KR100990260B1 - 발효 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본원은 발효 흑마늘 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로 이는 항비만, 항고지혈증 효과 및 이로 인해 초래될 수 있는 대사증후군 증상의 치료에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 조성 {Composition for treating or alleviating obesity or hyperlipidemia comprising black garlic extract}

본 발명은 천연 추출물 분야이며, 구체적으로 흑마늘 추출물, 구체적으로 발효된 흑마늘 추출물에 관한 것이다.

비만에 대한 늘어나는 경각심과 비만의 원인을 이해하고 이에 대응하고자 하는 전 지구적 노력에 불구하고, 전 세계적으로 비만은 가속적으로 증가하고 있다. 비만의 발생은 유전적, 사회적 및 경제적 요인 등의 많은 복잡한 요인과 함께 운동량의 사회적 감소와 고열량 음식의 섭취량 증가로 인한 에너지 항상성 조절 실패가 원인으로 보고되고 있다 (Mitchell et al ., Implications for female fertility and obesity. Reproduction. 2005;130:583-97). 최근에는 고칼로리 음식의 섭취와 육체활동 저하에 의해 발병하는 것으로 알려진 2형 당뇨병을 포함하는 대사증후군과 연관된 비만의 발병이 세계적으로 증가하고 있다(James PT et al., The worldwide obesity epidemic. Obes Res. 2001;9:228S-233S). 또한, 2025년에는 이러한 대사증후군을 가진 인구가 2배로 늘어나 약 3억명에 이를 것으로 예측되고 있다(Zimmet P. The burden of type 2 diabetes: are we doing enough? Diabetes Metab. 2003;29:6S9-18).

비만 진행 여부의 판단은 대표적으로 과체중 여부로 판단할 수 있으며, 구체적으로 특정 부위에서의 체지방의 증가(예를 들어, 복부 비만 등)로 판단할 수 있다. 비만으로 분류된 경우 즉, 비만자는 다른 질병에 비해 유병률과 사망률이 높고 정상체중을 가진 사람과 비교하여 당뇨병 질환으로 인한 사망률은 4배, 간병경증 질환으로 인한 사망률은 2배, 뇌혈관질환으로 인한 사망률은 1.6배 및 관상동맥질환으로 인한 사망률은 1.8배 정도 높은 것으로 보고되고 있다.

또한, 복부 비만은 동맥경화성 죽종형성(atheroma formation)의 원인으로 보고되었으며 (Kunitomi M et al., Relationship between reduced serum IGF-I levels and accumulation of visceral fat in Japanese men. Int J Obes Relat Metab Disord. 2002;26:361-9), 기타 고혈압, 고지혈증, 면역체계의 이상 및 고인슐린증 등의 여러 질환의 원인으로 보고되고 있으며, 결과적으로 심혈관질환의 이환률(morbidity)과 사망률(mortality) 증가의 원인이 되는 것으로 보고되고 있다(Hida K, et al., Visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor: a unique insulin-sensitizing adipocytokine in obesity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:10610-5).

현재 비만을 치료하기 위한 다양한 방법이 제공되고 있다. 일반적으로 비만증의 치료법은 식이요법, 운동요법, 식욕 억제제, 이뇨제, 설사제 혹은 포만감을 주기 위한 섬유질 등을 사용하는 약물요법, 잘못된 식습관과 생활습관을 교정해 주는 행동수정요법, 외과에서 장이나 위의 용적을 줄이는 수술요법, 성형외과 등에서 초음파를 이용하여 지방세포를 분해, 제거하는 방법 등의 지방제거수술 등이 있다.

그러나 현재까지 제공된 방법은 그 효과가 뛰어나지 않거나 여러 부작용을 수반하는 문제점이 있다. 특히 약물요법의 경우, 우울증, 불면증이나 소화장애 등 그 부작용이 다양하게 보고되고 있다. 일예로 5060년대에 비만치료제로 널리 사용됐던 암페타민(amphetamine)은 중독성이 문제로 지적되었으며, 국내에서 가장 많이 팔리고 있는 '리덕틸'은 혈압 상승 등의 부작용이 보고되고 있다.

또한, 항비만제로 사용되는 티아졸리디네디온(thiazolidinediones, TZDs)은 글루코오스 신합성을 감소시킴으로써 간에서의 당생성을 저해하고, 고지방에 의해 유도되는 비만을 저해하는 메트포르민(Park SH et al., Euonymus alatus prevents the hyperglycemia and hyperlipidemia induced by high-fat diet in ICR mice. J Ethnopharmacol. 2005;102:326-35) 등의 경우에도 다양한 부작용과 이차적 실패(secondary failure) 확률(Inzucchi SE. Oral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetes: scientific review. JAMA. 2002;287:360-72)이 높은 것으로 보고되고 있다.

상기한 이유로, 최근에는 비만의 치료와 관련하여 약용 식물(medicinal herb)의 사용을 포함한 대체 접근법에 대한 관심이 증대되고 있다. 최근에는 많은 천연 또는 생합성 물질을 이용한 항비만제에 대한 연구가 진행되고 있다.

그러나, 동물 실험이나 인간에 대한 임상실험 결과 상기 약용 식물 등을 이용한 물질의 경우 유효한 효과를 얻기 위해서는 높은 함량의 투여가 요구된다는 문제점이 있음이 보고되고 있다.

비만과 밀접하게 관련되어 있는 대사증후군은 만성적인 대사 장애로 인하여 발생하는 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 비만, 관상 또는 동맥경화증과 같은 여러 가지 질환이 동시에 발생하는 질환을 일컫는 것으로, 1988년 Reaven (Raven GM, Diabetes 1088; 37:1595-607) 에 의해 처음으로 규명되어 X 증후군이라고 불리는 복합성 질환이다. 국제콜레스테롤 교육프로그램의 제3차 콜레스테롤 관리치침 (NCEP-ATP III)에서 제시한 가이드라인에 의하면 당뇨병 또는 내당장애, 비만도, 고혈압, 고지혈증 등을 3가지 이상 복합적으로 나타내는 경우를 대사증후군으로 진단하며 이러한 대사증후군의 증상은, 비만과도 밀접한 관련이 있는 내당장애, 이로 인한 고혈압, 고지혈증과 고지혈증으로 인한 신장 및 간손상인 것으로 보고되었다 (Laaksonen DE, et al., American Journal of Epidermiology 2002; 156:1070-1077).

그러므로 비만의 치료는 물론 복합적 증상을 갖는 대사증후군의 효과적인 관리 또는 치료를 위해서는 정상 혈당의 유지를 위한 혈당강하 효과와 동시에 신병증, 간병증, 고지혈증 등을 치료하는 효과를 갖는 것이 이상적이나, 아직까지 이러한 치료제는 개발되지 않았으며, 혈당강하제, 혈압강하제, 콜레스테롤 치료제 등을 각각 개별적으로 별도로 복용하고 있다.

종래 대사증후군의 한 증상인 당뇨병을 완화하는 추출물이 공지되었다. 한국 등록특허공보 제195886호는 동충하초, 우황 등의 17종의 생약성분을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 개시하고, 한국 등록특허공보 제126431호는 곡물류와 녹차, 자황 등의 생약 성분을 포함하는 혈당강하 효과가 있는 건강식품 조성물을 개시한다. 그 외, 상엽 추출물(한국 특허 공개 제1998-21670), 홍경천추출물(한국 공개특허공보 제1997-32879), 녹차추출물(일본차의 혈당강하 성분에 관한 연구, 108권, 10호: 964-970, 1988), 장생도라지 추출물(한국 특허 공개 제2000-7447호) 등을 함유하는 약제가 혈당 강하 효과가 있는 것으로 보고되었다.

그러나 이러한 치료제는 상기 치료제는 혈당강하에 중점을 두고 있는 것으로서, 어느 문헌도 비만의 치료, 신병증, 간병증, 고지혈증에 복합적으로 사용될 수 있는 추출물 및 나아가 이러한 효능을 갖는 흑마늘 추출물은 전혀 개시하고 있지 않다.

본원은 비만 및 고지혈증의 치료는 물론 이로 인해 나타나는 대사증후군, 신병증, 간병증의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있는 추출물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 한다.

본원은 발효 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 발효는 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti), 또는 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 중 하나 이상을 이용한 것인 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 발효는 효모를 이용한 것인 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 비만은 대사증후군을 유발하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 대사 증후군은 내당장애, 고혈압, 고지혈증, 간병증 및 신병증 중 하나 이상을 포함하는 증상을 갖는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 고지혈증은 비만에 의해 유발된 것인 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 조성물은 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제로 제공되는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원의 흑마늘 추출물 및 이를 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 건강식품은 체중감소, 혈당강하, 신병증, 간병증, 고지혈증 증상의 예방, 치료 및 완화 효과를 갖는다.

도 1은 HFD 식이를 한 마우스에 표 2에 기재된 각종 시험물질을 64일간 연속 투여한 경우 체중의 변화를 나타내는 그래프이다. 그래프에서 B28은 시험물질 투여 시작 28일전 HFD 사료공급 개시 시 마우스의 체중을 나타낸 것이다. B1은 시험물질 투여 1일 전을 의미하고, Day 0은 투여개시일, Day 63은 투여 63일째로 마우스가 희생된 날을 의미한다.
도 2는 H&E 염색된 난소주위의 지방세포 (좌측) 및 복부 지방패드 (우측)의 조직병리 광학현미경 관찰 사진이다(Olympus, X400). 정상대조군 (A, B), HFD 대조군 (C,D), 심바스타틴 (E,F), 실리마린 (G, H), 메트포르민(I, J), BG (흑마늘 추출물) 400mg/kg (K, L), 발효흑마늘 추출물 400mg/kg (M, N), 200mg/kg (O,P) 및 100mg/kg (Q, R). 화살표는 측정된 지방세포의 직경을 나타내고, 스케일 바는 80μm이다.
도 3은 H&E 염색된 복부 지방패드의 조직병리 광학현미경 관찰 사진이다(Olympus, X400). 정상대조군 (A), HFD 대조군 (B), 심바스타틴 (C), 실리마린 (D), 메트포르민(E), BG 400mg/kg (F), 발효흑마늘 추출물 400mg/kg (G), 200mg/kg (H), 100mg/kg (I), MS(등복벽근육), LN(림프절), 화살표는 축적된 지방층 두께를 나타내고, 스케일 바는 80μm이다.
도 4는 H&E 염색된 간조직의 조직병리 광학현미경 관찰 사진이다(Olympus, X400). 정상대조군 (A), HFD 대조군 (B), 심바스타틴 (C), 실리마린 (D), 메트포르민(E), BG 400mg/kg (F), 발효흑마늘 추출물 400mg/kg (G), 200mg/kg (H), 100mg/kg (I), CV(Central Vein), 화살표는 측정한 지방세포의 직경을 나타내고, 스케일 바는 80μm이다.
도 5는 H&E 염색된 간조직의 조직병리 광학현미경 관찰 사진이다(Olympus, X400). 정상대조군 (A), HFD 대조군 (B), 심바스타틴 (C), 실리마린 (D), 메트포르민(E), BG 400mg/kg (F), 발효흑마늘 추출물 400mg/kg (G), 200mg/kg (H), 100mg/kg (I), GL(Glomerulus, 사구체), DT(Distal convoluted tubule, 먼쪽곱슬세뇨관), PT (proximal convoluted tubule, 근위곱슬세뇨관), AB(abnormal vacuolated tubules, 비정상 공포화 세뇨관)이고, 스케일 바는 80μm이다.

본원은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 및/또는 고지혈증 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "비만"은 에너지 불균형에 의하여 체내에 축적된 지방이 정상수치보다 높은 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 세계보건기구 WHO에 의하면 아시아태평양 지역의 경우, 비만의 진단에 이용되는 것은 키(meter단위)의 제곱으로 자신의 체중을 나눈 값이 되며, 이 값이 25.0 이상인 경우는 비만이라고 정의하고, 23이상 25미만은 과체중(위험체중)으로 정의하고 있다. 비만은 분류에 따라 내분비성 비만 (내분비 이상 또는 뇌질환으로부터 기인), 단순성 비만(과다한 영양 섭취로부터 기인); 증식성 비만 (지방세포수의 증가로 인한 비만), 비대형비만 (지방세포의 크기 증대로 인한 비만); 상반신 비만, 하반신비만; 및 내장형 비만, 피하지방형 비만 등으로 나눌 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 비만은 대사증후군과 관련된 비만이다. 본 명세서에서 사용된 용어 “대사증후군”은 제2형 당뇨병, 고지혈증, 비만, 신병증, 간병증과 같은 질환이 동시에 발생하는 것을 의미한다 (Pershadsingh HA, Dual Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-alpha/gamma Agonists : In the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus and the Metabolic Syndrome. Treat Endocrinol. 2006;5(2):89-99).

본 명세서에서 사용된 용어 “고지혈증”은 혈액 중에 지방성분 특히 콜레스테롤과 중성지방(triglyceride)의 농도가 높은 경우로 일반적으로 240mg/㎗을 넘거나 중성지방이 200mg/㎗ 이상일 때를 고지혈증 이라고 한다. 고지혈증은 유전적 소인, 비만, 식이습관, 당뇨병, 신증후군, 갑상선기능저하증에 의해서 유발될 수 있다.

본원의 추출물이 효과를 나타내는 고지혈증은 비만, 대사증후군, 당뇨, 식이습관, 갑상선기능저하증, 신증후군으로 인한 고지혈증을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서, 본원의 고지혈증은 비만으로 인한 것이다. 다른 구현예에서 본원의 고지혈증은 당뇨병으로 인한 것이다. 다른 구현예에서 본원의 고지혈증은 대사증후군으로 인한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료"란 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 비만 또는 고지혈증 또는 이로 인한 다른 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 비만 또는 고지혈증 또는 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 비만 또는 고지혈증 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 비만 또는 고지혈증에 치료효과가 있는 본원의 추출물은 비만 고지혈증의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "추출물(extract)"란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다.

마늘 (Allium sativum L.)은 식품으로 사용되며, 파, 양파, 부추 및 달래 등과 함께 백합과의 알리움에 속하는 다년생 구근 식물이다. 본원의 추출물의 재료는 흑마늘로서, 흑마늘은 생마늘을 일정기간 동안 알맞은 온도 및 습도 조건에서 숙성하여 제조된다. 이러한 흑마늘의 제조방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 (장은경, 서지현, 이삼빈, “숙성에 의해 제조된 흑마늘 추출물의 생리학적 활성 및 항산화 효과, 한국식품과학회지, 40(4), 443-448, 2008)에 기재된 방법을 사용할 수 있거나, 또한 시중에서 구입할 수 있다 (의성농산,한국). 본원의 조성물에는 흑마늘, 흑마늘 추출물, 및/또는 발효된 흑마늘 추출물이 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 흑마늘 추출물을 발효한 것이 사용된다. 본원에서 흑마늘 추출물이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미하며, 통상적으로 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 제조되며, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매의 추출물, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다.

이러한 흑마늘 추출물은 공지의 방법대로 제조될 수 있다. 예를 들면 본원에 사용되는 흑마늘 추출물 또는 이의 분말은 열수 추출 또는 적절한 유기용매 예를 들어, 메탄올, 에탄올 등을 추출용매로 하여 공지의 방법대로 제조될 수 있다 (Nomura T. Phenolic compounds of the mulberry tree and related plants. In: Progress in the Chemistry of Organic Natural Products (Herz W, Grisebach H, Kirby GW, Tamm Ch, eds.), vol. 53. Springe:Vienna, 1988;87-201.)

상기 용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 이로 제한하는 것은 아니나, 구체적으로는 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 등을 포함하는, 탄소수 1 내지 5의 저가 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 특히 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 특히는 물, 50 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있다.

본원의 추출물은 통상의 식물 추출물의 공지된 일반적 제조방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법 또는 상기 용매를 추출용매로 하여 공지의 방법에 의해 제조하는 방법일 수 있다 (예를 들면 Nomura T, 1988 등 참조). 또한 추출과정을 거친 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획 시 용매는 2종이상 개별적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하여 각 용매의 추출물을 제조할 수 있다. 추출물 제조온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 30일 일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 예를 들면, 흑마늘에 용매를 1: 1 내지 1: 20 중량비로 가열 순환식 추출탱크에 넣고, 정제수 또는 식용 알콜을 가하여 80 내지 100℃에서 6-24시간 정도 추출한 후 여과하여 여액을 얻고, 잔여물에 다시 정제수 또는 식용 알콜을 가하여 동일한 과정을 수회 반복할 수 있다. 여액을 합하여, 그 자체로 사용하거나, 이를 진공 농축기로 감압하에서 농축한 후, 열풍 또는 동결 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.

일예로, 본 발명의 흑마늘 추출물은, 흑마늘 100 g당 물 0.1 내지 10ℓ를 가한 후 추출하는 방법으로 실시된다. 추출 온도는 약 80 내지 150℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다. 추출시간은 한정되진 않으나 30분 내지 수일 일 수 있으며, 통상의 추출 기기나 초음파분쇄 추출기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 사용될 수 있다.

다른 일예로 흑마늘 100 g당 에탄올 약 0.5 내지 5ℓ를 가해 얻어진 에탄올 추출물을 농축하여 얻은 농축물 약 10 내지 15 g을 물 약 100 내지 1000 ㎖에 현탁하고, 헥산 100 내지 1000 ㎖를 가한 후 추출한 후 헥산 분획추출물을 얻어낸다. 상기 헥산 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 메틸렌 클로라이드 100 내지 1000㎖ 를 가한 후, 추출하여 메틸렌 클로라이드 분획추출물을 얻는다. 상기 메틸렌 클로라이드 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 에틸아세테이트 100 내지 1000㎖를 가한 후, 추출하여 에틸아세테이트 분획추출물을 얻는 방법으로 실시된다. 또한, 상기 에틸아세테이트 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 부탄올 100 내지 1000㎖를 가한 후, 추출하여 흑마늘 부탄올 분획추출물을 얻을 수 있으며, 이 때 상기 부탄올 분획추출물을 제외한 물 층을 물 추출물로 얻을 수 있다. 상기 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 또는 부탄올로 추출할 경우 추출 온도는 20 내지 40℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않으며, 추출시간도 한정되진 않으나 30분 내지 20 시간일 수 있으며, 통상의 추출 기기나 초음파분쇄 추출기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 용매를 제거한다.

또 다른 일예로, 상기 추출물은 흑마늘 100 g당 메탄올 0.1 내지 5 ℓ를 가하여 추출하여 메탄올 추출물을 제조한다. 상기 메탄올 추출물은 추후 헥산 또는 메틸렌클로라이드를 가하여 각 용매별 분획물을 수득함으로써 헥산 추출물 또는 메틸렌클로라이드를 제조한다. 이후 잔류물에 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가하여 분획함으로써 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물을 각각 제조하며, 상기 용매에서 추출되지 않은 물 분획은 물 추출물로 제조된다. 상기 용매를 이용한 분획시, 추출대상물에 대하여 용매를 1: 0.1 내지 10 부피비로 가하여 실시된다. 본 발명에서 여과는 추출물로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 공정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친수성 등에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리과정을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 건조공정은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조 또는 적외선건조 등을 포함하는 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서는 발효된 흑마늘 추출물이 사용될 수 있다. 흑마늘 추출물의 발효는 예를 들면 적절한 미생물을 이용하여 통상의 방법대로 수행될 수 있다 (예를 들면 대한민국 특허출원 제2006-0116341호). 예를 들면 상기 발효는 이로 제한하는 것은 아니나, 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti), 또는 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있다. 한 구현예에서는 본원의 흑마늘 추출물은 효모(KCTC 7910)를 이용하여 발효된다. 발효는 상기 언급한 방법을 사용할 수 있으며 당업자라면 사용하는 미생물 및 이의 종류에 따라 적절한 발효 조건을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 본원의 실시예에 기재된 방법이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

과량의 지방산 섭취는 몸의 여러 조직, 특히 지방조직에 트리글리세리드의 축적을 가져오고 이로 인해 지방조직에서 지질분해가 증가된다. 이로 인한 혈류의 지방산 증가는 인슐린 저항성을 초래하고 근육, 췌장 및 간과 같은 비지방조직까지 지방산의 증가를 가져온다. 인슐린 저항성이 있는 사람의 경우, 지방 및 비지방조직에서의 지방산결합수송단백질 (FABP 및 CD36)의 농도가 증가하여 지방산의 이용(uptake)를 촉진하게 된다. 이러한 과량의 자유 지방산 및 근육에의 지방산의 축적은 인슐린 신호전달 및 당의 사용에 있어 악순환을 초래한다. 췌장이 자유 지방산에 오래 노출되게 되면 지방독성 기전을 통하여 인슐린 분비에 장애를 가져오는 것으로 알려져 있다 (Lebovitz HE. Insulin resistance: definition and consequences. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2001;109:S135-48). 간에서도 당의 방출을 향상시켜 인슐린의 작용을 방해하는 것으로 알려졌다 (Goldstein BJ. Insulin resistance as the core defect in type 2 diabetes mellitus. Am J Cardiol. 2002;90:3G-10G). 간에 트리글라세리드가 쌓이게 되면 비알콜성 지방간을 초래하며, 이는 지방증, 지방간염, 간세포괴사, 섬유증과 같은 간의 손상을 가져와, 간의 주요기능인, 당대사를 막는다 (Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med. 2002;346:1221-31). 이러한 증상은 대사증후군의 중요 증상이기도 하다 (Kadowaki T, Yamauchi T. Adiponectin and adiponectin receptors. Endocr Rev. 2005;26:439-51).

설취류에서의 비만은 고지방사료(High Fat Diet, HFD)로 사육하여 초래되며, 이러한 비만 마우스는 고혈당, 인슐린 저항성, 지방간, 고지방혈 및 신장손상의 증상을 갖는다 (Thupari JN, et al., Chronic C75 treatment of diet-induced obese mice increases fat oxidation and reduces food intake to reduce adipose mass. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004;287:E97-E104; Yun SN et al ., Wild ginseng prevents the onset of high-fat diet induced hyperglycemia and obesity in ICR mice. Arch Pharm Res. 2004;27:790-6; Lee JW et al., Selective increase in pinolenic acid (all-cis-5,9,12-18:3) in Korean pine nut oil by crystallization and its effect on LDL-receptor activity. Lipids. 2004;39:383-7). HFD로 유발된 동물 모델은 비만, 고지혈증 및 이로 인한 대사증후군의 증상을 나타내어, 이러한 증상의 치료제 개발에 적합하다 (Park et al., 2005).

마늘의 향균, 항암 효과에 대하여는 보고된 바가 있으나, 흑마늘, 특히 발효된 흑마늘의 비만, 고지혈증, 대사증후군, 혈당강하, 간병증 및 신병증 등에 대한 복합적 효과는 전혀 개시된 바 없다.

본원의 발효된 흑마늘은 실시예로 제한하는 것은 아니지만, 실시예에 기재된 바와 같이 비만 및 비만으로 인한 대사증후군 및 고지혈증 증상의 개선에 탁월한 효과가 있다.

본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 포함하는 약학 조성물은 동시에 또는 연속적으로 투여가능하며, 이들 혼합물을 단독으로 또는 비만 및/또는 대사증후군의 증상 예를 들면 고지혈증의 치료를 위한 다른 약학적 활성성분과 병행하여 투여될 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 포함하는 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘, 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 포함하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 경구 투여가 바람직하다.

경구 투여를 위한 고형 제형에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제형은 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 슈크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제형으로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

더 나아가 본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 포함하는 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 포함하는 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물의 유효 투여량은 통상적으로 성인(60kg)의 경우, 약 1 내지 100 g/일, 특히 약 10 내지 50g/일, 더욱 바람직하게는 약 30g/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본원의 추출물 및 이의 발효물을 포함하는 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.

본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 포함하는 약학 조성물은 비만과 이로인한 대사증후군 및 고지혈증 등에 대하여 우수한 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 의한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다. 이에 따라, 상기 본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물 식품의 주, 부원료 및 식품 첨가제로서 사용이 가능하다.

따라서, 이러한 관점에서, 본 발명은 상기 기술한 본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 포함하는 조성물은 식품, 예를 들면, 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제 등으로 제공될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "기능성식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 특히 "건강기능식품"을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "건강보조식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 가공한 식품으로서, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품원료에 들어있는 성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말한다.

특히 본 발명에서 기능성식품 또는 건강보조식품은 상기 식품을 섭취하기 전과 비교하여 비만, 고지혈증 및 이로인해 유발되는 질환의 증상을 개선하거나, 이의 경감 또는 해소에 도움을 줄 수 있는 효과가 있는 식품을 의미하며, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 이러한 질환의 정확한 기준을 알고, 개선된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

상기 기능성식품 및 건강보조식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본원에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

본원에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미하며, 바람직하게는 대사증후군 증상, 예를 들면 고지혈증 개선을 위한 음료를 의미한다.

상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본원의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.001 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

비만, 고지혈증 및 대사증후군의 개선을 목적으로 하는 식품에 있어서, 상기 본원의 흑마늘 추출물 또는 이의 발효물의 양은 전체 식품 중량의 약 0.01 내지 70 중량%, 약 0.1 내지 60 중량%, 약 1% 내지 50%, 약 1% 내지 40%, 약 1% 내지 30%, 약 1% 내지 20%, 약 1% 내지 10%의 범위로 포함할 수 있으나, 상기 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 예를 들면 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 흑마늘 추출물의 제조

흑마늘 (Black garlic, BG)은 의성농산(대한민국)에서 구입하였다. 건조된 통흑마늘 100g을 1ℓ증류수에 넣고 환류 하에서 2시간 동안 80℃에서 충분히 달인 후, 이를 흡입여과 하여 추출물을 준비하였다. 여과 후 남은 잔류물에 대하여 동일한 추출과정을 추가로 1회 반복하였다. 추출물을 모두 모아, 회전식 진공증발기 (N-N type; LAB Camp, Dajeon, Korea)로 감압/농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결건조기(PVTFD10A; ilShin Lab, Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 수율 약 12%로 진갈색의 동결건조물을 수득하였다. 상기 추출물은 사용시까지 빛으로부터 차단되어 4℃에서 보관하였다.

실시예 2 흑마늘 추출물의 발효

실시예 1에서와 같이 제조한 흑마늘 추출물을 식용 효모 (Saccharomyces cerevisiae, KCTC 7910)을 이용한 2단계 배양법을 사용하여 발효하였다. 1단계에서, 상기 미생물 건조중량 0.002g 을 3% (w/v) 말트 추출물을 포함하는 0.5ℓ의 배지(M 배지)에 접종하여, 28℃ 36시간 동안 배양하여 세포 성장을 촉진하였다. 이어서 상기 세포를 원심분리한 후, 이 중 1 g을 실시예 1에서 제조한 5% (w/v) 흑마늘 추출물을 포함하는 1ℓ의 BG 배지 (증류수에 실시예 1에서 수득한 흑마늘추출물 5% 포함)에 접종하여 28℃ 36시간 동안 발효하였다.

발효 후 상기 발효물을 환류 하에서 2 시간 동안 80℃에서 충분히 달인 후 이를 흡입여과 하여 추출물을 준비하였다. 여과 후 남은 잔류물에 대하여 동일한 추출과정을 추가로 1회 반복하였다. 추출물을 모두 모아, 회전식 진공증발기 (N-N type; LAB Camp, Dajeon, Korea)로 감압/농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결건조기(PVTFD10A; ilShin Lab, Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 수율 약 42%로 연한갈색의 동결건조물을 수득하였다. 상기 추출물은 사용시까지 빛으로부터 차단되어 4℃에서 보관하였다. 동물실험에 사용 시 멸균 증류수에 용해하여 사용하였다.

실시예 3 동물모델 및 시험물질의 투여

실시예 3-1 동물모델

발효 흑마늘 추출물의 치료 효과 확인을 위하여, 200 마리의 암컷 ICR 마우스 (입수시 5.5 주령, 24~28g, SLC, Japan)를 구입하여, 케이지 당 5마리씩 넣어 12일 동안 주변 환경에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 실험기간 동안 사료와 물은 낮 동안에 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물 사육실의 온도는 20 내지 25℃, 습도는 40 내지 45%로 유지하였다. 또한 12시간 마다 낮과 밤이 반복되도록 사육실내 명암주기(light-dark cycle)를 조절하였다. 적응기간 후 28일간 190 마리에게는 고지방사료(표 1)를 공급하고, 10마리에게는 정상 사료를 공급하였으며, 이 중 체중을 기준으로 77 마리를 선별하고, 각 그룹에서 표준편차를 기준으로 2마리씩은 제외하고, 최종적으로 그룹당 5마리씩, 총 55마리를 희생하였다.

고지방식이(High Fat Diet, HFD) 마우스의 경우 본원의 시험물질 투여 28일전부터 시험물질 투여 전 기간 동안 45%Kcal/Fat HFD (표 1, Diet research, USA)를 공급하였으며, 정상 대조군에는 일반 설치류 사료(표 1, Superfeed Co., 한국)를 동일한 방법으로 공급하였다. HFD 군 및 정상대조군을 포함하는 본 실험에 사용된 마우스 그룹은 표 2와 같으며, 군당 5마리의 마우스가 사용되어, 11개군 총 55 마리의 마우스가 사용되었다.

표 2의 용어는 다음과 같다: BG (흑마늘 추출물), FBG-1(발효 흑마늘 추출물).

실시에 3-2 시험물질의 투여

상기 실시예 3-1에서 준비된 동물모델 마우스에 일일 1회, 63일간 시험물질 및 대조군 물질을 표 2의 양으로 경구투여(부피, 10ml/kg)하였다. 정상 대조군(control) 및 HFD 대조군에는 동부피의 증류수를 투여하였다. 참조군(reference)로 사용된 심바스타틴(동화제약, 대한민국), 실리마린(Sigma, U.S.A), 메트포르민 (Wako Pure Chemical, Japan)에서 구입하였으며, 각각 고지혈증치료제, 간기능보조제 및 혈당강하제로 시판되는 약물로 사용 시까지 -10℃에서 보관하였다.

실시예 3-3 통계분석

상이한 투여 그룹에서 다중 검증법을 수행하였다. 분산 동일성 (variance homogeneity)는 Levene 테스트를 이용하여 계산하였다. Levene 테스트 결과 분산 동일성으로 부터의 편차가 유의하지 않은 것으로 나타난 경우에만, 원웨이 ANOVA (공변량분석) 테스트로 분석하고, 이어서 최소유의차 (Least significant differences, LSD) 다중 검증법으로 분석하여 유의성 있는 차이를 보이는 그룹 쌍을 선별하였다. Levene 테스트의 분산동일성에서 큰 편차를 보이는 경우, 비모수적검증법(non-parametric comparision test), Kruskal-Wallis H 테스트를 사용하였다. Kruskal-Wallis H 테스트에서 유의성 있는 차이를 보이는 경우, Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W 테스트를 사용하여 그룹 비교용 특정 쌍을 결정하였다. 통계 분석은 Windows 용 SPSS (Release 6.1.3., SPSS Inc., USA)를 이용하여 수행하였다. 상기 각 변수에 대하여, 정상대조군에 대한 백분율 변화는 [(HFD 대조군 데이터 - 정상대조군의 데이터)]/정상대조군의 데이터] x 100; 및 HFD 대조군에 대한 백분율 변화는 [(시험군의 데이터 - HFD 대조군의 데이터)]/HFD 대조군의 데이터] x 100으로부터 계산하였다.

실시예 4 흑마늘 추출물 발효물의 비만에 대한 효과

발효 흑마늘 추출물의 항비만 효과를 측정하기 위하여 체증, 증체량 및 난소주의 지방 중량의 변화, 사료섭취량의 변화, 난소주위 지방, 및 복벽 지방세포의 조직병리학적 변화 (지방세포 크기의 변화 및 복벽 지방 두께의 변화를 측정하였다. 지방의 축적은 비만시 초래되는 일반적인 현상으로 조직병리학적 검사시 지방세포의 비대가 초래된다 (Morange PE et al., Influence of PAI-1 on adipose tissue growth and metabolic parameters in a murine model of diet-induced obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000;20:1150-4). 지방조직은 에너지 저장소인 동시에 내분비과 분리를 동시에 수행하는 장기로 아디포카인을 분비하는데 (Fujita H et al., Effects of antidiabetic treatment with metformin and insulin on serum and adipose tissue adiponectin levels in db/db mice. Endocr J. 2005;52:427-33), 이의 변화는 비만과 인슐린 저항성과 같은 복합적 질병을 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Fujita H et al ; Mitchell et al., 2005).

실시예 4-1 체중 변화에 대한 효과

체중 변화는 마우스의 몸무게를 HFD 사료 공급개시 직전 및 시험물질의 투여 하루 전 및 투여시작일과 그 후 매주 및 희생하기 직전에 전자저울(Precisa Instrument, Switzland)로 측정하였다. 희생하기 전날 밤 모든 실험 동물은 약 12시간 사료를 주지 않아 사료섭취로 인한 변이를 줄였으며 물은 제한하지 않았다. 증체량은 다음과 같이 계산하였다: 적응기간 체중(시험물질 투여 -28일부터 0일째까지)- 관찰기간 체중(시험물질 투여 0일부터 63일까지).

결과는 도 1 및 표 3에 기재되어 있다. HFD 사료 공급 28일 후 일정한 체중 증가를 나타내는 실험동물만을 선별하였으므로, HFD대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중의 증가가 고지방사료 공급 28일 후부터 인정되었으며, 실험 전 기간 동안의 증체량 역시 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었다. 한편 메트포르민 투여군에서는 투여 21일 후부터 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 인정되었고, 실험 전 기간 동안의 증체량 역시 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었고, 심바스타틴, 실리마린, BG 및 모든 FBG-1 투여군에서도 HFD 대조군에 비해 유의성은 인정되지 않았으나, 현저한 체중의 감소가 투여기간 동안 인정되었고, 실험 전 기간 동안의 증체량 역시 유의성 없는 현저한 감소를 나타내었다. 한편 BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 증체량의 감소는 FBG-1 400mg/kg 투여군에 국한되어 인정되었다.

투여기간인 63일간의 증체량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 341.92%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -35.97, -55.04, -95.65, -47.13, -61.56, -47.92, -23.22%의 변화를 나타내었다.

실시예 4-2 사료섭취량의 변화

개별 케이지 당 150g의 사료를 공급한 후, 24시간 후에 남은 양의 사료를 전자저울로 측정하였다. 이어 이를 같은 케이지에서 사육된 동물의 수로 나누었다. 하루평균사료섭취량 (g/day/moude): {공급된 사료의 양 (150g) -24시간 경과 후 남은 사료의 양}/마우스 수. 사료섭취량은 시험물질 투여 63일 동안 일주일에 1회씩 측정하였다.

결과는 표 5에 기재되어 있다. 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 평균 사료 섭취량의 감소가 모든 HFD 공급군에서 인정되었으나, HFD 대조군에 비해 유의성 있는 사료 섭취량의 변화는 모든 투여군에서 인정되지 않았다. 평균 사료섭취량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -27.69%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD 대조군에 비해 1.60, 9.92, -7.20, 9.18, 8.52, 6.40, 1.49%의 변화를 나타내었다.

본 실험의 결과, 모든 HFD 공급군에서는 정상 대조군에 비해 현저한 사료 섭취 중량 의 감소를 나타내었으나, 열량적 측면에서 보면, 본 실험에 사용한 HFD의 열량(4.73kcal/g)이 정상 사료 (0.21kcal/g)에 비해 대략 20배 정도 높으므로 (표 1 참고), 비만 유발에는 큰 영향을 미치지 않은 것으로 판단되며, HFD 대조군에 비해 유의성 있는 사료 섭취량의 감소는 모든 투여군에서 인정되지 않아, 본 실험에서 인정된 약리효과들이 사료 섭취량 감소에 의한 것은 아닌 것으로 판단된다.

실시예 4-3 난소주위 지방 중량의 변화

마우스 희생시, 간, 신장 및 난소주의 지방패드 무게를 g 수준으로 측정(절대 중량)하였다. 개별 마우스의 체중 차이로 인한 변이를 감소시키기 위해서 상대중량 (% of body weight)를 다음과 같이 계산하였다: 기관의 상대중량(%)=[(절대 기관 중량/희생시 몸무게)x100]

결과는 표 3에 기재되어 있다. HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 지방의 상대 및 절대 중량의 증가 인정되었으나, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG 및 모든 FBG-1 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 현저한 난소주위 지방 중량의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 난소 주위 지방 중량의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 난소주위 지방 중량의 감소를 나타내었다.

난소주위 지방의 상대 중량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 394.81%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD 대조군에 비해 -27.90, -25.30, -54.99, -27.68, -40.57, -35.16 및 -22.04%의 변화를 나타내었다.

실시예 4-4 난소주위 지방 세포 직경 변화

조직병리실험

실시예 4-3에서와 같이 기관의 무게를 측정한 후 허리네모근에 붙어있는 간의 좌측엽, 왼쪽 신장, 왼쪽 난소주위지방 패드 및 복벽 지방패드를 채취하였다. 이어 시료를 10% 중성완충포르말린에 고정하였다. 파라핀포매 후, 3-4μm 연속 절편을 만들었다. 절편에 대하여 헤마톡실린과 에오신 (H&E)염색(Sigma, USA)을 한 후 광학현미경하에서 관찰 하였다.

위와 같이 준비된 조직에 대하여 난소주위 지방세포의 평균 직경 및 복벽 (dosal abdominal) 흰색 지방세포 평균 직경은 자동이미지분석 방법(DMI, Daegu, Korea)을 사용하여 컴퓨터 모니터상에서, 현미경의 한 시야에서 간세포의 평균 직경을 μm로 측정하였다. 각 시료당 10개 세포의 크기를 측정하였다.

결과는 도 2 및 표 4에 있다. 도 2에서 보는 바와 같이 HFD 대조군에서 정상대조군과 비교하여 난소주위 및 복부 지방세포가 상당히 증가되었음을 세포직경의 증가로부터 알 수 있다. 이러한 지방세포 직경의 증가는 다음과 같이 시험물질의 투여로 상당히 개선되었다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 지방세포 직경의 증가가 인정되었으나, 3 종류의 reference 투여군을 포함한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 난소주위 지방세포 직경의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 난소주위 지방세포 직경의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 난소주위 지방세포 직경의 감소를 나타내었다.

난소주위 지방세포 직경은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 304.21%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -28.20, -26.08, -57.26, -22.61, -45.10, -30.16 및 -21.58%의 변화를 나타내었다.

실시예 4-5 복벽 지방 세포 직경 변화

실시예 4-4와 같이 지방세포 직경 변화를 측정하였다. 결과는 도 2 및 표 4에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 복벽 지방 세포 직경의 증가가 인정되었으나, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG 및 모든 FBG-1 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 현저한 복벽 지방세포 직경의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 복벽 지방세포 직경의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 복벽 지방세포 직경의 감소를 나타내었다.

복벽 지방세포 직경은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 281.23%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -36.13, -56.16, -60.52, -23.19, -51.42, -27.39 및 -22.99%의 변화를 나타내었다.

실시예 4-6 복벽 지방 두께의 변화

복벽지방두께는 자동이미지분석(DMI, Daegu, Kroea)법을 사용하여 mm단위로 측정하였다. 시료당 1개의 시야를 사용하였다.

결과는 도 3 및 표 4에 기재되어 있다. 도 3에서 보는 바와 같이 HFD대조군에서 정상대조군과 비교하여 복벽에 많은 지방이 축적된 것을 지방패드 두께로부터 알 수 있다. 그러나 이러한 현상은 다음과 같이 시험물질의 투여로 현저하게 개선되었다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 복벽 지방두께의 증가가 인정되었으나, 3 종류의 reference 투여군을 포함한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 복벽 축적 지방 두께의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 복벽 지방두께의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 복벽 지방두께의 감소를 나타내었다.

복벽 축적 지방 두께는 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 395.24%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -28.25, -48.04, -64.70, -23.40, -47.64, -31.89 및 -23.36%의 변화를 나타내었다.

본 실험결과 BG 투여군과 비교하여, FBG-1 투여군에서 훨씬 우수한 항비만 효과가 인정되었다.

실시예 5 혈당에 미치는 영향

혈당은 63일째 대정맥에서 혈액을 채취한 후, 취합한 혈액을 NaF 당 진공튜브 (Becton Dickinson, USA)에 넣고, 혈장을 분리하였다. 혈당 농도는 자동화 혈액분석기 (Hemagen Analyst, Hemagen Diagnostic, USA)로 측정하였다.

결과는 표 5에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈당의 증가가 인정되었다. HFD 대조군의 경우, 혈당은 정상 대조군에 비해 137.64%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -9.94, -23.52, -49.38, -0.47, -4.89, -3.80, 및 -3.11의 변화를 나타내었다.

실시예 6 고지혈증에 미치는 영향

본원의 시험물질이 손상된 고지혈증에 미치는 영향을 조사하기 위하여 혈중 총콜레스테롤 함량의 변화, 혈중 트리글리세리드 함량의 변화, 혈중 LDL의 변화, 혈중 HDL의 변화를 측정하였다. 고혈당 상태가 지속됨에 따라 합병증의 형태로 고지혈증이 초래되며 (Chen X, et al., Pharmacological profile of a novel, non-TZD PPARgamma agonist. Diabetes Obes Metab. 2005;7:536-46), 일반적으로 고지혈증시 LDL, 트리글리세리드 및 총콜레스테롤 함량 증가와 함께 HDL 감소가 문제시 되고 있다 [Milionis HJ et al., Effects of statin treatment on uric acid homeostasis in patients with primary hyperlipidemia. Am Heart J. 2004;148:635-40; Forrester JS et al., Increasing high-density lipoprotein cholesterol in dyslipidemia by cholesteryl ester transfer protein inhibition: an update for clinicians. Circulation. 2005;111:1847-54). 따라서 후보물질에 대한 항고지혈증 효과는 혈중 LDL, 트리글리세리드 및 총콜레스테롤 함량 감소와 함께 HDL함량의 증가에 초점이 맞추어져 있다[Cheng JW. Rosuvastatin in the management of hyperlipidemia. Clin Ther. 2004;26:1368-87; Pirat B et al., The effects of simvastatin combined with different antioxidant vitamin regimens on serum lipid profile in patients with low HDL cholesterol levels. Anadolu Kardiyol Derg. 2004;4:318-22; Zdrenghea D et al., The effect of simvastatin associated with ranitidine and alcohol upon serum lipids. Rom J Intern Med. 2004;42:143-8).

혈청의 생화학적 성분의 검출은 다음과 같이 수행하였다. 희생직전 마취상태에서 대정맥에서 1ml의 정맥혈을 채취하였다. 채취 후 혈액응고 활성화된 혈청 튜브를 사용하여 실온에서 15000rpm에서 10분간 원심분리를 하였다. 이어 혈청 AST, ALT, 총콜레스테롤, 트리글리세리드, LDL, BUN 및 크레아티닌 농도는 자동화 혈액분석기 (Hemagen Analyst, Hemagen Diagnostic, USA)로 제조자의 권고대로 측정하였고, HDL의 농도는 AU 400 (Olympus, Japan) 혈액분석기를 제조자의 권고대로 사용하였다.

실시예 6-1 총콜레스테롤 함량의 변화

결과는 표 6에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 총 콜레스테롤 함량의 증가가 인정되었으나, 3 종류의 reference 투여군을 포함한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 총 콜레스테롤 함량의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 혈중 총 콜레스테롤 함량의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 총 콜레스테롤 함량의 감소를 나타내었다.

혈중 총 콜레스테롤은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 130.87%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -41.43, -39.46, -41.35, -22.48, -37.33, -29.70, 및 -22.31%의 변화를 나타내었다.

실시예 6-2 혈중 트리글리세리드 함량의 변화

결과는 표 6에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 트리글리세리드 의 증가가 인정되었으나, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG 및 모든 FBG-1 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 트리글리세리드 함량의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 혈중 트리글리세리드 함량의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 트리글리세리드 함량의 감소를 나타내었다.

혈중 트리글리세리드 는 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 281.44%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -48.18, -34.16, -39.52, -21.05, -33.76, -29.29 및 -20.36%의 변화를 나타내었다.

실시예 6-3 혈중 LDL(Low Density Lipoprotein)함량의 변화

결과는 표 6에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 LDL함량의 증가가 인정되었으나, 3 종류의 참조군을 포함한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 LDL함량의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 혈중 LDL 함량의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 LDL 함량의 감소를 나타내었다.

혈중 LDL 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 103.23%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -42.65, -29.41, -26.47, -20.59, -33.09, -27.21 및 -21.32%의 변화를 나타내었다.

실시예 6-4 혈중 HDL(High Density Lipoprotein) 함량의 변화

결과는 표 6에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HDL함량의 감소가 인정되었으나, HFD 대조군에 비해 유의성 없는 현저한 혈중 HDL 함량 증가를 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HDL 함량의 증가가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 혈중 HDL 함량의 증가는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 HDL 함량의 증가를 나타내었다.

혈중 HDL 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -61.23%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 24.10, 59.49, 48.72, 33.85, 51.79, 45.64 및 34.36%의 변화를 나타내었다.

본 실험결과 BG 투여군과 비교하여 FBG-1 투여군에서 훨씬 우수한 항고지혈증 효과가 인정되었다.

실시예 7 간손상 회복에 미치는 영향

본원의 시험물질이 손상된 간의 회복에 미치는 영향을 조사하기 위하여 간 중량의 변화, 혈중 AST의 변화, 혈중 ALT의 변화, 간 지방변성 비율의 변화, 간세포 직경의 변화를 측정하였다.

실시예 7-1 간 중량의 변화

간 중량은 실시예 4에서와 같이 측정하였다. 결과는 표 7에 기재되어 있다. HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 간 절대 중량의 증가가 인정되었으나, 상대 중량은 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. 한편 실리마린 및 메트포르민투여군에 국한되어, HFD 대조군에 비해 현저한 간 상대 중량의 증가가 인정된 이외에, HFD 대조군에 비해 의미 있는 간 중량의 변화는 모든 투여군에서 인정되지 않았다.

간 상대 중량 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -29.41%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 9.31, 18.53, 29.63, 9.52, 9.73, 6.96 및 2.47%의 변화를 나타내었다.

실시예 7-2 혈중 AST 및 ALT 의 변화

혈중 AST (Aspartate Transaminase) 및 ALT(Alanine Transaminase)는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 표 7에 기재되어 있다.

AST의 경우HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST함량의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 혈중 AST변화를 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 AST함량의 감소가 각각 인정되었다. BG 400mg/kg 투여군과 비교하여, 더 우수한 혈중 AST함량의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 AST함량의 증가를 나타내었다. 혈중 AST 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 145.58%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -1.94, -42.95, -14.87, -12.05, -30.13, -17.98 및 -12.15%의 변화를 나타내었다.

ALT의 경우 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 ALT함량의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 혈중 ALT 변화를 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 ALT의 감소가 각각 인정되었다. BG 투여군에 비해 더 우수한 혈중 ALT감소 효과는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군에서는 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 ALT감소 효과가 인정되었다 (vy 7).

혈중 ALT 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 500.79%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200 및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 1.31, -42.86, -17.69, -12.98, -30.80, -17.96 및 -11.53%의 변화를 나타내었다.

실시예 7-3 간 지방변성 변화율

실시예 4-4에서와 같이 준비된 조직에 대하여 지방간 부위(간실질의 지방산 변화가 있는 부위의 %)을 자동 이미지 분석방법(DMI, Daegu, Korea)을 사용하여 염색된 간 조직의 광학현미경하의 1개 시야 (%/간실질 1mm² )에 대하여 대조군/참조군과 비교하여 지방이 변화된 부위의 %를 계산하여, 간지방변화율을 측정하였다.

결과는 표 8 및 도 4에 기재되어 있다. 도 4에서 보는 바와 같이 HFD 대조군에서 정상대조군과 비교하여 현저한 간세포비대 및 지방간(steatohepatitis)이 생성되었음을 알 수 있다. 이러한 증상이 시험물질의 투여로 현저하게 개선되었다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 지방변성 비율의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 간 지방변성 비율을 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 지방변성 비율의 감소가 각각 인정되었다. BG 투여군에 비해 더 우수한 간 지방변성 비율의 감소 효과는 FBG-1 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군에서는 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 간 지방변성 비율의 감소 효과가 인정되었다.

간 지방변성 비율은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 791.50%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -1.10, -48.96, -28.93, -18.19, -33.57, -25.70 및 -22.95%의 변화를 나타내었다.

실시예 7-4 간세포 직경의 변화

실시예 4-4에서와 같이 준비된 조직에 대하여 간세포 평균 직경은 다음과 같이 측정하였다. 자동이미지분석 방법을 사용하여 컴퓨터 모니터상에서, 현미경의 한 시야에서 간세포의 평균 직경을 μm로 측정하였다. 각 간의 시료당 10개의 간세포 크기를 측정하였다.

결과는 표 8 및 도 4에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간세포 직경의 증가, 즉 비대가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 간세포 직경의 변화를 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간세포 직경의 감소가 각각 인정되었다. 한편 BG 투여군에 비해 더 우수한 간세포 직경의 감소 효과는FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군에서는 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 간세포 직경의 감소 효과가 인정되었다.

간세포 직경은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 85.77%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200 및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 2.36, -36.75, -24.27, -16.31, -30.45, -21.80 및 -15.65%의 변화를 나타내었다.

본 실험결과 BG 투여군과 비교하여 FBG-1 투여군에서 훨씬 우수한 간보호 효과가 인정되었다.

실시예 8. 신장손상 회복에 미치는 영향

본원의 시험물질이 손상된 신장의 회복에 미치는 영향을 조사하기 위하여 신장 중량의 변화, 혈중 BUN의 변화, 혈중 크레아티닌의 변화 및 변성세뇨관 수의 변화를 측정하였다. 당뇨병 상태가 만성화함에 따라 사구체 위축과 섬유화, 염증세포 침윤 및 세뇨관 괴사와 이에 따른 혈중 BUN 및 크레아티닌 함량의 증가를 주요 증상으로 하는 신장병변이 초래되며, 이를 당뇨병성 신병증이라 한다 (Imaeda A, et al., Antioxidative effects of fluvastatin and its metabolites against DNA damage in streptozotocin-treated mice. Food Chem Toxicol. 2002;40:1415-22; Clark TA et al., Pierce GN. Codelivery of a tea extract prevents morbidity and mortality associated with oral vanadate therapy in streptozotocin-induced diabetic rats. Metabolism. 2004;53:1145-51). 이중 혈중 BUN과 크레아티닌 함량은 신장의 상태를 나타내는 가장 대표적인 혈액화학 수치이다 (Sodikoff CH. Laboratory profiles of small animal diseases. A guide to laboratory diagnosis. 2nd ed., Mosby: St. Louise, 1995:1-36).

실시예 8-1 신장중량의 변화

신장의 중량은 실시예 4-3에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 표 9에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 현저한 신장 절대 중량의 증가가 인정되었으나, 상대 중량은 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. 한편 실리마린, 메트포르민, FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에 국한되어, HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 신장 상대 중량의 증가가 인정된 이외에, HFD 대조군에 비해 의미 있는 신장 중량의 변화는 모든 투여군에서 인정되지 않았고, BG 투여군과 비교하여 더 우수한 신장 중량의 변화를 나타낸 FBG 투여군은 없었다.

신장 상대 중량 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -35.11%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 15.55, 36.94, 43.03, 21.94, 15.53, 17.14 및 12.95%의 변화를 나타내었다.

실시예 8-2 혈중 BUN 함량의 변화

혈중 BUN(Blood Urea Nitrogen) 함량의 변화는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 표 10에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 BUN함량의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 혈중 BUN 변화를 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 현저한 혈중 BUN의 감소가 각각 인정되었다. 한편 BG 투여군에 비해 더 우수한 혈중 BUN함량의 감소 효과는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 BUN함량의 감소를 나타내었다.

혈중 BUN 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 88.13%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 -4.13, -33.50, -24.51, -15.78, -32.28, -24.03 및 -18.69%의 변화를 나타내었다.

실시예 8-3 혈중 크레아티닌 함량의 변화

혈중 크레아티닌 함량의 변화는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 표 10에 기재되어 있다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 크레아티닌 함량의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 혈중 크레아티닌 변화를 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 크레아티닌 의 감소가 각각 인정되었다. 한편 BG 투여군에 비해 더 우수한 혈중 크레아티닌 함량의 감소 효과는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 혈중 크레아티닌 함량의 감소를 나타내었다.

혈중 크레아티닌 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 143.24%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD 대조군에 비해 -3.33, -32.22, -25.56, -15.56, -32.22, -22.22 및 -17.78%의 변화를 나타내었다.

실시예 8-4 변성세뇨관 수의 변화

변성세뇨관 수 (20% 넘게 공포(vacuolated)화된 세뇨관)는 시료당 한 개의 시야에서 100개 세뇨관을 관찰하여, 이중 공포화된 세포 수를 자동이미지 분석방법을 사용하여 측정하였다.

결과는 표 9 및 도 5에 기재되어 있다. 도 5에서 보는 바와 같이 정상대조군과 비교하여 HFD 대조군 신장에서 비정상 세뇨관 (지방변화; 공포화)의 수가 현저하게 증가하였다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 지방변화를 나타내는 변성 세뇨관(공포화) 수의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 변성 세뇨관 수의 변화를 나타낸 심바스타틴 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 변성 세뇨관 수의 감소가 각각 인정되었다. 한편 BG 투여군에 비해 더 우수한 혈중 변성 세뇨관 수의 감소는 FBG-1 400 및 200mg/kg 투여군에서 인정되었고, FBG-1 100mg/kg 투여군은 BG 400mg/kg 투여군과 유사한 변성세뇨관 수의 감소를 나타내었다.

지방변화를 나타내는 변성 세뇨관 수는 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 653.06%의 변화를 나타내었으며, 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민, BG, FBG-1 400, 200및 100mg/kg 투여군에서는 각각 HFD대조군에 비해 0.27, -42.01, -25.75, -26.83, -42.01, -35.50 및 -26.56%의 변화를 나타내었다. 본 실험결과 BG 투여군과 비교하여 FBG-1 투여군에서 훨씬 우수한 간보호 효과가 인정되었다.

이상에서, FBG-1의 용량별 항비만, 혈당강하, 항고지혈증, 간보호 및 신장보호 효과를 45%/Kcal 설치류 고지방사료 공급 마우스를 이용하여, BG와 비교평가한 결과, FBG-1는 혈당 강하, 항고지혈증, 간보호 및 신장보호 효과를 각각 나타내었다. 한편, BG 투여군에 비해 FBG-1에서 우수한 약리효과를 나타내었다. 또한 참조군인 치료약물인 심바스타틴, 실리마린, 메트포르민과 비교해서도 FBG-1에서 약리효과가 참조군의 50%이상 수준으로 우수하였다.

제제예 1. 정제의 제조

흑마늘 추출물 및/또는 이의 발효물 200mg

유당 100mg

전분 100mg

스테아린산 마그네슘 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 2. 캡슐제의 제조

흑마늘 추출물 및/또는 이의 발효물 100mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 갭슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 3. 액제의 제조

흑마늘 추출물 및/또는 이의 발효물 1000mg

설탕 20mg

이성화당 20mg

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제제예 4. 주사제의 제조

흑마늘 추출물 및/또는 이의 발효물 100mg

소듐 메타비설파이트 3.0mg

메틸파라벤 0.8mg

프로필파라벤 0.1mg

주사용 멸균증류수 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종부피가 2ml가 되도록 제조한 후 2ml 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

제제예 5. 건강 음료의 제조

흑마늘 추출물 및/또는 이의 발효물 1000mg

구연산 1000mg

올리고당 100g

메실농축액 2g

타우린 1g

정제수를 가하여 전체 900ml

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

흑마늘 추출물 및/또는 이의 발효물 1000mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70mg

비타민 E 1.0mg

비타민 B1 0.13mg

비타민 B2 0.15mg

비타민 B6 0.5mg

비타민 B12 0.2mg

비타민 C 10mg

비오틴 10mg

니코틴산아미드 1.7mg

엽산 50mg

판토텐산칼슘 0.5mg

비타민 E 1.0mg

무기질 혼합물 적량

황산 제1철 1.75mg

산화아연 0.82mg

탄산 마그네슘 25.3mg

제1인산칼륨 15mg

제2인산칼슘 55mg

구연산칼륨 90mg

탄산칼슘 100mg

염화마그네슘 24.8mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립 제형의 건강식품을 제조하였다.

Claims (7)

1. 발효 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 발효는 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti), 또는 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 중 하나 이상을 이용한 것인 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 발효는 효모를 이용한 것인 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물.
4. 제 1 항에 있어서 상기 비만은 대사증후군을 유발하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 대사 증후군은 내당장애, 고혈압, 고지혈증, 간병증 및 신병증 중 하나 이상을 포함하는 증상을 갖는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 고지혈증은 비만에 의해 유발된 것인 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 건강보조식품, 기능성 식품, 또는 식품첨가제로 제공되는 비만 또는 고지혈증 개선용 조성물.

Images