KR100861126B1

KR100861126B1 - Reagent generating superoxide anion and its application

Info

Publication number: KR100861126B1
Application number: KR1020070016514A
Authority: KR
Inventors: 이정국; 이해진; 김의진
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2007-02-16
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2008-09-30
Also published as: KR20080076502A

Abstract

본 발명은 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 산소 조건 하에서 과산화수소를 생성하지 않으면서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터(Rhodobacter)를 포함하는 광합성 세균 유래 단백질을 이용한 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약으로 사용하여, 직접 슈퍼옥시드 음이온 제거물질을 검색하거나, 또는 시토크롬 C나 NBT(nitro blue tetrazolium)를 이용하여 간접적으로, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화를 측정함으로써, 시료에 있는 슈퍼옥시드 디스뮤타제 양에 비례하여 슈퍼옥시드 생성 시약에 의해 생성된 슈퍼옥시드 음이온의 분해율의 상관관계를 이용하여 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 활성 측정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a superoxide anion generating reagent and its use, and more particularly, derived from photosynthetic bacteria including Rhodobacter having the activity of generating superoxide anion without generating hydrogen peroxide under oxygen conditions Using superoxide anion generating reagents using proteins, the superoxide anion remover can be directly detected, or indirectly using cytochrome C or nitro blue tetrazolium (NBT), cytochrome C by the superoxide anion produced. Or by measuring the change in absorbance that the NBT has been reduced, using the correlation of the decomposition rate of the superoxide anion produced by the superoxide generating reagent in proportion to the amount of superoxide dismutase in the sample. It relates to a method of measuring the activity of a dismutase.

슈퍼옥시드 음이온 생성 시약, 항산화활성 검색, 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성 측정 Superoxide Anion Generation Reagent, Antioxidant Activity Detection, Superoxide Dismutase Activity Measurement

Description

Reoxide generating superoxide anion and its application

도 1은 슈퍼옥시드 생성 단백질의 발현벡터를 제작하는 과정을 나타낸 모식도 이다.1 is a schematic diagram showing a process for preparing an expression vector of a superoxide-producing protein.

도 2는 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터 유래 활성화된 단백질의 제조하여 아크릴아마이드겔 위에 전기영동한 결과이다.Figure 2 shows the results of electrophoresis on acrylamide gel by the preparation of Rhodobacter-derived activated protein having the activity of generating superoxide anion.

도 3은 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터 유래 단백질의 활성산소에 대한 안정성을 조사한 결과이다.3 is a result of investigating the stability of the active oxygen of the Rhodobacter-derived protein having the activity of generating a superoxide anion.

도 4는 로도박터 유래 단백질에 의한 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 사용하여 광합성 미생물 추출물의 슈퍼옥시드 음이온에 대한 항산화 효과를 검색한 결과이다.Figure 4 is a result of searching for the antioxidant effect on the superoxide anion of the photosynthetic microbial extract using a superoxide anion generating reagent by Rhodobacter-derived protein.

도 5는 대장균 세포 추출물의 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성분석 결과이다. 5 shows the results of superoxide dismutase activity analysis of E. coli cell extracts.

활성산소는 유기체가 에너지를 얻기 위해서는 필수불가결하게 부수적으로 동반되어 생성되는 매우 반응성이 큰 물질로서, 활성산소는 일종의 강력한 독소로서 산화스트레스를 유발할 뿐만 아니라, 부분적으로 조절 가능한 소량이 생성될 때는, 생체 내에서 세포성장, 염증반응 유발, 세포방어 등의 정상적인 신호전달과정에서의 신호전달물질로서도 기능을 하는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 활성산소의 특정 부위에서의 정상적인 생성과 분해는 다양한 생리 기능에도 필요하나, 이것의 정상적인 생성과 분해의 균형이 깨지게 되면, 직ㆍ간접적으로 암, 파킨스, 알쯔하이머 등의 퇴행성 뇌질환, 동맥경화, 염증반응 등의 매우 다양한 질병의 발생과 조절에 관여하는 것으로 알려져 왔다. 따라서, 특정부위에서, 과발생된 활성산소의 생성을 저해하거나, 분해를 촉진하여, 이의 부작용을 막아 주는데 관여하는 생체물질을 검색하여, 의약품이나 식품첨가제로 사용하려는 많은 시도가 이루어져 왔다. 그러나, 생체 내외에 생성된 활성산소들에 대한 분석의 어려움과, 짧은 반감기로 생체 내에서 활성산소에 대한 병리연구나 항활성산소제의 개발에 많은 제한이 있었다. 특히, 안정적이고, 특이적으로 슈퍼옥시드 음이온만을 안정적으로 생성시키는 시약은 복합생체 물질의 항활성산소 활성이나, 특히 슈퍼옥시드에 대한 항산화 활성을 화학적 발광(chemiluminescence)에 의해 슈퍼옥시드를 분석함으로서, 생체 복합 물질에서의 슈퍼옥시드에 항산화 활성을 측정하거나 검색할 수 있는 방법을 제공한다. 이를 위해 종래의 슈퍼옥시드 음이온 생성 화합물로는 메틸 바이올로젠, 플럼바진, 메나디온(menadione), 잔틴옥시다아제 등 산화환원 순환시약을 이용하여 슈퍼옥시드 음이온 생성체로서 사용하였으며, 그 중에서 잔틴옥시다아제가 가장 널리 사용되어져 왔으나 다음과 같은 몇몇 문제점이 있어 왔다. 첫째, 상기 시약들은 그 작용 도중 슈퍼옥시드 음이온뿐만 아니라 과산화수소를 동시에 생성시켜, 중성 pH에서는 전체 전자의 15% 이내만이 슈퍼옥시드 생성에 사용되어, 안정적인 슈퍼옥시드 생성 효율이 떨어지며, 둘째, 많은 양의 슈퍼옥시드 생성을 위해 많은 양의 잔틴옥시다아제를 사용하게 되면, 반응이 너무 빨리 진행되어, 정확하고 안정적으로 슈퍼옥시드 양을 측정하기 어렵게 된다. 셋째, 잔틴옥시다아제는 알데하이드 등의 많은 다른 기질을 산화시키며, 산화된 기질은 다시 잔틴옥시다아제를 억제할 수 있으며, 세포질 내 산화한원 효소들에 의해서도 잔틴의 산화환원 반응이 저해될 수 있어, 생체 추출물로 분석 슈퍼옥시드에 항산화 활성을 조사할 경우 특이성이 떨어지는 단점이 있다. Active oxygen is a highly reactive substance that is produced by the organism as an indispensable event for energy. Active oxygen is a powerful toxin that not only causes oxidative stress, but also generates a small amount of partially adjustable It is known to function as a signaling material in normal signaling processes such as cell growth, inflammatory response, and cell defense. Therefore, the normal production and decomposition of free radicals is necessary for various physiological functions, but if the balance of its normal production and degradation is broken, degenerative brain diseases such as cancer, Parkin's and Alzheimer's, arteries It has been known to be involved in the development and control of a wide variety of diseases, including hardening and inflammatory reactions. Accordingly, many attempts have been made to search for biomaterials that are involved in inhibiting the production of over-produced active oxygen or promoting degradation and preventing their side effects, and use them as pharmaceuticals or food additives. However, there are many limitations in the analysis of active oxygen generated in vivo and externally, and a short half-life for pathological studies of active oxygen or development of anti-active oxygen in vivo. In particular, a stable and specific reagent that stably produces only superoxide anions is characterized by the analysis of superoxide by chemiluminescence of anti-oxidative oxygen activity of complex biomaterials, but particularly of antioxidant activity against superoxide. The present invention provides a method for measuring or retrieving antioxidant activity on superoxide in a biological composite material. To this end, conventional superoxide anion generating compounds were used as superoxide anion generators using redox circulation reagents such as methyl biogen, plumbazine, menadione, and xanthine oxidase, among which xanthine oxidase is used. The most widely used, but there are some problems as follows. First, the reagents simultaneously produce not only superoxide anion but also hydrogen peroxide, and at neutral pH, only 15% of the total electrons are used for superoxide generation, resulting in a poor efficiency of producing superoxide. If a large amount of xanthine oxidase is used to generate a large amount of superoxide, the reaction proceeds too quickly, making it difficult to accurately and stably measure the amount of superoxide. Third, xanthine oxidase oxidizes many other substrates, such as aldehydes, and the oxidized substrate can again inhibit xanthine oxidase, and the redox reaction of xanthine can be inhibited by oxidative enzymes in the cytoplasm. When investigating the antioxidant activity of the assay superoxide, there is a disadvantage that the specificity is poor.

반면, 슈퍼옥시드 음이온만을 생성시키는 광합성 세균의 단백질은 공기 중에 서 환원제의 존재 하에서 거의 모든 전자가 산소에 제공되어 높은 효율로 슈퍼옥시드가 생성되며, 또한 이 효소반응을 저해하는 저해제도 거의 없어 슈퍼옥시드 음이온을 특이적으로 생성할 수 있어서, 활성산소 대사효소의 활성을 측정하는데 사용되는 슈퍼옥시드를 특이적이며, 안정적으로 생성하는 시약으로 효과적으로 사용될 수 있을 것이다. On the other hand, proteins of photosynthetic bacteria that produce only superoxide anions provide superoxide with almost all electrons in the air in the presence of a reducing agent in the air, producing superoxide with high efficiency, and there is almost no inhibitor that inhibits this enzymatic reaction. Since the oxide anion can be specifically produced, it can be effectively used as a reagent for generating a specific and stable superoxide used to measure the activity of active oxygen metabolase.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 산소 조건 하에서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하면서 과산화수소는 생성하지 않는 광합성 세균 유래 단백질을 이용한 안정적이고, 특이적인 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have conducted research to solve the above problems, and as a result, a stable, specific superoxide anion generating reagent using a photosynthetic bacteria-derived protein that generates superoxide anion under oxygen conditions but does not generate hydrogen peroxide The present invention has been completed by the development.

따라서, 본 발명은 산소 조건 하에서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하면서 과산화수소는 생성하지 않는 광합성 세균 유래 단백질을 포함하는 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a superoxide anion generating reagent including a photosynthetic bacterial-derived protein which produces a superoxide anion under oxygen conditions and does not generate hydrogen peroxide.

또한, 본 발명은 상기 시약을 사용하여 복합 생체 추출물에서의 슈퍼옥시드에 대해 선택적인 항산화 활성을 직접 측정하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of directly measuring the selective antioxidant activity for superoxide in complex biological extracts using the reagents.

또한, 본 발명은 상기 시약을 사용하여 슈퍼옥시드 디스퓨타제의 활성을 분석하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for analyzing the activity of superoxide disputase using the reagent.

본 발명은 산소 하에서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하면서 과산화수소는 생성하지 않는 광합성 세균 유래 단백질을 포함하는 슈퍼옥시드 음이온 생성시약을 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by a superoxide anion generating reagent comprising a photosynthetic bacteria-derived protein which produces a superoxide anion under oxygen but does not produce hydrogen peroxide.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.

본 발명은 산소 농도 1 ~ 3%의 조건 하에서 과산화수소를 생성하지 않으면서 슈퍼옥시드 음이온을 생성하는 활성을 가진 로도박터(Rhodobacter)를 포함하는 광합성 세균 유래 단백질을 이용한 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약으로 사용하여, 직접 슈퍼옥시드 음이온 제거물질을 검색하거나, 또는 시토크롬 C나 NBT(nitro blue tetrazolium)를 이용하여 간접적으로, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화를 측정함으로써, 시료에 있는 슈퍼옥시드 디스뮤타제 양에 비례하여 슈퍼옥시드 생성 시약에 의해 생성된 슈퍼옥시드 음이온의 분해율의 상관관계를 이용하여 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 활성 측정하는 방법에 관한 것이다.The present invention is used as a superoxide anion generating reagent using a photosynthetic bacteria-derived protein including Rhodobacter having the activity of generating superoxide anion without generating hydrogen peroxide under conditions of oxygen concentration of 1 to 3%. By directly searching for a superoxide anion removing material, or indirectly by using cytochrome C or NBT (nitro blue tetrazolium), measuring the change in absorbance of the reduction of cytochrome C or NBT by the produced superoxide anion. Thereby, the present invention relates to a method for measuring the activity of superoxide dismutase using a correlation of the decomposition rate of superoxide anion produced by a superoxide generating reagent in proportion to the amount of superoxide dismutase present in a sample. .

대장균에서 재조합 BchZ를 대량 생산하기 위해 bchZ 유전자[서열번호 1]를 PCR을 통하여 N-말단에 스트랩-태그를 연결하기 위하여 도 1에 나타난 대로, PCR된 DNA조각을 SacI과 HincII로 오려내어, SacI과 EcoRV 지역을 절단된 pASK-IBA7plus 벡터(IBA)에 접합하여, 발현벡터 pAStZ를 제작하였다.In order to mass-produce recombinant BchZ in Escherichia coli, the PCR fragments were cut into SacI and HincII as shown in FIG. 1 in order to connect the strap-tag to the N-terminus by PCR with the bchZ gene [SEQ ID NO: 1]. And EcoRV regions were conjugated to the cleaved pASK-IBA7plus vector (IBA) to prepare an expression vector pAStZ.

상기 유전자 재조합방법으로 대장균에서 대량 발현하여 분리 정제한 활성화된 단백질에 헤민을 결합하게 하고, 다이티오나이트(Na-dithionite)를 첨가해 활성화시킨 단백질은 공기 중에서, 슈퍼옥시드 음이온을 안정적으로 생성하여, 이를 슈 퍼옥시드 음이온 생성 시약으로 시험관에서 사용할 수 있다. The gene was recombined with hemin to the activated protein, which was expressed and purified by E. coli in a large amount, and activated by adding dithionite, which stably generates superoxide anions in the air. It can be used in vitro as a superoxide anion generating reagent.

슈퍼옥시드 음이온 생성 시약를 이용하면, 후보물질이 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 있는지를 루미놀(luminol) 유도체인 L-012(Wako Chemical)를 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온에 의해 직접적으로 생겨나는 화학적 발광의 양을 측정함으로써 생체 복합물질을 그대로 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 얼마나 있는지를 민감하게 직접적으로 분석, 검색할 수 있다. Using a superoxide anion generating reagent, whether or not the candidate is active to remove the superoxide anion is generated directly by the superoxide anion using L-012 (Wako Chemical), a luminol derivative. By measuring the amount of chemiluminescence, the biocomposite can be used as it is, so as to directly and sensitively detect and detect how much activity there is for removing superoxide anions.

또한, 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약에 시토크롬 C나 NBT를 가하여, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화로 측정하여, 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 분석하는 방법에 사용할 수도 있다. 또한, 상기 분석법은 수용성 NBT 유도체를 사용할 경우, 수용성 항산화제의 고속 선별에도 사용 가능하다. In addition, a method of analyzing superoxide dismutase by adding cytochrome C or NBT to a superoxide anion generating reagent and measuring the reduction of cytochrome C or NBT by the generated superoxide anion with a change in absorbance Can also be used. In addition, the assay can be used for the high-speed screening of water-soluble antioxidants when using a water-soluble NBT derivative.

따라서, 본 발명은 활성산소의 유해성으로부터 발생되는 다양한 질병들, 예로서, 알쯔하이머, 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환과 순환기계 질환인 심장병과 동맥경화 등의 치료용 의약품만 아니라, 건강보조식품을 포함하는 식품 및 화장품의 첨가제로 사용되는 효과적인 항산화제 탐색과 활성분석에 유용하게 이용되리라 기대된다.Accordingly, the present invention includes not only pharmaceutical products for treating various diseases resulting from the harmfulness of free radicals, such as degenerative brain diseases such as Alzheimer's and Parkinson's disease and heart disease and arteriosclerosis, which are circulatory diseases, but also dietary supplements. It is expected to be useful for the effective antioxidant search and activity analysis used as additives in food and cosmetics.

이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 특히, 본 발명은 특허 출원 제2005-118377호의 개량발명에 해당되며, 이의 발명을 참고하도록 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples. In particular, the present invention corresponds to an improved invention of Patent Application No. 2005-118377, to which reference is made.

실시예 1: 재조합 로도박터 유래 슈퍼옥시드 생성 단백질의 발현벡터 제조Example 1 Preparation of Expression Vector of Recombinant Rhodobacter-derived Superoxide Producing Protein

대장균에서 재조합 BchZ를 대량 생산하기 위해 bchZ 유전자[서열번호 1]를 PCR을 통하여 N-말단에 스트랩-태그를 연결하였다. 전방 프라이머(primer)는 번역 시작 코돈인 ATG 코돈을 제거하였다. 이를 위하여 서열번호 1의 프라이머를 제작하여 사용하였다. 후방 프라이머는 서열번호 2를 제작하여 사용하였다. 표 1의 밑줄은 제한효소 위치를 만들기 위하여 임의로 변형시킨 염기서열을 나타내고, 굵게 표시한 염기 서열은 해당 제한효소의 인식서열이다.To mass produce recombinant BchZ in Escherichia coli, the bchZ gene [SEQ ID NO: 1] was linked to the N-terminus by a strap-tag via PCR. The forward primer removed the ATG codon, the translation start codon. For this purpose, a primer of SEQ ID NO: 1 was prepared and used. The rear primer was used to make SEQ ID NO: 2. Underlined in Table 1 represents the nucleotide sequence arbitrarily modified to make a restriction enzyme position, the nucleotide sequence in bold is the recognition sequence of the restriction enzyme.

서열번호SEQ ID NO: 구분division 서열목록(5' → 3')Sequence Listing (5 '→ 3') 비고Remarks 1One 전방 프라이머Anterior primer GGAGAGAGCTCATGCTCGTGCGGAGAGA G CT C ATGCTCGTGC SacI(SstI) 인식 서열 제조Preparation of SacI (SstI) Recognition Sequences 22 후방 프라이머Rear primer GCGTGTTGACGTCTAGATCGGCGTGTTGACGTCTAGATCG

PCR로 얻어진 조각을 SacI과 HincII로 오려내어 pASK-IBA7plus 벡터(IBA)의 SacI과 EcoRV 지역을 절단하고 여기에 접합하여 pAStZ를 제작하였다. DNA 조각을 얻기 위한 절단을 위해 해당 제한효소(restriction endonuclease, TAKARA)를 사용하였고, 조각의 접합을 위해서는 T4 DNA 리가아제(ligase, TAKARA)를 사용하였다. 이 구조물을 대장균 BL21(DE3)로 형질전환한 후, 형질전환체를 얻기 위해 벡터 플라스미드를 선별할 수 있는 항생제 앰피실린을 첨가한 엘비배지에 도말하였으며 항생제 저항성을 가지는 균주들을 확보하였다. BchZ 단백질의 발현은 히스-태그 또는 스트랩(strep)-태그에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 다음, 스트랩-태그 제조사(IBA)가 권장하는 방법에 따라 단백질을 분리하였다. 대장균에서 제조된 단백질을 광합성 세균에서 제조한 단백질과 비교를 위하여, 슈퍼옥시드를 생성하는 단백질을 로도박터에서도 발현하였다. 이를 위하여, 세포 내에서 rrnB 프로모터에 의해 전사되고 N-말단에 히스-태그가 융합된 해당 단백질을 발현시키는 pRK-HisZ 발현 벡터를 대장균 S17-1로 형질전환한 다음 로도박터 스페로이데스에 접합법을 통해 가동화하였다. The fragments obtained by PCR were cut out with SacI and HincII to cut the SacI and EcoRV regions of the pASK-IBA7plus vector (IBA) and conjugate them to prepare pAStZ. Restriction endonuclease (TAKARA) was used for cleavage to obtain DNA fragments, and T4 DNA ligase (TAKARA) was used for conjugation of fragments. The constructs were transformed with E. coli BL21 (DE3), and then plated on Elbi medium with antibiotic ampicillin, which can select vector plasmids to obtain transformants. Expression of BchZ protein was confirmed by Western blotting with antibodies against heat-tag or strap-tag, and then the protein was isolated according to the method recommended by the strap-tag manufacturer (IBA). In order to compare the protein produced in E. coli with the protein produced in photosynthetic bacteria, superoxide-producing proteins were also expressed in Rhodobacter. To this end, a pRK-HisZ expression vector that is transcribed by the rrnB promoter in the cell and expresses the corresponding protein with a heat-tag fused to the N-terminus is transformed into Escherichia coli S17-1 and then conjugated to Rhodobacter spheroids. It was activated through.

실시예 2: 슈퍼옥시드 생성 시약 제조 및 이에 의한 슈퍼옥시드 생성 Example 2 Preparation of Superoxide Reagent and Production of Superoxide

슈퍼옥시드 생성 시약 제조를 위해, 실시예 1에서 제조한 슈퍼옥시드 발현 균주들로부터 슈퍼옥시드 생성 단백질을 과발현시키고, 발현된 단백질을 분리하였다[서열번호 2]. pRK-HisZ 또는 pAStZ 구조물을 포함하는 각 균주들은 어둠 혐기 조건에서 1L 배양병을 부틸 합성 고무 뚜껑으로 막고 배지를 질소 가스로 치환하여 배양하였다. 분리과정은 5% 수소, 5% 이산화탄소, 90% 질소를 포함하고 있는 혐기상자에서 수행하였다. 세포 내에 있는 수용성의 과발현 단백질을 얻기 위해 초음파 파쇄기(sonicator, Sonifier 250, Branson, Sweden)를 이용하여 4 ℃에서 10 분간 세포를 파쇄하였고, 이를 4 ℃에서 12,000 g로 원심분리하여 수용성 세포질액을 얻은 후 니켈-친화 크로마토그래피(Qiagen)를 제조사의 방법에 따라 이용하여 분리하였다. 세포질액을 니켈 레진(resin)에 붙인 후 이미다졸(imidazole)과의 친화도 경쟁을 통해 BchZ 단백질을 수득하였으며, 단백질의 용출을 위하여 150 mM의 이미다졸과 300 mM 염화나트륨이 포함된 50 mM 인산이수소나트륨(NaH₂PO₄) 버퍼(pH 7.9)를 사용하였다. 스트렙-태그된 단백질의 분리를 위해 스트렙탁틴-아가로즈 컬럼에 스트렙-태그된 단백질 발현 대장균 배양액 추출물을 가한 뒤, 4배 부피의 완충용액으로 세척한 다음, 결합되어 있는 단백질을 2.5 mM 디스티오바이오틴(destiobiotin)이 첨가된 완충용액으로 단백질을 용출하여 얻는다. 활성화된 단백질을 얻기 위해, 1 mM의 다이티오나이트를 용출된 단백질 용액에 가한 뒤 30분간 둔 뒤, 미반응된 과량의 다이티오나이트를 완충용액[100 mM HEPES-KOH(pH 7.4), 5 mM 염화마그네슘(MgCl₂·6H₂O), 0.01 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)에서 투석으로 제거한 다음, 단백질 확인은 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동을 통하여 이루어졌으며 로도박터와 대장균에서 분리된 BchZ를 57 kDa의 밴드로 확인할 수 있었다(도 2). 다이티오나이트로 처리된 슈퍼옥시드 생성 단백질을 각각 헤민(hemin)이 있거나 없는 조건에서 각각, 30분간 반응시킨 후, 투석하여 제조한 뒤, 이 단백질의 산소와 슈퍼옥시드에 대한 안정성을 측정하였다(도 3). 고무 뚜껑으로 반응 완충용액[100 mM HEPES-KOH(pH 7.4), 5 mM 염화마그네슘(MgCl₂·6H₂O), 0.1 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)]이 들어있는 밀폐된 5 mL의 유리병 내에 다음과 같이 수행하였다. 각 단백질을 넣은 후 이를 밀봉하고 질소로 치환시켰다. 이를 30 ℃에서 30 분간 배양하여 상기 단백질의 재조합을 유도한 후 생성된 슈퍼옥시드는 아래의 시토크롬 방법으로 정량 분석하였다. 20 μM의 시토크롬(cytochrome c)가하고, 시토크롬의 환원은 550 nm에서 흡광도의 증가를 통해 측정하였고, 21000 M^-1cm^-1의 흡광계수(extinction coefficient)를 이용하여 값을 얻어내었다. 이때, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 슈퍼옥시드 음이온 디스뮤테이즈(superoxide dismutase; SOD)가 첨가된 반응과 그렇지 않은 반응에서의 시토크롬의 환원 정도 차이를 통하여 슈퍼옥시드 음이온의 생성 정도를 다음 표 1과 같이 확인할 수 있었다. 즉, 광합성 세균으로 부터의 제조한 슈퍼옥시드 생성 단백질(BchZ-ph)은 헤민과의 결합반응을 시켜 주지 않아도, 슈퍼옥시드 생성을 잘 시켜주는 반면, 대장균에서 대량 생산한 슈퍼옥시드 생성 단백질(BchZ)은 헤민과 결합시켜준 슈퍼옥시드 생성 단백질[BchZ(+heme)]에서만 슈퍼옥시드 생성이 잘 일어남을 알 수 있었다.For preparing superoxide generating reagents, Superoxide-producing proteins were overexpressed from the superoxide-expressing strains prepared in Example 1, and the expressed proteins were isolated (SEQ ID NO: 2). Each strain containing pRK-HisZ or pAStZ constructs was incubated in a dark anaerobic condition with a 1L culture bottle closed with a butyl synthetic rubber cap and the medium replaced with nitrogen gas. The separation process was carried out in an anaerobic box containing 5% hydrogen, 5% carbon dioxide and 90% nitrogen. Cells were disrupted at 4 ° C. for 10 minutes using an ultrasonic crusher (sonicator, Sonifier 250, Branson, Sweden) to obtain water-soluble overexpressed protein in cells, and centrifuged at 12,000 g at 4 ° C. to obtain a water-soluble cytoplasm. Nickel-affinity chromatography (Qiagen) was then isolated using the manufacturer's method. After attaching the cytosol to nickel resins, the BchZ protein was obtained through affinity competition with imidazole, and 50 mM phosphoric acid containing 150 mM imidazole and 300 mM sodium chloride was used to elute the protein. Sodium hydrogen (NaH ₂ PO ₄ ) buffer (pH 7.9) was used. Strep-tagged protein-expressing E. coli culture extract was added to a streptatin-agarose column for isolation of strep-tagged proteins, washed with four volumes of buffer solution, and then the bound protein was 2.5 mM disthiobiotin. Obtained by elution of protein with (destiobiotin) added buffer. To obtain the activated protein, 1 mM dithionite was added to the eluted protein solution and left for 30 minutes, and the unreacted excess dithionite was buffered [100 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 5 mM. After removal by dialysis in magnesium chloride (MgCl ₂ · 6H ₂ O), 0.01 mM dithiothreitol, protein identification was performed by electrophoresis using a 12% polyacrylamide gel and isolated from Rhodobacter and Escherichia coli. BchZ could be confirmed with a band of 57 kDa (FIG. 2). Superoxide-producing proteins treated with dithionite were each reacted with or without hemin for 30 minutes, and then prepared by dialysis to measure the stability of the protein against oxygen and superoxide. (FIG. 3). Closed 5 mL glass bottle containing reaction buffer [100 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 5 mM magnesium chloride (MgCl ₂ · 6H ₂ O), 0.1 mM dithiothreitol] with a rubber lid Was performed as follows. After each protein was added it was sealed and replaced with nitrogen. After incubating for 30 minutes at 30 ℃ to induce the recombination of the protein produced superoxide was quantitatively analyzed by the following cytochrome method. Cytochrome c of 20 μM was added, and reduction of cytochrome was measured by increasing the absorbance at 550 nm, and the value was obtained using an extinction coefficient of 21000 M ⁻¹ cm ⁻¹ . In this case, the degree of generation of superoxide anion is determined through the difference in the degree of reduction of cytochrome in the reaction to which superoxide anion dismutase (SOD) is added to remove the superoxide anion and the reaction thereof is not shown in Table 1 below. It could be confirmed as follows. In other words, superoxide-producing protein (BchZ-ph) prepared from photosynthetic bacteria can produce superoxide well even without binding reaction with hemin, whereas superoxide-producing protein produced in mass in E. coli (BchZ) was found that superoxide production occurs only in the superoxide generating protein [BchZ (+ heme)] bound to hemin.

실시예 3: 슈퍼옥시드에 대한 직접적인 항산화 활성 측정Example 3: Direct Antioxidant Activity Determination for Superoxides

광합성 세균의 대사체를 대상으로 슈퍼옥시드에 대한 항산화 물질을 검색하기 위하여, 각종의 광합성세균들의 배양물을 에탄올과 디에틸에테르(diethylether), 클로르포름으로 각각 추출하고, 이 추출물들을 Pch-계열숫자로 명명하였다. 이들 중 Pch21/53/212를 0.1 ~ 1 mg/ml의 농도로 에탄올이나 디메틸설폭사이드 등에 녹여 사용하였다. 슈퍼옥시드에 대한 항산화 활성을, 실시예 2에서 기술한 바와 같이, 슈퍼옥시드 생성 단백질을 사용해 슈퍼옥시드를 생성하는 반응용액에, 이들 추출물과, 음성대조군(NCON)으로 디메틸설폭사이드, 양성대조군으로 퀴서틴(quercetin)을 각각 가하고, 슈퍼옥시드를 제거하는지를 슈퍼옥시드에 의한 100 μM 루미롤 유도체인 L-012(Wako Chemical)를 가하고, 10분간 슈퍼옥시드에 의한 화학적 발광양을 루미노미터(Luminometer)로 각각 연속 측정하였다. 단위시간당 생성된 화학적 발광양(CL)은 약 2분에서 10분까지 직선의 반응성을 보여, 아주 안정적인 반응성을 보여주었으며, 생성된 화학적 발광양은 10분에서 강력한 항산화제인 퀴서틴의 경우 100 이하의 낮은 값에서부터, 용매만 처리한 음성대조군의 경우 10분 동안 약 25만의 큰 반응성 기록하였으며, 각 분획 Pch 추출물은 각각의 항산화능이 클수록, 낮은 반응성을 보여주었다(도 4). In order to search for antioxidants against superoxide in the metabolites of photosynthetic bacteria, cultures of various photosynthetic bacteria were extracted with ethanol, diethylether and chloroform, respectively, and the extracts were Pch-based. Named by number. Of these, Pch21 / 53/212 was dissolved in ethanol or dimethyl sulfoxide at a concentration of 0.1 to 1 mg / ml and used. As described in Example 2, the antioxidant activity against the superoxide was expressed in the reaction solution for producing superoxide using the superoxide-producing protein, and these extracts and the negative control group (NCON) were dimethyl sulfoxide and positive. As a control, quercetin was added to each other, and superoxide was removed. L-012 (Wako Chemical), a 100 μM luminol derivative by superoxide, was added, and the amount of chemiluminescence by superoxide was measured for 10 minutes. Continuous measurements were made with a luminometer. The amount of generated chemiluminescence (CL) per unit time was about 2 to 10 minutes, indicating a very stable reactivity, and the amount of chemiluminescence produced was lower than 100 for quercetin, a powerful antioxidant at 10 minutes. From the value, the solvent-treated negative control group recorded a large reactivity of about 250,000 for 10 minutes, each fraction Pch extract showed a lower reactivity, the greater the antioxidant capacity of each (Fig. 4).

실시예 5: 슈퍼옥시드 디스퓨타제 활성분석 Example 5: Superoxide Disputase Activity Assay

슈퍼옥시드에 의한 시토크롬 환원방법을 이용하여, 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성을 분석하였으며, 시토크롬 환원법은 기존 방법을 응용하여 다음과 같이 수행하였다[McCord and Fridovich, 1969, J. Biol. Chem. 244: 6049-6055]. Superoxide dismutase activity was analyzed using the cytochrome reduction method by superoxide, and the cytochrome reduction method was performed by applying the existing method as follows [McCord and Fridovich, 1969, J. Biol. Chem. 244: 6049-6055.

시험관 내에서의 실시예 1에서 분리한 슈퍼옥시드 생성 단백질의 재조합은 반응 완충용액[100 mM HEPES-KOH(pH 7.4), 5 mM 염화마그네슘(MgCl₂ㆍ6H₂O), 0.1 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)]에서 수행하였다. 고무 뚜껑으로 밀폐된 5 mL의 유리병 내에 버퍼와 각 단백질을 넣은 후 이를 밀봉하고 질소로 치환시켰다. 이를 30 ℃에서 30분간 배양하여 상기 단백질의 재조합을 유도한 후 20 μM의 시토크롬(cytochrome c)과 대장균 세포 추출물을 각각 0, 10, 2, 5, 100 ㎍을 첨가하였다. 대장균 세포 추출물은 대장균 세포를 초음파 파쇄기를 이용하여 4 ℃에서 10 분간 세포를 파쇄하고, 이를 4 ℃에서 16,000 g로 원심분리한 상층액을 사용하였다. 시토크롬의 환원은 550 nm에서 흡광도의 증가를 통해 측정하였고, 21000 M^-1cm^-1의 흡광계수(extinction coefficient)를 이용하여 값을 얻어내었다. 이때, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 슈퍼옥시드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase; SOD)가 첨가된 반응(Vi)과 그렇지 않은 반응(Vo)에서의 시토크롬의 환원되는 속도의 비율을 시간에 따라 도 5에서와 같이 그려보면, 슈퍼옥시드 음이온의 생성 정도를 결정할 수 있었다. 즉, (Vi/V0)-1 값이 1이 되는 활성을 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 활성도 1규격(unit)으로 정의하였다. 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 총 활성뿐만 아니라, 시아나이드(CN)에 저항성이 있는 슈퍼옥시드 디스뮤타제도 0.1 ~ 2.5 규격의 활성범위에서 매끄러운 직선의 반응성을 보여 주어, 이 분석법이 효과적으로 슈퍼옥시드 디스뮤타제 활성 분석에 사용될 수 있음을 보여주었다.Recombination of the superoxide producing protein isolated in Example 1 in vitro was carried out in reaction buffer [100 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 5 mM magnesium chloride (MgCl ₂ .6H ₂ O), 0.1 mM dithiostray. To dithiothreitol]. The buffer and each protein were placed in a 5 mL glass jar sealed with a rubber lid, sealed and replaced with nitrogen. After incubation for 30 minutes at 30 ℃ to induce the recombination of the protein 20 μM cytochrome (cytochrome c ) and E. coli cells extract 0, 10, 2, 5, 100 ㎍ were added respectively. E. coli cell extract was used for the supernatant of the E. coli cells were disrupted for 10 minutes at 4 ℃ by using an ultrasonic crusher, centrifuged at 16,000 g at 4 ℃. Reduction of cytochrome was measured by an increase in absorbance at 550 nm, and a value was obtained using an extinction coefficient of 21000 M ⁻¹ cm ⁻¹ . At this time, the ratio of the rate of reduction of the cytochrome in the reaction (Vi) to which the superoxide dismutase (SOD) which removes the superoxide anion is added and the reaction (Vo) to FIG. As shown, the degree of formation of superoxide anion could be determined. That is, the activity at which the value of (Vi / V0) -1 is 1 was defined as the activity 1 unit of superoxide dismutase. In addition to the total activity of superoxide dismutase, cyanide-resistant superoxide dismutase also exhibits smooth linear reactivity in the active range of 0.1 to 2.5. It has been shown that it can be used for dismutase activity analysis.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 광합성 유래 단백질을 혐기성 조건에 서 헤민을 가해 결합되도록 제조하면, 공기 중에서 다이티오나이트 환원제의 존재 하에서 거의 모든 전자가 산소에 제공되어 높은 효율로 슈퍼옥시드가 생성되며, 또한 이 효소반응을 저해하는 저해제도 거의 없어 슈퍼옥시드 음이온을 특이적으로 생성할 수 있다. 따라서, 후보물질이 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 있는 지를 루미노 유도체를 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온에 의해 직접적으로 생겨나는 화학형광의 양을 측정함으로써 생체 복합물질을 그대로 사용하여, 슈퍼옥시드 음이온을 제거하는 활성이 얼마나 있는지를 민감하게 직접적으로 분석, 검색할 수 있다. 본 발명에 따른 슈퍼옥시드 음이온 생성 시약은 특이적이며, 안정적으로 슈퍼옥시드 음이온을 생성하므로, 시토크롬 C나 NBT를 가하여, 생성된 슈퍼옥시드 음이온에 의하여 시토크롬 C나 NBT가 환원된 것을 흡광도의 변화로 측정하여, 슈퍼옥시드 디스뮤타제를 분석하는 방법에 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 검색법은 수용성 NBT를 사용할 경우, 수용성 항산화제의 고속 선별에도 사용 가능하다. As described above, when the photosynthetic-derived protein of the present invention is prepared to bind by adding hemin under anaerobic conditions, almost all electrons are provided to oxygen in the presence of a dithionite reducing agent in air to generate superoxide with high efficiency. In addition, there are few inhibitors that inhibit this enzymatic reaction, so that superoxide anions can be specifically produced. Therefore, by using a lumino derivative to determine whether the candidate substance is active to remove the superoxide anion, by measuring the amount of chemical fluorescence generated directly by the superoxide anion, the bio-composite material is used as it is. Sensitivity can be directly analyzed and searched for how active there is to remove seed anions. Since the superoxide anion generating reagent according to the present invention is specific and stably produces the superoxide anion, by adding cytochrome C or NBT, the reduction of cytochrome C or NBT by the generated superoxide anion is obtained by absorbance. It can also be used in the method of measuring superoxide dismutase by measuring by change. In addition, the screening method according to the present invention can be used for high-speed screening of water-soluble antioxidants when water-soluble NBT is used.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Reagent generating superoxide anion and its application <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 1 atgctcgtgc aggatcatga cagggcaggg ggctactggg gcgccgtcta tgccttctgt 60 gcggtgaagg ggcttcaggt ggtgatcgac ggccccgtgg gctgcgagaa cctgccggtg 120 acctcggtgc tgcattacac cgacgcgctg cccccgcacg agctgcccat cgtggtgacg 180 ggcctcggcg agagcgagat gagcgagggc accgaggcct cgatgagccg ggcctggaag 240 gtgctggatc cggcgctgcc cgcggtggtg gtcacgggct cgatcgccga gatgatcggc 300 ggcggcgtga cgccgcaggg cacgaacatc cagcgcttcc tgccccgcac catcgacgag 360 gaccagtggg aagcggccga ccgggcgatg acctggatct tctcggagtt cgggatgacc 420 aagggtcgca tgccgcccga agccaagcgc cccgaggggg cgaagccgcg ggtgaacatc 480 ctcgggccca tgtacggcgt cttcaacatg gcgtcggacc ttcacgagat tcgccgtctc 540 gtcgagggga tcggcgccga agtgaacatg gtgatgccct tgggcgcgca tctggccgag 600 atgcgacact tggtcaatgc cgacgccaac atcgtcatgt accgcgaatt cggccgcggg 660 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Rhodobacter sphaeroides <400> 2 Met Leu Val Gln Asp His Asp Arg Ala Gly Gly Tyr Trp Gly Ala Val 1 5 10 15 Tyr Ala Phe Cys Ala Val Lys Gly Leu Gln Val Val Ile Asp Gly Pro 20 25 30 Val Gly Cys Glu Asn Leu Pro Val Thr Ser Val Leu His Tyr Thr Asp 35 40 45 Ala Leu Pro Pro His Glu Leu Pro Ile Val Val Thr Gly Leu Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Met Ser Glu Gly Thr Glu Ala Ser Met Ser Arg Ala Trp Lys 65 70 75 80 Val Leu Asp Pro Ala Leu Pro Ala Val Val Val Thr Gly Ser Ile Ala 85 90 95 Glu Met Ile Gly Gly Gly Val Thr Pro Gln Gly Thr Asn Ile Gln Arg 100 105 110 Phe Leu Pro Arg Thr Ile Asp Glu Asp Gln Trp Glu Ala Ala Asp Arg 115 120 125 Ala Met Thr Trp Ile Phe Ser Glu Phe Gly Met Thr Lys Gly Arg Met 130 135 140 Pro Pro Glu Ala Lys Arg Pro Glu Gly Ala Lys Pro Arg Val Asn Ile 145 150 155 160 Leu Gly Pro Met Tyr Gly Val Phe Asn Met Ala Ser Asp Leu His Glu 165 170 175 Ile Arg Arg Leu Val Glu Gly Ile Gly Ala Glu Val Asn Met Val Met 180 185 190 Pro Leu Gly Ala His Leu Ala Glu Met Arg His Leu Val Asn Ala Asp 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335 Leu Val Leu Met Gly Ser Ile Asn Glu Lys Ile Tyr Leu Ala Glu Leu 340 345 350 Lys Ala Gly His Gly Pro Gln Pro Ser Phe Ile Ala Ala Ser Phe Pro 355 360 365 Gly Ala Ala Ile Arg Arg Ala Thr Gly Thr Pro Val Met Gly Tyr Ala 370 375 380 Gly Ala Thr Trp Leu Leu Gln Glu Val Cys Asn Ala Leu Phe Asp Ala 385 390 395 400 Leu Phe His Ile Leu Pro Leu Gly Thr Glu Met Asp Ser Ala Ala Ala 405 410 415 Thr Pro Thr Thr Leu Arg Arg Asp Phe Pro Trp Asp Ala Asp Ala Gln 420 425 430 Ala Ala Leu Asp Arg Ile Val Glu Glu His Pro Val Leu Thr Arg Ile 435 440 445 Ser Ala Ala Arg Ala Leu Arg Asp Ala Ala Glu Lys Ala Ala Leu Asp 450 455 460 Ala Gly Ala Glu Arg Val Val Arg Glu Thr Val Glu Ala Leu Arg Gly 465 470 475 480 Pro Gly Phe Gly Glu Arg Lys Gly Glu Asn Gln 485 490

Claims

delete

A superoxide anion generating reagent, which is expressed in E. coli and is prepared to stably produce a superoxide anion by reacting a hemin-bound BchZ protein with a dithionite reducing agent.

A method of searching for a superoxide anion removing active material, characterized in that the amount of luminescence is measured by adding a superoxide anion removing activity candidate material and a luminol derivative to the reagent of claim 3.

Analyzing the activity of the superoxide dismutase, characterized in that by measuring the absorbance change of the reduction of cytochrome C or NBT by the anion generated by adding cytochrome C or NBT (nitro blue tetrazolium) to the reagent of claim 3 Way.