KR100970598B1 - 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 반월상 연골 모양의 다공성 생분해성 중합 지지체; 및 (b) 상기 지지체에 파종된 동종 활액막 세포를 포함하는 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물에 관한 것이다. 본 발명의 반월상 연골 치환용 이식물은 손상된 반월상 연골 부분에 이식되어 우수한 연골 재생 능력을 발휘한다. 본 발명의 이식물을 이용하는 경우, 지지체의 점진적인분해 및 흡수와, 이와 동시에 일어나는 활액막 조직의 침투 및 성장으로 반월상 연골의 재생이 효과적으로 일어나며, 관절 연골의 보호 효과가 발생한다.

슬 관절, 반월상 연골, 활액막 세포, 지지체

Description

반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물{Porous Biodegradable Polymer Implants for Meniscal Transplantation}

본 발명은 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 동종 활액막 세포를 함유하는 다공성 생분해성 중합 지지체로 이루어진 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물에 관한 것이다.

슬관절의 반월상 연골은 하중을분산시켜 관절 연골에 전달되는 스트레스를 줄여주고, 충격을 흡수하며, 관절의 안정성을 유지하며, 관절 연골의 영양공급과 관절의 윤활을 돕는 기능을 가지는 매우 중요한 조직이다. 반월상 연골은 무릎관절 내에서 손상이 가장 흔한 구조물로서, 그 손상은 중장년층에서 퇴행성 변화에 의한 파열 외에도 비교적 젊고 활동적인 연령에도 스포츠 손상 등을 통하여 호발한다. 특히 반월상 연골 손상은 비가역적인 과정으로 반월상 연골은 희박한 혈관분포로 인하여 재생과 치유가 매우 제한적이다. 치유되지 않은 반월상 연골의 파열은 파열된 조각 또는 충격 흡수재로서의 역할 부재로 인하여 관절 연골의 손상으로 이어지게 되어 결국 퇴행성 관절염의 발생으로 이어진다는 것이 정설이다. 특히 내측 구획의 퇴행성 변화는 절제된 반월상 연골의 양과 비례적 관계가 있다고 알려 져 있다.

반월상 연골 파열의 치료로써 절제술 및 봉합술이 많이 시행되고 있다. 그러나 절제술의 경우, 부분 또는 전 절제술로 주로 기계적인 증상을 없애 급성기의 통증을 개선할 수 있지만, 장기적으로 퇴행성 변화를 초래하여 관절염의 진행을 막지 못한다는 한계가 있고, 봉합술의 경우 적응증이 매우 제한되어 있고, 적지 않은 실패율이 보고되고 있다. 또한, 자가 반월상 연골의 기능적 회복을 얻지 못한 경우, 동종 반월상 연골 이식술도 시도되고 있지만, 감염의 위험, 면역학적 거부 반응, 제한된 공급, 적절한 크기를 맞추기 어려움. 고 비용 등이 문제점으로 지적되고 있다.

이러한 현존하는 반월상 치료 방법의 한계를 극복하기 위하여 조직 공학적인 기법을 이용한 반월상 연골 치료법이 대두되고 있으며, 다양한 동물 실험을 거쳐 현재 인체에 대한 임상 연구가 진행 중이다. 조직 공학(tissue engineering)은 세포(cell), 지지체(scaffold) 및 환경(environment) 등을 그 기본 구조로 하여 조직을 재생하려는 기법이다. 반월상 연골 재생을 위한 세포로는 자가 또는 동종 반월상 연골의 섬유연골세포(fibrochondrocyte) 및 골수 줄기 세포 등이 있고, 지지체로는 천연 고분자 화합물로 콜라겐(collagen), 소장의 점막(porcine small intestinal submucosa), 골외막(periosteum) 및 연골외막(perichondrium) 등이 있으며, 합성 지지체로서 테프론(teflon), 탄소 섬유(carbon fiber), 폴리락틱산 (polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리다이옥사논(polydioxanone) 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL)등이 있고, 환경으로 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor), 혈소판-유래 성장인자(Platelet-derived growth factor), 형질전환성장인자(Transforming growth factor), 히알루론산(Hyaluronic acid), BMP(Bone morphogenic protein) 및 인슐린-유사 성장인자(Insulin-like growth factor) 등의 다양한 성장 인자와 기계적인 자극이 시도되어 왔다. 하지만 이러한 다양한 시도를 이용한 동물 실험에서 아직 만족할 만한 반월상 연골의 재생과 관절 연골 보호 효과를 증명하지 못하고 있다.

활액막 세포는 반월상 연골 손상 등 관절 내 손상에서 치유에 중요한 역할을 한다는 것이 잘 알려져 있으며, 관절 연골 또는 섬유 연골로분화할 능력이 있는 것이 증명되었다. 또한 임상적으로도 최소 침습적인 관절경적 수술을 통하여 손쉽게 채취할 수 있어, 그 응용 및 치료적 적용에 많은 기대가 모아지고 있다. 지지체는 생체 친화성과 생체조직과 유사한 생분해성을 가져야 하고, 독성 대사 산물이 생기지 않아야 하며, 주술적으로 고정될 수 있고 하중에 견딜 수 있는 강도를 지녀야 하며, 동시에 관절 내 다른 구조물을 손상시키지 않아야 한다. 폴리카프로락톤 지지체는 기존의 다양한 연구에서 위의 조건을 가지는 우수한 성분으로 인정되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 반월상 연골을 재생시킬 수 있는 반월상 연골 치환용 이식물(implant)을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 반월상 연골 형상의 다공성 생분해성 중합 지지체에 동종(allogenous) 활액막 세포를 파종하여 손상된 관절 연골에 이식하는 경우에는, 반월상 연골이 재생됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 반월상 연골 모양의 다공성 생분해성 중합 지지체; 및 (b) 상기 지지체에 파종된 동종 활액막 세포를 포함하는 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물을 제공한다.

본 발명자들은 반월상 연골을 재생시킬 수 있는 반월상 연골 치환용 이식물(implant)을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 반월상 연골 형상의 다공성 생분해성 중합 지지체에 동종(allogenous) 활액막 세포를 파종하여 손상된 관절 연골에 이식하는 경우에는, 반월상 연골이 재생됨을 확인하였다.

본 발명의 이식물은 기본적으로 반월상 연골 모양의 다공성 생분해성 중합 지지체(scaffold)를 이용한다.

본 발명에서 이용되는 지지체는 반월상 연골의 재생을 촉진시키기 위하여 반월상 연골 모양을 갖는다.

본 발명에서 이용될 수 있는 지지체는 조직공학분야에서 통상적으로 이용되는 다공성 생분해성 중합체를 포함한다.

본 명세서에서 용어 “생분해성 중합체”는 pH 6-8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때분해되는 중합체를 의미하며, 바람직하게는 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서분해될 수 있는 고분자를 의미한다. 본 발명에서 사용가능한 생분해성 중합체는, 상술한 분해성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴리카프로락톤(polycaprolactone: PCL), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트), 폴리(하이드록시발러레이트) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 다공성 생분해성 중합 지지체는 폴리카프로락톤(polycaprolactone: PCL) 중합체이다. PCL은 다른 중합 지지체보다 반월상 연골을 재생하는 데 우수한 효과를 나타내며, 파종되는 활액막 세포의 증식에 특히 바람직한 지지체이다.

본 발명의 중합 지지체는 다공성(porosity)을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 다공성 생분해성 중합 지지체의 다공 크기가 50-300 ㎛, 보다 바람직하게는 80-200 ㎛, 가장 바람직하게는 100-150 ㎛이 다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 다공성 생분해성 중합 지지체는 50-95%의 다공성, 보다 바람직하게는 60-95%, 보다 더 바람직하게는 80-95%, 가장 바람직하게는 약 90%의 다공성을 갖는다.

상술한 본 발명의 지지체의 다공 크기 및 다공성은 파종되는 활액막 세포의 증식에 매우 중요한 역할을 수행한다. 지지체의 다공 크기 및 다공성은 다양한 방법을 통해 조절할 수 있으며, 바람직하게는 멜트-몰딩 입자-리칭 방법(melt-molding particulate-leaching method)에 따라 조절된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 다공성 생분해성 중합 지지체는 콜라겐 타입 I이 흡착되어 있다. 흡착된 콜라겐 타입 I은 파종된 활액막 세포의 지지체로서의 부착 및 증식에 중요한 역할을 담당한다.

이식물이 반월상 연골 부분에 이식되어 성공적인 연골을 재생하기 위해서는, 지지체가 적절한 압축장도 및 봉합강도를 갖는 것이 중요하다.

지지체의 압축강도는 외부에서 가해지는 힘에 견딜 수 있는 정도를 나타내는 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 다공성 생분해성 중합 지지체는 300-600 kPa의 압축강도, 보다 바람직하게는 380-500 kPa, 보다 더 바람직하게는 380-460 kPa, 가장 바람직하게는 420-440 kPa의 압축강도를 갖는다.

지지체의 봉합강도는 지지체를 원하는 위치에 고정시키기 위해 필수적인 물성이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 다공성 생 분해성 중합 지지체는 1.5-4.0 kg의 봉합강도, 보다 바람직하게는 2.0-3.5 kg, 보다 더 바람직하게는 2.0-2.8 kg, 가장 바람직하게는 2.3-2.6 kg의 봉합강도를 갖는다.

지지체에 파종되는 세포는 활액막 세포(synovial cells)이다. 본 명세서에서 용어 “활액막 세포”는 활액막에 존재하는 세포군을 의미하며, 특별하게 다른 언급이 없는 하, 활액막-유래 세포(synovium-derived cells)와 동일한 의미로 혼용된다.

본 발명에서 이용되는 활액막 세포는 동종(allogenous) 활액막 세포이다. 본 명세서에서 용어 “동종 활액막 세포”는 동일종으로부터 유래된 활액막 세포를 의미하는 것으로서, 자가 동종 활액막 세포 및 타가 동종 활액막 세포를 포괄하는 의미를 갖는다. 지지체에 파종되는 활액막 세포의 밀도는 특별하게 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 1 x 10³ - 1 x 10⁷ 세포/지지체의 세포밀도, 보다 바람직하게는 1 x 10⁵ - 1 x 10⁶ 세포/지지체, 가장 바람직하게는 3 x 10⁵ - 8 x 10⁵ 세포/지지체의 세포밀도로 활액막 세포가 지지체에 파종된다.

활액막 세포가 파종된 다공성 생분해성 지지체로 이루어진 본 발명의 이식물은 지지체 제조 직후 이식될 수 있지만, 바람직하게는 활액막 세포의 증식 후 이식된다. 증식 기간은 특별하게 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 증식 기간은 5-30일, 보다 바람직하게는 10-25일, 가장 바람직하게는 13-15일이다.

상기 증식 과정에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio. Med ., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는, DMEM, F12, DMEM과 F12의 혼합물 및 RPMI 1640이며, 가장 바람직하게는 DMEM이다. 배지에 대한 설명은, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 배지는 혈청(예컨대, 우태아혈청)이 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물은 손상된 반월상 연골 부분에 이식되어 우수한 연골 재생 능력을 발휘한다. 본 발명의 이식물을 이용하는 경우, 지지체의 점진적인분해 및 흡수와, 이와 동시에 일어나는 활액 막 조직의 침투 및 성장으로 반월상 연골의 재생이 효과적으로 일어나며, 관절 연골의 보호 효과가 발생한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 반월상 연골 모양의 다공성 생분해성 중합 지지체 및 동종 활액막 세포를 포함하는 반월상 연골 치환용 이식물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 반월상 연골 치환용 이식물은 손상된 반월상 연골 부분에 이식되어 우수한 연골 재생 능력을 발휘한다.

(ⅲ) 본 발명은 반월상 연골의 치환 기술의 획기적인 진전을 가져온다.

(ⅳ) 본 발명의 이식물을 이용하는 경우, 지지체의 점진적인분해 및 흡수와, 이와 동시에 일어나는 활액막 조직의 침투 및 성장으로 반월상 연골의 재생이 효과적으로 일어나며, 관절 연골의 보호 효과가 발생한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

연구 목적

본 연구는 가토의 슬 관절 내측 반월상 연골 결손 모델에서 폴리카프로락 톤(polycaprolactone: PCL) 다공성 지지체를 이용한 반월상 연골 치환술을 실시하여 6개월까지 추시 관찰하여 외관 및 조직학적, 생화학적 및 역학적 방법을 이용하여 평가하였다. 다공성 지지체에는 활액막 세포를 파종하지 않은 것과 파종하여 2주 동안 배양한 것을 사용하였으며, 대조군으로 반월상 연골 절제술을 실시한 슬관절을 사용하였다. 본 연구의 목적은, 1. 가토 슬관절에서 지지체를 이용한 반월상 연골 치환술을 실시하여 반월상 연골의 재생 과정을 6개월까지 관찰하고, 2. 지지체에 대한 활액막 세포 파종의 효과를 알아보는 것이다. 본 연구에서 상정한 가정은, 지지체를 이용한 반월상 연골 치환술은 반월상 연골의 재생에 긍정적인 효과를 가질 것이고, 지지체에 대한 활액막 세포의 파종은 재생을 더욱 촉진하는 효과를 나타낼 것으로 예상하였다.

연구 재료 및 방법

실험의 개요

가토의 양측 슬관절에서 내측 반월상 연골 제거술을 실시하였다. 좌측은 반월상 연골 제거술을 실시한 대조군으로 하고, 우측은 정상 반월상 연골 모양의 지지체 단독으로, 또는 동종 활액막 세포를 파종(seeding)하여 2 주간 배양한 지지체를 삽입하였다. 수술 후 1, 3 및 6개월에 재생된 반월상 연골에 대하여, 조직학적, 생화학적 및 기계적 성질을 확인하였고, 같은 시기에 지지체만 삽입, 파종 (Seeded) 된 지지체를 삽입, 반월상 연골 제거술을 시행한 슬관절에서 관절 연골의 변화를 확인하였다. 모조수술(sham operation)을 실시한 개체에 대하여는 수술적 접근 및 노출을 반월상 연골에 대한 조작을 하기 직전까지 실시하고, 그대로 관절 낭 봉합술을 실시하였다.

지지체 제조

반월상 연골 형태의 지지체 제조의 전 단계로서, 폴리카프로락톤(polycaprolactone: PCL)(Sigma-Aldrich Co., MO, USA)을 동결 파쇄기(freezer mill)을 사용하여 파쇄함으로써 PCL 미세분말을 제조하였다. 다공질의 크기를 조절하기 위하여 소금입자를 막자사발을 이용하여분쇄한 후,분자체를 이용하여 200-300 ㎛ 크기의 입자들을 걸러내어 사용하였다. 이어, PCL 미세분말을 소금입자와 함께 반월상 연골 형태가 음각으로 새겨진 스테인리스 스틸 몰드에 넣고 100℃로 예열된 열 압착기를 이용하여 30 Mpa로 열압착하여 반월상 연골 형태의 PCL 필름을 제조하였다. 제조된 반월상 연골 형태의 필름을 미세분말 열 압착법을 이용하여, 반월상 연골 형태의 다공성 지지체를 제조하였다. 제조된 다공성 지지체가 가토 슬관절의 반월상 연골과 매우 유사한 형태를 가짐을 확인할 수 있었다. 다공성 지지체에 세포 점착성을 향상시키고자 반월상 연골의 주 성분인 제1형 교원질(type 1 collagen, calf skin, Sigma)을 흡착시켰다. 제조된 지지체를 34 시간 동안 세척한 후에 진공 오븐에서 24시간 이상 건조하였다. 제1형 교원질을 0.1 mol 아세트산에 0.5 mg/ml 농도로 용해한 다음 상기 제조된 지지체를 3시간 동안 담가 둔 후, 30분 동안 세척하고 진공 오븐에서 24시간 이상 건조하여 지지체에 제1형 교원질을 흡착시켰다. 세척은 탈이온수(DI water)를 사용하였다.

제조된 다공성 폴리머 지지체의 물성을 측정하였다. 사용된 소금입자와 동일한 크기의 다공 크기 100-150 ㎛가 균일하게 형성됨을 관찰할 수 있었고, 또한 조직공학용 지지체로 사용이 용이한 약 90%의 다공성을 가짐도 확인 할 수 있었다.

반월상 연골 지지체의 성패를 좌우하는 가장 중요한 물성은 외부에서 가해지는 힘에 견딜 수 있는 압축강도와 지지체를 원하는 위치에 고정시키기 위해 필수적인 봉합강도이다. 압축강도의 경우 기존 동물 실험에서 사용되고 있는 지지체들, 예컨대 폴리우레탄-기반 공중합체 및 폴리-L-락틱-ε-카프로락톤 공중합체 등(압축계수(compression modulus) 약 200 kPa)에 비해, 본 발명의 다공성 지지체는 그 강도가 약 2배 정도(압축계수 약 430 kPa) 크다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 봉합 강도의 경우 실제 임상에 사용 중인 콜라겐 반월상 연골 이식물(CMI; 봉합강도, 약 2.5 kg)과 비교하여 본 발명의 다공성 지지체는 유사한 강도(봉합강도, 약 2.4 kg)를 가짐을 확인하였다.

지지체에 동종 활액막 세포 파종

앞의 실험에서 채취한 동종 활액막 세포를 제조된 지지체에 2주간 배양하였다. 상세하게 설명하면 다음과 같다: 활액막을 넣어주고, 조직 1 g 당 0.2% 프로나아제(pronase)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 10 ml을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. DMEM은 혈청을 포함하지 않고 항진균제만 포함하였으며, 프로나아제는 다공크기가 0.2 ㎛인 필터에 여과하여 사용하였다. 조직 1 g 당 0.2% 콜라게나아제를 포함한 DMEM 10 ml를 첨가하고, 37℃에서 3시간 반응시켰다. 70 ㎛ 체에 걸러진 부유물을 1300-1400 rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리 하였다. 그 부유물을 10% FBS-DMEM(완전 배지)로 세척하였다. 1.5-2.5 x 10⁶ cells/plate가 되도록 플레이트에 살포하였다. 배지를 일주일에 2 회 교환하면서, 10-20 일정도 배양하였다.

파종된 활액막 세포의 운명을 확인하기 위하여, PKH-26(Sigma-Aldrich Co., MO, USA)을 이용하여 활액막 세포에 표지(labeling)를 붙였다. 세포 증식의 마지막 시기에 활액막 세포들을 형광염색 PKH-26로 표지를 붙였다. 부착 세포를 단일세포로 현탁시키고, 실온에서 2 x 10⁷ 밀도의 세포 현탁액을 혈청이 포함되지 않은 배지로 1 번 세척하였다. 현탁액을 400 g에서 5분 동안 원심분리하고, 조심스럽게 흡입하였다. 여기에 희석액(diluent C)을 1 ml 첨가하고 재부유를 하였다(no voltex). 즉시 4 x 10^-6 M의 PKH-26를 첨가하고, 파이펫으로 빠르게 섞었다. 25℃에서 2-5분 동안 부드럽게 섞으면서 배양하였다. 같은 양의 혈청을 첨가하여 염색을 중지시키고, 1분 동안 다시 배양하였다. 완전 배지를 같은 양 이용하여 희석하고 400 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 3 회 이상 세척한 다음, 완전 배지에 원하는 농도로 세포를 부유하였다. PKH-26 염색 시약의 최종 농도는 1 x 10⁷ 세포 농도 당 2 x 10^-6 M이었다. 본 실험에서 세포 숫자는 스캐폴드 당 5.0 x 10⁵ cells/scaffold이었고, 농도는 2 x 10^-6 M이었다.

동물 실험

생후 12주 가량 된, 체중 2.6-3 kg의 뉴질랜드 흰 토끼(New Zealand White Rabbit)를 사용하였으며, 검역을 통해서 건강에 이상이 없는 것을 확인하였다. 파종이 안 된 지지체와 파종이 된 지지체에 대하여 1, 3 및 6개월에 조직학적 실험, 생화학적 실험 및 역학적 실험을 각각에 대하여분석이 가능하도록 동물 실험을 실시하였고, 반월상 연골 절제술과 모조 수술(sham operation)을 실시하였다.

청결한 환경에서 수술 준비를 하고, 케타민 염산염(Ketamine hydrochloride)과 자일라진 염산염(Xylazine hydrochloride)을 근주 또는 정주하여 토끼를 마취시켰다. 슬관절의 피부 및 피하조직에 전방 정중 종 절개를 실시하여, 대퇴 사두근, 슬개골 및 근위 경골 부위를 노출하였다. 내측 관절낭 절개를 실시하여, 슬개골을 외측으로 탈구 시키고, 슬관절을 굴곡하여 관절 내부에 접근하였다. 내측 반월상 연골이 있는 슬관절 내측 구획을 잘 보이게 하기 위하여 내측 측부 인대(medial collateral ligament) 및 내측 관절낭(medial capsule)을 횡으로 절개하였고, 내측 관절 구획을 벌리고 내측 반월상 연골을 전방으로 아탈구하여 전장을 노출하였으며 십자 인대의 손상은 없었다. 내측 반월상 연골의 전방부 1/5을 남겨 놓고, 나머지 4/5부분을 반월상 연골과 관절낭의 접합부에서 제거하였다. 지지체도 전방부 1/5을 제거하고, 제거된 반월상 연골 결손부에 크기와 모양을 맞추어 삽입하였다. 그 다음 지지체의 변연부와 관절낭 사이, 남아 있는 원래의 반월상 연골과 지지체의 전방부 사이를 PDS 5-0를 이용하여 봉합하였다(도 1). 삽입된 지지체가 대퇴골 과와 경골과 사이에 위치하도록 슬개골을 포함한 슬관절을 원래의 위치로 정복하고, 절단한 내측 측부 인대와 내측 관절낭을 Vicryl 3-0를 이용하여 봉합한 후, 피부는 Nylon 2-0를 이용하여 봉합하였다. 수술 후 감염을 예방 하기 위하여 겐타마이신(Kyung Dong Pharm Co., Seoul, Korea)을 3 일간 근주하였으며, 부목 등을 이용한 관절 고정은 실시하지 않았고, 가능한 범위에서 자유롭게 활동하도록 하였다. 양측 슬관절에서 내측 반월상 연골을 제거하였으며, 우측은 파종이 안 된 또는 파종이 된 지지체를 원래의 반월상 연골의 위치에 삽입하여 봉합하고, 좌측은 반월상 연골이 제거된 상태 그대로 봉합하였다. 모조 수술(sham operation)을 실시한 개체에서는 수수적 접근 및 노출을 상기한 바와 같이 하여, 반월상 연골에 대한 조작을 하기 직전까지 한 후 관절낭 및 피부를 봉합하였다.

시료 채취 및 외관 관찰

동물 실험 후, 1, 3 및 6개월에 재생된 반월상 연골을 채취하여 재생된 반월상 연골 및 관절 연골을 관찰하였다. 가토는 마취제를 과량으로 사용하여 안락사시킨 후 슬관절을 절개하여 관찰하고 조직을 얻었다. 주변 조직의 염증 정도 및 재생된 반월상 연골의 외관 및 관절낭과의 부착 정도를 관찰하였고, 조직학적 검사, 생화학적 검사 및 기계적 검사를 위한 표본을 준비하였다. 관절 연골의 상태를 정상 슬관절, 파종이 안 된 지지체, 파종된 지지체 및 반월상 연골 절제술 슬관절에서 비교하였다. 대퇴골과에 비하여 경골 고평부의 퇴행성 변화가 더욱 현저하다는 이전의 보고를 참고하여 관찰은 주로 경골과의 관절 면에 집중하였다. 관절 연골의 전체적인 모양의 평가에 Chang등의 방법을 사용하였다. Gr 0: 정상 연골(normal cartilage), Gr 2: 약간의 손상(minimal wear), 표면에 불규칙함 없음(no surface irregularities), 약간의 색 변화(slight color change), Gr 4: 선명한 연골 세선화(obvious cartilage thinning), 제한된 부분에서의 섬유성 연 축(limited regions of fibrillation), 선명한 색 변화(obvious color change), Gr 6: 상아질화된 부분들(areas of eburnation), 심각한 섬유성 연축(severe fibrillation), 선명한 색 변화(obvious color change), Gr 8: 연골의 부분적 손실(partial loss of cartilage), 연골 하골은 보이지 않음(no exposed subchondral bone), Gr 10: 연골하골의 부분적인 노출(partial exposure of subchondral bone), 판누스 형성(pannus formation)으로 평가하여 그 숫자의 평균값을 비교하였고, 인디아 잉크를 관절 면에 떨어뜨려 관절 연골의 틈을 명확하게 보이도록 하여 비교하였다.

조직학적 검사

재생된 반월상 연골에 대하여 H & E(hematoxylin and eosin), 사프라닌-O(Safranin-O), 매이슨 트리크롬(Masson’s trichrome) 및 콜라겐 타입 I 및 Ⅱ에 대한 면역 조직 화학 염색을 실시하여 반월상 연골의 재생 정도를 평가하였다. 채취된 반월상 연골은 4% PFA(파라포름알데하이드)에 담가 냉장 보관하였으며, 조직을 급속 냉동(frozen section)한 후 염색을 실시하였다. 재생된 반월상 연골의 평가를 위하여 Tienen 등의 방법을 이용하였다. 지지체와 피막과의 융합, 즉 이식물과 캡슐 사이의 융합(Integration between implant and capsule), 지지체 내부로의 조직침투(Tissue infiltration into the implant), 지지체에서 세포의 표현형(Phenotype of cells in the implant), PG 염색의 양(Amount of PG staining), 콜라겐 타입 I과 Ⅱ에 대한 표지화 및 활액막과 지지체 동공에서의 이물반응(foreign body reaction in the synovium and in the pores of the implant) 등 의 항목을 평가하였다.

관절 연골과 연골 하골을 포함하는 골 검체에 대하여 H & E(hematoloxylin and eosin), 사프라닌-O(Safranin-O) 및 매이슨 트리크롬(Masson’s trichrome) 염색을 실시하여 관절 연골의 퇴행성 변화 정도를 평가하였다. 관절 연골의 현미경적 소견 평가에 Mankin등의 방법을 사용하였다. I. 구조(Structure); Gr 0: 정상(normal), Gr 1: 불규칙한 표면형성(surface irregularities), Gr 2: 불규칙한 판누스와 표면형성(pannus and surface irregularities), Gr 3: 변화하는 지역에서의 갈라짐들(clefts to transitional zone), Gr 4: 요골에서의 갈라짐들(clefts to radial zone), Gr 5: 석회화된 지역에서의 갈라짐(clefts to calcified zone), Gr 6:분열화된 구조(complete disorganization), II. 세포(Cells); Gr 0: 정상(normal), Gr 1: 흩어진 세포질(diffuse hypercellularity), Gr 2: 복제(cloning), Gr 3: 세포분열(hypercellularity), III. 사프라닌-O 염색(Safranin-O staining); Gr 0: 염색하지 않은 상태(normal), Gr 1: 약간의 환원(slight reduction), Gr 2: 적당한 환원(moderate reduction), Gr 3: 심각한 환원(severe reduction), Gr 4: 비염색(no dye noted), IV. 타이드마크 완전성(Tidemark integrity); Gr 0: 변하지 않음(intact), Gr 1: 혈관에 의한 교차(crossed by blood vessels)로 평가하였고, 총점으로 비교하였다.

H & E 염색( Hematoxylin & Eosin staining )

H & E 염색은 조직의 기본적인 구조를 확인하기 위하여 실시하였다. 고정액으로 4% PFA를 사용하였다. 파라핀 포매하여 폴리-L-라이신이 코팅된 슬라이 드(poly-L-lysine-coated slide)에 부착(4 ㎛)하고, 신선한 자일렌(fresh xylene)으로 5분에 걸쳐 2 회 탈파라핀 하였다. 재수화 과정으로 100% 에탄올(5 min x 2) -> 90% 에탄올(5 min x 1)-> 80% 에탄올(5 min x 1) -> 70% 에탄올(5 min x 1) -> 증류수(DW)로 4분간 세척하였다. 실온에서 헤마토실린(hematoxylin)으로 6분 염색하고, 증류수에 담가 5분간 발색 후 세척하였다. 1% 아세트산으로 2-3회 담금질(dipping) 후 증류수로 4분간 세척하였다. 에오신(Eosin)으로 15초간 염색하고 증류수로 4분 동안 세척하였다. 탈수 과정으로 70% 에탄올(1 min x 1) -> 80% 에탄올(1 min x 1) -> 90% 에탄올(1 min x 1) -> 100% 에탄올(1 min x 1)-> 자일렌(xylene)으로 처리하고 커버 슬라이드로 마운팅 하였다.

사프라닌 -O와 패스트 -그린 염색( Safranin -O & Fast - green staining )

사프라닌-O(Safranin-O) 염색은 주로 황산화된 글루코사미노글리칸(sulfated glycosaminoglycan)을 확인하기 위해서 실시하였다. 사프라닌-O에 의해서 붉은 색으로 염색되는 부분이 세포간 물질(ground substance)중 주로 프로테오글리칸(proteoglycan)부위에 염색되는 것이며, 녹색으로 염색되는 부분은 패스트 그린 염색(fast green dye)에 의한 카운터-염색(counter-staining)이다.

고정액으로 4% PFA를 사용하였다. 파라핀 포매하여 폴리-L-라이신으로 코팅된 슬라이드에 부착(4 ㎛)하고, 신선한 자일렌으로 5분에 걸쳐 2 회 탈파라핀 하였다. 재 수화 과정으로 100% 에탄올(5 min x 2) -> 90% 에탄올(5 min x 1)-> 80% 에탄올(5 min x 1) -> 70% 에탄올(5 min x 1) -> 증류수로 4분간 세척하였다. 실온에서 헤마토실린으로 6분 염색하고, 증류수로 4분간 세척하였다. 1% 아세트 산으로 2-3회 담금질한 후 증류수로 4분간 세척하였다. 패스트 그린으로 3분간 염색하고, 증류수에 담가 5분간 발색 후 세척하였다. 1% 아세트산에 2-3회 담금질한 후 증류수로 4분간 세척하였다. 사프라닌-O로 15분간 염색하고, 증류수로 4분간 세척하였다. 탈수 과정으로 70% 에탄올(1 min x 1) -> 80% 에탄올(1 min x 1) -> 90% 에탄올(1 min x 1) -> 100% 에탄올(1min x 1) -> 자일렌 처리 후 커버 슬라이드로 마운팅 하였다.

매이슨 트리크롬 염색( Masson - Trichrome staining )

매이슨-트리크롬 염색은 주로 콜라겐 섬유를 확인하기 위해서 실시하였다. 파란색으로 보이는 것이 콜라겐 섬유이며, 그 배열이 조잡한지와 조직화되어 있는지를 확인할 수 있다. 빨간색은 세포질, 케라틴 및 근육 부분이며, 검은 색은 핵을 나타낸다.

고정액으로는 4% PFA를 사용하였다. 파라핀 포매하여 폴리-L-라이신이 코팅된 슬라이드에 부착(4 ㎛)하고, 신선한 자일렌으로 5분에 걸쳐 2 회 탈파라핀 하였다. 재 수화 과정으로 100% 에탄올(5 min x 2) -> 90% 에탄올(5 min x 1) -> 80% 에탄올(5 min x 1) -> 70% 에탄올(5 min x 1) -> 증류수로 4분간 세척하였다. 슬라이드를 매염제 용액(Mordant in Bouin’s solution)에 담근 후 실온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음 노란색이 없어질 때까지 증류수에 1 시간 30분 이상 담가 놓은 후 다시 증류수로 세척하였다. 바이게르트 아이언 헤마토실린 용액(Weigert’s iron hematoxylin solution)으로 실온에서 10분간 염색하고, 헤마토실린을 사용하여 6분간 염색한 후, 증류수에 5분간 발색 후 세척하였다. 비브리 히 스칼릿-산성 푹신 용액(Biebrich scarlet-acid fuchsin solution)에 5분간 염색하고 증류수로 세척하였다. 포스포몰리브덴-포스포턴스텐산 용액(Phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution)에 5분간 염색하고, 아닐린 블루용액에 5분간 반응시킨 후, 증류수로 세척하였다. 1% 아세트산용액에 2분 30 초 동안 반응시켰다. 탈수 과정으로 70% 에탄올(1 min x 1) -> 80% 에탄올(1 min x 1) -> 90% 에탄올(1 min x 1) -> 100% 에탄올(1 min x 1) -> 자일렌 처리 후 커버 슬라이드로 마운팅하였다.

면역조직화학 염색( Immunohistochemistry staining )

면역조직화학 염색은 콜라겐 유형을 확인하기 위해서 실시하였다. 정상적인 반월상 연골(Native meniscus)에서 내측 부분(inner portion)은 주로 연골 유사 타입 Ⅱ 콜라겐(cartilage-like type 2 collagen)이 존재하고, 외측 부분(outer portion)은 힘줄 유사 타입 I 콜라겐(tendon-like type 1 collagen)이 존재한다. 갈색으로 염색되는 것을 양성으로 판단하며, 세포의 표현형(phenotype)도 연골세포와 유사한지(chondrocyte-like)와 섬유아세포와 유사한지(fibroblast-like)를 확인한다.

고정액으로 4% PFA를 사용하였다. 파라핀 포매하여 폴리-L-라이신이 코팅된 슬라이드에 부착(4 ㎛)하고, 신선한 자일렌으로 5분에 걸쳐 2 회 탈파라핀 하였다. 재 수화 과정으로 100% 에탄올(5 min x 2) -> 90% 에탄올(5 min x 1) -> 80% 에탄올(5 min x 1) -> 70% 에탄올(5 min x 1) -> DW 세척(4min)하였다. 내인성 퍼옥시다아제의 활성을 막기 위해서, 3% H₂O₂로 실온에서 30분간 반응시키고, 0.05% PBS-T(0.05% tween-20 in PBS)로 5분간 3 회 세척하였다. 100 units/ml 히알루로니다아제(Hyaluronidase(Sigma, USA)) 용액으로 37℃에서 30분간 반응시키고, 0.05% PBS-T로 5분간 3 회 세척하였다. 비특이적인 연결(Non-specific binding)을 막기 위하여, 블록킹 용액(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)으로 실온에서 10분간 반응시켰다. 1 차 항체 반응으로 마우스 단클론 항-콜라겐 Ⅱ 항체(Mouse monoclonal anti-collagen Ⅱ Antibody(2 ㎍/ml; Lab Vision-Neomarkers, Fremont, CA, USA))로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰고, 0.05% PBS-T 로 5분간 3 회 세척하였다. 2차 항체 반응으로 링크 용액(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)으로 실온에서 30분간 반응 시키고 0.05% PBS-T로 5분간 3 회 세척하였다. 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 용액(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA))으로 실온에서 30분간 반응시키고, 0.05% PBS-T로 5분간 3회 세척하였다. 발색 반응을 하기 위하여 증류수 1 ml, 완충용액(sub. A) 1 방울, DAB(3-3'-diaminobezidine tetrachloride)(sub. B) 1 방울 및 20% H₂O₂(sub. C) 1 방울을 넣고, 실온에서 2분간 반응시키고, 증류수로 발색 반응을 중지시키고, 증류수로 5분간 1 회 세척하였다. 대조 염색으로 헤마토실린을 6분간 처리하고, 증류수에 담가 5분간 발색 후 세척하였다. 과염색시, 1% 아세트산 용액으로 1회 세척하였다. 탈수 과정으로 70% 에탄올(1 min x 1) -> 80% 에탄올(1 min x 1) -> 90% 에탄올(1 min x 1) -> 100% 에탄올(1 min x 1) -> 자일렌 처리 후 커버 슬라이드로 마운팅하였다.

파종된 활액막 세포의 추적 ( PKH -26 관찰)

검체에서 파종된 활액막 세포를 관찰하기 위하여, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole.(Roche, Mannheim, Germany))로 염색을 하고, 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다. 파종된 활액 세포는 PKH(Paul Karl Horan, the name of the developer)-26으로 표지(labeling)되어 있으므로, 파종된 활액막 세포의 자연 경과를 확인할 수 있었다. DAPI는 일반적인 dsDNA와 형광 복합체를 형성하는 성질 때문에 세포 생존을 확인하는데 유용한 방법으로 사용된다. 공초점 현미경 상에서 활액막 세포를 파란색으로 확인할 수 있다. PKH-26은 세포막에 표지하여 세포를 추적할 때 유용한 방법이다. PKH(Paul Karl horan, the name of the developer)는 형광 다이가 PKH-26분자내 긴 지용성인 부분에 붙어 있는 구조로, 이 지용성 부분이 세포막으로 융합된다. 세포 독성이 없고, 안정적이고, 정상적인 세포 대사에 영향이 없어 인 비보 실험에서 사용된다. 반감기는 100일 이상이다. 공초점 현미경 상에서 빨간색으로 확인할 수 있다.

생화학적 검사

재생된 반월상 연골에 대해서 수분, 콜라겐 및 프로테오글리칸 성분을 측정하였다. 채취한 재생된 반월상 연골은 DMEM에 담가 냉장 보관하였다.

수분 함량( Water content )

Whatman 거름 종이로 검체의 표면에 있는 잉여의 수분을 제거한 후, 무게를 재고, 냉동건조기에 검체를 넣고, 하룻밤 숙성하였다. 건조된 무게를 측정하여, 건조시키기 전과의 무게 차이를 이용해 수분의 양을 계산하였다.

콜라겐 함량( Collagen content )

100 ㎕의 추출 완충액을 시약 블랭크에 넣어 콜라겐 표준용액 12.5, 25 및 50 ㎕의 3가지 농도로 준비하였다. 적당한 양의 검체를 미세 원심분리 튜브에 넣고, 여기에 1.0 ml의 Sircol 염색 시약(Sircol dye reagent)을 첨가한 후, 믹서(mechanical mixer)를 이용해서 30분간 혼합하였다. 10,000 g에서 10분 동안 원심분리기로분리하여 콜라겐-염색약 복합체를 튜브의 바닥으로 가라앉게 하고, 복합체를 형성하지 않은 염색시약들이 상층액에 남아 있게 하였다. 상층액을 제거하고, 콜라겐-염색시약 복합체 펠릿에 1.0 ml의 알칼리 시약을 첨가한 후, 5-10분 동안 혼합 믹서기를 이용해 콜라겐과 결합되어 있는 염색 시약을 용해시켰다. 충분히 녹인 알칼리 염색 용액을분광 광도계를 이용해 흡광도를 측정하였다.

프로테오글리칸 함량

DMB분석(dimethylmethylene blue assay)을 이용하여 추출된 세포와 수집한 배지에서 합성된 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)을 측정하였다. 0.1 M 소듐 포름산, 0.005 M EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.005 M L-시스테인으로 구성된 파파인 완충용액을 사용하여 파파인 100 ㎍/ml(배지: 8 ㎕/ml, 스캐폴드: 4 ㎕/ml)의 농도로 첨가된 파파인 용액을 만들고 이를 추출된 세포에 500 ㎕(배지: 200 ㎕/ml, 스캐폴드: 500 ㎕/ml) 첨가한 후 55℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 배양 기간 동안 수집한 배지와 세포 추출시 얻어진 부유액에는 200 ㎍/ml 농도의 파파인(Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액을 100 ㎕ 첨가한 후 역시 55 ℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 난 뒤에는 6000 rpm에서 5분간 원심분리하여 반응된 상층액을 취하여 실험하였다. 이때 생성된 침전 산물은 DNA의 양적분석에 사용하였다. 반응된 상층액을 50 ㎕씩 96-웰 플레이트에 정량하고 각 웰 당 DMB 시약을 250 ㎕씩 첨가하였다. 희석 용액을 미세 원심분리용 튜브 7개에 각각 500 ㎕씩 넣는다. 콘드로이틴황산 스톡(chondroitin sulfate stock(1 mg/ml)) 100 ㎕에 900 ㎕ 희석용액을 첨가하고 혼합하였다. 이 용액 1 ml중 500 ㎕를 튜브에 넣고 1/2씩 덜어서 희석하였다. 낮은 농도 순서로 96 웰 플레이트에 50 ㎕씩 넣고, DMB(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액 250 ㎕를 넣었다(시료 희석 완충 용액: 0.05 M 소듐 포름산, 0.05% Tween 20 from pH 3.0 by 포름산). 즉시 샘플과 표준 시료를 마이크로플레이트분석기를 이용하여 530 nm와 590 nm에서의 흡광도를 측정한 후 그 비율을분석하였다. 그 측정치를 DNA 결과로 보정하였다.

인돌 방법으로 측정하여 세포의 수를 반영하였다. 합성된 글리코사미노글리칸의 양을 측정할 때 얻어진 세포 침전물에 1 N NaOH를 100 ㎕ 가하고 인돌 용액과 100% HCl이 50%씩 들어간 인돌(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 시약을 100 ㎕를 넣어주었다. 100℃로 10분간 가열한 후 실온에서 충분히 식혔다. 그 다음 96 웰 플레이트에 각 웰 당 200 ㎕씩 넣어주고, 마이크로플레이트분석기를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이를 DNA 표준 곡선을 이용하여 DNA 절대량으로 환산하였다.

역학적 검사

파종되거나 파종되지 않은 지지체와 재생된 반월상 연골의 강성(Stiffness)을 측정하기 위해서 4% PFA에 담가 냉장 보관하였다. 역학적 검사(mechanical study)는 쌍축 인장 검사(bi-axial tensile test)를 변형 시킨 쌍축 압력 검사(bi-axial compression test) 방법을 사용하였다. 실험 장비는 Intron 인장기기(AG-5000G, SHIMADZU, JAPAN)를 사용하였으며 50 kg 하중계(load cell)를 사용하였다. 누름자 팁(Indenter tip)은 스테인리스 강철로 제조하였으며, 팁의 크기는 1.0 mm 지름으로 팁의 끝 부분은 힘을 균일하게 전달시키기 위해서 반구 형태로 제작하였다. 물성 측정은 내측 팁(inter tip)이 0.3 mm/min의 속도로 샘플을 측정하도록 설정해 놓았다. 역학적 특성을 알고자 하는 샘플의 두께는 두 가지 방법으로 측정을 하였다. 첫 번째 방법은 마이크로미터기를 사용하여 샘플을 직접 육안으로 측정하는 것이고, 두 번째는 누름자 팁이 샘플에 닿는 순간부터 샘플을 뚫는 순간까지의 길이가 모니터에 변위로 기록되어 이것으로 샘플의 두께를 측정하였다. 검체들을 측정하기 전에 생리 식염수에 30분 동안 담가 두었으며 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate)로 둥근 접시 판에 고정시켰다. 누름자 팁과 검체가 일치되도록 하기 위해서 반구 형태의 둥근 접시 판을 움직여서 누름자 팁이 일치 되게 조절하였다. 검체는 둥근 접시 판에 고정시킨 뒤 끝부분이 반구 형태인 누름자 끝과 검체 표면이 수직으로 닿는지 CCD(charge-coupled device: 전자-결합 소자) 카메라를 사용해서 모니터로 확인하며 누름자 팁과 검체 표면을 일치시켰다. 쌍축 압력 검사는 반원상 연골에서 내하력(load bearing) 지역의 가운데 위치를 측정하였다. 누름자 팁이 0.3 mm/min 속도로 샘플에 들어가는 변위에 따라 로드 값을 측정함으 로써 샘플의 물성을 측정하였다. 이렇게 얻어진 로드-변위 곡선(load-displacement curve)은 응력-변형률 곡선(stress-strain curve)으로 변환하였으며, 총 인장 계수(aggregate modulus)를 구하여 정상 반월상 연골과 비교하였다. 지지체와 재생된 반월상 연골의 강성(stiffness)을 총 인장 계수를 이용하여 비교하였다.

연구 결과

전체적인 외양

1. 정상 반월상 연골 및 관절 연골의 소견

정상 반월상 연골 및 관절 연골의 육안 소견 및 인디아 잉크 염색 소견을 기본 정보로 제시하였다(도 2). 반월상 연골은 사람의 그것과 동일하지 않고, 특히 경골 부착부에서 다른 양상을 보여주었다. 관 절면은 매끈하였으며, 인디아 잉크 염색상에서도 관절 면에 균열(crack)은 없었다.

2. 반월상 연골

반월상 연골의 육안적인 외관은 시간이 지나면서 더욱 성숙해지는 것으로 보였다. 관절낭과는 대부분 잘 부착되어 있었고, 남아 있는 반월상 연골의 전각부에는 부착이 되어 있는 개체와 부착이 되어 있지 않은 개체가 모두 존재하였다. 봉합사는 1개월에는 거의 모두 남아 있었으나, 6개월에는 거의 흡수되어서 구별하기 어려웠으며, 관절 막의 비후, 섬유화 등의 주변 조직의 염증은 시간이 지날수록 감소하는 양상이었다. 파종된 개체에서 육안 소견은 파종되지 않은 개체보다 좀 더 성숙한 것으로 보였다. 관절 막의 비후, 섬유화 등의 주변 조직의 염증 소견 은 파종되지 않은 개체와 비교하여 차이가 없었으며, 거부 반응의 증거는 보이지 않았다(도 3).

3. 관절 연골

관절 연골의 미란이나 궤양 등의 명확한 결손은 보이지 않았다. Chang등의 방법에 의한 관절 연골의 평가에서 1, 3 및 6개월에 파종하지 않은 개체에서 0, 0.7, 2, 파종한 개체에서 0, 1.3, 2 및 반월상 연골 절제에서 0, 1.3, 2라는 수치를 얻었다. 이는 인디아 잉크를 이용해서 관절 연골의 크랙을 염색하여 관찰하여도 마찬가지였다. 하지만 Chang등의 평가 방법은 골극의 형성을 고려하지 않은 한계가 있으며, 육안 관찰 상의 변화는 골극의 형성에서 두드러진 차이가 있었다(도 4). 반월상 연골 치환술을 시행한 개체나 반월상 연골 절제술을 시행한 개체 모두 골극의 크기는 시간이 지남에 따라 증가 되었으나, 그 정도는 파종 되지 않은 지지체, 파종된 지지체 및 반월상 연골 절제술을 시행한 개체 사이에 유의한 차이는 없는 것으로 관찰되었다(도 5).

조직학적 검사

1. 정상 반월상 연골 및 관절 연골의 소견

대퇴골-반월상 연골-경골 복합체, 반월상 연골 및 경골 관절 면을 매이슨-트리크롬 염색 및 사프라닌-O 염색을 통하여 관찰하고, 이것을 실험 결과와 비교하기 위한 자료로 사용하였다. 반월상 연골은 대퇴골과 경골 사이에 깊숙이 위치하고 있었으며, 관 절면은 퇴행성 변화를 보이지 않았고, 기질에 다량의 단백다당을 관찰할 수 있었고, 연골 세포도 조직적으로 배열되어 있었다(도 6).

2. 대퇴골 -반월상 연골 -경골 복합체

도 7에서는 파종하지 않은 지지체, 파종된 지지체, 반월상 연골 제거술을 실시한 지지체에서 각각 1, 3 및 6개월에 채취한 대표적인 매이슨-트리크롬 염색 결과이다. 지지체를 삽입한 경우 시간이 지남에 따라서 반월상 연골의 재생이 진행하여 점점 더 성숙한 모양을 보였으며, 파종된 지지체를 사용한 경우에 파종하지 않은 지지체를 사용한 경우보다 좀 더 성숙된 재생을 보였다. 반월상 연골 제거술을 시행한 경우에는 관절 막에서 일부 반월상 연골-유사(meniscus-like) 조직이 보이는듯 하였으나, 완전한 반월상 연골의 재생이라고 보기에는 어려웠다. 지지체를 삽입한 경우에는 공통적으로 재생된 반월상 연골이 대퇴골과 경골 사이의 관절 면 상이에서 유지되지 못하고 외측으로 밀려 나와 탈골되어 있는 양상이었다.

3. 반월상 연골

거의 모든 예에서 주변부 관절낭과 지지체의 부착은 견고하게 관찰되었으며, 잔존하는 반월상 연골의 전각부와 지지체 사이에 접착에 대한 소견은 대부분의 예에서 확인할 수 있었다. 파종을 한 지지체의 경우에 파종을 하지 않은 지지체보다 더욱 성숙한 반월상 연골의 재생을 보여 주었다 (도 8). 시간이 지남에 따라 조직 성장(tissue ingrowth)이 진행되었으며, 점점 더 많은 교원 섬유가 지지체 내부로 자라 들어가는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 지지체의 표면을 따라 주위 활액막에서 새로운 조직이 자라 들어가는 양상을 확인할 수 있었다(도 9, 10). 6개월 추시 관찰에서도 지지체는 완전히 흡수되지 않고 남아있었다.

3. 파종된 활액막 세포의 추적 ( PKH -26 관찰)

지지체는 1개월에는 조잡하게 배열되어 있었고, 3개월에는 파종된 활액막 세포가 지지체 안으로 흡수되고 지지체를 대체하는 모습을 나타내었다. 세포의 수는 시간이 지나면서 전체적으로 증가하였으며, 파종된 활액막 세포는 지지체 표면을 따라 주위 관절낭에서부터 안으로 자라 들어오는 양상이었다. 파종된 활액막 세포에 PKH-26으로 표지(labeled, seeded synovial cell)를 하여 6개월까지 관찰할 수 있었다(도 11).

4. 관절 연골

시간이 지나면서 관절 연골의 퇴행성 변화는 증가하였다. 반월상 연골 절제술을 실시한 개체의 퇴행성 변화가 이식술을 실시한 개체보다 많은 퇴행성 변화를 보였다(도 12). 퇴행성 변화는 관절 연골 표면 변화뿐만 아니라 골극의 형성도 잘 관찰되었는데, 기존의 점수 체계에는 골극의 형성이 반영되어 있지 않은 한계가 있었다.

생화학적 검사

1. 수분 함량

파종이 되지 않은 지지체를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 수분 함량은 전체 무게(wet weight)의 68.5%이었고, 1개월에 81.1%, 3개월에 82.4% 및 6개월에 80.3%이었다. 파종된 지지체를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 수분 함량은 전체 무게의 63.8%였고, 1개월에 82.1%, 3개월에 81.7% 및 6개월에 79.4%였다(도 13). 조기에 과다한 수분 함량은 시간이 갈수록 감소하는 양상이었으며, 파종하지 않은 지지체와 파종한 지지체 사이에 유의한 차이는 없었 다.

2. 콜라겐 함량

파종이 되지 않은 지지체를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골 콜라겐 함량은 평균적으로 건조 중량의 77.3%이었고, 1개월에 49.1%, 3개월에 51.4% 및 6개월에 61.3%(정상의 79.3%)이었다. 파종된 지지체를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 콜라겐 함량은 건조 중량의 79.4%였고, 1개월에 40.5%, 3개월에 43.3% 및 6개월에 47.2% (정상의 59.4%)였다(도 14). 콜라겐 함량은 시간이 지남에 따라 증가하였으며, 파종하지 않은 지지체에서 파종한 지지체보다 많은 콜라겐 함량을 보였다.

3. 프로테오글칸 함량( Proteoglycan ( GAG ) content )

파종이 되지 않은 지지체를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 GAG함량은 평균적으로 전체 무게 (wet weight)의 2.0%이었고, 1개월에 0.29%, 3개월에 0.09% 및 6개월에 0.30%(정상의 15%)이었다. 파종된 지지체를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 GAG함량은 전체 무게(wet weight)의 1.56%였고, 1개월에 0.70% 및 3개월에 0.58%, 6개월에 0.88%(정상의 56.4%)이었다(도 15). GAG함량은 두 군 모두에서 3개월째에는 감소하였으나, 6개월째에는 처음보다 증가하였으며, 파종한 지지체에서 파종하지 않은 지지체보다 많은 GAG 함량을 보였다.

4. 역학적 검사

스캐폴드는 건조 상태, 젖은 상태 및 세포 파종 상태에서의 물성은 유의한 차이가 없었다(도 16). 정상 반월상 연골 및 파종을 하거나 하지 않은 지지체를 통해서 재생된 반월상 연골의 응력-변형률 곡선(stress-strain curve)은 그림과 같다(도 17). 파종하지 않은 지지체와 파종된 지지체 모두에서 이식 후, 시간이 지남에 따라서 계수가 커지는 경향을 보였다. 특히 1개월과 3개월 사이에서 크게 증가하였으며, 3개월과 6개월 사이에서는 큰 차이가 없었다. 파종하지 않은 지지체의 이식 후 6개월의 계수는 정상 반월상 연골의 59% 정도였으며, 파종한 지지체는 35%였다. 파종하지 않은 지지체가 파종한 지지체보다 더 큰 계수를 보였다. 정상 반월상 연골, 지지체 및 재생된 반월상 연골의 인장 계수(aggregate modulus)는 그림과 같다(도 18).

고찰

연구 목표에 대한 답

본 발명자들은 가토의 슬 관절에서 다공성 지지체를 이용한 반월상 연골 치환술을 실시하여, 6개월까지 추시 관찰하면서 조직학적, 생화학적 및 역학적 검사 상 반월상 연골의 재생을 확인하였다. 폴리카프로락톤 지지체는 조직 친화성은 우수하였으며, 반월상 연골의 재생에 긍정적 영향을 주는 것을 확인할 수 있었으나, 6개월까지 완전히 흡수되지 않고 남아 있었다. 동종 활액막 세포 파종은 부분적으로 반월상 연골 성숙을 촉진하였다.

연구 결과의 요약

외관 관찰 상, 반월상 연골은 시간이 지남에 따라 더 성숙하게 재생된 외관을 보였다. 하지만 6개월 추시 결과 재생된 반월상 연골은 정상 반월상 연골과 같은 육안 소견은 보여주지 못했다. 관절 연골의 퇴행성 변화는 시간이 지남에 따라 증가 되었으며, 특히 골극의 형성이 현저하였다. 퇴행성 변화의 정도는 반월상 연골 치환술의 여부에 따라서 큰 차이가 없었다.

조직학적 소견상, 조직 성장은 시간이 지남에 따라 비례적으로 진행되었으며, 반월상 연골로의분화를 보였다. 관절 연골의 퇴행성 변화는 시간이 지남에 따라 증가하였고, 반월상 연골 절제술을 실시한 개체에서 치환술을 시행한 개체보다 그 정도가 심하였다.

화학적 검사상 수분 함량, 콜라겐 함량, 프로테오글리칸 함량은 지속적으로 증가하였다. 정상적인 반월상 연골에서 수분 함량은 70-75%로 보고되었고, 콜라겐함량은 건조 중량의 60-70%로 보고되었다. 6개월 추시 관찰에서 콜라겐 함량이 전체 무게의 61.3%(정상 반월상 연골의 79.3%), 프로테오글리칸 함량이 정상 반월상 연골의 83%까지 증가한 것은 매우 고무적인 결과로 사료되었다.

역학적 검사상, 인장-변형률 곡선상에서 계수는 시간이 지남에 따라 증가하였다. 파종하지 않은 지지체의 경우 6개월에 총 인장 계수는 정상 반월상 연골의 65%이었다.

지지체의 조건

이상적인 지지체는 적절한 압축 계수, 다공성, 다공 크기를 가져야 한다. 조속한 조직 침투를 위해서 생체 재료의 부피 비는 가능한 작아야 하며, 완전한 침투를 위해서는 지지체가 크고 서로 연결되어 있는 다공의 균질한분포를 가져야 한다. 생체 재료의분해는 조직이 침투 및분화할 수 있는 시간적 여유를 가지도록 천천히 일어나야 한다. 이전 보고에서 초기의 기계적 물성이 새로 형성되는 재생 조직의 성질을 결정한다는 것이 알려졌으며, 150 kPa이 되지 않을 때에는 섬유 조직만이 형성되었다. 본 실험에 사용된 지지체는 100-150 ㎛ 크기의 다공을 가지며, 다공성이 90%이상이고, 압축 계수가 430 kPa까지로 매우 강할 뿐만 아니라, 봉합 강도도 2.4 Kg으로 우수한 물성을 가진 것을 확인할 수 있었다.

본 실험에서 지지체로 폴리카프로락톤은 지방족 폴리에스터(aliphatic polyester)의 일종으로, 생체 내에서 락타이드 산과 그리콜릭 산으로분해된다. 유사한 종류의 다른 생분해성 고분자로서는 폴리글라이콜릭 산(PGA, polyglycolic acid), 폴리락틱 산(PLA, polylactic acid), 폴리락틱-글라이콜릭 산(PLGA, polylactic-glycolic acid), 폴리다이옥사논(PDO, polydioxanone) 등이 있다. PCL은 유연한 성질이 뛰어난 고분자로서, 지지체 제조 시 봉합 강도가 크지만,분해 기간이 2년 이상이라는 단점이 있다. 본 실험에서 폴리카프로락톤을 선택한 이유는, 예비 실험에서 폴리다이옥사논를 이용하였을 때, 지지체 자체의 강도가 너무 약하여, 봉합 자체를 견디지 못할 정도로 실험 자체가 곤란할 정도였다는 것을 참고하여, 강도가 충분한 지지체를 선택하였다. 또한 본 폴리카프로락톤 지지체는 용매를 사용하지 않고 열과 압력만으로 제조 가능하며 다공 크기를 균일하게 제조함은 물론 지지체 바깥 표면까지 다공이 막힘없이 제조 가능하므로, 형태 제조에 있어 장점이 있다고 사료되었다. 또한 현재 미국식품의약국(FDA, food and drug administration)에서 생체에 이용 가능한 재료로 허가를 취득한 재료이다.

활액막 세포의 파종

조직 공학적 기법은 세포가 적절한 환경에서 지지체에서 증식하여 조직을 형 성하도록 하는 방법이다. 본 실험은 생체 내 실험이라는 실험 모델 상, 적절한 환경에 대한 관심보다 세포 및 지지체에 연구의 초점이 맞추어 졌으며, 지지체는 상기한 바와 같은 이유로 폴리카프로락톤으로 선택하였다. 전술한 바와 같이 활액막 세포는 반월상 연골 손상 등 관절 내 손상에서 치유에 중요한 역할을 한다는 것이 잘 알려져 있으며, 관절 연골 또는 섬유 연골로분화할 능력이 있는 것이 증명되었다. 또한 임상적으로도 최소 침습적인 관절경적 수술을 통하여 손쉽게 채취할 수 있으며, 채취 시 위험 및 정상 조직에 피해가 적다는 장점이 있어, 그 응용 및 치료적 적용에 많은 기대가 모아지고 있다. 반월상 연골 내의 섬유연골세포(fibrochondrocyte)의 경우,분화하기가 상대적으로 어렵고, 채취 시 정상 조직에 손상을 피할 수 없다는 단점이 있으며, 다른 줄기 세포의 경우, 반월상 연골에 존재하는 섬유연골세포로분화시키기 위한 조건이 확립되어 있지 않고, 안전성이 아직 입증되지 않았으며, 채취가 상대적으로 어렵다는 단점이 있다. 파종 후 생체 외 배양기간을 2주로 정한 것은, Yamasaki등이 쥐의 반월상 연골 스캐폴드와 골수 중간엽 줄기 세포를 이용한 실험에서 인 비트로 2 주 배양 이후에 강성에 차이가 없다는 것을 참고하였다.(Yamasaki, J Biomed Mater Res A, 2005)

실험 동물 및 수술 기법

본 실험에서는 생체 모델로서 가토를 사용하였다. 가토는 족부의 지면 지지 상 지행(Digitigrade)형 동물로 대퇴 과가 좁고 긴 형태로 슬관절의 골성 구조가 사람과 다른 면이 있고, 장 족지 신전근(EDL, extensor digitorum longus)이 대퇴골 외과(lateral femoral condyle)에서 기시하는 등 그 해부학적 구조가 사람과 다른 점이 있으며, 슬관절 완전 신전이 잘 되지 않는 등 슬관절에 가해지는 생역학적 환경이 사람과 다를 수 있다는 점을 참고하여야 하겠다. 반월상 연골의 전방 기시부도 사람과 달리 정중선을 지나 외측 경골과의 앞쪽까지 연결되어 있다. 기존의 연구에서 외측 반월상 연골 치환술을 시행한 보고도 있으나 (Tienen, Am J Sports Med, 2006) 장 족지 신전근(EDL)과 슬와근(popliteus)등의 장벽이 존재하여 수술 자체가 용이하지 않았음을 예상할 수 있겠다. 본 실험에서는 내측 측부 인대를 절개하여 쉽게 내측 반월상 연골을 노출시킬 수 있었다. 재생된 반월상 연골을 채취할 때, 반월상 연골이 관절면 밖으로 돌출된 모양인 경우가 있었다. 이는 좁은 관절면 안에서 후프 스트레스(hoop stress)에 적절히 대응할 만한 반월상 연골의 전각부와 후각부에서의 적절한 골성 고정(bony fixation)을 얻지 못한 것이 원인으로 사료된다. Tienen 등은 도그 모델에서 지지체의 전방 후방을 봉합사를 이용하여 경골에 풀-아웃 봉합(pull-out suture)을 실시하여 지지체에 장력을 주어 돌출을 방지한 방법으로 소개하였고, Chiari 등은 쉽 모델(Sheep model)에서 지지체의 전장에 봉합사를 통과시킨 후, 풀-아웃 봉합을 실시하여 지지체가 돌출되는 것을 방지하는 방법을 소개하였다. 하지만, 중소형 동물 모델에서 골 터널을 만들어 풀-아웃 봉합을 실시하는 것이 기술적으로 어려울 뿐만 아니라, 상대적으로 큰 상처를 남기게 되는 부작용이 있을 수 있다. 본 실험에서는 관절낭 및 내측 측부 인대(medial collateral ligament)를 튼튼히 봉합하여 지지체가 좁은 관절면 안에서 유지되도록 하였다. 지지체의 돌출을 방지하고, 재생 반월상 연골이 적절한 후프 스트레스(hoop stress)를 저항할 수 있도록 효과적인 고정 방법을 개발하 는 것이 필요할 것으로 사료되었다.

반월상 연골의 재생

조직학적으로 반월상 연골이 시간이 지남에 따라 성숙하면서, 조직 성장이 진행되는 것을 확인할 수 있었다. 조직 성장은 표면 일부분에서 안쪽 일부분으로 진행하였으며, 꼭 바깥부분에서 안쪽부분으로 진행하는 것이라고 할 수는 없었다. 매이슨-트리크롬 염색상 안으로 자라는 조직에 콜라겐 섬유가 풍부하게 존재하는 것을 확인할 수 있었으나, 콜라겐 섬유의 주변 패턴 배열을 확인하기는 어려웠다. 반월상 연골의 성숙과 리모델링은 더욱 최적화된 조건과 장기간의 추시 관찰이 필요할 것으로 사료되었다.

관절 연골의 보호 효과

반월상 연골 치료의 궁극적인 목적은 관절 연골의 보호 및 퇴행성 변화의 방지이다. 본 연구에서 반월상 연골 자체의 재생은 어느 정도 이루어졌지만, 관절 연골의 보호 효과가 현저하게 나타나지 않은 것은 아직 연구되어야 할 점들이 많은 것으로 생각할 수 있겠다. 이전의 연구에서도 유사한 결과를 보고한 경우가 많다. Tienen 등은 도그 모델에서 생분해성 에스탄 폴리머(Estane polymer)를 이용한 반월상 연골 대치물을 삽입한 개체에서 반월상 연골 제거술을 실시한 대조군 보다 관절 연골의 퇴행성 변화가 더 있음을 보고하였다(Tienen, Am J Sports Med, 2006). Kobayashi M은 토끼 모델에서 폴리비닐 알코올-하드로겔(polyvinyl alcohol-hydrogel : PVA-H)을 성분으로 하는 지지체를 사용한 반월상 연골 치환술이 6개월까지는 반월상 연골 제거술을 시행한 대조군보다 관절 연골의 퇴행성 변화 가 많았다. 하지만 이후에는 치환술 군의 퇴행성 변화는 진행하지 않은 반면, 제거술 군의 퇴행성 변화는 계속 진행하여, 1년 6개월 추시 결과상에서는 치환술 군보다 제거술 군의 퇴행성 변화가 더 심하다고 보고하였다(Kobayashi, Bio-medical materials and Engineering, 2004). 이러한 관절 연골 보호의 실패에 대한 원인으로는 지지체 재료의 한계, 수술 술기의 부족 등을 생각할 수 있겠으며, 향후 지속적 개발 및 개선이 필요하리라 사료되었다. 반면, 보바인 콜라겐(Bovine collagen)을 이용한 콜라겐 반월상 연골 이식물(Collagen meniscal implant : CMI)로 치환술을 시도하고 있는 그룹에서는 주로 반월상 연골의 재생 및 임상 적용에 대해 보고하고 있으나, 관절 연골의 보호 효과에 대해서는 보고가 희박하여 주의하여 해석하여야 할 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 정상정인 반월상 연골과 이식된 폴리머 스캐폴드의 이미지이다. (a) 내측 관절낭 절개를 실시하여 내측 반월상 연골이 있는 슬관절 내측 구획을 잘 보이게 하기 위하여 내측 측부 인대(medial collateral ligament) 및 내측 관절낭(medial capsule)을 횡으로 절개하였고, 내측 관절 구획을 벌리고 내측 반월상 연골을 전방으로 아탈구하여 전장을 노출하였다. (b) 내측 반월상 연골의 전방부 1/5을 남겨 놓고, 나머지 4/5부분을 반월상 연골과 관절낭의 접합부에서 제거 하였다. 지지체도 전방부 1/5을 제거하고, 제거된 반월상 연골 결손부에 크기와 모양을 맞추어 삽입하였다. 그 다음 지지체의 변연부와 관절낭 사이, 남아 있는 원래의 반월상 연골과 지지체의 전방부 사이를 봉합하였다. 삽입된 스캐폴드가 대퇴골 과와 경골과 사이에 위치하도록 슬개골을 포함한 슬관절을 원래의 위치로 정복하고, 절단한 내측 측부 인대와 내측 관절낭을 봉합하였다.

도 2는 (a) 정상적인 반월상 연골, (b) 정상적인 관절 연골 및 (c) 정상적인 관절 연골을 인디아 잉크로 염색한 모습이다.

도 3은 반월상 연골 지지체의 전체적인 모습을 나타낸 모습이다. 위에는 파종하지 않은 스캐폴드를 이식한 후 1, 3 및 6개월에 채취한 스캐폴드와 재생된 반월상 연골의 모습이다. 아래는 파종한 스캐폴드를 이식한 후 1, 3 및 6개월에 채취한 지지체와 재생된 반월상 연골의 모습이다.

도 4는 활액막 세포를 파종하지 않은 스캐폴드, 파종된 스캐폴드 및 반월상 연골 절제술을 시행한 토끼 경골의 관절 연골 모습을 나타낸 모습이다. 반월상 연골 치환술을 시행한 개체나 반월상 연골 절제술을 시행한 개체 모두 미란과 골극의 크기는 시간이 지남에 따라 증가된 모습을 나타내었다.

도 5는 활액막 세포를 파종하지 않은 스캐폴드, 파종된 지지체 및 반월상 연골 절제술만을 한 연골에 대해 각각 인디아 잉크로 염색한 모습이다. 결과적으로 시간이 지남에 따라 미란과 골극의 형성됨을 명확히 알 수 있었다.

도 6은 정상적인 반월상 연골과 관절 연골의 이미지이다. (a) 대퇴골-반월상 연골-경골로 구성된 부분을 매이슨-트리크롬(Masson's-trichrome staining)으로 염색한 모습, (b) 반월상 연골만을 매이슨-트리크롬으로 염색한 모습, (c) 관절 연골을 사프라닌-O(Safranin-O)로 염색한 모습( x 40), (d) 관절 연골을 매이슨-트리크롬으로 염색한 모습이다( x 100).

도 7은 (a) 활액막 세포를 파종하지 않은 반월상 연골을 이식, (b) 파종된 반월상 연골을 이식 및 (c) 반월상 연골 절제술만 한 각각의 대퇴부-반월상연골-경골 부분의 모습이며, 1, 3 및 6개월의 모습을 각각 나타낸 모습이다. (a), (b) 및 (c) 대부분의 모습에서 스캐폴드와 관절낭 사이의 접착된 모습을 보였으며, 조직 성장이 시간에 따라 진행되는 것을 알 수 있었다.

도 8은 활액막 세포를 파종하지 않은 스캐폴드(위)와 파종된 스캐폴드에서 재생된 반월상 연골(아래)을 각각 매이슨-트리크롬으로 염색한 모습이다. 또한 반월상 연골은 시간이 지남에 따라 조직 성장과 함께 성숙된 모습을 나타내었다.

도 9는 (a) 활액막 세포로 파종하지 않은 스캐폴드와 인접한 관절낭 사이의 결합된 모습을 1개월이 되었을 때 매이슨-트리크롬으로 염색한 모습, (b)활액막 세 포로 파종하지 않은 스캐폴드와 인접한 관절낭 사이의 결합된 모습을 3개월이 되었을 때 매이슨-트리크롬으로 염색한 모습 및 (c) 활액막 세포로 파종된 스캐폴드와 인접한 관절낭 사이의 결합된 모습을 3개월이 되었을 때 사프라닌-O로 염색한 모습이다.

도 10은 스캐폴드 표면을 따라 반월상 연골의 재생된 모습뿐만 아니라 스캐폴드 안으로 조직이 자라 들어가는 모습을 나타낸 이미지이며, 활액막 세포가 반월상 연골의 재생과 조직 성장에 중요한 역할을 한다고 추측할 수 있다.

도 11은 스캐폴드에 파종된 활액막 세포를 확인하기 위해 PKH-26로 염색한 모습이다. (a) 1, 3 및 6개월에 걸쳐 수거한 재생된 반월상 연골을 보기 위해 DAPI를 처리하여 세포핵을 파란색으로 염색하고, 공초점 현미경으로 본 모습이다. (b) 활액막 세포를 PKH-26로 염색하면 빨간색을 나타낸다. (c) 스캐폴드는 1개월에 조잡하게 배열되고, 점차적으로 조직이 안으로 자라나 스캐폴드를 대체하였다. (d) 반월상 연골의 핵을 염색한 것과 PKH-26으로 활액막 세포를 염색한 것을 혼합한 모습이고, 회색으로 보이는 부분은 스캐폴드의 모습이다.

도 12는 활액막 세포로 파종한 스캐폴, 파종하지 않는 스캐폴드 및 절제술만을 한 경우에 경골 관절 연골의 퇴행성을 나타낸 이미지이고, 이 3가지의 경우에 있어서 절제술만 한 경우가 가장 큰 퇴행성 변화를 나타내었다. 결과적으로 반월상 연골 이식술이 연골 보호에 큰 효과가 있다고 추측할 수 있다. 위에는 사프라닌-O로 염색한 모습이고, 아래는 매이슨-트리크롬으로 염색한 모습이다.

도 13은 활액막 세포로 파종하지 않는, 파종한 반월상 연골의 수분 함량을 1, 3 및 6개월에 걸쳐 측정한 결과이다. 파종이 되지 않은 스캐폴드를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 수분 함량은 전체 무게(wet weight)의 68.5%이었고, 1개월에 81.1%, 3개월에 82.4% 및 6개월에 80.3%를 나타내었다. 그리고 파종된 스캐폴드를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 수분 함량은 전체 무게(wet weight)의 63.8%였고, 1개월에 82.1%, 3개월에 81.7% 및 6개월에 79.4%를 나타내었다.

도 14는 활액막 세포로 파종하지 않는, 파종한 반월상 연골의 콜라겐 함량을 1, 3 및 6개월에 걸쳐 측정한 결과이다. 파종이 되지 않은 스캐폴드를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골 콜라겐 함량은 평균적으로 건조 중량의 77.3%이었고, 1개월에 49.1%, 3개월에 51.4% 및 6개월에 61.3%(정상의 79.3%)를 나타내었다. 그리고 파종된 스캐폴드를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 콜라겐 함량은 건조 중량의 79.4%였고, 1개월에 40.5%, 3개월에 43.3% 및 6개월에 47.2% (정상의 59.4%)를 나타내었다.

도 15는 활액막 세포로 파종하지 않는, 파종한 반월상 연골의 프로테오글리칸(glycosaminoglycan : GAG) 함량을 1, 3 및 6개월에 걸쳐 측정한 결과이다. 파종이 되지 않은 스캐폴드를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 프로데오글리칸 함량은 평균적으로 전체 무게 (wet weight)의 2.0%이었고, 1개월에 0.29%, 3개월에 0.09% 및 6개월에 0.30%(정상의 15%)를 나타내었다. 그리고 파종된 스캐폴드를 이식한 개체에서, 대조군인 정상 반월상 연골의 GAG함량은 전체 무게(wet weight)의 1.56%였고, 1개월에 0.70% 및 3개월에 0.58%, 6개월에 0.88%(정 상의 56.4%)를 나타내었다.

도 16은 정상적인 반월상 연골, 건조, 젖은 상태 및 활액막 세포로 파종된 스캐폴드의 응력-변형률 곡선이다. 결과적으로 건조 상태, 젖은 상태 및 활액막 세포 파종 상태에서 스캐폴드의 물성은 유의한 차이가 없었다.

도 17은 정상 반월상 연골 및 파종을 하거나 하지 않은 스캐폴드를 통해서 재생된 반월상 연골의 응력-변형률 곡선이다. 파종하지 않은 스캐폴드와 파종된 스캐폴드 모두에서 이식 후, 시간이 지남에 따라서 계수가 커지는 경향을 보였다. 특히 1개월과 3개월 사이에서 크게 증가하였으며, 3개월과 6개월 사이에서는 큰 차이가 없었다.

도 18은 정상적인 반월상 연골, 스케폴드, 혈액막 세포로 파종하지 않은 스케폴드 및 혈액막 세포로 파종한 스케폴드의 재생된 반월상 연골에 대한 총 인장 계수를 나타낸 결과이다. 전체적으로 시간에 지남에 따라 증가하는 모습을 보였다.

Claims (6)

1. (a) 콜라겐 타입 I이 흡착되어 있는 반월상 연골 모양의 다공성 생분해성 폴리카프로락톤(polycaprolactone: PCL) 지지체; 및 (b) 상기 지지체에 파종된 동종 활액막 세포를 포함하는 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 생분해성 폴리카프로락톤 지지체는 다공 크기가 100-150 ㎛이고, 80-95%의 다공성을 가지는 것을 특징으로 하는 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 생분해성 폴리카프로락톤 지지체는 380-460 kPa 압축강도를 가지고, 2.0-2.8 kg 봉합강도를 가지는 것을 특징으로 하는 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 생분해성 폴리카프로락톤 지지체는 1 x 10⁵ - 1 x 10⁶ 세포/지지체의 밀도의 동종 활액막 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 반월상 연골 치환용 다공성 생분해성 중합 이식물.
6. 삭제

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