KR100866784B1

KR100866784B1 - 개서어나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료조성물

Info

Publication number: KR100866784B1
Application number: KR1020070045764A
Authority: KR
Inventors: 유병삼; 함영민; 문지영; 김재우; 김주호; 유권종; 김철수; 김대신
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2008-11-04

Abstract

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 추출물에 관한 것으로, 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎의 추출물이 MMP-1을 저해하며, 피부세포독성 완화 효과와 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있음을 밝혀 피부주름개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

개서어나무, 화장료, 피부주름, 콜라겐합성촉진

Description

개서어나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물{cosmetic compositions containing extract of Carpinus tschonoskii used for antiwrinkle}

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 추출물에 관한 것으로, 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎의 추출물이 MMP-1을 저해하며, 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있음을 밝혀 피부주름 개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

사람의 피부는 25세를 전후해서 노화가 촉진되는데 자연노화와 외적노화로 구분되며 자연노화는 유전적요소에 주로 기인하므로 조절하기 어렵다. 외적노화는 오염물과 먼지, 공해 자외선 등 외부 요인에 의해 발생하므로 인위적 조절이 가능하다. 이 중 특히 피부가 자외선에 노출 되었을 때 섬유아세포에서 활성산소종이 생성되어 콜라게네이즈(collagenase, 이하 MMP-1)의 발현이 유도된다.(Yoshiharu Kawaguchi et al. ,1996)

MMP-1은 세포외 기질인 콜라겐을 분해하는 효소로서 기질 금속단백질분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 'MMP'라 칭함) 의 한 종류이다. MMP-1은 콜라겐 타입 I을 분해한다. 따라서 MMP-1의 발현이 유도되면 콜라겐의 합성이 감소하여 피 부에 주름이 발생하게 된다.(Laure Rittie et al., 2002)

지금까지 연구보고된 주름완화 및 피부노화 예방 물질로는 레티놀, 아데노신, AHA 등이 개발되어 있으나 안정성이 떨어지며 피부자극을 유발하고 뚜렷한 가시적인 효과가 미흡하다는 문제점을 안고 있다. 따라서 앞선 문제점들을 보완할 수 있는 주름개선 및 피부노화예방 소재 연구가 필요한 상황이다.

한편, Carpinus 속은 40 종으로 구성되며 북반구의 온대 지역에 분포하는데, C. tschonoskii, C. laxiflora, C. cordata, C. turczaninowi 및 C. coreana의 5 종만이 한반도에 분포한다(Lee et al., 1989). Carpinus 속으로부터 플라보노이드를 분리하였다는 보고가 있으며, 여기에는 플라보놀(flavonols) 미리세틴(myricetin), 캄페롤(kaempferol) 및 쿠에르세틴(quercetin), 그리고 플라본(flavones) 아피게닌(apigenin) 및 루테올린(luteolin)이 존재한다고 알려져 있다.(Chang et al., 2004)

한국특허등록번호 제478136호(2005.3.11)에는 항산화 활성을 가지는 식물유래추출물을 기재하고 있으며, 여기에 본 발명과 같은속 식물인 서어나무(C. laxiflora)추출물도 항산화활성을 가지는 것으로 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 피부주름개선효과를 나타내는 콜라겐합성촉진효과와 콜라게나제의 활성저해효과는 개시되어 있지 않다.

본원 발명은 천연유래추출물을 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하고자 하는 것으로, 개서어나무 추출물이 피부주름개선에 효과가 있음을 밝혀 이를 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 추출물에 관한 것으로, 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎의 추출물이 MMP-1을 저해하며, 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있음을 밝혀 피부주름 개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 개서어나무 추출물은 개서어나무 잎을 60 ~ 95중량% 에탄올, 메탄올, 1,3-부틸렌글리콜 등을 추출용매로 사용하여 추출한 것으로 본 발명자는 개서어나무 추출물의 유효활성성분이 에틸갈레이트(ethyl gallate) 임을 처음으로 밝혔다.

본 발명에 따른 피부주름개선용 화장료 조성물에 함유되는 개서어나무 잎 추출물의 함량은 조성물 전체중량 의 0.0001 내지 1 중량% 포함되는 것이 바람직하다.

0.0001 중량%이하 함유하면 본 발명의 효과를 기대하기 어렵고, 1중량% 이상 함유하면 화장료조성물의 제제화에 어려움이 있다.

실시예 1 : 개서어나무 잎 에탄올추출물의 제조

개서어나무 잎은 한라수목원에서 채취, 동정되었다. 시료를 정제수로 세척하고 건조하여 분쇄하였다. 건조 분쇄된 개서어나무 잎 150g을 80% 에탄올 5L로 상온에서 초음파를 이용하여 4시간 동안 추출한 후 어드반텍 NO. 4 (제조판매원:Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)여과포로 여과한다. 여액을 감압회전농축기를 이용하여 건조중 량 19.3g 을 얻었다.

실시예 2 : 개서어나무 잎 에탄올 추출물의 용매분획물 제조

실시예 1에서 얻은 개서어나무 잎 에탄올추출물에 대해 용매분획을 실시하였다.

개서어나무 잎 에탄올추출물 12g을 헥산과 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 통상적인 방법으로 용매분획을 실시하여 각각 1.29g, 0.82g, 1.98g, 2.53g, 1.74g을 얻어냈다.

실시예 3 : 개서어나무 잎 추출물로부터 유효 활성성분 분리 및 구조 확인

실시예 2에서 얻은 각 분획물 중 DPPH 라디칼 소거 활성과 세포내 활성산소 소거 효능이 가장 우수했던 에틸아세테이트 분획에 대해 Prep-LC를 실시하여 총 3개의 분획을 얻었다. HPLC 분석 결과 정제율이 좋았던 2번 분획에 대해 UV, NMR을 이용하여 구조를 분석하였다. 216, 271nm에서 최대 UV흡광도를 보였다. NMR을 이용한 구조 분석에서는 7.08ppm(적분값 : 2H)에서 단일피크, 4.8ppm(적분값 : 2H)에서 4사중 피크, 1.28ppm(적분값 : 3H)에서 삼중피크를 확인하였으며 이를 참고 문헌(Jong Min Kim et al., 2006)과 비교하여 ethyl gallte임을 확인하였다. Etyhl gallate는 이미 항산화효과, 항혈전효과, 히스타민 방출 억제효과 등 다양한 생리 활성이 밝혀진 물질이다.

그러나 개서어나무로부터 ethyl gallte를 분리 동정한 결과는 본 연구결과가 처음이다.

삭제

본 발명에서는 개서어나무 잎 에탄올 추출물 중 ethyl gallate 0.1~2중량% 를 포함하는 것을 확인하였다.

실시예 4 : 콜라겐 합성 촉진 효과 측정 실험

본 실시예에서는 수득한 시료들의 콜라겐 합성 촉진효과를 측정하기위해 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다.

96공 평판배양기(96-well plate)에 5% 우태아혈청이 함유된 IMDM(Iscove's Modified Dulbesco's Media) 배지와 함께 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입한 인간의 정상섬유아세포(CCD-985sk)를 5000 세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 10% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간 후 시료를 우태아혈청이 포함되지 않은 IMDM 배지에 농도별로 희석하여 2일 동안처리하고 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Procollagen Type I-C-peptide EIA Kit(MK101), Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐(Procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide : PICP) 합성양을 측정하였다.

측정방법은 우선 콜라겐 항체가 균일하게 도포되어 있는 96공 평판배양기에 POD(perosidase)효소가 결합된 항체용액 100㎕와 채취된 세포배양액 20㎕를 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 상등액을 모두 제거하고 각 well을 400㎕의 PBS로 4회 세척하였다. 세척 후 각 well에 POD와 반응하는 기질용액 100㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위해 1N 황산용액 100㎕를 첨가하여 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. PICP양은 콜라겐 측정 키트에 포함되어 있는 표준용액을 희석하여 작성된 표준농도곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였다. 또한 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

개서어나무 잎 추출물의 콜라겐 합성 촉진 효과

시 료	농도(㎍/㎖)	합성된 콜라겐량 (ng/㎖)
개서어나무 잎 에탄올 추출물	0.01	126
	0.05	182
	0.1	241
	0.5	290
개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획	0.01	112
	0.05	128
	0.1	135
	0.5	235
대조군		92

표 2에 나타난 바와 같이 개서어나무 잎 에탄올 추출물과 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획은 시료를 처리하지 않은 대조군보다 약 3배 정도 콜라겐 합성량을 증가시켰음을 확인하였다. 특히 에틸아세테이트 분획물 보다 에탄올 추출물이 더 우수한 콜라겐 합성효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 5 : SLS에 의해 유발되는 세포독성 완화 효과

SLS(Sodiul lauryl sulfate)는 화장품에 첨가되는 계면활성제로 접촉성 피부염을 일으키는 대표적인 부식성 자극물질로 피부장벽 기능의 손실을 유발하며 경표피 수분손실을 증가시킨다. 본 실시예에서는 수득한 시료들의 인간 정상섬유아세포에 대한 SLS 자극완화 효과를 평가하고자 세포 배양 기술을 이용하여 실험을 수행하였다.

사람의 정상 섬유아세포 (Human normal fibroblast)를 IMDM 배지가 들어 있는 96-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고 (2x10⁴ 세포/well), 10% CO₂ 조건에서 37℃로 24시간 배양하였다. 상기 사람의 정상 섬유아세포는 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입하였다. 먼저 예비 실험을 통해 개서어나무 잎 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물이 10㎍/㎖ 농도 이내에서 세포 독성이 없음을 동일조건의 실험을 통해 확인하였다. 그 후 100㎍/㎖ SLS와 농도별로 희석된 각 시료를 동시에 처리하고 음성대조군으로 100㎍/㎖ SLS를 단독으로 처리하여 24시간동안 추가 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 각 웰 당 MTT 용액 [3-(4,5-Dimethyl-thiazole-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide : 2.0 ㎎/㎖] 50㎕를 첨가하였다. 4시간 동안 반응 후, MTT 용액을 제거하고. 각 웰당 200㎕의 디메틸설폭시드 (DMSO :Dimethyl sulfoxide)용액을 가하여 20분간 교반하여 생성된 formazan을 녹였다. 마이크로플레이트 리더 (microplate Reader)를 사용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 시료의 SLS에 의한 세포 독성 완화 효과를 확인하였다.

SLS에 의해 유도된 세포독성 완화효과

샘 플 (㎍/㎖)	세포생존률(%, control)
개서어나무 잎 에탄올 추출물(0.1)+SLS(100)	99.8
개서어나무 잎 에탄올 추출물(1.0)+SLS(100)	102.2
개서어나무 잎 에탄올 추출물(5.0)+SLS(100)	104.0
개서어나무 잎 에탄올 추출물(10)+SLS(100)	103.6
개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획(0.1)+SLS(100)	80.4
개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획(1.0)+SLS(100)	100.8
개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획(5.0)+SLS(100)	97.2
개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획(10)+SLS(100)	95.1
SLS(100)	43.0

표 3 결과로부터 개서어나무 잎 추출물과 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 화장료 조성물에 포함되었을 때 계면활성제에 의해 나타날 수 있는 피부자극을 완화하는 물질임을 확인하였다.

실시예 6 : 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 측정 실험

본 실시예에서는 수득한 시료들의 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 효과를 관찰하기 위해 수행 하였으며 정제된 콜라게나제와 플루오레세인에 접합된 콜라겐의 이용을 기초로 한다.

먼저, 반응 완충액(0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.02mM NaN₃, pH7.3) 100㎕에 0.25㎎/㎖의 DQ^TM콜라겐 용해액(Molecular probes, USA) 20㎕와 농도별 시료를 40㎕씩 첨가한 다음, 5 Unit의 콜라게나제(GIBCO, USA) 40㎕와 잘 혼합하여 암소, 상온에서 20분간 반응하였다. 그 후 형광 분광광도계를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚에서 형광값을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차추출물( 김지은, 인체피부 섬유아세포에서 열자극에 의해 유도되는 type Ⅰprocollagen, MMP-1과 TIMP-1 발현에 대한 녹차추출물(epigallocatechin-3-gallate)의 효과: 고려대학교 생명환경과학대학원 생명유전공학과, 2004. 2)을 사용하였다.

참고로, 녹차 추출물에 대한 콜라게네이즈 효소생성억제 작용은 대한민국 특허 특1999-0056976에 개시되어 있다. 각 시료의 콜라게나제의 활성 저해효과는 효소활성을 50% 소거하는 농도인 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 실험액의 형광값으로 하였다.

MMP-1 저해효과

sample	농도(㎍/㎖)
	10	50	100	200	IC₅₀
	MMP-1 Inhibition(%)				IC₅₀
개서어나무 잎 에탄올 추출물	2.59	51.40	80.05	91.18	45.77
개서어나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획	31.29	87.88	91.57	91.90	17.02
녹차추출물	1.11	10.67	24.84	49.19	>200

표 4에서 나타난 바와 같이 개서어나무 잎 에탄올 추출물과 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획물은 기존의 MMP-1저해제로 알려진 녹차추출물보다 매우 뛰어난 MMP-1저해물임을 확인하였다. 특히 개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세티이트 분획물은 녹차추출물보다 약 10배 우수한 효과를 나타내었다.

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 추출물에 관한 것으로, 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎의 추출물은 MMP-1을 저해하고 피부세포독성 완화 효과가 있으며 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있어 피부주름 개선에 유용한 화장료로서 사용가능하다.

Claims

개서어나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 개서어나무 잎 추출물의 함량은 조성물 전체중량의 0.0001 내지 1 중량% 임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 개서어나무 잎추출물은 에탄올추출물 임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 개서어나무 잎추출물은 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획 임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부세포 독성 완화 효과가 있는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 콜라겐 합성 촉진효과에 기 인한 것임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 MMP-1의 활성저해효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물.