KR100910982B1 - 당화헤모글로빈의 정량분석을 위한 시스템 및 이를 이용한당화헤모글로빈 측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 측방 유동 검정 스트립, 레이저 유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치를 포함하는 혈중 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈의 동시 검출 장치 및 이 장치를 이용하여 면역학적 방법으로 혈중 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈을 동시에 간편하게 측정하는 방법을 제공한다.

당화헤모글로빈, 헤모글로빈, 정량

Description

당화헤모글로빈의 정량분석을 위한 시스템 및 이를 이용한 당화헤모글로빈 측정 방법 {SYSTEM FOR THE QUANTITATIVE MEASUREMENT OF GLYCOHEMOGLOBIN AND A METHOD FOR MEASURING THE CONTENT OF GLYCOHEMOGLOBIN USING THE SAME}

본 발명은 혈액에 존재하는 당화헤모글로빈을 고감도로 정량할 수 있는 측방 유동 정량 검정 시스템 및 그 방법에 관한 것으로서, 특히 당화헤모글로빈과 총 헤모글로빈을 동시에 정량할 수 있는 일체형 정량 검정 방법 및 정량 시스템에 관한 것이다.

당뇨병은 체내에 흡수된 포도당을 제대로 사용하지 못하는 일종의 부적절한 탄수화물 대사로서, 혈액 내에 과다한 혈당을 가지게 되어 다양한 합병증을 유발할 수 있는 질환이다. 이는 크게 세가지로 분류되며, 대표적인 것은 제1형 당뇨병인 인슐린 의존성 당뇨병으로, 이자세포의 자가면역반응에 의하여 인슐린을 합성하거나 분비하는 기능을 상실하는 타입이라 할 수 있다. 다음으로 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병으로, 인슐린에 대한 체내 저항성 또는 부적절한 인슐린 분비 등에 의해 발병한다. 그 외에 임신 중 발생할 수 있는 태아당뇨병이 있다. 그러나 제 1형 당뇨병과 태아당뇨 형태의 당뇨병은 흔하지 않으며, 당뇨병 중 대부분은 제 2형 당뇨병으로서 선진국 당뇨질환 중 90-95%를 차지하고 있는 것으로 알려져 있다.

당뇨병을 진단하는 방법은 요당 측정, 혈중 포도당 측정 등 여러 가지가 있지만, 요당 측정은 신뢰할 수 없으며, 혈중 포도당 측정은 식사, 운동 등 여러 요인의 영향을 받아 부정확하므로 당뇨병을 관리하고 치료하기 위해서는 혈액 중 당화헤모글로빈을 측정하는 것이 효과적인 방법 중의 하나이다.

1986년 미국 당뇨협회에서 모든 형태의 당뇨병을 관리하기 위해 연간 2회씩의 당화헤모글로빈 측정을 제안함으로써　비교적 안정한 지표인 당화헤모글로빈의 양을 당뇨병 관리지표로 사용하기 시작하였고, 1993년 DCCT (Direct Control and Complication Trial, 당뇨 조절과 합병증 연구)에서 당화헤모글로빈의 농도와 당뇨합병증의 관계를 보고하면서 본격적으로 사용하였다.

당화헤모글로빈의 참고치 설정과 관련하여 ADA(American Diabetes Association, 미국 당뇨병 학회)에서는 DCCT 및 UKPDS(United Kingdom Prospective Diabetes Study, 영국 전향적 당뇨병 연구)의 보고서를 기초로 하여, 당화헤모글로빈 수치를 7% 이내로 관리할 것을 권고하고 있으며, 당화헤모글로빈 수치가 8% 이상인 경우 당뇨 관리의 재평가 및 적극적인 치료를 권고하고 있다. 2001년 미국 내분비 학회에서는 6.5%를 참고치로 제시하였는데 이는 6.5% 이상일 때도 당뇨망막증 의 발병율이 증가하는 것으로 UKPDS에서 보고한 결과를 참조한 것이다. 1999년 국제 당뇨협회(International Diabetes Federation, IDF)에서도 동일하게 당화헤모글로빈 6.5%를 참고치로 제시하고 있다.

DCCT 연구에 의하면, 1441명의 당뇨 질환자를 대상으로 6.5년 동안 임상 실험을 수행한 결과, 당뇨병의 집중적인 혈당 관리를 통하여 당뇨질환으로 인한 미세혈관 합병증을 상당히 감소시킬 수 있다고 한다. 따라서 당뇨 환자 또는 의사에게 있어서 지속적인 혈당 관리의 필요성이 대두된다.

성인의 헤모글로빈은 97%의 헤모글로빈A, 2.5%의 헤모글로빈A₂ 및 0.5%의 헤모글로빈F의 세 종류로 구성되어있다. 이 중 헤모글로빈A는 141개의 아미노산을 가진 두 개의 알파 체인과 146개의 아미노산을 가진 두 개의 베타 체인으로 이루어진 네 개의 폴리펩타이드 구조이다. 헤모글로빈A를 크로마토그래피법을 이용하여 분석해 보면 96%의 일반적인 헤모글로빈과 5~6%의 미량 헤모글로빈으로 구성되며, 이들 헤모글로빈을 통칭하여 헤모글로빈A1 또는 당화헤모글로빈이라고 한다. 헤모글로빈A1의 80%는 베타 사슬 N-말단의 발린 잔기에 글루코스가 결합된 구조이며 그 외 미량의 헤모글로빈A1a, 헤모글로빈A1b로 이루어져 있다.

단백질의 아미노기에 당 잔기가 비 효소적인 반응으로 결합하는 것을 당화과정이라 하며, 이 반응은 매우 점진적인 비가역적인 반응이다. 당화헤모글로빈은 헤모글로빈과 혈중 포도당의 결합에 의해 형성되고, 헤모글로빈과 당화헤모글로빈의 비율은 적혈구와 혈중 포도당의 노출 정도에 의해 결정된다. 구체적으로, 당화과정에서는 헤모글로빈A의 발린 잔기에 포도당이 결합하여 헤모글로빈A1c 전구물질을 형성하게 되며, 이는 아마도리 재배열 반응을 통해 안정적인 케토아민 결합을 가진 헤모글로빈A1c가 된다. 이때 혈액 내의 포도당 수치가 높아지면 포도당과 헤모글로빈의 접촉 빈도가 높아지고, 당화헤모글로빈의 비율도 증가하게 된다. 따라서 당화헤모글로빈의 비율로써 혈액 내 포도당 수치의 정확한 정량이 가능하다. 또한 적혈구의 수명은 60 내지 120일 정도이므로 비교적 긴 기간 동안 혈중 포도당 농도 변화를 모니터링 할 수 있다.

혈액 내의 당화헤모글로빈을 측정하기 위한 다양한 측정법이 개발되어 왔다. 현재 상업적으로 응용되고 있는 방법으로는 이온교환크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 전기영동법, 복합 착색법 등이 있다. 이러한 방법들은 사용 방법이 어려우며 복잡하고 숙련된 기술이 요구된다. 또한 일회성 임상분석 시스템의 기술개발 동향을 살펴보면, 원격, 재택 또는 현장검사를 위한 장비로 매우 유용하고 다양한 정량 방법이 제시되고 있으며, 그 종류는 육안 판독법, 광학 판독법, 전기화학 측정법 등이 있다.

최근 당화헤모글로빈의 N-말단 펩타이드 잔기를 인식할 수 있는 단일 항체 및 다중 항체가 개발된 이래(U.S. Pat. No.4,647,654), 이를 이용하여 당화헤모글로빈을 정량하는 면역학적 방법에 관한 많은 연구가 진행중이다. 면역학적 방법은 당화헤모글로빈을 인식하는 항체를 이용하기 때문에 특이도 및 민감도가 높다는 장점이 있다. 면역학적 방법을 사용하여 당화헤모글로빈의 양을 측정할 때에는 당화헤모글로빈의 당화된 특정 부위를 고감도로 인식할 수 있는 항체를 제작하는 것이 필수 요건이다. 혈중의 당화헤모글로빈은 당화된 부위가 외부로 노출되어있지 않으므로, 우선 항체가 이 부위를 인식할 수 있도록 당화헤모글로빈을 변형해야 하며, 다음으로 전체 헤모글로빈을 분광학적인 방법으로 측정하기 위해서 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 전환해야 한다. 메트헤모글로빈은 특정 파장을 흡수하는 특성이 있으므로 분광학적인 방법으로 흡수율을 측정하여 전체 헤모글로빈의 양을 정량할 수 있고, 또한 변형된 당화헤모글로빈을 면역학적인 방법으로 측정하여 혈중 당화헤모글로빈의 양을 측정할 수 있다.

면역학적 방법을 이용한 기구는 그 원리에 따라 유동 통과(Flow Through) 방식과 측방 유동(Lateral Flow) 방식으로 나누어진다. 유동 통과 방식은 항체가 공유결합 되어있는 다공성 매트릭스의 표면에 검체를 첨가하여 검체 내의 분석물질이 고정상의 항체와 결합하게 되고, 이후 이차 포획항체를 첨가하여 직접 눈으로 판독하거나 효소기질을 첨가하여 발색시키는 방식이다. 측방 유동 방식은 하나의 디바이스에 전 분석과정을 함유하는 방식과 검체 용액이 표지항체가 고정되어 있는 다공성 매트릭스 지역을 통과하면서 표지항체와 결합하는 방식이 있다.

측방 유동 분석 타입의 키트 구조를 살펴보면, 시료가 적용되는 시료 패드, 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출 패드, 시료가 이동 또는 분리되면서 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동할 수 있도 록 하는 흡수 패드로 구성되어 있다. 이와 같은 기존의 측방유동 분석법은 임신진단, 암진단, 미생물 탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있으나, 육안으로 판단이 이루어지기 때문에 정확한 양을 확인하기 어려운 점이 있다.

HbA1c에 대한 항체를 이용하여 면역학적인 방법으로 검사하는 제품은 대부분 혼탁도 검사방법이며, 이때 당화헤모글로빈의 베타 사슬의 N-말단 부분만이 항원 결정 부위이므로 항원-항체 복합체에 의한 응집반응이 매우 어렵다. 그러므로 여러 개의 항원 결정기로 이루어진 폴리합텐(polyhapten)을 항체와 반응시켜 불용성 면역 복합체를 만들고 이를 측정하는 혼탁도 검사 방법을 사용한다. 이는 검체 내에 당화헤모글로빈의 농도가 증가함에 따라 혼탁도가 감소하게 되는 일종의 경쟁반응이다. 이러한 검사방식은 여러 과정을 거쳐 결과를 얻을 수 있으므로 전문화된 검사실 및 자동화된 장비가 필요하다는 단점이 있다.

대한민국공개특허 2004-0018893에서는 당화헤모글로빈에 대한 항체를 포함하고 있는 완충용액, 헤모글로빈에 대한 항체를 포함하는 스트립 및 세척용액으로 구성된 당화혈색소 진단 키트에 대해 개시하고 있다. 상기 한국공개특허는 반정량 시스템에 관한 것으로, 당화헤모글로빈에 대한 항체에 염료를 첨가하여 당화혈색소가 존재하는 경우의 색상변화를 표준혈색소와 육안 또는 색상대조표에의해 판정하는 방식이므로 당화헤모글로빈의 양을 실제로 정확히 정량할 수 없다는 한계가 있다.

또한 면역진단법에 있어서 현재까지 정량화가 가능한 RIA 방법이나 ELISA 방법은 시료에서 분석물의 정량화를 위하여 효소를 처리하고 세척하는 등의 몇 단계를 거 쳐야 한다. 따라서 빠르고 간편하면서 고감도로 정량화가 가능한 일반적인 분석법이 필요하다.

면역학적 방법의 장점과 정량 분석의 필요성을 감안하여 이루어진 본 발명은 현장 분석용 당화헤모글로빈 측정 제품을 개발함으로써, 간단한 방법으로 효과적으로 혈중 당화헤모글로빈을 정량하여 당뇨병을 조기에 진단하여 당뇨 질환자에게 의심되는 당뇨 합병증의 예방 및 위험성을 최소화하고, 또한 의사 및 환자 스스로 정확하고 지속적으로 혈당을 관리할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 당화헤모글로빈과 총 헤모글로빈을 동시에 정량할 수 있는 일체형 정량시스템, 즉 당화헤모글로빈을 검정할 수 있는 측방 유동 검정 스트립, 항원분석물을 정량하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치 및 색소분석물을 정량하는 LED 검출 장치를 포함하는 일체형 정량시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역반응의 특이성 및 선택성을 이용하여, 일정량의 탐지자가 도입된 항원분석물을 포함하는 시료가 측방 유동 검정 스트립을 따라 이동하면서 시료중의 탐지자와 매질 상에 고정된 포획자와 경쟁적으로 항원항체 반응을 하며, 그 후 표지된 탐지자에의해 발생된 신호를 측정하고, 측방 유동 검정 스트립 상의 색소분석물의 양을 별로도 측정하여, 색소분석물의 양에 대한 항원분석물의 비율을 산출함으로써 시료 중 항원분석물을 정량하는 방법을 제공하는 것이다.

이상에서 설명한 바, 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립, 레이져유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치가 일체로 구성된 측방 유동 검정 시스템은 항원-항체 반응에 의해 효과적으로 당화헤모글로빈을 정량할 수 있는 방법을 제공하므로 당뇨환자를 비롯하여 지속적인 혈당의 관리가 필요한 환자들에게 매우 유용할 것으로 기대된다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 양태에서는, 지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 흡수 패드(absorption pad)를 포함하는 측방 유동 검정 스트립으로서, 상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 각각 샘플 패드와 흡수 패드가 서로 겹치지 않도록 접착되어 있으며; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 상기 크로마토그래피 매질 상에는 상기 샘플 패드로 부터 일정한 거리를 두고 포획자가 분주 고정되어 있는 측방 유동 정량 검정 스트립을 제공한다. 바람직하게 상기 스트립은 상기 샘플 패드와 크로마토그래피 매질 사이에 형광물질 표지된 탐지자가 흡착된 결합체 방출패드를 더 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 이 와 같은 스트립은 스트립의 오염 등을 방지하기 위해 시료의 적하 위치와 표면형광측정지역 및 LED 측정지역을 제외하고 스트립 전체를 감싸도록 구성된 스트립 하우징을 더 포함할 수 있다.

본원에서 용어 "액체 시료" 또는 "시료"는 분석물 또는 탐지자 및 분석물을 포함하는 분석대상 화합물 또는 조성물을 가리키며, 본 발명에서 사용될 수 있는 액체시료 또는 시료는 크로마토그래피매질을 이동할 수 있어야 하므로 액체상 또는 액체와 유사한 유동성 있는 물질을 말한다.

본원에서 용어 “분석물”은 시료 중의 분석 대상 화합물로서, 항원분석물 및 색소분석물을 포함한다. 또한 본원에서 용어 "색소분석물" 및 "항원분석물"은 각각 단백질 및 당화단백질로서, 특히 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈을 가리킨다. 항원분석물은 항원-항체반응에 관여하고, 색소분석물 및 항원분석물 모두는 본 발명에 따른 LED에 의해 신호를 발생시킨다.

본원에서 용어 "탐지자"는 상기 언급된 항원분석물에 대한 항체, 즉 바람직하게는 당화헤모글로빈에 대한 항체를 말하며, 더욱 바람직하게는 표면형광 물질로 표지되어 있다.

본원에서 용어 "포획자"는 시료 중의 항원분석물과 동일한 물질 또는 화합물이거나, 시료 중 항원분석물의 탐지자 인식 부위와 동일한 구조를 갖는 부분을 포함하는 물질로서, 당화단백질, 바람직하게는 인간의 당화헤모글로빈이며, 스트립상에 고정되어 스트립을 따라 이동하는 시료 중의 탐지자 단일체를 특이적, 선택적으 로 포획할 수 있는 것을 가리킨다.

또한 본원에서 용어 "표면형광"은 크로마토그래피를 이용한 측방 유동 검정스트립의 항원분석물 측정지역에 고정되는 형광물질 표지된 탐지자-분석물 복합체로부터 발광되는 형광, 또는 형광물질 표지된 탐지자로부터 발광되는 형광을 말한다.

본원에서 용어 "흡착"은 크로마토그래피 매질 또는 스트립을 구성하는 패드에 물질이 농축되어 붙어 있는 것을 말하며, 크로마토그래피의 이동상을 따라서 같이 이동할 수 있으나, 적절한 처리에 의해서 고정화될 수도 있다.

또한 본원에서 용어 "고정" 또는 "고정화"는 시료 또는 시약을 크로마토그래피 매질이나 스트립에 붙이는 것을 말하며, 특히 크로마토그래피의 이동상이나 용매에 녹지 않으며 상기 이동상이 이동하더라도 같이 이동하지 않고 고정된 자리에서 움직이지 않는 상태를 말한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 첫 번째 양태에 따른 측방 유동 검정 스트립, 상기 측방 유동 검정 스트립상의 표면형광 물질의 표면형광을 측정함으로써 항원분석물의 양을 결정하는 레이저-유발 표면형광 검출장치, 및 상기 측방 유동 검정 스트립 상의 색소분석물의 양을 결정하는 LED(light emitting diode) 검출장치를 포함하는, 시료 중의 항원분석물 및 색소분석물의 양을 동시에 측정할 수 있는 일체형 측방 유동 정량 검정 시스템을 제공한다.

구체적으로 상기 표면형광 검출장치는 레이저의 레이저빔 형상제어용 렌즈와 여기필터를 통과한 빛을 조사하여 이로부터 반사된 빛을 포집렌즈에 통과시켜 평행광을 형성하고, 이 평행광을 형광필터에 통과시켜 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분광만 집광렌즈로 입사시키고, 이 집광렌즈에 의해 형광성분광이 공간필터의 중심으로 집속되며, 상기 공간필터에서 순수한 형광성분 광 이외의 빛이 제거된 광만이 광검출기로 입사되며, 광검출기로 입사된 광은 아날로그 디지털 컨버터(ADC)를 통해 CPU로 전달되어 상기 복합체의 형광 양을 표준 형광양에 대하여 상대적으로 비교하여 항원분석물의 양을 결정한다.

또한 LED 검출장치는 색소 분석물의 양에 따라 LED 광원에 의한 빛이 흡수 및 산란되는 광량이 다른 것을 이용하여 색소분석물의 양을 측정한다. 구체적으로 LED 광원에 의한 빛을 고른 분포로 분석물에 조사시키고, 분석물에 의해 산란된 빛은 광축 전방에 위치한 공간 필터에 의해 색소분석물에 의한 산란광만을 통과시키고, 이 산란광은 광검출기로 입사된다. 광검출기로 검출된 광신호는 ADC를 통해 CPU로 전달되어 시료의 색소분석물의 양을 결정하게 된다.

또 다른 양태로서 본 발명은, 상기 본 발명에 따른 일체형 측방 유동 정량 검정 시스템을 이용하여 혈액 중 당화헤모글로빈의 양을 측정하는 방법을 제공한다.

구체적으로 상기 방법은, 측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드 상에 항원분석물 및 색소분석물이 함유된 것으로 예상되는 시료를 적하하여 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 이동되도록 하고, 시료의 적하 전 또는 이동 중에 시료에 일 정량의 탐지자를 도입함으로써 제 1 면역반응에 의해 탐지자-항원분석물의 결합체를 형성하고, 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 전개함에 따라 샘플 패드로부터 일정 거리에 위치한 크로마토그래피 매질 상에 고정된 포획자와 상기 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단일체가 경쟁적으로 제 2 면역 반응에 의해 결합체를 형성하면서 이동하도록 하고, 경쟁반응 후 크로마토그래피 매질 상에 고정된 포획자에 결합된 탐지자의 양과, 이와 별개로 크로마토그래피 매질 상의 색소분석물의 양을 각각 측정함으로써 시료중의 분석물에 대한 항원분석물의 비율을 결정하여 시료 중의 항원분석물을 정량하는 측방 유동 정량 검정 방법을 제공한다.

바람직하게 상기 일정량의 탐지자는 형광물질로 표지되어 있으며, 시료의 적하 전에 액체시료에 혼합되는 방식으로 도입되거나, 또는 측방 유동 검정 스트립이 결합체 방출 패드를 포함하는 경우 결합체 방출 패드에 흡착되어, 시료가 적하되어 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 상기 결합체 방출 패드를 통과하는 과정에서 시료에 용해 및/또는 혼합되는 방식으로 도입될 수 있다. 이에 따라 탐지자가 시료 중 항원분석물과 결합하여 형광물질 표지된 탐지자-항원분석물 결합체를 형성하거나 시료 중에 항원 분석물이 없거나 부족한 경우 탐지자 단일체의 형태로 크로마토그래피 매질을 따라 이동한다.

상기 포획자는 크로마토그래피 매질 상에 시료의 적하 지점으로부터 시료가 전개되는 방향으로 일정 간격 떨어진 위치(이하, '항원분석물 측정지역'이라 함)에 분주 고정되어, 포획자가 고정되어 있는 지역으로 유입되는 시료 중의 탐지자 단일체 및/또는 탐지자-항원분석물 결합체와 탐지자-포획자 결합체를 형성한다. 이에 따라 탐지자의 표면형광 물질을 탐지하는 레이저유발 표면 형광 검출 장치는 상기 항원분석물 측정지역에서 발생하는 표면 형광 신호에 의해 항원분석물, 즉 탐지자와 결합된 당화헤모글로빈의 양을 측정한다.

한편, 크로마토그래피매질 상의 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈은 색소분석물을 탐지하는 LED에 의해 측정되며, 측정된 색소분석물의 농도에 대한 항원분석물의 농도 비율을 산출하여 시료중의 항원분석물의 양을 정량하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립, 레이져-유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치가 일체로 구성된 측방 유동 정량 검정 시스템 및 이를 이용하여 혈액 중 총 헤모글로빈의 양 및 당화헤모글로빈의 양을 동시에 특정하는 방법을 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 측방 유동 검정 스트립의 모식도 로서, 상기 스트립은 지지대(101), 샘플 패드(102), 결합체 방출패드(103), 크로마토그래피 매질(104) 및 흡수 패드(105)를 포함한다. 측방 유동 검정 스트립을 구성하는 각 구성요소를 자세히 설명하면 다음과 같다.

지지대( backing card )

지지대(101)는 스트립의 모든 구성요소를 지지하고 있으며, 지지대가 생략되는 경우에는 크로마토그래피 매질(104) 자체가 지지대가 될 수 있다. 지지대는 보 통 수불용성, 비다공성 및 경직성이고, 보통은 지지대 위에서 시료를 전개하는 패드의 길이와 너비가 동일하나 보다 크거나 작을 수 있다. 지지대는 다양한 천연 및 합성의 유기 및 무기 재료를 사용할 수 있으나, 다만 흡수 물질의 모세 작용을 방해하거나, 분석물과 비특이적으로 결합하거나, 분석물과 탐지자의 반응을 방해해서는 안된다. 지지대로 사용가능한 대표적인 중합체로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 유리, 세라믹, 금속 등이 포함된다.

일반적으로 지지대 위에는 접착제가 코팅되어 각종 패드가 부착된다. 적절한 접착제의 선택은 스트립의 성능을 개선하고 수명을 연장하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립에 사용되는 것으로는 감압성 접착제(pressure-sensitive adhesive, PSA)가 대표적이다. 전형적인 측방 유동 검정 스트립에서 각종 패드의 결합은 접착제가 패드의 기공 내로 침투하고 이에 따라 패드가 지지대와 함께 결합함으로써 달성된다. 이와 같이 접착제가 정상적인 조건하에서 이동하는 과정을 콜드 플로우(cold flow)라고 한다. PSA를 패드에 적층하는 과정에서는 가열을 하지 않기 때문에 어느 정도의 콜드 플로우는 패드와 지지대 사이의 결합이 형성되기 위해서는 필수적이다. 콜드 플로우의 정도가 너무 낮으면 스트립의 저장 기간 동안에 함께 결합되어 있는 패드 내로 접착제가 이동하여 기공이 차단되거나 소수성 얼룩이 형성되거나 패드의 재습윤 문제가 발생할 수 있다. 이러한 접착제의 콜드 플로우와 연관된 문제는 직접-주조막을 사용함으로써 해결될 수 있다. 이러한 막은 지지플라스틱 시트에 의해 접착제가 막의 기공으로 들어가는 것을 차단해 주기 때문에 저장 기간 동안에 접착제의 상하이동을 예방할 수 있다.

샘플 패드( sample pad )

샘플 패드(102)는 스트립의 한쪽 말단에 위치하며, 샘플 패드의 한쪽 말단은 크로마토그래피 매질(104) 또는 결합체 방출 패드(103)를 추가적으로 포함하는 경우에는 결합체 방출 패드의 일부와 적층된다.

원칙적으로 샘플 패드는 분석물이 함유된 시료를 접수하는 역할을 한다. 이러한 기능에 더하여, 샘플 패드는 시료중의 불용성 입자를 여과하는 기능을 가질 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 샘플 패드는 여과 기능을 부가하는 재질인 셀룰로스 소재의 여과지 또는 유리 섬유 여과지가 바람직하며, 본원 실시예에서는 S & S사가 공급하는 등급 903의 셀룰로스 여과지를 사용하였다.

샘플 패드는 그 재질에 시료 중의 분석물이 비특이적으로 흡착되는 것을 막고, 동시에 시료의 성분들이 크로마토그래피 매질을 통해 용이하게 이동할 수 있도록 보조하기 위해서, 그리고 반응의 감도를 유지하고 형광물질 표지된 탐지자와 시료의 성분 사이에 이루어질 수 있는 원하지 않는 비특이적 반응을 최대한 방지하기 위하여 전처리하는 것이 바람직하다. 샘플 패드는 보통 불활성 단백질 또는 계면활성제로 전처리한다. 불활성 단백질로는 0.1 내지 10% 소 혈청 알부민(BAS) 함유 0.1M 트리스 완충액(pH 6 내지 9) 중의 0.1% 내지 10% 탈지유분의 용액 및/또는 0.1% 내지 10% 카제인 용액이 사용될 수 있고, 계면활성제로는 트리톤 X-100 또는 트윈 20이 사용될 수 있다. 그러나 이러한 전처리의 결정은 분석물 및 시료의 종류에 따라 결정될 것이다.

결합체 방출 패드( conjugate releasing pad )

측방 유동 검정 스트립은 선택적으로 결합체 방출 패드(103)를 포함할 수 있다. 이때, 결합체 방출 패드의 한쪽 말단의 일부는 샘플 패드(102)에, 다른 한쪽 말단의 일부는 크로마토그래피 매질(104)에 적층되어 지지대(101)에 부착된다.

결합체 방출 패드에는 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성할 수 있는 형광물질 표지된 탐지자가 흡착될 수 있다. 탐지자는 패드에 고정된 것이 아니라 단순히 흡착되어 있으므로 시료 중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성한 후, 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 전개, 이동됨에 따라 함께 이동한다.

결합체 방출 패드에 시약을 흡착시키는 방법은 본원 출원 이전에 이미 다양하게 이루어져 있는 통상의 방법에 의해서 이루어질 수 있다. 구체적인 예로는 침지(impregnation process), 건조 또는 동결건조를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

결합체 방출 패드는 신속한 여과 속도와 함께 양호한 입자 보유를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 것으로는 폴리에스테르와 같은 합성소재 및 유리 섬유 필터가 사용될 수 있다. 일반적으로 유리를 주성분으로 하는 유리 섬유 및 폴리에스테르를 사용할 수 있으며, 본원 실시예에서는 S & S사가 공급하는 유리 섬유를 사용하였다. 이들은 생물학적으로 불활성이고 천연 소재보다 정교한 섬유질을 갖고 있기 때문에 수성 시약이나 시료가 투입되었을 때 뒤틀리거나 팽창하지 않는다. 바람직하게는, 결합체 방출 패드는 이에 분석물과 형광물질 표지된 탐지자가 비특이적으로 흡착되는 것을 방지하면서 결합체의 방출과 이동이 원활히 이루어질 수 있도록 계면활성제와 같은 시약으로 전처리한다.

결합체 방출 패드의 성능 향상 및 안정성을 위해서 안정화제 및 차단제가 사용될 수 있다. 안정화제의 예로는 수크로즈, 트레할로즈와 같은 당류를 들 수 있으며, 차단제로는 BSA(소혈청알부민), 젤라틴, 카세인, 탈지유 등의 단백질류를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

크로마토그래피 매질

크로마토그래피 매질(104)의 양 말단의 일부에는 각각 샘플 패드(102)와 흡수 패드(105)가, 결합체 방출 패드를 추가적으로 포함하는 경우에는 각각 결합체 방출 패드(103)와 흡수 패드(105)가 서로 겹치지 않게 적층되어 있다.

크로마토그래피 매질은 지지대(101)에 부착될 수 있다. 다른 방법으로서, 크로마토그래피 매질은 그 자체가 지지대가 될 수 있다.

크로마토그래피 매질은 바람직하게는 액체 시료, 분석물 등이 모세관력에 의해 신속하게 이동하여 그 위에 고정된 포획자에 도달될 수 있도록 하는 것이면 어느 것이든 사용될 수 있으며, 다만, 균일한 특성을 갖는 것이 바람직하다. 일반적으로 크로마토그래피 매질은 모세관력에 반응하여 수성 매질에 의해 이동하기 쉽고 기공이 0.1μ 이상, 바람직하게는 1.0μ 이상인 다공성 물질을 가리킨다. 이러한 물질은 일반적으로 친수성이거나 친수성으로 될 수 있으며, 그 예로는 무기 분말(예를 들면, 필터지, 크로마토그래피지 등과 같은 섬유 함유 지), 또는 합성 또는 변형된 천연 중합체(예를 들어, 니트트로셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 가교된 텍스트란, 아가로즈, 폴리아크릴레이트 등)가 포함된다. 상기 예시된 물질은 단독으로 사용되거나 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로는 세라믹 물질을 들 수 있다.

또한 크로마토그래피 매질은 다작용성이거나 다작용성으로 변형시켜 포획자와 공유결합을 가능하게 할 수 있다.

상기와 같은 성질을 갖는 크로마토그래피 매질은, 예를 들면, S&S 사의 AE98, AE99 및 AE100, Millipore 사의 HF090, HF120, HF135, HF180 및 HF240 및 Sartorius사의 CN90, CN140 및 CN200 등이 있다. 이중 바람직한 크로마토그래피 매질은 CN90 막(제조사 Satorius)이다. CN90 막은 증류수가 매질을 타고 일정 거리를 오르는데 걸리는 유속의 변화 폭이 ± 3초로서 작기 때문에 재현성이 뛰어나며, 매질의 단위면적(㎠)당 리간드가 결합할 수 있는 결합능이 10 내지 30㎍ 정도로 높은 편은 아니지만 형광 표지물질의 증폭이 뛰어난 탓에 그 정도의 결합능으로도 충분하다.

크로마토그래피 매질 상에는 당화헤모글로빈 측정을 위하여 항체나 HbA1c 항원이 포획자로서 특정 위치(항원분석물 측정지역)에 분주되어 있으며, 따라서 상기 위치에서 발생하는 형광의 양을 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 의해 측정함으로써 당화헤모글로빈을 정량할 수 있다.

흡수 패드( absorption pad )

측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드가 부착된 말단과 반대 방향의 말단에는 크로마토그래피 매질의 일부와 적층되어 흡수 패드(105)가 위치하고 있다.

흡수 패드는 모세관 작용에 의헤 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 온 시료를 물리적으로 흡수하고 미반응 물질을 제거하기 위한 수단이다. 즉, 흡수 패드는 측방 유동 검정 스트립의 말단에 위치하면서 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 오는 시료 및 시약의 속도를 조절 및 촉진하고 이를 담아두는 펌프 또는 저장소로서 작용한다. 시료 및 시약의 이동 속도는 흡수 패드의 질 및 크기에 따라 다를 수 있으며, 보통 사용되는 흡수 패드는 셀룰로즈 여과지, 부직물, 천 또는 셀룰로즈 아세테이트와 같은 물-흡수 재질로부터 형성된 것들이다.

도 2는 본 발명에 의한 따른 일체형 정량 검정 시스템의 모식도이다. 본 발명에 따른 일체형 정량 검정 시스템은 상술한 측방 유동 검정 스트립(100), 레이저 유발 표면형광 검출 장치(200), LED 검출 장치(300) 및 구동장치를 포함한다. 또한 본 발명에 따른 일체형 정량 검정 시스템에 사용되는 레이저 유발 표면형광 검출 장치(200) 및 LED 검출 장치(300)의 모식도를 각각 도 3-A 와 도 3-B에 나타내었다. 이하, 상기 일체형 정량 검정 시스템을 구성하는 레이저-유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치에 대해 자세히 설명한다.

레이저-유발 표면형광 검출 장치

레이저-유발 표면형광 검출 장치(도 3-A)는 레이저(201), 레이저빔 형상제어용 렌즈(202), 여기필터, 포집렌즈(203), 형광필터(204), 집광렌즈(205), 공간필터(206), 광검출기(207), 아날로그디지털 컨버터(ADC) 및 중앙처리장치(CPU)를 포함한다. 레이져 유발 표면형광 검출 장치는 본원 출원인에 의한 등록특허 10-0639776에서 사용된 레이져 유발 표면형광 검출 장치와 동일한 것을 사용할 수 있다. 레이져 유발 표면형광 검출 장치는, 점광원 또는 선형으로 가공된 레이져 광원의 빛이 여기 필터를 통과한 뒤 시료에 입사되고, 이 위치에서 시료 중 타겟 물질에 부착된 염료에 의해 형광을 발광하면, 포집렌즈, 형광필터 및 집광렌즈에 의해 공간필터의 중심으로 집속되어 광검출기 도달하게 되며, 도달된 신호는 아날로그 디지털 컨버터(ADC) 및 중앙처리장치(CPU)에 의해 환산되어 출력된다.

레이저 유발 표면형광 검출 장치는 항원분석물, 즉, 바람직하게 혈액 중 당화헤모글로빈의 정량에 사용된다. 광원인 레이저와 항원분석물과 특이적으로 결합하는 탐지자의 표면에 표지된 물질이 반응하여 생성되는 형광을 광학계에 의하여 포집하여 디텍터(detector)에서 정량화한다. 즉, 액체 시료를 투하한 후 일정 시간이 지나 면역반응이 끝나면 구동장치에 의해 스트립이 일정한 속도로 광원방향으로 이동하며, 이 스캐닝 과정에서 레이저에 의하여 생성되는 형광을 디텍터에 의하여 측정한다. 바람직하게는 스트립이 이동함에 따라 항원분석물 측정지역에서 발생하는 신호를 수회 포집하여 정량화한다.

LED 검출 장치

분석물 내의 총헤모글로빈 양을 광학적으로 측정하기 위해 본 발명에서는 LED 검출장치(도 3-B)를 사용한다. 면역반응에 관여하는 형광물질과 달리, 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈은 원래 적색을 띄므로 녹색 LED(green-LED)를 광원으로 사용한다. 즉, 필요한 광원은 458 내지 612 ㎚의 가우시안 형태의 스펙트럼을 가지고 있는 green-LED이며, 액체 시료가 적하된 구획 또는 크로마토그래피 매질 상의 색소분석물 측정지역(107)에서 반사되는 빛의 양을 실리콘 다이오드로 측정하도록 광학계를 디자인한다. 형광을 측정하는 방식과 유사하게 스캐닝 방식을 사용하며, 광원을 조사하여 반사되는 전체 광량을 단시간 내에 측정한다.

상기 설명한 바와 같은 본 발명에 따른 측방 유동 검정 시스템을 이용하여 시료 중 항원분석물을 정량하는 방법을 역시 도면을 참조하여 보다 자세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 측방 유동 정량 검정에 사용되는 스트립의 모식도를 나타낸다. 본 발명에 따른 항원분석물의 정량은 액체 시료를 본 발명에 따른 스트립에 적하함으로써 시작된다. 액체 시료는 샘플 패드(102)에, 바람직하게는 샘플투입구(109)를 통해 적하된다. 시료가 샘플 패드로 적하되면 모세관현상에 의해서 이 동하게 되고, 그 이동 속도는 흡수 패드의 재질, 크기 등에 영향을 받을 수 있다.

이때 시료의 적하 전 또는 이동 중에 시료에 일정량의 탐지자가 도입되면 제 1면역반응이 일어나 결합체를 형성하게 되는데, 그 방식은 전술한바와 같이 두 가지이다. 첫 번째 방식은, 액체 시료를 검체로부터 채취한 후, 정량을 실시하기 전에 시료에 직접 일정량의 표지된 탐지자를 첨가하고, 이에 따라 액체 시료중의 항원분석물과 탐지자의 제 1의 면역 반응을 마친 액체 시료를 스트립에 적하하는 것이다. 이와 대체적으로 사용될 수 있는 두 번째 방식은, 미리 형광물질 표지된 탐지자를 결합체 방출 패드(103)에 흡착시켜 제조한 결합체 방출 패드를 포함하는 스트립에 액체시료를 적하하는 것이다. 이때 탐지자는 결합체 방출 패드 상에 흡착되어 있으나, 시료가 적하되어 결합체 방출 패드로 유입되면 용매 또는 액체시료에 용해 및/또는 혼합되어 항원분석물과 제 1의 면역반응이 일어나게 된다. 상기 방식 어느 것이나 이용될 수 있으나, 여러 종류의 탐지자를 적용하여 분석하는 것이 쉬울 뿐 아니라 총헤모글로빈 측정도 용이하기 때문에 첫 번째 방식이 바람직하다.

탐지자는 액체 시료 중 다른 색소분석물에는 결합하지 않으나 항원분석물인 당화헤모글로빈에 특이적으로 결합하는 항체로서, 본원 출원일 전에 공지된 다양한 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직하게는, 마우스 단일클론항체를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 탐지자는 상술한 시료에의 도입 방식과 무관하게, 신호 발생원인이 되는 형광물질로 표지된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 제 1 면역반응의 결과, 형광물질 표지된 탐지자-항원분석물 결합체가 형성되어 크로마토그래피 매질(104)을 따라 이동하며, 항원분석물과 결합하지 못한 탐지자는 단독체로서 스트립을 따라 이동하여 항원분석물 측정지역(106)에 도달하게 된다.

항원분석물 측정지역은 시료 적하지점인 샘플 패드로 부터 일정한 거리에 위치하고 있으며, 일정량의 포획자가 고정되어 있다. 상기 포획자는 당화헤모글로빈 이거나 또는 상기 탐지자를 인식할 수 있는 화합물로서, 항원분석물 측정지역에 고정되어 있기 때문에 액체시료가 스트립을 따라 전개되어도 시료를 따라 같이 이동하지 않는다. 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단독체를 포함하는 시료가 포획자가 고정된 지역에 도달하면 탐지자, 탐지자-항원분석물 결합체 및 포획자 사이에서 경쟁적으로 제 2 면역반응이 일어나며, 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 상기 포획자가 고정된 지역(항원분석물 측정지역)에서 형광물질 표지된 탐지자-포획자 결합체에 의해 발생한 신호를 수집한다.

또한 시료는 계속 스트립을 따라 이동하면서 색소분석물 측정지역(107)을 통과한다. 색소분석물 측정지역은 특정되어 있는 것이 아니고 포획자가 고정된 지역이 아니라면 스트립상의 어느 위치든지 될 수 있으며, 바람직하게는 샘플 패드 또는 스트립 하우징(110)에 형성된 검사창(108)을 통해 노출된 스트립의 특정 부분 일 수 있다. 색소분석물 측정지역에서는 헤모글로빈의 적색에 반응하는 LED에 의해서 총헤모글로빈의 양이 측정된다. 그리고나서, 항원분석물 측정지역 및 색소분석물 측정지역을 통과한 시료는 흡수 패드(150)에 저장된다.

항원분석물의 정량을 위해서는 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈의 표준곡선의 작성이 필요한데, 이는 농도가 확인된 전혈(whole blood) 검체를 사용하며, 이때 농도는 당해 기술분야에 알려진 다양한 방법에 의해 측정할 수 있다. 준비된 전혈 검체를 본 발명에 따른 스트립에 적하하여 레이저유발 표면형광 검출 장치에 의해서 형광을 측정하여 표준곡선을 작성한다.

본 발명은 이하 실시예를 통해서 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 단지 예시하는 것으로 이해되어야하며, 본 발명이 이들 실시예로 한정되어서는 안된다.

실시예 1 : 단백질-형광물질 결합체 제조

측정하고자 하는 항원분석물인 당화헤모글로빈(HbA1c)에 대한 마우스 단일클론 항체에 신호 발생원인 형광물질을 다음과 같은 방법으로 중합하였다. 형광물질을 부착할 단백질은 95% 이상의 고순도로 정제된 것을 사용하였으며, 농도는 1mg/ml 이상의 농도가 좋은 결합비율을 보여 주었다. 형광물질과의 반응을 용이하게 하기 위하여 정제된 단백질을 암모니아나 아민이온이 들어 있지 않은 완충용액(0.1M 중탄산나트륨, pH 8.5)으로 4℃ 냉장실에서 12 내지 24시간 동안 투석하였다. 투석된 단백질은 사용하기 전까지 영하 20℃이하 냉동고에 보관하였다. 완충용액에서 투석된 단백질에 분말로 된 Alexa 647 형광물질(Molecular Probes, USA)을 직접 첨가하여 천천히 섞어 준 후 4℃ 냉장고에서 1 내지 2시간 동안 교반기를 사용하여 반응시켰다.

실시예 2 : 단백질-형광물질 결합체의 정제

세파덱스(Sephadex) G-25를 충전한 분배 컬럼을 사용하여 단백질/형광물질 중합체와 반응하지 않고 남아있는 여분의 형광물질을 제거하였으며, 정제 완충용액은 0.1M 중탄산나트륨(pH 8.5)를 사용하였다. 정제된 단백질/형광물질 중합체는 사용하기 전까지 냉장 또는 영하 20℃이하 냉동고에 보관하였다.

실시예 3 : 니트로셀룰로스 막에 포획자의 고정

주사기 펌프에 연결된 미세 분주기(Biodot Dispenser)를 이용하여 포획자인 HbA1c를 가는 선의 형태로 농도와 분주량을 달리하여 니트로셀룰로스 막위에 분주하였다. 분주한 이후에 온도 25℃, 습도 35~50%로 유지되는 제습 장치 안에서 2시간 동안 분주된 단백질을 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 1% 수크로즈, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다. 위의 안정액 성분중에서 BSA는 젤라틴으로 트윈 20은 트리톤 X-100으로 수크로즈는 트레할로즈(trehalose)로 PVA(폴리비닐알코올)는 PEG 또는 PVP(폴리비닐피롤리돈)로 각각 대체하여 사용할 수도 있다. 처리된 막 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 건조된 막은 마찬가지로 25℃, RH 35 내지 50%가 유지되는 보관용기 안에서 사용 전까지 보관하였다.

실시예 4 : 샘플 패드의 전처리

니트로셀룰로스 막을 통한 용액 성분들의 이동을 용이하게 하며, 또한 반응의 감도를 유지하고 단백질/형광물질 중합체와 시료 사이의 비특이적 반응에 의한 시험결과의 오류를 막기 위하여 샘플 패드를 전처리 하였다.

샘플 패드(2.5 × 30 cm)를 1ml의 전처리 용액(20mM 트리스-Cl, 0.1% 트리톤 X-100, 0.05% NaN3, pH 8.5)에 충분히 적셔 10분간 평형화시켰다. 전혈을 시료로 사용할 경우에는 다른 전처리 용액(PBS, 10mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.05% NaN3, pH 7.4)을 사용하여 적혈구 용혈현상을 방지하였다. 이어 샘플 패드의 과도한 용액을 제거하고 열에 의한 샘플 패드의 변형을 막기 위해 50℃ 내지 60℃의 온도에서 1시간 동안 진공 건조하였다. 단백질/형광물질 결합체의 변성을 최소화하기 위하여 동결건조방법을 택하였다. 준비된 패드는 위의 막과 동일한 조건의 보관용기에서 사용하기 전까지 보관하였다.

실시예 5 : 당화헤모글로빈 측정용 형광 면역 크로마토그라피 스트립의 제조

나이트로셀루로즈 막(NC 막)과 샘플 패드, 흡수 패드, 지지대를 460mm의 크기의 스트립을 1회용 카세트에 조립하였다. 포획자인 휴먼 당화헤모글로빈 2mg/ml을 분주기(Bio Dot dispenser)를 사용하여 0.88ul/cm의 양으로 선의 폭을 0.8mm가 되도록 NC 막 위에 분주한 후, RH 35~50%에서 2시간 동안 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다(위의 안정액 성분 중 BSA는 젤라틴으로, 트윈 20은 트리톤 X-100으로, 수크로즈는 트레할로즈로, PVA는 PEG 나 PVP로 각각 대체하여 사용할 수도 있다). 처리된 막은 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 시험에 사용할 막은 샘플 패드와 흡수 패드 등을 포개어 붙인 후 절단기를 사용하여 4mm 폭으로 잘라 최종 스트립의 크기가 4 × 60mm이 되도록 하였다.

NC막 상에 내부 표준 기능으로서 streptavidin(3g/L)의 대조선을 미세분주기(Bio-Dot, Irvine, CA, USA)를 사용하여 두께 1mm에 1㎕/cm 의 양으로 분주하였다. 제조된 스트립은 형광측정장치(laser-fluorescence scanner)의 투입구(holder)에 맞게 제작된 1회용 카세트(16x90 mm)에 조립하여 제습실에서 제습상태로 포장한 후 사용하기 전까지 실온에서 보관하였다.

실시예 6 : 탐지자 완충용액의 준비

기존의 측방 유동 크로마토그라피법에서 사용되는 방식인 탐지자를 결합체 방출 패드에 고정하는 방식 대신 액체 상태로 새로운 튜브에 보관하여 사용하였다. 이는 채취한 혈액의 양이 5㎕에 불과해 전개막 위해서 이동을 유발하기에는 모자라는 부피여서 첨가해야 할 완충용액이 필요하여 이 방식을 활용하였다. 사용된 완충용액으로는 1% BSA가 첨가된 PBS를 사용하였다.

실시예 7 : 적혈구 용혈 용액의 제조

10mM Kpi 용액 1L에 포타슘페리시아나이드 50g을 녹인 후 적혈구 용혈을 위 하여 디지토닌을 100mg을 첨가 하여 pH 7.4의 용액을 제조하였다. 제조된 용액을 0.45um 멤브래인 필터를 사용하여 멸균하였으며 사용하기 전까지 냉암소에 보관하였다.

실시 예 8 : LED 검출 시스템을 이용한 헤모글로빈의 표준곡선 작성

헤모글로빈 측정을 위한 표준 물질로는 기존의 헤모글로빈 생화학 측정법으로 농도가 확인된 전혈 검체를 사용하였다. 준비된 용액을 당화헤모글로빈 측정용 스트립에 첨가하여 당화헤모글로빈과 헤모글로빈을 동시에　측정할 수 있도록 제작된 기기에서 헤모글로빈 값을 측정하여 표준 곡선을 작성하였다. 실리콘 다이오드에 의하여 측정된 헤모글로빈 농도는 기존의 생화학 측정법과 비교하였더니 완전히 일치함을 확인할 수 있었다. 농도 의존적인 실험 결과를 도 4에 나타내었다. 측정된 농도값은 기존 방법과 상관도에서 R2 값이 0.98이상으로 거의 완벽하게 일치함을 알 수 있었고 재현성을 보여 주는 CV% 값이 3% 이내로 매우 신뢰성이 높은 방법을 한 번 더 확인해 주었다.

실시 예 9 : 면역크로마토그라피 방법을 이용한 당화헤모글로빈 표준곡선 작성

당화헤모글로빈 검출 용액은 BSA-biotin 접합체(0.1g/L)와 anti-HbA1c 항체(4ug/ml)로 만들었으며, 당화헤모글로빈 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml 각각을 검출용액과 1:1 비율로 혼합한 후 준비된 카세트의 샘플 투입구에 75㎕를 적하하였다. 혼합 용액이 적하된 카드리지는 실온에서 12분간 반응시킨 후 형광 검출기를 사용하여 형광의 양을 측정하였다. 스트립의 검사선과 대조선에서 측정된 결과를 준비된 프로그램을 사용하여 면적 값(검사선: A_T, 대조선: A_C)으로 전환 한 다음 A_T/A_C의 면적 비를 사용하여 측정된 항원들의 농도로 계산한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 따르면 당화헤모글로빈의 농도에 따른 면적값이 농도의존적으로 비례하였고 이 표준곡선을 사용하여 HbA1c%값을 알아내었다. 시험결과 HbA1c의 농도와 상관성이 R값이 0.99로 아주 높았으며 CV% 값도 5% 정도로 낮았다.

실시예 10 : 기존 HbA1c 측정장치와의 실 검체 비교시험

HPLC 측정 방법인 Bio-Rad Variant II 장비로 당화헤모글로빈 값을 확인 한 다음 본 발명에서 준비된 당화헤모글로빈 측정 시스템을 사용하여 실 검체를 측정하여 그 측정 값을 비교하였다. 결과치를 비교한 자료를 도 6에 나타내었다. 본 발명에서 사용한 면역분석법과 HPLC법은 원리적으로는 전혀 다른 방법이지만 상관도 R값은 0.96으로 두 방법이 매우 비슷한 결과를 보여 주었다.

도 1은 본 발명에 따라 혈중 헤모글로빈을 정량하기 위한 일체형 정량 시스템의 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 측방 유동 정량 검정 스트립의 모식도이다.

도 3A는 레이져 유발 표면 형광장치를 이용한 당화헤모글로빈 측정용 광학계의 모식도이고, 도 3B는 LED를 이용한 총 헤모글로빈 측정용 광학계의 모식도이다.

도 4는 LED 측정 시스템을 이용한 헤모글로빈 표준곡선이다.

도 5는 당화헤모글로빈의 표준곡선이다.

도 6은 기존의 대형 장비와 본 발명에 따른 정량 시스템의 성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

※ 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

100 : 측방 유동 정량 스트립 101 : 지지대

102 : 샘플 패드 103 : 결합체 방출 패드

104 : 크로마토그래피 매질 105 : 흡수 패드

106: 항원분석물 측정지역 107 : 색소분석물 측정지역

108 : 검사창(window) 109 : 샘플 투입구

110: 스트립 하우징

200 : 레이저-유발 표면 형광 검출장치 201 : 레이저

202 : 레이저빔 형상 제어용 렌즈 203 : 포집렌즈

204 : 형광필터 205 : 집광렌즈

206 : 공간필터 207 : 광검출기

300 : LED 검출장치 301 : LED 광원

302 : 구경(aperture) 303 : 포토 디텍터

Claims (18)

1. 지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 흡수 패드(absorption pad)를 포함하는 측방 유동 검정 스트립으로서,

   상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 서로 겹치지 않도록 샘플 패드와 흡수 패드가 접착되어 있고; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 그 위에는 상기 샘플 패드로부터 일정한 거리를 두고 시료 내의 분석물 중 하나와 실질적으로 동일한 성분으로 이루어져 시료 내의 분석물과 항원-항체 반응으로 결합하는 물질과 경쟁적 면역반응에 의해 결합하는 물질인 포획자가 분주 고정되어 있으며; 상기 포획자는 당화헤모글로빈인 것을 특징으로 하는 측방 유동 검정 스트립.
2. 제1항에 있어서, 한쪽 말단은 샘플 패드와 겹쳐지고 다른 쪽 말단은 크로마토그래피 매질에 겹쳐지며, 분석물 중 하나와 항원-항체반응에의해 선택적으로 결합할 수 있는 물질인 탐지자가 흡착된 결합체 방출 패드(conjugate release pad)를 더 포함하는 측방 유동 검정 스트립.
3. 삭제
4. 제2항에 있어서, 탐지자는 항-당화헤모글로빈 항체인 측방 유동 검정 스트립.
5. 제4항에 있어서, 탐지자가 표면형광 표지된 항-당화헤모글로빈 항체인 측방유동 검정 스트립.
6. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 측방 유동 검정 스트립과, 상기 스트립 상의 포획자 고정 위치에서 표면 형광 신호를 검출하기 위한 레이저-유발 표면형광 검출장치, 및 분석물 내 색소를 띄는 분석물을 검출하기 위한 LED 검출 장치를 포함하는, 분석물 중 항원-항체 반응에 의해 검출되는 항원분석물과 색소에 의해 검출되는 색소분석물을 동시에 측정할 수 있는 일체형 정량 검정 시스템.
7. 제6항에 있어서, 상기 LED 검출 장치는 458 내지 612 nm의 범위에서 선택되 는 광원을 사용하는 것인 일체형 정량 검정 시스템.
8. 삭제
9. 제6항에 있어서 탐지자는 항-당화헤모글로빈 항체인 일체형 정량 검정 시스템.
10. 제6항에 있어서, 항원분석물은 당화헤모글로빈이고, 색소분석물은 당화되거나 당화되지 않은 헤모글로빈인 일체형 정량 검정 시스템.
11. 시료 중의 항원 분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드 상에 항원분석물 및 색소분석물이 함유된 것으로 예상되는 시료를 적하하여 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 이동되도록 하되, 시료의 적하 전 시료에 일정량의 탐지자를 도입함으로써 면역반응에 의해 탐지자-항원분석물 결합체를 형성하도록 하고, 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 전개함에 따라 크로마토그래피 매질 상에 분주된 포획자와 상기 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단일체가 경쟁적으로 면역반응에 의해 결합체를 형성하면서 이동하도록 하며, 그 후 크로마토그래피 매질상에 포획자가 고정된 위치에서 레이저-유발 표면형광 검출장치에 의해 포획자에 결합된 탐지자의 농도를 측정하고, 이와 별개로 크로마토그래피매질 상의 색소분석물의 농도를 LED 검출장치에 의해 측정하는 단계를 포함하고,

    상기 측방 유동 검정 스트립은 지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 흡수 패드(absorption pad)를 포함하고,

    상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 서로 겹치지 않도록 샘플 패드와 흡수 패드가 접착되어 있고; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 그 위에는 상기 샘플 패드로부터 일정한 거리를 두고 시료 내의 분석물 중 하나와 실질적으로 동일한 성분으로 이루어져 시료 내의 분석물과 항원-항체 반응으로 결합하는 물질과 경쟁적 면역반응에 의해 결합하는 물질인 포획자가 분주 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 시료 중의 항원 분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법.
12. 시료 중의 항원분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드 상에 항원분석물 및 색소분석물이 함유된 것으로 예상되는 시료를 적하하여 시료가 결합체 방출 패드를 통과하는 과정에서 탐지자-항원분석물 결합체를 형성하도록 하고, 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 전개함에 따라 크로마토그래피 매질 상에 분주된 포획자와 상기 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단일체가 경쟁적으로 면역반응에 의해 결합체를 형성하면서 이동하도록 하며, 그 후 크로마토그래피 매질상에 포획자가 고정된 위치에서 레이저-유발 표면형광 검출장치에 의해 포획자에 결합된 탐지자의 농도를 측정하고, 이와 별개로 크로마토그래피매질 상의 색소분석물의 농도를 LED 검출장치에 의해 측정하는 단계를 포함하고,

    상기 측방 유동 검정 스트립은 지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium), 흡수 패드(absorption pad) 및 결합체 방출 패드를 포함하고,

    상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 서로 겹치지 않도록 샘플 패드와 흡수 패드가 접착되어 있고; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 그 위에는 상기 샘플 패드로부터 일정한 거리를 두고 시료 내의 분석물 중 하나와 실질적으로 동일한 성분으로 이루어져 시료 내의 분석물과 항원-항체 반응으로 결합하는 물질과 경쟁적 면역반응에 의해 결합하는 물질인 포획자가 분주 고정되어 있으며; 상기 결합체 방출 패드의 한쪽 말단은 샘플 패드와 겹쳐지고 다른 쪽 말단은 크로마토그래피 매질에 겹쳐지며, 분석물 중 하나와 항원-항체 반응에 의해 선택적으로 결합할 수 있는 물질인 탐지자가 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 시료중의 항원분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 탐지자는 형광물질 표지된 것인 방법.
14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 검출된 색소분석물 농도에 대한 항원분석물 농도의 비율을 산출함으로써 시료 중의 항원분석물을 정량하는 것을 더 포함하는 방법.
15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 항원분석물은 당화헤모글로빈이고, 색소분석물은 당화되거나 당화되지 않은 헤모글로빈인 방법.
16. 제15항에 있어서, 탐지자는 항-당화헤모글로빈 항체인 방법.
17. 제15항에 있어서, 포획자는 당화헤모글로빈인 방법.
18. 제16항에 있어서, 포획자는 당화헤모글로빈인 방법.

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