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KR100887822B1 - 락토바실러스 루테리 균주를 이용하여 포유동물에서 면역기능을 향상시키는 방법 - Google Patents

락토바실러스 루테리 균주를 이용하여 포유동물에서 면역기능을 향상시키는 방법 Download PDF

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KR100887822B1
KR100887822B1 KR1020057004087A KR20057004087A KR100887822B1 KR 100887822 B1 KR100887822 B1 KR 100887822B1 KR 1020057004087 A KR1020057004087 A KR 1020057004087A KR 20057004087 A KR20057004087 A KR 20057004087A KR 100887822 B1 KR100887822 B1 KR 100887822B1
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바이오가이아 에이비
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Abstract

본 발명은 면역강화제로서 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주의 용도, 이런 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주를 함유하는 산물, 이런 산물을 이용하여 포유동물에서 면역-기능을 향상시키는 방법에 관한다. 이들 선별된 균주는 우수한 독소 결합과 중화 효과 및 우수한 CD4+ 세포 동원을 보인다.
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)

Description

락토바실러스 루테리 균주를 이용하여 포유동물에서 면역 기능을 향상시키는 방법{METHOD OF IMPROVING IMMUNE FUNCTION IN MAMMALS USING LACTOBACILLUS REUTERI STRAINS}
본 발명은 면역강화제로서 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주의 용도 및 이런 목적에 가장 적합한 균주를 선별하는 개선된 방법에 관한다.
항생제-저항성 병원균의 급증으로 인하여, 다양한 위장 미생물을 함유하는 생균제가 제조되고 있다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 비롯한 다양한 락토바실러스 종(Lactobacillus species)이 생균제 제조에 이용되고 있다. 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)는 동물의 위장관에서 자연적으로 발생하고, 통상적으로 건강한 동물의 장에서 발견된다. 이는 항생 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(U.S. Patent No. 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238, 5,849,289). 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 세포는 글리세롤의 존재하에 혐기성 조건에서 배양되면, 루테린(β-하이드록시-프로피온알데하이드)으로 알려진 항균 물질을 생산한다.
면역조절 활성 역시 락토바실러스 루테리(L. reuteri)와 연관한다(“Biotherapeutic effects of probiotic bacteria on candidiasis in immunodeficient mice”, Wagner RD, et al. Infect Immune 1997 Oct 65:4165-72). 하지만, 균주간에 효능의 차이가 존재하기 때문에, 가장 효과적인 균주를 선별하는 방법, 예를 들면, 본 발명에 제시된 CD4+ 세포를 이용하여 균주를 선별하는 방법이 요구된다.
게다가, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)가 전반적으로 유익한 생균제로서 사용되는 것으로 알려져 있긴 하지만, 선행 기술에서는 위장관에 이미 존재하는 병원균에 의해 생산된 독성을 중화하는 락토바실러스(Lactobacillus) 균주를 가장 효율적으로 이용하는 중요성을 인식하지 못하였다(“Removal of common Fusarium toxins in vitro by strains of Lactobacillus and Propionibacterium”, El-Nezami HS, et al, Food Addit Contain 2002 Jul 19:680). 본 발명에 따르면, 결합을 비롯한 이런 독소 중화는 이들 독소 발생 병원균에 의해 유발된 직접적인 효과를 완화시킬 뿐만 아니라 면역계에 대한 전반적인 부담을 감소시키는 데에도 중요하다.
병원성 미생물에 의해 유발되는 위장관 문제는 다수의 서로 다른 원인에 의해 유발된다. 가령, 헬리코박터 파일로리(Helicobacteri pylori)는 위궤양과 십이지장궤양 및 위 점막-결합된 림프 조직 림프종을 유발한다. 특정 병원성 대장균(Escherichia coli) 균주는 항생제의 효과를 무력화시키는 대장균(E. coli) 0157:H7에 의해 생산된 베로 독소(V)와 같은 독소를 생산한다.
이런 이유로, 본 발명의 목적은 CD4+ 세포 동원과 독소 중화 모두에 유효한 것으로 확인된 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주를 이용하여 포유 동물에서 면역-기능을 향상시키는 방법을 제시하고, 이런 면역-향상 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주를 선별하는 방법을 제시하며, 이런 균주를 함유하는 산물을 제시하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 이들 독소의 면역 부담을 감소시키는데 효과적인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주의 배양 상층액을 이용하는 방법을 제시하는 것이다.
다른 목적과 이점은 아래의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명확하다.
본 발명의 요약
본 발명은 면역강화제로서 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주의 용도, 이런 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주를 함유하는 산물, 이런 산물을 이용하여 포유동물에서 면역-기능을 향상시키는 방법에 관한다. 이들 선별된 균주는 우수한 독소 결합과 중화 효과 및 우수한 CD4+ 세포 동원을 보인다. 본 발명의 다른 목적과 특징은 아래의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명확하다.
도 1. 경쟁 ELISA를 통하여 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액에서 베로 독소(VT)와 Gb3 수용체의 결합에 대한 저해 활성의 확인. 각각은 Gb3으로 코팅된 평판에서 아래와 같이 반응시키고, 이후 VT에 대한 mAb를 이용하여 ELISA를 실행하였다.
대조: VT + 카세인 대두 소화 액체 배지(TSB).
VT + G: VT + 250 mM 글리세롤 용액.
VT + LRS: VT + 250 mM 글리세롤 용액에서 배양된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액.
본 발명은 포유동물에서 면역-기능을 향상시키는 조성물의 생산에 이용되고 우수한 독소 결합과 중화 효과 및 우수한 CD4+ 세포 동원을 보이는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주의 용도에 관한다. 또한, 본 발명은 이런 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주를 함유하는 산물 및 이런 산물을 이용하여 포유동물에서 면역-기능을 향상시키는 방법에 관한다. 이에 더하여, 본 발명은 이런 면역-향상 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주를 선별하는 방법에 관한다.
사이토킨은 생체반응 조절물질로서 기능하는 면역계 단백질이다. 이들은 항체와 T 세포 면역계 상호작용을 조정하고 면역 반응성을 증폭시킨다(10). 사이토킨에는 대식세포에 의해 합성되는 모노카인(monokine) 및 활성화된 T 림프구와 자연 킬러(NK) 세포에 의해 생산되는 림포카인이 포함된다. 사람과 생쥐 모두에서 CD4+ 부분집합은 사이토킨 생산과 주효체 기능에 기초한다. Th1 세포는 인터페론-감마(INF-γ), IL-2, 종양 괴사 인자(TNF)를 합성한다. 이들은 세포내 미생물에 대항하고 지연형 과민 반응을 유도하는 세포 면역을 주도적으로 담당한다. 이들은 면역글로불린 G2a(IgG2a) 합성 및 항체 의존성 세포 매개된 세포독성에 영향을 준다. 이들이 생산하는 INF-γ은 대식세포를 활성화시키고, 결과적으로 식세포작용을 유도한다. Th2 세포는 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-13(IL-13)을 합성한다. 이들은 IgE와 IgG1 항체 반응; 비만 세포 및 호산구 성장과 분화 인자의 합성에 의한 점막 면역; IgA 합성의 조장을 유도한다.
본 발명은 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주를 투여하고, 이런 균주를 분석하며, CD4+ 세포 동원과 독소 중화 모두에서 이런 균주의 효능을 확인하는 다양하고 전형적인 단계를 포함하는 방법을 포괄한다. 데이터는 예로써 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 함유하는 정제 제제가 세포 배양액의 직접 투여에서와 유사한 위장 군체형성(colonization) 수준을 제공한다는 것을 지시한다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 군체형성은 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 섭취와 관련되고, 청소 기간(washout period)(락토바실러스 루테리(L. reuteri) 수준이 섭취-이전 수준으로 하락하는데 걸리는 시간)은 정제 투여이후 적어도 28일인데, 이는 본 발명이 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 세포 배양액뿐만 아니라 이런 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양액을 함유하는 산물에도 적용될 수 있음을 입증한다.
적절하게는, 본 발명은 포유동물에서 면역-기능의 예방적 향상을 위한 생균제로서 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주를 함유하는 산물의 용도에 관한다. 이런 산물은 선별된 균주의 세포를 함유하는 다양한 식료품, 예를 들면, 식이 보조제, 과자 또는 정제일 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주는 독소를 생산하는 다양한 미생물, 예를 들면, 대장균(Echericia coli)의 치료를 위한 약물의 제조에도 이용될 수 있다. 따라서, 장출혈성 대장균(E. coli)과 VT 독소가 치료될 수 있다.
본 발명에 따라, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주의 세포 및 이들의 세포 배양액은 예방적 생균-유형 제약학적 조성물의 생산에 이용될 수 있다.
본 발명에 따라, 우수한 CD4+ 세포 동원 및/또는 우수한 독소 결합을 보이는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주를 이용할 수 있다. CD4+ 세포가 존재하는 지는 예로써 면역조직화학적 방법(예, 실시예 5) 또는 면역형광 방법으로 CD4에 대한 항체를 이용하여 검사할 수 있다. 독소 결합은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 세포 또는 상층액을 독소와 접촉시키고 이용가능 독소에서 차이를 검사함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 예방적 생균-유형 제약학적 산물은 영양학적 또는 제약학적 용도에 적합한 첨가제와 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명의 특징은 아래의 실시예를 참고하면 더욱 분명하지만, 이들 실시예는 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예 1. 베로 독소 연구
3가지 유산균 박테리아 균주: 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC 55730, 락토바실러스 불가리스(L. bulgaricus) 균주 LB12(CHR, Horsholm, Denmark), 락토 바실러스 카제이(L. casei) 균주 01(CHR, Horsholm, Denmark)이 본 실험에 이용되었다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 MRS 액체배지(+ 20 mM 글루코오스)에 접종한 이후 굴기성 고정 조건하에 37℃에서 24-48시간동안 배양하였다. 일부 경우에, 최초 배양이후 2,500 rpm에서 30분동안 원심분리하고, 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세척하여 배지 성분을 제거하며, 250 mM 글리세롤 용액에 부유시키고, 굴기성 고정 조건하에 37℃에서 6시간동안 배양하였다. 락토바실러스 불가리스(L. bulgaricus)와 락토바실러스 카제이(L. casei)는 굴기성 고정 조건하에 37℃에서 24-48시간동안 MRS + 20 mM 글루코오스(글리세롤 없음)에 배양하였다. 각 검사 유산균 박테리아는 2 g/30 ㎖(건조 중량)으로 조정하고, 배양이후 2,500 rpm에서 30분동안 원심분리하며, 상층액을 회수하고, NaOH로 pH를 7.0으로 조정하여 베로 세포(하기 참조)를 접종하며, 2.0 ㎛ 필터에 여과한 이후 이용하였다. pH 7.0로 조정된 글리세롤 용액과 MRS 액체배지는 2.0 ㎛ 필터에 여과한 이후 대조로 이용하였다.
베로 세포(African Green Monkey 신장 세포, ATCC - CCL81)는 37℃, 10% C02 배양기에서, 25 g/㎖ 젠타마이신(Sigma)의 10% 소 태아 혈청(FBS, Sigma)으로 보충된 최소 필수 배지(MEM, Sigma)에 48시간동안 배양하고, 단층 형성을 확인한 이후 이용하였다.
VT1과 VT2 모두를 분비하는 대장균(Escherichia coli) 0157:H7(ATCC 43894)은 카세인 대두 소화 액체 배지(TSB)에 접종하고, 37℃, 교반 배양기에서 교반하면 서 24시간동안 배양하며, 2,500 rpm에서 30분동안 원심분리하고, 배양 상층액을 여과한 이후 이용하였다.
500 베로 세포(2 x 1O5 세포/㎖)는 96-웰 평판에 접종하고, 37℃, 10% C02 배양기에서 48시간동안 배양하여 단층의 형성을 확인하며, 이후 아래의 치료물질을 실험하였다: A: VT 단독(양성 대조); B: TSB(대장균(Escherichia coli) 0157:H7 배양 배지); C: MRS 액체 배지(검사 유산균 박테리아); D: 글리세롤 용액(락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 배지); E: VT + MRS 액체 배지; F: VT + 글리세롤 용액; G: VT + 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 글리세롤 용액 배양 상층액; H: VT + 락토바실러스 불가리스(L. bulgaricus)의 MRS 액체 배지 배양 상층액; I: VT + 락토바실러스 불가리스(L. bulgaricus) 배양 상층액; J: VT + 락토바실러스 카제이(L. casei) 배양 상층액. 치료물질 B, C, D는 각 배양액 자체가 베로 세포에 독성을 유발하는 지를 결정하게 된다; E와 F는 검사 유산균 박테리아의 배양 배지가 자체적으로 VT에 중화 능력을 갖는 지를 결정하게 된다. G, H, I, J에서 검사 유산균 박테리아의 각 배양 상층액은 2x 연속 희석하고, 검사 유산균 박테리아의 각 희석된 배양 상층액과 VT는 각각 400 ㎖ + 100 ㎖; 300 ㎖ + 200 ㎖; 200 ㎖ + 300 ㎖; 100 ㎖ + 400 ㎖로 합치고, 이후 37℃, 10% C02 배양기에서 18시간동안 배양하여 세포변성 효과(CPE)가 나타나는 지를 확인하였다.
250 mM 글리세롤 용액에 녹인 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 배양액에루테린 생산을 저해하는 300 mM 중화된 세미칼바지드 염산염(Sigma)을 첨가하여 루 테린 생산을 억제하고, 상기한 바와 같이 상층액을 수집하였다. 100 ㎕ 베로 세포는 96-웰 평판에 접종하고 37℃, 10% C02 배양기에서 24시간동안 배양하여 단층의 형성 여부를 검사하고, 이후 아래의 치료물질을 실험하였다: A: VT 단독; B: VT + 25 mM 글리세롤 용액; C: VT + 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 글리세롤 용액 배양 상층액; D: VT + 루테린 저해물질 처리이후 접종된 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 글리세롤 용액 배양 상층액. B, C, D에서 글리세롤 용액과 루테린 저해물질로 처리되거나 처리되지 않은 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 각 배양액은 VT와 각각 20 + 80 ㎕; 30 + 70 ㎕; 40 + 60 ㎕; 50 + 50 ㎕; 60 + 40 ㎕; 70 + 30 ㎕; 80 + 20 ㎕로 혼합하고, 이후 37℃, 10% C02 배양기에서 18시간동안 배양하여 세포변성 효과가 나타나는 지를 검사하였다. 현미경 관찰이후, 배양액은 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 이들의 O.D.(흡광도) 값은 490 nm에서 판독하였다.
96-웰 평판은 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단된 Gb3(글로보트리아오실세라미드)(Sigma)으로 코팅되고, VT 또는 VT + 250 mM 글리세롤 용액에서 배양된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액과 반응시켰다. 이후, VT에 대한 단클론 항체(mAb)를 일차 항체로 이용하였는데, 여기에 양고추냉이 과산화효소(HRP)-공액된 염소 항-생쥐 IgG를 첨가하고, 이의 흡광도(O.D.)는 O-페닐렌 디아민의 발색이후, ELISA 판독기를 통하여 490 nm에서 판독하였다. 상기 실험은 락토바실러스 루테리(L. reuteri)와 Gb3 수용체 사이의 상호작용을 저해하는 물질의 존재를 입증하였다.
VT와 250 mM 글리세롤 용액 사이의 상호작용 및 VT와 Gb3으로 코팅이후 글리세롤 용액에 배양된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액 사이의 상호작용의 결과로부터, VT와 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액의 조합은 도 1에 도시된 바와 같이 VT 단독과 비교하여 유의하게 낮은 O.D. 값을 보였다. 이는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액에서 VT와 Gb3 수용체의 결합을 저해하는 물질의 존재가 간접적으로 감지될 수 있음을 의미한다.
96-웰 평판은 VT/NT + 250 mM 글리세롤 용액에서 배양되고 3% BSA로 차단되며 VT와 반응된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액으로 코팅하였다. 이후, VT에 대한 단클론 항체(mAb)를 일차 항체로 이용하였는데, 여기에 양고추냉이 과산화효소(HRP)-공액된 염소 항-생쥐 IgG(H+L)를 첨가하고, 이의 흡광도(O.D.)는 O-페닐렌 디아민의 발색이후, ELISA 판독기를 통하여 490 nm에서 판독하였다. 상기 실험은 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 상층액에서 VT와 상호작용하는 물질의 존재를 입증하였다.
실시예 2: 대장균( E. coli ) 0157:H7에 의해 분비된 베로 독소(VT) I과 Ⅱ에 대한 유산균 박테리아의 중화 효과 조사
TSB, MRS 액체 배지, 글리세롤 용액을 베로 세포에 첨가하면, 세포변성 효과는 관찰되지 않았다. 이에 더하여, VT와 MRS 액체 배지/글리세롤 용액 모두를 베로 세포에 첨가하면, 베로 세포에서 CPE가 관찰되었는데, 이는 상기 배양액 자체에 VT에 대한 중화 활성이 부재함을 입증한다.
검사 유산균 박테리아의 각 세포 배양 상층액을 pH 7.0으로 조정하고 여과하며 VT와 결합시키면, 표 1에 도시된 결과가 관찰되었다. 락토바실러스 불가리스(L. bulgaricus)와 락토바실러스 카제이(L. casei)는 전체 농도 범위에서 CPE가 나타난 반면, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 4:1의 검사 유산균 박테리아 대 VT의 비율에서 훨씬 낮은 CPE가 나타나긴 하지만 대부분의 글리세롤 상층액에서 CPE가 나타나지 않았다. 따라서, 250 mM 글리세롤 용액에서 배양된 배양 상층액의 VT에 대하여 인식가능한 중화 능력이 존재하였다. MRS 액체 배지(+20 mM 글루코오스)에서 배양하면, 모든 농도에서 CPE가 나타났다.
표 1. 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 불가리스(L. bulgaricus), 락토바실러스 카제이(L. casei)의 배양 상층액에서 베로 독소(VT)에 의한 베로 세포의 세포변성 효과(CPE)에 대한 저해 능력의 비교
Figure 112005012606217-pct00001
* 250 mM 글리세롤 용액에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 배양한 이후 수득된 배양 상층액
** MRS 액체 배지(+ 20 mM 글루코오스)에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 배양한 이후 수득된 배양 상층액
- CPE(세포변형 효과) 없음
+ CPE
a 경미한 CPE
경쟁 ELISA 및 VT와 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양 상층액 사이의 결합 분석의 결과는 Microcal Origin 6.1(Microcal Software, Inc., Boston, MA) 프로그램을 이용하여 스튜던트 검증을 실행하였다.
실시예 3. 락토바실러스 루테리( L. reuteri )의 피험자 투여
본 실시예에서, 피험자에 1 x 108 CFU(콜로니-형성 단위)의 락토바실러스 루테리(L. reuteri)(SD2112: ATCC 55730)를 함유하는 2알의 츄잉 정제를 일일 2회 제공하여 4 x 1O8 CFU 일일 총량(total daily dose)의 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 제공하였다. 정제에 사용된 모든 다른 부형제는 공지되어 있고 국제 약전을 충족하였다. 본 연구는 두 부분으로 진행되었다: 상부 위장관을 조사하는 위 내시경 및 원위 소장을 조사하는 회장내시경 검사(아래 참조). 배제 기준은 아래와 같았다: 연구 2주전과 연구 동안 항생제 복용; 연구 3주전과 연구 동안 생균제 복용, 이후 위장 관련된 약물로 치료; 정기적인 치료를 요하는 심각한 기관 질환(예, 암). 환자 치료를 위한 프로토콜은 Danish Ethical Committee로부터 승인을 받았고 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)을 준수하였다. 본 연구는 덴마크에서 진행되었다.
윌콕슨 부호-순위 검정(Wilcoxon signed-rank test)을 이용하여 증상, 혈액 검사 수치, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 분변 함량, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 섭취 전후에 조직학적 차이를 비교하였다. P < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
모든 피험자가 연구를 완결하였다. 위내시경 검사에서, 18세 이상의 식사 습관이 정상적인 10명의 건강한 지원자를 조사하였다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 섭취에 앞서 0일에, 연구의 종결 시점인 28일에 하룻밤동안 단식이후 위십이지장내시경 검사를 실행하였다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 배양 및 조직학적 검사를 위하여, 위 몸통과 위 동부(antrum of stomach) 및 십이지장 제3부로부터 생검을 채취하였다. 생검의 평균 크기는 33 ㎎이었다. 생검은 PBS(2:1 Vol/wt 시료)에 즉시 위치시키고 얼음 위에 보관하며 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 총수의 분석을 위하여 Biogaia AB Laboratories(Lund, Sweden)로 운반하였다. 조직 분리에서 분석까지 시간은 36시간 이내이었다.
회장내시경 검사에서, 궤양성 대장염(3명의 피험자) 또는 크론병(6명의 피험 자)으로 인하여 결장절제술(colectomy)을 받은 9명의 회장루 피험자를 조사하였다. 모든 피험자에서 소장은 염증의 징후가 나타나지 않았다. 회장내시경은 0일과 28일에 실행하였다. 생검은 상기한 바와 같이, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)와 다른 락토바실러스(Lactobacillus)의 배양 및 조직학적 검사를 위하여 소장의 원위 20㎝ 이내에서 채취하였다.
실시예 4: 미생물 분석
락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 섭취 이전(0일) 및 연구의 종결 시점(28일)에서 각 피험자로부터 분변 시료를 수집하였다. 회장내시경 피험자(아래 참조)에서 배설물은 기문(stoma)으로부터 채취하였다. 42일(락토바실러스 루테리(L. reuteri) 섭취의 중단이후 14일)에, 위장내시경 검사를 받은 7명의 지원자와 회장내시경 검사를 받은 4명의 지원자로부터 분변 시료를 수집하였다. 이들 시료(5 g 이하)는 무균 용기에 수집하고 냉장기에 즉시 위치시켰다. 24시간 이내에, 20 ㎖(1:5 wt/vol)의 0.1% 펩톤수(peptone water)를 첨가하였다. 시료는 균질화시키고, 분량은 저온-바이알에 분배하고 -70℃에서 즉시 동결하였다. 시료는 전체 락토바실러스(Lactobacillus)와 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 분석을 위하여 드라이아이스에 동결시켜 Biogaia AB laboratory로 운반하였다. 이곳에서, 시료는 해동하고 희석하며 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 경우에 반코마이신(50 ㎎/ℓ)을 함유하는 MRS-3 한천배지에, 전체 락토바실러스(Lactobacillus) 총수의 경우에 LBS 한천배지 평판(KEBOLAB; AB, Lund, Sweden)에 도말하였다. MRS-3은 2% 아세트산나트륨(wt/vol)을 함유하는 변형된 MRS 한천배지(KEBOLAB AB, Lund, Sweden)이다. LBS 한천배지는 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 1.32 ㎖ 차가운 아세트산/ℓ를 첨가하여 준비하였다. 한천배지 평판은 혐기성 병에 담긴 BBL Gas 팩을 이용하여 37℃에서 48시간동안 혐기성 배양하였다. 본 연구로부터 선별된 분리물로부터 DNA는 Bacterial Barcodes repPROTM DNA Fingerprinting 키트(Bacterial BarCodes, Inc., Houston, TX)를 이용한 PCR로 분석하고, DNA 지문은 Bionumerics 소프트웨어(Applied Maths BVBA, Sint-Martens-Latem, Belgium)를 이용하여 분석하였다.
연구의 출발 시점 및 연구 산물의 투여 이전에, 위내시경 검사를 받은 피험자의 배설물에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 감지되지 않았다(표 2). 28일간의 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 섭취이후, 이들 피험자의 배설물에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 1.0 X 102 내지 3.5 x 105 CFU/g(콜로니-형성 단위/배설물 g) 범위의 양으로 존재하였고, 평균은 4.0 x 104 CFU/g이었는데, 이는 연구 산물의 투여에 기인한 배설물에서 생존 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 현저한 증가를 암시한다. 5명의 피험자는 42일과 56일(즉, 연구 산물의 투여이후 최대 28일)에 배설물 시료를 전달하도록 선택되었다. 이들 피험자의 배설물에서, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 섭취이후 4주시점에도 존속하였다(표 2).
표 2. 배설물에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 회수
Figure 112005012606217-pct00002
nd = 감지되지 않음(<1.0 x 102 CFU/배설물 g); * = 피험자에 의해 시료가 제공되지 않음.
배설물(회장내시경 산물) 시료는 28일간 락토바실러스 루테리(L. reuteri)로 보충이전, 0일에 채취하였다.
결과는 콜로니 형성 단위(CFU)/습윤 중량 배설물 g으로 표시된다.
실시예 5. 조직학적 평가
임의의 국부적 면역 반응을 평가하기 위하여, B-림프구, T-림프구, 대식세포의 양적 변화를 측정하였다. 기준 생검과 D-28 생검은 포르말린-고정시키고 파라핀에 포매하였다. 이후, 4 ㎛ 절편을 절단하고 표준 기술(헤마톡실린에오신, Van Gieson, Periodic Acid Sciff-Alcain, Periodic Acid Sciff-diastase)을 이용하여 조직학적으로 또는 면역조직화학적으로 염색하였다. DAKO(Glostrup, Denmark)로부터 구입한 일차 항체는 아래와 같았다: CD20(B-림프구), CD3, CD4+, CD8(T-림프구), CD68(조직구), 헬리코박터(Helicobacter), Ki-67(증식 마커). 면역조직화학적 염색은 DAKO TechMateTM 500 면역염색기에서 실행하여 균일한 염색을 달성하였다.
한 명의 병리학자가 생검을 평가하였다. 조직화학적 염색에 기초하여, 조직 손상은 Madsen et al.(Gastroenterol. 1999; 116:1107-1114)에 따라 등급을 매겼다. 이런 등급은 4가지 기준: 궤양 형성, 상피 증식(epithelial hyperplasia), 단핵구 세포의 양, 점막 고유층에서 호중구성 과립구의 수치 합계를 나타낸다. 면역조직화학적 염색에 기초하여, 점막 고유층에서 CD20, CD3, CD4+, CD8, CD68 양성 세포의 총수를 반정량적으로 평가하였다. 3개월후, 기준 생검과 D-28 생검은 동일 한 병리학적에 의해 맹검으로 재평가되었다. 각 평가 과정에서 기준 생검과 D-28 생검의 양성 염색된 세포간의 전체적인 상관관계를 산정하고 비교하였다.
현저한 단일 B-림프구 세포는 0일에 2명의 피험자, 28일에 2명의 피험자의 위(몸통과 동부)에서 관찰되었다. 1명의 피험자는 28일에 위(동부)에서 분산된 세포를 보유하였다. 0일에 4명의 피험자가 십이지장에서 단일 세포를 보유하였고, 28일에 8명의 피험자가 현저한 단일 세포를 보유하였다. 0일에 8명의 피험자가 위(몸체와 동부)에서 현저한 CD3, CD4+, CD8(T-림프구)의 단일 세포를 보유하였고, 28일에 9명의 피험자가 심실(몸체와 동부)에서 현저한 단일 세포를 보유하였다(표 3). 분산된 세포는 0일에 8명의 피험자의 십이지장에서 관찰되었고, 현저하게 분산된 T-림프구는 28일에 7명의 피험자의 십이지장에서 관찰되었다.
현저한 단일 조직구 세포는 0일에 9명, 28일에 5명의 피험자의 위(몸체와 동부)에서 관찰되었다. 현저하게 분산된 세포는 0일에 6명, 28일에 6명(동일하지 않음)의 피험자의 십이지장에서 관찰되었다.
피험자가 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 섭취한 이후, 위 몸체(p=0.025)와 동부(p=0.046)로부터 얻은 생검에서 조직구(CD68) 총수에서 통계학적으로 유의한 감소 및 십이지장에서 B-세포(CD20) 총수에서 유의한 증가(p=0.046)가 관찰되었다(표 3). 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 섭취에 기인한 T-림프구 양에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 이들 두 조사결과(조직학적 시료의 1차 비-맹검 분석과 2차 맹검 분석)간의 일치율은 76%이었다(표 3). 위 몸통과 동부의 조직구(CD68) 세포에서, 일치율은 각각 40%와 65%이었다. 십이지장 B-세포(CD20)의 일 치율은 60%이었다. 따라서, 이들 조사결과에는 다소의 불명확실성이 존재하였다. CD3, CD4+, CD8 분석에서 일치율은 훨씬 높았다(최대 90%; 표 3).
회장내시경 검사에서, 모든 생검은 조직학적으로 정상이었고 헬리코박터(Helicobacter) 음성이었다. Ki-양성 세포는 모든 생검에서 정상이었다. 0일에 현저한 단일 B-림프구는 세포는 6명의 피험자에서, 분산된 세포는 2명의 피험자에서 관찰되었다. 28일에 모든 피험자에서 단일 세포가 관찰되었다. 현저하게 분산된 CD3 세포(B-림프구)는 0일과 28일 모두 7명의 피험자에서 관찰되었다. 현저하게 분산된 CD4+ 세포는 0일에 7명의 피험자에서 관찰되었고, 현저하게 서로 인접한 세포 집단은 28일에 7명의 피험자에서 관찰되었다. 현저하게 분산된 CD8 세포는 0일에 7명의 피험자에서, 28일에 9명의 피험자에서 관찰되었다(표 3). 현저하게 분산된 조직구 세포는 0일과 28일 모두 7명의 피험자에서 관찰되었다.
28일간 락토바실러스 루테리(L. reuteri)로 보충이후 CD4+ 림프구 양이 유의하게 증가하였다(p=0.046; 표 3). 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 투여에 기인한 B-림프구 또는 조직구의 양에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 두 조사결과간의 일치율은 검사된 모든 세포 유형에서 전반적으로 높았고, CD4+ 조사결과에서 일치율은 78%이었는데, 이는 이들 데이터에서 상당한 신뢰성을 암시한다(표 3). 모든 헬리코박터(Helicobacter) 염색은 음성이었다.
표 3. 회장내시경 검사에서 피험자로부터 얻은 회장 생검의 조직학적 평가
Figure 112005012606217-pct00003
생검은 소장의 원위 20 ㎝ 이내에서 채취하고, 특정 세포 유형의 면역조직화학적 염색을 이용한 조직학적 검사를 위하여 고정시키고 얇은 조각으로 잘랐다.
“_” = 감지된 세포없음; “X” = 단일 세포; “XX”= 분산된 세포 또는 세포 집단; “XXX”= 인접한 여러 세포 집단.
조직 손상의 정도를 등급으로 매기는 조직학적 스코어(1 내지 10).
통계학적 분석: 윌콕슨 부호-순위 검정. 명목 스코어, X, XX, XXX가 부여된 시료는 통계학적 분석을 위하여 각각 1, 2, 3, 4로 설정되었다.
실시예 6. 혈액의 생화학
혈액 시료는 0일과 28일에 채취하고 헤모글로빈, 적혈구용적비(hematocrit), 혈소판, 백혈구, C-반응성 단백질, 칼륨, 나트륨, 크레아티닌, b-우레아, p-글루코오스, 콜레스테롤, HDL(고밀도 지단백), LDL(저밀도 지단백), VLDL(초저밀도 지단백), 트리글리세리드, 전체 빌리루빈, 요산염(urate), ALAT, 알칼리성 포스파타제, 락테이트를 분석하였다.
락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 섭취 전후에 대부분의 혈액 검사는 정상이었다. 혈액 변수에서 몇몇 특이점이 있긴 했지만, 치료이후 임상적으로 유의한 비정상 및 전신적인 변화는 관찰되지 않았다.
실시예 7. DNA 핑거프린팅
DNA 핑거프린팅(fingerprinting) 분석은 본 연구로부터 선별된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 분리물에서 실행하였다. 따라서, 28일간 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 섭취한 3명의 피험자로부터 배설물을 채취하고, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 투여이전 0일에 십이지장 생검으로부터 하나의 분리물과 회장 생검으로부터 하나의 분리물을 채취하였다. 모든 분리물은 서로 98%의 유전적 유사성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 분리물은 정제에 함입되는 균주인 SD2112와 97% 유사성을 보였다.
실시예 8: 사람에서 면역-기능을 향상시키기 위한 산물의 제조
본 실시예에서는 독소 중화와 CD4+ 세포 동원을 위한 상기한 방법을 이용하여, 표준 요구르트에 첨가될 수 있는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) SD2112, ATCC 55730을 선택한다. 상기 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주는 유가공 산업에서 락토바실러스(Lactobacillus)를 성장시키는 표준 방법을 이용하여 성장시키고 동결 건조시킨다. 이후, 상기 배양액은 전통적인 요구르트 배양액을 이용하여 발효된 우유에 10E+7 CFU/요구르트 g의 수준으로 첨가되는데, 상기 요구르트는 사람의 면역 기능을 향상시키는 한가지 방법으로서 이용된다.
본 발명은 특정 구체예를 참조하여 기술하였지만, 다수의 개변이 가능하고, 따라서 이런 모든 개변은 본 발명의 기술적 사상과 범위에 속하는 것으로 간주된다.

Claims (9)

  1. 포유동물에서 면역-기능을 향상시키는 조성물의 생산에 이용되고, 독소 결합과 중화 효과 및 CD4+ 세포 동원을 보이는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) ATCC 55730 균주.
  2. 제 1 항에 따른 균주를 함유하는 산물.
  3. 제 2 항에 있어서, 선별된 균주의 세포를 함유하는 식품으로 제조되는 것을 특징으로 하는 산물.
  4. 제 2 항에 있어서, 선별된 균주의 세포를 함유하는 정제로 제조되는 것을 특징으로 하는 산물.
  5. 제 2 항에 있어서, 선별된 균주의 세포를 함유하는 식이 보조제로 제조되는 것을 특징으로 하는 산물.
  6. 제 2 항에 있어서, 선별된 균주의 세포를 함유하는 과자로 제조되는 것을 특징으로 하는 산물.
  7. 제 2 항에 있어서, 선별된 균주의 세포를 함유하는 약물로 제조되는 것을 특징으로 하는 산물.
  8. 박테리아 독소를 중화시키는데 이용되는, 제 1항에 따른 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC 55730의 배양 상층액.
  9. 삭제
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