 모든 종류의 세포내에서 methionine의 대사과정 중에 대사물질로 생성된다. SAM은 세포내의 단백질, DNA의 메틸화 반응에서 methyl group(CH3) 의 donor 로서 기능하며, 유황의 화합반응을 활성화시키는데 관여하는 물질로 알려져 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 세포 독성제는 5-플루오로우라실,독소루비신 및 캄프토테신으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 사용된 SAM과 5-플루오로우라실은 시그마 컴퍼니(St. Louis, MO, USA)로부터 시판되고 있는 제품을 구입하여 사용하였다.

5-Fu는 피리미딘 유사체로서 세포 내에서 세포독성을 일으키는 대사물로 전환된다. 이 대사물은 뉴클레오티드의 신생합성에서 dUMP에서 dTMP로의 전환을 저해하는 thymidylate synthase inhibitor 로 작용한다. 결과적으로 DNA 및 RNA의 합성을 저해하게 되며 S phase cell cycle arrest를 유도하여 암세포를 apoptosis로 이끈다.

본 발명의 다른 구현에 의하면, 세포독성 작용물의 투여에 앞서, 적어도 본 발명의 SAM에 의한 세포보호 화합물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항암제와 같은 세포독성제 투여의 세포독성 부작용으로부터 개체를 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명의 화합물 및 그 접합체는 암으로 고통받는 개체(동물 및 사람을 포함하는 포유류)에게 투여될 것이다.

본 발명의 화합물 및 그 접합체는 하기에 한정되는 것은 아니나, 난소암; 자궁 경관암; 유방암; 전립선암; 고환암; 폐암; 신장암; 직장암; 피부암; 뇌암; 급성 골수 백혈병, 만성골수 백혈병, 급성 림프아세포 백혈병, 만성 림프아세포 백혈병을 포함하는 백혈병을 포함하는 넓은 범위의 종양 유형들에 대하여 적용될 수 있을 것이라고 믿어진다.

더욱 상세하게는, 하기에 한정되지는 않으나, 본 발명의 화합물, 접합체, 조성물 및 방법에 의하여 적용될 암들로서;심장암으로, 예를 들어, 육종의 예로 혈관육종, 섬유육종, 횡문육종 및 지질육종; 점액종; 횡문근종; 섬유종; 지방종 및 기형종;

폐암으로, 예들 들어, 기관지암의 예로 편평상피 세포, 미분화 소형 세포(undifferentiated small cell), 미분화 대형 세포(undifferentiated large cell) 및 선암(adenocarcinoma); 치조 및 기관지암; 기관지 아데노마(adenoma); 육종; 임파종(lymphoma); 연골혈종(chondromatous); 및 중피종(mesothelioma);

소화기관의 암으로, 예를 들어 식도암의 예로 편평상피 세포 암(squamous cell carcinoma), 선암(adenocarcinoma), 평활근육종(leiomyosarcoma) 및 임파종(lymphoma); 위암의 예로 종양, 임파종 및 평활근육종; 췌장암의 예로 관 선암(ductal adenocarcinoma), 인슐린종(insulinoma), 글루카곤종(glucagonoma), 가스트린종(gastrinoma), 암양종 종양(carcinoid tumors) 및 바이포종(vipoma); 소장암의 예로 선암(adenocarcinoma), 임파종, 암양종, 카포시 육종(Karposi's sarcoma), 평활근육종(leimyoma), 혈관종(hemangioma), 지방종(lipoma), 신경섬유종(neurofibroma) 및 섬유종; 대장암의 예로 선암, 관 아데노마(tubular adenoma), 융모 아데노마(villous adenoma), 하마토종(hamartoma), 및 평활근종;

비뇨생식기 영역의 암으로, 예를 들어 신장암의 예로 선암, Wilm 종양(네프로블라스토마), 임파종 및 백혈병; 방광 및 요도암의 예로 편평상피세포암, 변이세포암(transitional cell carcinoma) 및 선암; 전립선암의 예로 선암 및 육종; 고환암의 예로 반수암(seminoma), 기형배암(teratoma embryonal carcinoma), 기형암종(teratocarcinoma), 융모암(choriocarcinoma), 육종(sarcoma), 세포간 육종, 섬유종, 섬유아데노마, 아데노마토이드 종양(adenomatoid tumors) 및 지방종;

간암으로, 예를 들어 간종양의 예로 간세포암(hepatocellular carcinoma), 담관암(cholagiocarcinoma); 간세포블라스토마(hepatoblastoma);혈관육종(angiosarcoma);간세포 아데노마(hepatocellular adenoma) 및 혈관종(hemangioma);

골격암으로서, 예를 들어 골원성 육종(osteogenic sarcoma, osteosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 유해한 섬유질 대식세포(malignant fibrous histiocytoma), 연골육종(chondrosarcoma), Ewing 육종(Ewing's sarcoma), 유해한 거대 세포 종양 척색증(malignant giant cell tumor chordoma), 골연골성 외골증(osteocartilagious exostoses), 양성 연골증(benign chondroma), 연골블라스토마(chondroblastoma), 연골류점액섬유종(chondromyxofibroma), 뼈골종(osteoidosteoma) 및 거대 세포 종양(giant cell tumors);

신경 체계 암으로, 예를 들어 두개골의 암의 예로 골종(osteoma), 혈관종(hemangioma), 육아종(granuloma), 황색종(xanthoma) 및 골염 변형들(osteitis deformans); 뇌막암의 예로 수막종(meningioma), 수막육종(meningiosarcoma) 및

신경고종증(gliomatosis); 뇌암의 예로 성상세포종(astrocytoma), 수질블라스토마(medulloblastoma), 신경교종(glioma), 뇌실상피종(ependymoma), 성아종(germinoma, pinealoma), 교아세포종(glioblastoma)의 다양한 형태, 희돌기 교종(oligodendroglioma), 슈반세포종(schwannoma), 망막아종(retinoblastoma) 및 선천적 종양들; 및 골수 암의 예로 신경섬유종, 수막종, 신경교종 및 육종;

산부인과 영역의 암으로, 예를 들어 자궁암의 예로 자궁내막암(endometrial carcinoma);자궁 경부암의 예로 자궁경부암(cervical carcinoma) 및 전-종양 자궁 경부 형성 질병;난소암의 예로 난소암(ovarian carcinoma), 혈청 낭종암(serouscystadenocarcinoma)를 포함하는, 뮤신의 낭종암(mucinous cystadenocarcinoma), 구분되지 않은 암, 여포-막 세포 종양, Sertoli-Leydig 세포 종양, 미분화세포종(dysgerminoma) 및 유해한 기형증;

외음부의 암의 예로 편평상피세포암, 상피내암(intraepithelial carcinoma), 분비선암(adenocarcinoma), 섬유종 및 흑색종;

질암의 예로 투명 세포(clear cell)암,편평상피세포암, 포도상육종(botryoid sarcoma) 및 태생 횡문근종(embryonal rhabdomyosarcoma); 및 나팔관 암의 예로 선암종(carcinoma);

혈액학적 암으로서, 예를 들어 혈액암의 예로 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 급성 림프아세포 백혈병, 만성 림프아세포 백혈병, 골수증식성의 질병(myeloproliferative diseases), 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 골수형성질병 증후군(myelodysplastic syndrome), Hodgkin 림프종(Hodgkin's lymphoma, malignant lymphoma) 및 Waldenstrom 매크로글로불린 혈액증(Waldenstrom's macroglobulinemia);

피부암으로서, 예를 들어 유해한 흑색종, 기저세포암, 편평상피세포암, Karposi 육종(Karposi's sarcoma), 몰 이형성 반(moles dysplastic nevi), 지방종, 혈관종, 표피섬유종, 켈로이드, 건선; 및

부신선 암으로서, 예를 들어 신경아세포증;이 포함된다.

암은 전이되는 혹은 전이되지 않는 고체상의 종양일 것이다. 암은 또한, 백혈병에서처럼, 확산성 조직으로서 발생할 것이다.

그러므로, 본 명세서에서 제공된 "종양 세포"라는 용어는, 상기 확인된 질병 중 어느 하나에 의해 고통받는 세포를 포함한다.

또한, 본 발명의 SAM 화합물은 정상 세포 및 조직을 세포독성제에 노출되는 영향으로부터 보호해준다.

본 발명의 화합물은 염의 형태를 취할 수 있다. 용어 "염"은 통상 알칼리 금속염 및 무 산성(free acids) 또는 무 염기성(free bases)의 첨가 염을 형성하는데 사용되는 염을 포함한다. 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 약학적 용도로 사용시효용성을 갖는 범위 내에서 독성 프로필을 갖는 염을 말한다. 약학적으로 허용될 수 없는 염은 예를 들어, 합성 공정에서 유용성과 같은 본 발명의 실시에 유용성을 갖는 높은 결정도와 같은 특성을 가질 수 있다. 적절한 약학적으로 허용가능한산 첨가 염은 유기산 또는 유기산으로부터 제조될 수 있다. 무기산의 예로는, 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산,질산, 탄산, 황산 및 인산을 들 수 있다. 적절한 유기산은 지방족계, 지환족계, 방향족계, 헤테로환계, 카르복시계 및 술폰계의 유기산으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락산, 말산,타르타르산, 시트르산, 아스콜브산, 글루쿠론산 말산, 푸말산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 메실산, 4-히드록시벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산(파모산), 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 판토텐산, 2-히드록시에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 술파닐산, 사이클로헥실아미노술폰산, 스테아릭산, 알긴산, B-히드록시부티르산, 살리시클릭산, 갈락타르산 및 갈락투론산을 들 수 있다. 약학적으로 허용할 수 없는 산 첨가 염은 예를 들어, 퍼클로레이트 및 테트라플루오로보레이트를 포함한다.

본 발명 화합물의 적절한 약학적으로 허용될 수 있는 염기성 첨가 염은 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 포타슘, 소디움 및 아연으로부터 생성되는 금속염 또는 N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 클로린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민 (N-메틸글루카민) 및 프로카인으로부터 생성되는 유기염을 포함한다. 약학적으로 허용될 수 없는 염의 예로는 리튬염및 시아네이트 염을 포함한다. 이들 염 모두는 예를 들어, 적절한 산 또는 염기를 본 발명의 SAM 화합물과 반응시킴으로써 본 발명의 화합물로부터 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.

화학적 보호에 대한 치료학적 이득을 얻기 위한 본 발명에 따른 화합물의 특정 용량은 환자의 크기, 체중, 연령 및 성별, 투여된 화학 요법의 타입 및 용량, 세포 손상의 특성 및 단계 및 본 발명의 화합물의 투여 경로를 포함하는 개별 환자의 특별한 환경에 의해 결정될 것이다.

예를 들어, 약 0.05 내지 약 50㎎/㎏/일의 1일 용량이 사용될 수 있다. 보다 많거나 적은 용량이 또한 고려된다.

화학 요법 제제의 세포 독성 효과로부터 세포보호를 제공하기 위해, 세포 독성 약물의 투여 계획, 즉, 화학요법제가 세포 독성 약물에 앞서 본 발명의 SAM 화합물을 투여하는 규정에 따라 어떤 계획이 가능하다. 세포 보호 화합물이 정상 세포에서 세포 보호 효과를 발휘하기에 충분한 농도로 환자의 정상 세포에 도달할 수 있도록 세포 독성 약물에 앞서 미리 충분히 투여되어야 한다. 또한, 특정 환자에 있어서, 개별 약물동역학 및 특정 약물의 혈액 수준은 본 분야에서 공지된 방법으로 결정될 수 있는 요소이다.

상기 세포 보호 화합물은 세포 독성 약물의 투여에 앞서, 적어도 약 1시간, 바람직하게는 적어도 약 2시간, 보다 바람직하게는 적어도 약 4시간 전에 투여된다. 상기 화합물은 세포 독성 약물의 투여에 앞서, 약 48시간, 바람직하게는 약 36시간 정도 전에 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 화합물은 세포 독성 약물에 앞서 약 24시간 전에 투여된다. 상기 화합물은 세포 독성 영향 24시간 이상 또는 이하의 시간 전에 투여할 수 있으나, 상기 화합물의 보호 효과는 세포 독성 약물 약 24시간 전에 투여할 때 가능 크다. 하나 또는 그 이상의 세포 독성 약물이 투여될 수 있다. 마찬가지로, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물이 조합될 수 있다.

세포 독성 약물 또는 약물들이 순차적으로 투여되는 곳에, 4-48시간 주기, 바람직하게는 12-36시간 주기, 가장 바람직하게는 24시간 주기로 분리하여 2가지 약물 타입을 투여하는 경고와 함께, 스케줄 내에서 본 발명의 세포 보호 화합물을 사이에 삽입하는 것이 실용적일 수 있다. 이러한 방법은 항암 활성에 영향을 끼치지 않고 세포 독성 약물의 부작용의 완전한 근절을 부분적으로 가져온다.

예를 들어, 화학요법제는 매일 또는 4일 마다, 또는 매 21일 마다 공급받을 수 있다. 상기 본 발명의 SAM 화합물은 세포 보호 제제로서 화학요법제 투여의 각 순환 24시간 전에 공급받을 수 있다.

본 발명의 화합물을 여러 경로, 예를 들어 예를 들어, 장(즉, 구강, 직장, 비강 등) 및 비경구 투여로 치료학적 효과를 위해 투여할 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 복막 내, 질 내, 방광 내(즉, 방광에), 진피 내, 국소성,피하 또는 혀 밑 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 범위로 생각되는 것은 후에 약물의 전신 또는 국소적 방출이 일어나도록 조절된 배합물로 환자의 신체에 약물을 투여하는 것이다.

본 발명의 SAM 화합물이 투여될 경우, 하나 또는 그 이상의 세포 독성 약물을 첨가하여 투여될 때, 상이한 화합물은 동일 또는 다른 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 접합체는 약학적으로 허용가능한 캐리어와 함께, 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 배합물에서 상기 활성 성분은 0.1 내지 99.99중량%를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 캐리어"는 희석제 또는 부형제 등 제제의 다른 성분과 혼화 가능하고, 수용체에 유해하지 않은 것으로서, 여하한 캐리어를 의미한다.

상기 활성화제는 선택된 투여 경로 및 표준 약학적 관습에 기초하여 선택된 약학적으로 수용가능한 캐리어와 함께 투여되는 것이 바람직하다. 상기 활성화제는 약학적 제조 분야에서 표준 관습에 따라 1회분 복용량 형태로 배합될 수 있다.Alphonso Gennaro, ed., Remington의 의약 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences), 18th Ed., (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA 참조. 적절한 투약 형태는 예를 들어, 정제, 캡슐, 액제, 비경구 투여액제, 트로키제(torches),좌약제, 또는 서스펜션을 포함한다.

비경구 투여를 위해, 활성화제는 물, 오일(특히, 식물성 오일), 에탄올, 살린 용액, 수성 덱스트로스(글루코스) 및 관련 당 용액, 글리세롤, 또는 프로필렌 글리콜로 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜과 같은 적절한 캐리어 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 비경구 투여용 용액은 수-용해성 염의 활성화제를 포함한다. 안정화제, 항산화제 및 방부제가 또한 첨가될 수 있다. 적절한 항산화제는 술파이트, 아스코르브산, 시트르산 및 그 염, 및 소디움 EDTA를 포함한다. 적절한 방부제는 벤즈알코니움 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤, 및 클로르부탄올을 포함한다. 비경구 투여용 조성물은 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션의 형태를 취할 수 있다.

경구 투여용으로, 활성화제는 정제, 캡슐, 환, 분말, 미립 또는 다른 적절한 경구 제제 형태의 제조를 위해 하나 또는 그 이상의 고체 불활성 성분과 혼합될 수 있다. 예를 들어, 활성화제는 필러, 바인더, 휴멕턴트, 분해제, 용해 억제제, 흡수 촉진제, 침윤제, 흡수제, 또는 윤활제와 같은 적어도 하나의 부형제와 혼합될 수 있다. 하나의 정제 구현예에 따르면, 상기 활성화제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨 및 전분과 혼합되고, 그 후에 통상적인 정제법에 의해 정제로 형성될 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

SAM은 methionine adenosyltransferase에 의해 methionine과 ATP가 결합하여 만들어진 물질이다. 구조적으로는 amine group과 methyl group 등을 가지고 있다. 특히 sulfonium ion에 있는 methyl group은 반응성이 매우 좋기 때문에 SAM은 세포내의 단백질, DNA의 메틸화 반응에서 methyl group (CH₃)의 donor 로서 기능한다. 또 SAM은 유황의 화합반응을 활성화시키는데 관여하는 물질로 알려져 있다. SAM은 우리 몸이 호르몬을 생산하고 조절하도록 도와주며 세포 점막과 특히 기분을 결정하는 신경 전달물질의 생성에 관련이 있어서 감정적으로 기분이 좋게 하고, 연골 형성을 도와주어 관절을 튼튼하게 하는 역할을 한다고 알려져 있다. 그리고 간에서 알코올과 같은 독성물질을 제거하는데 사용되는 항산화제인 glutathione의 생성에 관여되어 있어서 간을 보호하는 역할도 한다.

특히 SAM은 methyl화 반응에 관여하기 때문에 DNA 또는 histone 단백질들의 methylation을 유도하여 genome 구조의 안정화에 기여할 수 있다(도 1a).

SAM (S-adenosyl-methionine)은 모든 종류의 세포내에서 필수아미노산인 methionine의 대사과정 중에 대사물질로 생성된다. methionine 은 MAT(methionine adenosyltransferase)에 의하여 ATP와 반응하여 S-adenosyl methionine으로 전환되며, 이것은 체내에 필요한 여러 대사과정에서 메틸기를 제공해 주는 중요한 물질로 작용한다. 그 후 메틸기가 떨어져나가 중간산물인 호모시스테인(homocysteine)이 되고 이것은 다시 cystathionine synthetase와 cystathionase의 황전환작용에 의하여 시스테인(cysteine)으로 대사된다. 메티오닌 대사과정중 생성된 호모시스테인의 대부분은 재메틸화되어 메티오닌으로 전환된다(도 1b).

SAM은 세포내의 methyl donor 로서 작용하기 때문에 세포의 성장에 영향을 미칠수있는지 조사하고자 사람 페암세포주인 A549 세포에 10 uM의 SAM을 처리하여 48시간 후에 위상차 현미경을 이용하여 세포 형태등을 관찰하였더니 대조군과 비교하여 세포형태 및 성장에는 큰 영향이 없음을 확인할 수 있었다 (도 2a).

그러나 genome 구조의 안정화에 기여할 수 있는 SAM이 5-FU, cisplatin 등이 항암제들과 함께 처리되었을 때 항암효과에 대한 작용기전을 연구하기 위하여 항암제의 단독처리 또는 SAM 과 복합처리를 수행한 결과, 이중 저농도의 5-FU (2.5 uM)와 고농도의 5-FU (10 uM)을 처리한 실험군에서 흥미로운 양상을 관찰할 수 있었다.

고농도의 5-FU는 세포성장에 대한 저해효과를 관찰할 수 있었으나, SAM과 5-FU를 함께 처리하였을 경우에는 이러한 세포 성장 효과가 어느 정도 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(도 2b).

이러한 결과를 정량적으로 확인하고자 SAM 과 5-FU를 처리한 후 Methylene Blue 염색시약 (in 1% methanol)을 이용하여 염색한 결과 SAM 이 고농도의 5-FU에 대해서는 항암제의 protection 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 2c).

또한 세포계수 방법을 통해 유사한 결과를 확인할 수 있었다(도 2d).

세포주기변화에 대한 정량적인 분석을 위해 FACS 분석을 수행하였다. 그 결과 대조군과 비교하여, 10 uM의 SAM 단독처리군은 세포주기에는 큰 영향이 없음을 확인할 수 있었다(도 3a).

그러나 2.5 uM의 5-FU를 SAM 과 함께 처리한 후에는 세포사멸효과가 나타는 것을 확인할 수 있었다. 한편 10 uM의 5-FU를 단독처리한 실험군은 세포의 사멸효과를 관찰할수 있으나, 10 uM의 5-FU를 SAM 과 혼합처리하였을 경우에는 단독처리군과 비교하여 보았을 때 세포 주기가 안정화 되는 보호효과를 관찰할 수 있었다(도 3b). 이러한 결과는 도 2에서 다양한 방법을 사용하여 확인한 바와 함께, 일정한 양상으로 고농도의 5-FU 의 항암효과는 SAM과 복합처리에 의해 조절되는 것을 정량적으로 확인할 수 있었다.

SAM이 5-FU에 의한 세포 증식 및 성장억제에 어떻게 영향을 미치는 지를 조사하기 위해 96well에 5000 cell를 준비하여 MTT assay를 수행하였다. 도 4에서 보듯이, SAM을 4일간 처리하여 MTT assay를 수행한 결과 세포증식에 큰영향이 없었다. 그러나 저농도의 SAM에서는 오히려 세포 증식의 활성효과가 있는 것으로 여겨지며, 고농도의 SAM에서는 아주 미미한 세포성장 저해 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 5-FU는 농도의존적으로 꾸준하게 세포증식 저해효과를 보였지만 처리 후 3일 이후부터는 그 활성이 감소하는 경향이 있었다. 그러나 SAM 과 5-FU를 혼합처리하여 4일간 관찰한 결과 5-FU 단독처리군과 비교하여 SAM과 5-FU의 혼합처리에서 protection effect가 지속되는 것을 확인하였다(도 4).

농도별로는 10ug/ml의 농도까지 control에 비해 SAM 처리군의 세포가 더욱 잘 자랐지만, 그 이상의 농도에서는 오히려 세포생장을 저해하는 결과를 보였다. 5-FU의 세포저해 효과는 농도가 높아질수록 더 강하게 나타났으며 SAM과 5-FU의 혼합처리군의 세포가 5-FU 단독처리군의 세포보다 더 많이 생존하였음을 확인하였다. 그러므로 SAM과 5-FU의 혼합처리 시 5-FU의 독성에 대한 SAM의 보호효과가 dose/time-dependent하게 나타난다는 것을 알 수 있다.

5-FU의 항암효과를 매개한다고 잘 알려진 p53 등의 단백질의 발현양상을 western blot을 통해 조사하였다. p53 단백질은 5-FU 처리에서 항암효과를 매개하기 위해 급격히 증가하지만, SAM 과 5-FU의 혼합처리에는 발현변화가 일어나지 않음을 확인하였다.

한편 Bcl-2의 발현은 단독처리군 또는 혼합처리군에서 큰 변화가 없었다(도 5a). 또한 SAM의 세포내의 DNA 또는 단백질의 메틸화에 관여한다고 알려져 있으므로 본 발명자들은 세포내 메틸화에 관여하는 단백질들의 발현양상을 조사하였다. 그중 DNA의 메틸화에 관여하는 DNMT 단백질의 발현을 RT-PCR 로 조사하였다.

5-FU 의 단독처리는 DNMT1 과 DNMT3B 의 발현저하를 유도하였다. 그러나 5-FU 와 SAM 의 혼합처리시에는 DNMT 유전자들의 발현이 증가하였다(도 5b). 이러한 결과는 5-FU에 대한 SAM의 항암효과 보호작용은 DNMT의 기능을 매개로 하여 p53 등과 같은 여러 항암효과 조절 단백질들의 발현 조절이 일어나기 때문인 것으로 사료된다.

본 발명자들은 다양한 실험 방법을 이용하여 A549 human lung cancer cell에서 5-FU의 항암효과에 대한 SAM의 보호효과를 관찰하였다. 그러나 이러한 SAM의 5-FU에 대한 항암보호효과가 정상세포에서도 보여지는지를 알아보고자, 인간유래 정상 lung fibroblast (섬유아세포)인 IMR90 cell을 ATCC 로부터 구입하여 MTT assay를 수행하였다.

이전의 보고에 의하면 정상세포는 암세포에 비해 세포의 성장이 많이 느리며, 10 passage 이상에서 배양이 용이하지 않다고 알려져 왔다. A549의 경우 약 3-4일 정도의 세포 passage가 무한정 유지되는 반면, IMR90은 약 7일 이상이 한 passage에 해당하는 것을 알 수 있었다. 이러한 IMR90 세포에 항암제인 5-FU 만을 단독처리할 경우 암세포에서 보여지는 현상과 같이 세포성장억제효과를 확인할 수 있었다. 그러나 암세포에서는 SAM의 단독처리가 성장에 큰 영향이 없었던 점에 비해 IMR90 세포에 SAM 만을 단독처리하게 되면, 약간의 세포 증식 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었으나, 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이, 정상세포에 5-FU를 단독처리한 경우에 비하여 SAM을 병용처리한 경우 세포사멸에 대한 억제효과가 발생하여 SAM이 정상 세포에서 5-FU에 대한 세포독성을 감소시키는 것을 알 수 있었다. 따라서 SAM을 5-FU와 병용투여시에 세포독성제에 의한 부작용을 감소시켜 항암 보조제로 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명을 통하여 확인된 암세포에서 나타나는 5-FU에 대한 SAM의 항암보호효과는 암세포에 특이적인 것으로 보여지며, 이러한 보호효과를 이용하여 암으로 고통받는 환자들에게 SAM과 항암제와 혼합처리에 따른 저농도의 항암제 처치, 정상세포에 대한 부작용을 완화할 수 새로운 치료전략을 수립하는데 유용할것으로 사료된다.

도 1은 SAM의 구조(도 1a) 및 대사 경로(도 1b)를 나타낸 그림.
도 2a 및 b는 SAM의 세포 생존률 효과를 나타낸 사진이고, 도 2c는 Cell colony staining을 수행하여 세포사멸효과를 확인한 사진이고, 도 2d는 SAM에 의한 생존 세포수 증가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 FACScan flow cytometry에 따른 세포 주기 관찰 그래프이다.
도 4는 A549세포에서 MTT assay를 이용한 세포 증식 측정한 그래프로 4a 내지 4c는 시간 경과에 따른 효과를 나타내며, 4d 내지 4f는 용량 의존적인 효과를 나타낸다.
도 5는 SAM과5-FU 혼합처리에 따른 관련 단백질 발현 양상 및 DNMT 발현의 조절에 대한 분자기작을 나타낸 그림.
도 6은 MTT assay를 이용한 정상세포인 IMR90의 세포증식 측정한 그림이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:세포주 배양

본 발명에서는 인간 폐암세포 A549와 정상 섬유아세포 IMR90을 사용하였다. 세포배양을 위해서 A549세포는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium; Lonza Walkersville, MD USA)배지를, IMR90세포는 EMEM( Eagle's Minimum Essential Medium; Lonza Walkersville, MD USA)배지를 사용하였고 각 배지에는 10%FBS (Fetal Vovine Serum; Gibco BRL Life Technologies, Gaitherburg, MD USA)와 1% streptomycin-penicillin(Gibco BRL Life Technologies, Gaitherburg, MD USA)을 첨가하여 사용하였고, 5% CO₂, 37℃가 유지되는 습윤 배양기를 이용하여 배양하였다. 배지는 1주일에 2회 교체하였고, 세포가 배양용기에 약 80%를 차지할 정도로 자랐을 때 계대배양을 시행하였다. 세포 수확은 실험을 수행한 세포에 1X Trypsin(Gibco BRL Life Technologies, Gaitherburg, MD USA)을 처리하고 약 1분 후에 세포를 떼어내어 15ml 원심관에 옮겨 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 1X PBS(Phosphate Buffered Saline; Lonza Walkersville, MD USA)로 2회 washing하여 실험에 사용하였다.

실시예 2: Viability Assay

100mm dish에 상기 세포들을 8X 10⁵씩을 심고 6시간 배양 후 Media를 제거하고 1X PBS로 1회 Washing하였다. DMEM에 SAM (20ug/ml), 5-FU(2.5uM/10uM), SAM(20ug/ml) + 5-FU(2.5uM/10uM)을 넣어 세포를 배양하고, DMEM만 처리한 세포를 대조군으로 사용하였다.

5-FU 처리 48시간 후 세포의 모습을 확인하기 위해 광학현미경(Nicon Eclipse Ts100)으로 관찰하였다.

실시예 3: Cell Counting Assay

세포를 수집하여 회수한 일정 수의 세포 현탁액에 trypan blue 염색 시약을 50%가 되도록 첨가한 다음 haemocytometer를 이용하여 trypan blue에 염색되지 않은 생존 세포수를 산정하였다.

실시예 4: Cell Colony Staining

Cell colony staining을 수행하여 세포사멸효과를 확인하였다. 6well plate에 A549 Cell을 심고 6시간 후 DMEM만 처리한 대조군은 Media를 교체하여 주고 비교군은 DMEM에 SAM(20ug/ml), 5-FU(2.5uM), 5-FU(10uM), SAM+5-FU(2.5uM), SAM+5-FU(10 uM)의 농도가 되도록하여 각 96시간 처리 후 염색 하였다. 염색시약으로 Methylene Blue를 Methanol에 1%가 되도록 녹여 사용하였고 세포에 염색 시약을 처리하고 5시간 배양 후 D.W로 여러 번 헹구어 염색의 정도를 비교하였다.

실시예 5: FACS Analysis

수확한 세포를 1X PBS 1ml로 washing 후 그 중 300ul을 15ml Tube에 옮기고 1X PBS 300ul를 넣는다. 99% EtOH 1.4ml을 넣어 70%농도의 EtOH로 cell을 하루 동안 고정한다.

다시 원심분리하고 상층액 제거 후 0.5 ml의 PI 염색 시약(0.1% NP-40, 20μg/ml RNase, 0.004% PI)으로 염색하여 FACScan flow cytometry로 분석하였다.

실시예 6: MTT assay

MTT(sigma, cat.#M2128) 시약은 최종농도 5 mg/ml가 되도록 PBS에 녹인 후 빛을 차단하고 -20℃에 보관하였다. 96-well plate에 각 그룹별로 하나의 well 당 2X10³ cell/200ul (배양액)의 세포를 넣은 후 12시간 동안 5%의 CO2 배양기에서 배양하였다. 세포가 안정적으로 plate에 부착된 것을 확인 후, 각각의 96-well plate에 항생제 처리를 하였다. 그 후, 0~4일 동안 24시간 간격으로 96-well plate에 MTT 10 ul : 배양액 90 ul의 비율로 MTT 시약을 첨가하여 2시간 배양하였다. 배양액을 제거한 후 well당 DMSO 100ul를 첨가하여 세포에서 환원되어 배출된 MTT formazan을 녹여내고 scanning multiwell spectrophotometer로 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3개 well의 평균 흡광도를 결과로 사용하였다.

실시예 7: 역전사 PCR

A549 세포에 SAM(20ug/ml), 5-FU(2.5uM), 5-FU(10uM), SAM+5-FU(2.5uM), SAM+5-FU(10uM)의 농도가 되도록하여 각 48시간 처리한 후 세포를 수확하고 수확한 세포에서 RNAiso(Takara, cat.#9109)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA에 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, cat.#29473101)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

DNMT1은 5'-GTGGGGGACTGTGTGTCTCTGT(서열번호 1), 5'-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC(서열번호 2) DNMT3a는 5'GACTCCATCACGGTGGGCATGG(서열번호 3), 5'TGTCCCTCTTGTCACTAACGCC(서열번호 4) DNMT3b는 5'GAGTCCTTGCTGTTGGAACCG(서열번호 5), 5'-ATGTCCCTCTTGTCGCCAACCT(서열번호 6) 프라이머를 이용하여 95℃ 5분, 62℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 30cycle PCR을 수행하였으며, PCR 산물을 1% agarose gel 전기영동을 통해 확인하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

S-아데노실메티오닌(SAM)을 유효성분으로 함유하는 5-플루오로우라실의 세포독성 부작용으로부터 개체를 보호하는 항암보조용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 폐암에 사용하는 것을 특징으로 하는 항암보조용 약제학적 조성물.
S-아데노실메티오닌(SAM)을 유효성분으로 함유하는 5-플루오로우라실의 세포독성 부작용으로부터 개체를 보호하는 항암보조용 키트.
제 3항에 있어서, 상기 키트는 폐암에 사용되는 것을 특징으로 하는 항암보조용 키트.