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KR100858009B1 - 세균 배양물의 상층액으로 목적 단백질의 분비를 위한 융합 단백질 - Google Patents

세균 배양물의 상층액으로 목적 단백질의 분비를 위한 융합 단백질 Download PDF

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KR100858009B1
KR100858009B1 KR1020037010943A KR20037010943A KR100858009B1 KR 100858009 B1 KR100858009 B1 KR 100858009B1 KR 1020037010943 A KR1020037010943 A KR 1020037010943A KR 20037010943 A KR20037010943 A KR 20037010943A KR 100858009 B1 KR100858009 B1 KR 100858009B1
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KR
South Korea
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dna
protein
supernatant
host cell
fusion protein
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Application number
KR1020037010943A
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KR20030074842A (ko
Inventor
하베르만파울
에르틀요한
Original Assignee
사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 filed Critical 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Publication of KR20030074842A publication Critical patent/KR20030074842A/ko
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Abstract

본 발명은 융합 부분과 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질, 세균 숙주의 상층액으로 분비되는 융합 단백질을 초래하는 두 단백질의 조합 및 정확한 삼차원 구조로 존재하는 목적 단백질에 관한 것이다.
융합 단백질, 발현 카세트, 시그날 서열, 프로인슐린, 히루딘, 세균

Description

세균 배양물의 상층액으로 목적 단백질의 분비를 위한 융합 단백질 {Fusion protein for the secretion of a protein of interest into the supernatant of the bacterial culture}
본 발명은 융합 부분 및 목적 단백질을 포함하고 두 단백질의 조합이 당해 융합 단백질이 세균 숙주의 상층액으로 분비되도록 하고 목적 단백질이 올바른 삼차 구조로 존재하는 융합 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질에 대한 유전자 서열은 세균 숙주에서 발현을 허용하는 발현 카세트(expression cassette)의 일부분이다. 본 발명은 발현 카세트를 사용하는 융합 단백질의 발효, 발현 및 후처리를 위한 방법, 발현 카세트를 포함하는 플라스미드, 염색체에 통합된 및/또는 예를 들면 플라스미드와 같은 레플리콘(replicon)으로서 발현 카세트를 포함하는 세균 숙주 세포, 융합 부위로서 히루딘 또는 이의 유도체를 가진 상기 융합 단백질, 인슐린 또는 인슐린 유도체를 생산하는 방법 및 히루딘 또는 이의 유도체로부터 융합 단백질을 제조하고 인슐린 또는 인슐린 유도체를 생산하는 방법에서 당해 발현 카세트의 용도에 관한 것이다.
재조합 단백질을 기초로 약제를 생산하는 최적화된 방법의 개발은, 가능하다면, 두 관점을 공평하게 다루어야만 한다는 것을 나타낸다. 첫째, 방법은 가능한 한 비용- 효율적이어야 하고, 둘째로, 생성물이 최상급 순도여야 한다.
이 점에 있어, 발현 시스템의 선택은 특정 생산 방법의 과정을 결정하고, 신규한 단백질-화학 기술의 발전 및 생화학적 가능성의 다양함 및 공지된 기술의 새로운 조합이 항상 기존의 방법을 개선시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.
목적하는 단백질의 특성은 결정적인 방식으로 합성에 사용되는 숙주 세포 시스템의 선택을 결정한다. 이. 콜라이(E. coli)같은 세균은 값싼 배지에서 몇 그램의 조악한 수율로 빠르게 단백질을 생산할 수 있는 시스템을 대표한다. 상기 시스템은 특히 변형될 필요 없고 시험관 내에서 생물학적으로 활성 있는 형태로 재생될 수 있는 단백질에 대해 특히 유용하게 된다. 예를 들면 인슐린과 같이, 많은 양이 요구되는 단백질에서는, 봉입체의 형태로 단백질의 세포 내 축적을 이끄는 발현 속도가 지향된다. 세포 용해 후, 단백질은 용해되고, 추가의 공정 단계에서 폴딩된다. 그러나, 폴딩 공정은 정량적이지 않다. 그 이유는 봉입체 형성 동안의 비가역적 손상, 세포 용해 동안의 상응하는 손상 및 폴딩되는 동안의 오차 때문이다. 그리고 나서 "잘못" 폴딩되거나 변형된 분자는 추가의 분리 단계에서 제거되어야한다. 이는 생산 비용 면에서 불리한 효과이다. 부가하여, 상기 분자의 흔적은 역시 최종 생성물에서 재출현한다. 약제는 높은 순도 기준을 따라야하므로, 적절하게 주의 깊고 비용 집약적인 정제가 필요하다. 유리한 비용/ 조악한 수율 비율로 인해, 배양 배지로 적절하게 폴딩된 형태로 목적 단백질의 이. 콜라이에 의한 배출을 허용하는 방법이 바람직하다. 그러나, 이는 지금까지 예외적인 경우에서만 성공적이었다.
국제 특허원 PCT/EP00/08537에서는 그런 예외를 기술한다. 이. 콜라이에 의해서 그램 양으로, 약제학적 레플루단R의 활성 성분인, 레피루딘의 합성 및 배출은 배출을 위한 특별한 시그날 서열을 사용한 경우 성공적이었다. 독일 특허원 제100 33 195.2호(공개 되지 않은)는 히루딘 및 히루딘 유도체와 진드기로부터의 인자 Xa 억제제 및 이의 유도체로 구성된 두 가지 기능을 하는 단백질을 기술한다. 상기 단백질은 마찬가지로 높은 수율로 이. 콜라이에 의해서 합성되고 배출될 수 있다. 이 발견에 부가하여서, 히루딘이 TAP와의 융합 단백질로서 뿐만 아니라 프로인슐린 유도체와 같은 폴리펩티드와의 융합 단백질의 일부로서 높은 수율로 배출된다는 것, 이는 생물학적으로 활성이 있다는 것 및 놀랍게도 프로인슐린과 같은 융합 파트너는 올바른 삼차원 구조로 존재한다는 것이 그 후 놀랍게 밝혀졌다. 이 예상치 못한 결과는 수율에서 무시할 수 없는 손실과 관련된 세포내 발현 후 시험관내 재폴딩 단계가 배제될 수 있기 때문에, 예를 들면, 세균 숙주/벡터 시스템에 의한 인슐린의 더 비용 효과적인 생산의 가능성 및 이 방식으로 더 간단한 단백질 정제 공정 결과를 초래한다. 다른 장점은 이. 콜라이에서 인슐린의 생산을 위한 전통적인 방법에서 융합 단백질을 용해시키는데 부가되는 카오트로픽 보조제(chaotropic aids)가 필요하지 않다는 것이다. 생태학적으로, 이는 해당하는 폐기물을 피함으로써 환경 오염이 더 적어지도록 이끈다.
예를 들어, 히루도(Hirudo) 형의 거머리는 트롬빈 억제제 히루딘의 다양한 동종형(isoform)을 발전시켰다. 히루딘은 예를 들면 N-말단 아미노산의 교환(예를 들면 EP-A 0 324 712)과 같은 분자의 인위적 변이에 의해서 약제학적 요건이 최적화되었다.
본 발명은 예를 들면 원숭이의 프로인슐린 또는 이의 유도체와의 융합 단백질을 형성하기 위한 히루딘 및 히루딘 변이체의 사용을 포함한다. 본 발명의 특정한 양태는 천연적인 히루딘 동종형(천연적인 동종형은 모두 "히루딘"으로 표기된다) 중의 하나의 사용을 포함한다. 천연적 동종형은, 예를 들면, Val-Val-히루딘 또는 Ile-Thr-히루딘이다. 본 발명의 다른 양태는 천연적 히루딘 동종형의 변이체를 사용한다. 변이체는 천연적인 히루딘 동종형으로부터 유도되나 예를 들면, 천연적 동종형과 비교했을 때 부가적 아미노산 및/또는 아미노산 결실 및/또는 아미노산 교환을 포함한다. 히루딘 변이체는 천연적 히루딘 동종형의 교대하는 펩티드 절편 및 새로운 아미노산을 포함할 수 있다. 히루딘 변이체는 예를 들어, DE 3 430 556에서 기술되고 공지되었다. 히루딘 변이체는 상업적으로 단백질[참고 자료 : CalbiochemR Biochemicals, Cat.no.377-853, -950-960] 형태로 이용 가능하다.
인슐린은 두 아미노산 쇄, 즉 21개의 아미노산을 가진 A 쇄와 30개의 아미노산을 가진 B 쇄로 분기된 51개의 아미노산의 폴리펩티드이다. 쇄는 2개의 디설피드 가교(disulfide bridge)로 서로 연결된다. 인슐린 조성물은 오랜 기간동안 당뇨병 치료제로서 사용되어 왔다. 이는 천연 발생하는 인슐린뿐 아니라 인슐린 유도체 및 동족체(analog)도 포함한다.
인슐린 유도체는 천연 발생하는 인슐린, 즉 사람의 인슐린 또는 동물의 인슐린의 유도체로서, 천연 발생하는 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환 및/또는 아미노산 잔기 및/또는 유기물 잔기 하나 이상의 부가에 의해서 상응하는 천연 발생 인슐린과 상이한 인슐린이다.
일반적으로, 인슐린 유도체는 사람의 인슐린과 비교하여서 약간 변형된 작용을 한다.
가속화된 작용 개시를 나타내는 인슐린 유도체는 EP 0 214 826, EP 0 375 437 및 EP 0 678 522에서 기술되어 있다. 그 중에서도 EP 0 124 826은 B27 및 B28의 치환과 관련된다. EP 0 678 522는 B29 위치에, 바람직하게는 프롤린, 그러나 글루탐산(glutamic acid)은 제외하는, 다양한 아미노산을 가진 인슐린 유도체를 기술한다. EP 0 375 437은 적절하게 B3 및/또는 A21에서 부가적으로 변형될 수 있는, B28에 라이신 또는 Arg이 위치한 인슐린 유도체를 포함한다.
EP 0 419 504는 B3에 아스파라긴 및 A5, A15, A18 또는 A21의 위치에 하나 이상의 다른 아미노산의 변형에 의해서 화학적 변형으로부터 보호되는 인슐린 유도체를 기술하고 있다.
WO 92/00321은 B1 내지 B6의 위치에 하나 이상의 아미노산이 라이신 또는 Arg으로 교환된 인슐린 유도체를 기술한다. WO 92/00321에 의하면, 이 종류의 인슐린은 연장된 작용을 나타낸다.
유전 공학에 의해서 인슐린 및 인슐린 유도체를 생산할 때, B, C 및 A 쇄를 포함하는 인슐린 전구체인 "프로인슐린"(proinsulin)이 자주 발현된다. 상기 프로인슐린은 적절하고 정확한 폴딩 및 디설피드 가교의 형성 후 C 쇄의 효소적 또는 화학적 제거에 의해 인슐린 또는 인슐린 유도체로 전환된다. 프로인슐린은 자주 융합 단백질의 형태로 발현된다. 마찬가지로 "원하지 않는" 융합 파트너는 화학적으로 또는 효소적으로 제거될 필요가 있다.
재조합된 숙주/벡터 시스템의 선택으로 재조합된 세포의 배양, 증식 및 발효의 방법을 결정하는 것은 당업자에게 명확하다. 마찬가지로 이는 본 발명의 주제이다.
융합 단백질은 놀랍게도 산성 배지에서 우수한 용해도를 나타내며, 이는 단백질의 화학적 후처리에 관해서 명백한 장점으로 이끈다. 첫째로, 상층액의 많은 원하지 않는 성분이 상기 조건하에서 침전되고, 둘째로, 펩티다제 또는 프로테아제는 불활성이다. 그러므로, 조작 종결시에 발효 브로쓰를 산성화하는 것은, 융합 단백질로부터 숙주 세포와 함께 원하지 않는 상층액 단백질을 직접적으로 분리할 수 있게 하고, 추가의 단계에서, 상기 융합 단백질을 농축시킬 수 있게 한다. 마찬가지로 이는 본 발명의 주제이다.
발효의 마지막에서, 폴딩하는 과정은 아직 100% 완전하지 않을 수 있다. 예를 들면, 머캅탄(mercaptan) 또는 시스테인 하이드로클로라이드의 부가로 당해 공정을 완결할 수 있다. 이는 마찬가지로 본 발명의 주제이다.
만일 두 단백질이 다른 어떤 위치보다 융합 단백질을 효과적으로 절단하는 엔도프로테아제에 의해서 특별히 인지되는 아미노산의 링커를 통해서 융합된다면, 목적 단백질은 즉각 활성 있는 형태로 절단될 수 있다. 인슐린 생산의 경우에, 히루딘과 프로인슐린 사이의 링커는 바람직하게 카르복시-말단에 Arg을 포함한다. 그리고 나서 동시적인 프로세싱에서 트립신을 사용한 전환에 의해 융합 부분을 절단하고 프로인슐린을 모노(mono)- 또는 디(di)-Arg-인슐린으로 전환하는 것이 가능하다. 상기 링커는 히루딘 부분을 절단하는 것이 인슐린의 B 및 A 쇄를 연결하는 C 펩티드 서열 또는 이의 유도체에서의 절단보다 더 느리지 않도록 인슐린 프로세싱과 관련하여 최적화되어야만 한다. 이는 마찬가지로 본 발명의 주제이다. 사용된 수 있는 발현 시스템의 실시예는 유럽 특허 0 468 539의 도 1에서 기술된, 벡터 pJF118이다.
예를 들면, 프로인슐린 또는 프로인슐린 유도체를 암호화하는 DNA 서열을 포함한 플라스미드는 특허 EP-A 0 489 780 및 PCT/EP00/08537에서 기술된다.
EP-A 0 324 712에 따라 히루딘에 대한 서열을 포함하는 플라스미드 pK152는 히루딘에 대한 DNA 서열의 공급원으로 사용된다.
세균의 내막을 통과하는 목적 단백질의 외부 수송(export) 적격성은 분비에서 중요하다. 이에 관련해서, 다른 단백질에 대해 어느 정도 최적화될 수 있는 시그날 서열의 선택이 중요하다. 특허원 PCT/EP00/08537은 PCR에 기초한 시그날 서열 선별의 시스템을 기술한다. 또한 이 시스템은, 히루딘 활성이 놀랍게도 손상되지 않고 남아있어서 트롬빈 억제 검정을 통해서 쉽게 상층액에서 탐지할 수 있으므로, N 말단의 융합 부분에 히루딘을 포함하는 융합 단백질에 적용할 수 있다.
그러므로 본 발명은 하기 형태의 융합 단백질을 암호화하는 DNA(다른 용어 : 발현 카세트)에 관한 것이다 :
-F-Asm-Rn-Y-
상기식에서,
F는 발효 배지로 단백질 Y의 분비를 허용하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이며,
As는 유전자 코드에 의해 암호화될 수 있는 아미노산을 암호화하는 DNA 서열 또는 화학 결합이고,
m은 0부터 10까지의 정수이며,
R은 화학 결합 또는 아르기닌(Arg) 코돈이고,
n은 0 또는 1이며,
Y는 정확하게 폴딩되고, 발효 배지내 융합 단백질의 일부인, 목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
바람직하게, 히루딘 또는 이의 유도체(F) 및 프로인슐린 또는 이의 유도체(Y)를 암호화하는 DNA 서열을 선택한다.
게다가 본 발명은 하기 형태의 발현 카세트(다른 용어 : DNA 분자)에 관한 것이다:
P-S-F-Asm-Rn-Y-T
상기식에서,
P는 프로모터이고,
S는 최적화된 수율을 허용하는 시그날 서열을 암호화하는 DNA 서열이며,
T는 해독되지 않는 발현-증강 DNA 서열이다.
더욱이 본 발명은 상기 기술된 발현 카세트를 포함한 플라스미드, 및 이. 콜라이, 상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포 또는 바람직하게 숙주 게놈에 통합된 상기 발현 카세트를 포함한 상기 숙주 세포에 관한 것으로서, 당해 숙주 세포는 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
또한 본 발명은
(a) 상기 기술된 DNA 분자를 상기 기술된 것과 같은 숙주 세포에서 발현하는 단계, 및
(b) 발현된 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 상기 기술된 것과 같은 융합 단백질의 발효적 생산에 대한 방법, 바람직하게, 상기 발현된 단백질을 분리하기 위해서 상층액을 숙주 세포로부터 분리하고, 발현된 단백질을 상기 상층액으로부터 분리하는 방법; 및 침전 후 상층액에서 발현된 단백질을 농축시키는 공정 단계가 미세여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법, 및 바람직한 양태로, 발현된 단백질의 분리가 발현된 단백질이 용액에 남아있는 동안 배양 배지의 성분 또는 상층액을 침전시키는 단계를 포함하는 방법; 및 더 바람직한 양태로, 발효 후 머캅탄 또는 시스테인 하이드로클로라이드를 pH 6 내지 9에서 발효 상층액에 부가하여서, 유리 SH 그룹 농도가 0.05 내지 2.5 mM에 이르게 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특정한 양태는 숙주 세포로부터 발효 상층액을 분리하고, 더 나아가 숙주 세포를 새로운 배지에서 배양하고, 상층액으로부터 방출된 융합 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 즉, 본 발명의 추가의 양태는 상기 기술한 것처럼, 숙주 세포로부터 발효 상층액을 분리해낸 후, 숙주 세포를 새로운 배지에서 반복적으로 배양하고, 방출된 융합 단백질을 배양 기간동안 수득한 각각의 상층액으로부터 분리하는 방법이다.
게다가 본 발명은
(a) 상기 기술된 것과 같은 방법에서 발현된 단백질을 수득하는 단계,
(b) 상기 (a) 단계로부터 목적 단백질, 특히 인슐린 또는 인슐린 유도체를 효소적 또는 화학적 분해로 방출시키는 단계, 및
(c) 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 인슐린 또는 인슐린 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 제한하는 것으로 의도하지 않는 다음의 실시예는 더욱 상세하게 본 발명을 기술한다.
실시예 1 : 슈도모나스 플루오리센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 oprF 유전자 생성물의 시그날 서열에 부가된, 레피루딘-GNSAR-원숭이의 프로인슐린 융합 단백질의 작제
특허원 PCT/EP00/08537의 실시예 2는 슈도모나스 플루오리센스 oprF 유전자 생성물[참고 자료 : De, E. et al. FEMS Microbiol Lett. 127, 263-272, 1995]의 시그날 서열을 통해서 이. 콜라이에 사용되는 배지로 레플루단의 발현 및 분비를 허용하는 발현 벡터를 기술한다. 상기 벡터는 레플루단-GNSAR-원숭이의 프로인슐린 융합 단백질(GNSAR=서열번호 1)을 작제하는 역할을 하며 pBpfu_hir로 표기된다.
게다가 시작 물질은 pJF118(EP 0 468 539) 및 pK152(PCT/EP00/08537)인 플라스미드 DNA이다. 다음의 올리고뉴클레오티드가 요구된다:
프라이머 pfuf1
5'GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca3' (서열번호 2)
프라이머 insu11hindⅢ
5'-TTTTTAAGCT TCATGTTTGA CAGCTTATCA T -3' (서열번호 3)
프라이머 Hir_insf1
5' ATCCCTGAGG AATACCTTCA GGGAAATTCG GCACGATTTG TG -3' (서열번호 4)
프라이머 Hir_insrev1
5' - CACAAATCGT GCCGAATTTC CCTGAAGGTA TTCCTCAGGG AT -3' (서열번호 5)
프라이머 pfuf1은 발현 벡터에서 시그날 서열 및 레피루딘의 접합부(junction)를 암호화하는 DNA 부위와 하이브리드화한다.
굵은 글씨로 보이는 프라이머 Hir_insrev1의 부분은 플라스미드 pINT90d에서 프리프로인슐린(preproinsulin) 및 원숭이의 프로인슐린 서열의 접합부를 암호화하는 DNA 부분과 플라스미드 pK152에서 히루딘 서열의 3' 말단 서열과 하이브리드화 한다. 프라이머 Hir_insrev1는 프라이머 Hir_insf1와 100% 상보적이다.
프라이머 insu11hindⅢ는 pINT90d에서 클로닝되고 원숭이의 프로인슐린 서열을 암호화하는 DNA 부분의 3' 말단을 나타내고 부가적으로 제한 효소 HindⅢ에 의해 인지되는 헥사뉴클레오티드 서열을 운반한다.
두 개의 표준적인 중합효소 연쇄 반응은 주형으로서 플라스미드 pINT90d와 함께 Hir_insf1/Insu11HindⅢ 프라이머 쌍 및 주형으로서 플라스미드 pBpfu_hir과 함께 pfuf1/Hir_insrev 프라이머 쌍을 사용하여 수행한다. 두 반응의 생성물을 결합시켜서 분취량은 프라이머 pfuf1/Insu11HindⅢ와 함께 세 번째 중합효소 연쇄 반응으로 전환시킨다. 그 결과는 시그날(부분적으로)-레피루딘-GNSAR-원숭이의 프로인슐린 서열을 포함한 DNA 생성물이다. DNA 단편은 제한 효소 BamHⅠ 및 HindⅢ(레피루딘 서열을 절단시에는 BamHⅠ를 사용하고 프로인슐린 암호화 서열의 3' 말단은 HindⅢ를 사용하여 절단함)를 사용하여 전환한다.
유사한 반응에서, 벡터 pBpfu는 두 가지 효소를 사용하여 전환되고, 큰 벡터 단편은 분리된다. 양 반응의 분리된 생성물은 T4 리가아제 반응에서 전환된다. 이. 콜라이 균주 K12 Mc1061[참고 자료 : Sambrook et al. "Molecular Cloning" (Cold Spring Habor Laboratory Press 1989)]의 수용 적격의 세포(competent cell)는 결합 혼합물로 형질 전환되고 25㎍/ml 암피실린이 함유된 NA 배양접시에서 플레이팅한다. 플라스미드 DNA는 특성화를 위해서 형질 전환체로부터 분리된다. 동시에, 플라스미드 분석에서 특성화된 형질 전환체가 있는 배양 접시가 보관용으로 제작된다. DNA는 제한 효소 분석 및 DNA 서열 분석으로 특성화된다. 올바른 것으로 동정된 플라스미드는 pBpfuHir_Ins로 표시된다.
실시예 2 : 에스. 타이피뮤리움(S. typhimurium) 외막 단백질 (fimD)의 시그날 서열에 부가된 Ser-히루딘-GNSAR-원숭이의 프로인슐린 융합 단백질의 작제
작제는 실시예 1에서 기술된 계획에 따라서 수행된다.
특허원 PCT/EP00/08537의 실시예 10은 에스. 타이피뮤리움 외막 단백질[참고 자료 : Rioux, C. R., Friedrich, M. J. and Kadner, R. J. ;J. Bacteriol. 172(11), 6217-6222(1990)]의 시그날 서열을 통해서 레피루딘을 외부 수송하는 벡터의 작제를 기술한다. 수득된 플라스미드는 실험 목적상 pBstyfim_hir로 표기된다. 플라스미드 pK152 및 pINT90d의 DNA는 각각의 경우에 주형으로 작용한다.
작제에서 4개의 프라이머가 필요하다.
프라이머 insu11HindⅢ, Hir_insf1 및 Hir_insrev1은 실시예 1에서 기술되었다.
프라이머 styfimf1ser는 새로이 합성되고
5' CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC CTCTacgtat actgactgcaCTG 3' (서열번호 6)의 서열을 갖는다.
굵은 글씨인 DNA 트리플렛은 세린 코돈이다. 결과적으로, 히루딘은 아미노산 서열의 위치 1에서 류신 대신에 세린이 적용되어 생산된다.
실시예 1에 상응하게, 두 개의 표준적인 중합효소 연쇄 반응은 주형으로서 pINT90d DNA와 함께 Hir_insf1/Insu11HindⅢ 프라이머 쌍 및 주형으로서 pK152 DNA와 함께 styfimf1ser/Hir-insrev 프라이머 쌍을 사용하여서 수행한다. 양 반응의 생성물은 결합되어서 분취량은 프라이머 stymfimf1ser/insu11HindⅢ와 함께 세 번째 중합효소 연쇄 반응으로 전환한다. 결과는 시그날(부분적으로)-Ser-히루딘-GNSAR-원숭이의 프로인슐린 서열을 포함한 DNA 생성물이다. DNA 단편은 제한 효소 BamHⅠ 및 HindⅢ를 사용하여서 전환한다.
유사한 반응에서, 벡터 pBstyfim_Hir은 두 가지 효소를 사용하여서 전환하고 큰 벡터 단편은 분리된다. 양 반응의 분리된 생성물은 T4 리가아제 반응에서 전환된다. 이. 콜라이 균주 K12 Mc1061의 수용 적격의 세포는 결합 혼합물로 형질 전환되고, 플라스미드 DNA는 특성화를 위해서 형질 전환체로부터 분리된다. 동시에, 플라스미드 분석에서 특성화된 형질 전환체가 있는 배양 접시가 보관용으로 제작된다. DNA는 제한 효소 분석 및 DNA 서열 분석으로 특성화된다. 올바른 것으로 동정된 플라스미드는 pBstyfim_SerHir_Ins로 표기된다.
실시예 3 : 이. 콜라이 알칼리 포스파타제 전구체 단백질의 시그날 서열에 부가된 Ala-히루딘-R-원숭이의 프로인슐린 융합 단백질의 작제
이. 콜라이 알칼리 포스파타제 전구체는 시그날 서열
MKQSTIALAL LPLLFPVTK A (서열번호 7)
[참고 자료 : Shuttleworth H., Taylor J., Minton N. ; Nucleic Acids Res. 14 : 8689, (1986)]을 가진다.
펩티드 서열은 이. 콜라이 높은 빈도 코돈 사용 기준을 사용하여서 GCG 프로그램 백트랜슬레이트(Backtranslate)[참고 자료 : Wisconsin Package Version 10.1, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wisc.]에 의해서 DNA로 해독된다.
이로써 다음의 서열이 수득된다.
5' ATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTGTTCACCCCGGTTACCAAAGCG 3' (서열번호 8)
위치 1에 아미노산 알라닌이 위치함을 특징으로 하는 히루딘을 암호화하는 DNA 서열(EP-A 0 448 093)에 상기 서열을 부가하고 클로닝하기 위해서, 상기 서열을 굵은 글씨로 보이는 서열만큼 연장시킨다.
5'TTTTTTGAATTCATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTGTTCACCCCGGTTACCAAAG-CG GCT acgtat actgactgcaCTG (서열번호 9)
부분적으로 중복하는 두 올리고뉴클레오티드 서열은 거기에서 유래한다.
프라이머 phoaf1은
5' CTGCTGCCGCTGCTGTTCACCCCGGTTACCAAAGCG GCTACG TATACTGACTGCACTG-3' (서열번호 10)의 서열을 가진다.
프라이머 phoaf2는
5' TTTTTTGAATTCATGAAACAGTCGACCATCGCGCTGGCGCTGCTGCCGCTGCTG -3' (서열번호 11)의 서열을 가진다.
발현 벡터의 작제는 프라이머 insu11HindⅢ, Hir_insf2 및 Hir_insrev2와 플 라스미드 pK152, pINT90d 및 pJF118의 DNA가 필요하다.
프라이머 Hir_insf2는
5' - ATCCCTGAGGAATACCTTCAG cga TTTGTGAACCAGCAC C -3' (서열번호 12)의 서열을 가진다.
프라이머 Hir_insrev2는
5' - GGTGCTGGTTCACAAA tcg CTGAAGGTA TTCCTCAGGG AT -3' (서열번호 13)의 서열을 가진다.
굵은 글씨의 대문자는 프로인슐린과 하이브리드화하는 서열을 나타내는 반면, 보통체의 대문자는 히루딘 서열의 3' 말단과 중복 부분을 기술한다. 밑줄친 굵은 글씨의 소문자는 링커 Arg의 코돈을 나타낸다.
실시예 1에 상응하게, 두 개의 표준적인 중합효소 연쇄 반응은 주형으로서 pINT90d DNA와 함께 Hir_insf1/Insu11HindⅢ 프라이머 쌍 및 주형으로서 pK152 DNA와 함께 phoaf1/Hir-insrev 프라이머 쌍을 사용하여서 수행한다. 양 반응의 생성물은 결합되어서 분취량은 프라이머 phoa/insu11HindⅢ와 함께 세 번째 중합효소 연쇄 반응으로 전환한다. 결과는 시그날-Ala-히루딘-GNSAR-원숭이의 프로인슐린 서열을 포함한 DNA 생성물이다. DNA 단편은 제한 효소 BamHⅠ 및 HindⅢ를 사용하여서 전환된다. 유사한 반응에서, 벡터 pjF118은 두 가지 효소를 사용하여서 전환되고 큰 벡터 단편은 분리된다. 양 반응의 분리된 생성물은 T4-리가아제 반응에서 전환된다. 이. 콜라이 균주 K12 Mc1061의 수용 적격한 세포는 결합 혼합물로 형질 전환되고, 플라스미드 DNA는 특성화를 위해서 형질 전환체로부터 분리된다. 동시에, 플라스미드 분석에서 특성화된 형질 전환체가 있는 배양 접시가 보관용으로 제작된다. DNA는 제한 효소 분석 및 DNA 서열 분석으로 특성화된다. 올바른 것으로 동정된 플라스미드는 pNS22로 표기된다.
실시예 4 : 트롬빈 억제 검정
히루딘 농도는 그리에쓰바흐 등[참고 : Grieβbach et al., Thrombosis Research 37, pp. 347-350, 1985]의 방법에 따라 결정된다. 이를 위해서, 레플루단 기준의 특정 양을 측정치에 포함시켜 수율(mg/l 단위)이 직접 측정될 수 있는 보정 곡선을 확립한다. 또한 생물학적 활성은 융합 단백질에서 프로인슐린의 정확한 폴딩에 대한 직접적인 측정치가 된다. 다른 방법으로, 정확한 S-S 가교 형성을 측정하기 위해서 단백질분해성 에스. 오레우스(S. aureus) 분해 및 RP-HPLC 시스템에서 후속적 검정을 사용하는 것이 가능하다.
실시예 5 : 융합 단백질의 발현
재조합 세포는 100㎍/ml 암피실린이 함유된 2YT 배지(리터 당 : 트립토판 16 g, 효모 추출물 10 g, NaCl 5 g)에서 밤새 배양한다. 상기 배양물을 새로운 배지로 1:50으로 희석시키고 세포를 대략 0.8 OD600의 밀도로 배양한다.
그리고 나서 발현을 0.05 내지 2 mM 농도가 확립되는 방식으로 IPTG를 첨가함으로써 유도한다. 이렇게 유도된 세포는 3 내지 26 시간 동안 추가로 항온 처리한다.
세 시간 후, 히루딘의 항트롬빈(antithrombin) 작용은 상층액에서 명료하게 측정할 수 있다. 상기 작용은 목적하는 융합 단백질의 분비에 기여할 수 있는데, 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 후, SDS PAGE 분석으로 웨스턴 블롯(Western blot)에서 폴리클로날 항-인슐린 항체와 반응하는 새로운 밴드는 유도된 세포에서만 있다는 것이 밝혀졌기 때문이다. 발효 실험에서, 유도는 현저하게 더 높은 광학 밀도로 배양 후에만 개시된다. 여기서 최소배지에 기초를 둔 합성 배지가 선호된다.
세포 생산성은 세균 용출의 원리를 사용하여서, 즉 최적의 유도 시간 후, 상층액에서 주의 깊게 세포를 제거하고 나서 유도인자를 다시 첨가할 수 있는 새로운 배지에 상기 세포를 항온처리함으로써 증가시킬 수 있다. 그리고 나서 인슐린은 수거한 상층액에서 동시에 제조할 수 있다.
실시예 6 : 융합 단백질의 정제
유도가 끝난 후, 세포 상층액은 pH 2.5 내지 3으로 조정되고 세포 및 상층액 성분은 원심분리 또는 여과로 제거된다. 침전의 상층액은 양이온 교환 컬럼(S-Hyper DF, Source 30S)에 적용되고 30% 2-프로판올의 존재하에서 pH 3.5이고 150 내지 450 mM의 NaCl의 선형적 구배를 이용하여 분획화한다. 각개의 분획물은 RP-HPLC로 분석한다. 프로인슐린-히루딘 융합 단백질은 약 300 mM 농도의 NaCl에서 용출한다. 충분히 순수한 분획물을 결합하여, 0.1 % TFA로 희석하고, 주입으로 RP 컬럼(PLRP- S 7.5 × 50 mm)에 적용한다. 용출은 20 내지 25% 아세토니트릴의 구배를 이용하여서 수행한다. 분획물의 두 그룹을 합한다. 용매를 제거한 후, 상기 물질은 동결 건조한다. 물질의 순도는 SDS 폴리아크릴아마이드 전기영동으로 조사한다. 정제한 융합 단백질은 질량 분광법(ESI)로 분석한다. 융합 단백질의 실험적으로 측정된 분자량은 시그날 펩티드 제거 후 이론적으로 예측된 분자량과 일치한다.
실시예 7 : 디설피드 가교 결합의 결정
융합 단백질은 트립신에 의해서 분해되고 형성된 단편은 RP-HPLC로 분석되고 이후에 질량 분광법으로 분석된다. 5706 Da의 질량으로 인해서, de-(B30)인슐린으로 인지되는 단편이 성공적으로 동정된다. 상기 생성물은 에스. 오레우스 V8 프로테아제로 분해시킨다. RP-HPLC 분석은 예측한 펩티드 패턴을 보여준다.
트립신 절단은 다음처럼 수행된다 :
동결-건조된 융합 단백질을 50 mM Tris-HCl pH 8 (1 mg/ml)에 용해시키고, 트립신(융합 단백질 mg 당 1㎍)을 첨가한다. 트립신은 반응 끝에 pH 3에서 불활성화된다.
에스. 오레우스 분해는 다음처럼 수행된다 :
분리된 de-(B30) 인슐린은 pH 8에서 물에 용해하고, 에스. 오레우스 프로테아제 (인슐린 양의 1/50)를 첨가하고, 혼합물을 5시간 동안 37℃에서 항온 처리하고 나서 실온에서 밤새 항온 처리한다.
실시예 8 : 인슐린의 정제
숙주 세포의 자발적 용해 또는 분비 중 하나에 기인하여 상층액에서 발견되는 대부분의 다른 폴리펩티드와 반대로, 융합 단백질은 놀랍게도 pH 2.5 내지 3.5에서 침전하지 않는다. 따라서 배양 배지는 적절하게 산성화되고 나서 침전 완료 후, 침전물 및 세포는 원심분리 또는 미세여과에 의해서 제거되고 농축된다.
그 이후에, 배지는 pH 6.8로 조정되고 융합 단백질 함유량은 분석적인 HPLC 측정으로 동시에 결정된다. 결정 후 상층액에 트립신이 첨가되는데 대략적으로 융합 단백질 1- 1.5 mg 당 1㎍ 트립신이 있다. 실온에서 대략 4시간 정도 항온 처리 후, 정제는 2-프로판올의 존재하에 pH 3.5에서 양이온 교환 크로마토그래피로 수행된다. 용출은 0.15 내지 0.45 M의 구배를 적용하여서 완충액에서 수행된다.
디-Arg-인슐린은 대략 0.3 M에서 용출된다. 1:1 희석 후, 디-Arg-인슐린은 10 % 강도의 ZnCl2 용액의 첨가로 pH 6.8에서 인슐린을 포함하는 분획물 부분으로부터 침전된다. 인슐린은 여과되고 나서 2 mg/ml 용액이 되도록 0.05 M Tris-HCl (pH 8.5)에서 용해된다:
그리고 나서 100 ml 용액 당 대략 1 단위 카르복시펩티다제 B의 양이 첨가되고 반응은 부드러운 교반 상태로 수행된다. 그런 후 pH는 시트르산으로 pH 5.5로 조정하고, 인슐린은 ZnCl2의 존재하에서 결정화된다. 결정은 제거되고 용해되고, RP-HPLC에 의한 정제 후, 인슐린은 결정화로 다시 정제한다.
실시예 9 : 배양 배지에서 융합 단백질의 직접적인 프로세싱
발현기 말에, 배양 배지는 pH 6.8로 조정된 후 트립신을 교반하면서 첨가하여 리터 당 4 내지 8 mg의 최종 농도가 형성된다. 대략 4시간의 항온 처리 후, 이 방식으로 처리되는 발효 브로쓰는 pH 2.5 내지 3으로 조정된다. 침전 1 내지 6 시간 후, pH를 3.5로 올리고, 형성된 디-Arg-인슐린은 30% 2-프로판올의 존재하에 양이온 교환 크로마토그래피를 통해서 정제한다. 용출은 0.05 내지 0.5 염의 NaCl 구배에 의해서 수행된다. 생성물을 포함한 분획물 부분은 H2O로 1:1 희석되고 나서 ZnCl2를 첨가하여서, 0.1 % 강도 ZnCl2 용액이 형성된다. 디-Arg-인슐린은 pH 6.8에서 침전하고 실시예 8에 따라서 예시를 통해서 인슐린으로 전환된다.
실시예 10 : 융합 단백질 분비를 위한 추가의 시그날 서열
특허원 PCT/EP00/08537에서 기술된 기술을 사용하여서 히루딘-인슐린 융합 단백질의 분비를 유도하는 추가의 시그날 서열을 찾아낼 수 있다 :
세라티아 마르세센스(Serratia marccescens)의 주요 외막 단백질에 대한 ompA 유전자에서 유도한 시그날 서열 smompa[참고 : GenEMBL data base locus : SMOMPA, 1364 bp DNA BCT 30-MAR-1995]
주요 외막 단백질을 암호화하는 이. 콜라이 ompC 유전자에서 유래한 시그날 서열 ecoompc[참고 : GenEMBL data base locus : SMOMPA, 1364 bp, DNA BCT 30-MAR-1995]
바실러스 섭틸리스 내삼투압성 결합 단백질 전구체 (opuCC)로부터 유래한 시그날 서열 af009352[참고 : GenEMBL data base locus : AF009352, 4500 bp, DNA BCT 23-JUL-1997]
크실라나아제 Ⅰ 전구체에 대한 애로모나스 카비애(Aeromonas caviae) xynA 유전자로부터 유래한 시그날 서열 aeoxyna[참고 : GenEMBL data base locus : AEOXYNA, 1139 bp, DNA BCT 07-FEB-1999]
외막 단백질 S1의 에스. 타이피(S. typhi) 유전자로부터 유래한 시그날 서열 stomps1[참고 : GenEMBL data base locus : STOMPS1, 1938 bp, DNA BCT 24-AUG-1995]
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Fusion protein for the secretion of a protein of interest into the supernatant of the bacterial culture <130> DEAV2001/0009 <140> DE 101 08 212.6 <141> 2001-02-20 <160> 13 <170> KopatentIn Ver. 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:pBpfu_hir <400> 1 Gly Asn Ser Ala Arg 1 5 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:pfuf1 <400> 2 ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 58 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:insu11hindlll <400> 3 tttttaagct tcatgtttga cagcttatca t 31 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hir_insfl <400> 4 atccctgagg aataccttca gggaaattcg gcacgatttg tg 42 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hir_insrev1 <400> 5 cacaaatcgt gccgaatttc cctgaaggta ttcctcaggg at 42 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:styfimf1 <400> 6 cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc tatcttttgc ctctacgtat actgactgca 60 ctg 63 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: alkaline phosphatase (signal sequence) <400> 7 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:alkaline phosphatase (signal sequence) <400> 8 atgaaacagt cgaccatcgc gctggcgctg ctgccgctgc tgttcacccc ggttaccaaa 60 gcg 63 <210> 9 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:cloning fragment <400> 9 ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctgttcacc 60 ccggttacca aagcggctac gtatactgac tgcactg 97 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:phoaf1 <400> 10 ctgctgccgc tgctgttcac cccggttacc aaagcggcta cgtatactga ctgcactg 58 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:phoaf2 <400> 11 ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctg 54 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hir_insf2 <400> 12 atccctgagg aataccttca gcgatttgtg aaccagcacc 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hir_insrev2 <400> 13 ggtgctggtt cacaaatcgc tgaaggtatt cctcagggat 40

Claims (18)

  1. 하기 형태의 융합 단백질을 암호화하는 DNA :
    -F-Asm-Rn-Y-
    상기식에서,
    F는 발효 배지로 단백질 Y의 분비를 허용하는 히루딘을 암호화하는 DNA 서열이며,
    As는 유전자 코드에 의해 암호화될 수 있는 아미노산을 암호화하는 DNA 서열 또는 화학 결합이고,
    m은 0부터 10까지의 정수이며,
    R은 화학 결합 또는 아르기닌(Arg) 코돈이고,
    n은 0 또는 1이며,
    Y는 정확하게 폴딩되고 발효 배지내 융합 단백질의 일부인, 프로인슐린인 목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 형태의 발현 카세트(expression cassette)인 DNA :
    P-S-F-Asm-Rn-Y-T
    상기식에서,
    P는 프로모터이고,
    S는 슈도모나스 플루오리센스(Pseudomonas fluorescens)의 oprF 유전자, 에스 타이피뮤리움(S. typhimurium) 외막단백질의 시그날 서열(fim D)을 암호화하는 DNA, 이. 콜라이(E. coli)의 알칼리 포스파타아제 전구체 단백질의 시그날 서열을 암호화하는 DNA 서열, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)의 주요 외막 단백질에 대한 ompA 유전자로부터 유도된 시그날 서열 smompa를 암호화하는 DNA 서열, 주요 외막 단백질을 암호화하는 이. 콜라이 ompC 유전자로부터 유도된 시그날 서열 ecoompc를 암호화하는 DNA 서열, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 내삼투압성 결합 단백질 전구체 (opuCC)로부터 유도된 시그날 서열 af009352를 암호화하는 DNA 서열, 크실라나아제(xylanase) Ⅰ 전구체에 대한 애로모나스 카비애(Aeromonas caviae) xynA 유전자로부터 유도된 시그날 서열 aeoxyna를 암호화하는 DNA 서열 또는 외막 단백질 S1의 에스. 타이피(S. typhi) 유전자로부터 유도된 시그날 서열 stomps1을 암호화하는 DNA 서열이며,
    T는 해독되지 않는 발현-증강 DNA 서열이다.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, DNA 서열 F가 레피루딘(lepirudin), Ser-히루딘 또는 Ala-히루딘을 암호화하는 DNA.
  5. 삭제
  6. 제1항, 제2항 또는 제4항 중의 어느 한 항에 따른 DNA에 의해 암호화되는 단백질.
  7. 제1항에 따른 DNA를 포함하는 플라스미드.
  8. 제7항에 따른 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제1항에 따른 DNA를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 이. 콜라이, 비. 섭틸리스, 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 제7항에 따른 플라스미드 또는 제1항에 따른 DNA가 숙주 세포의 게놈내에 통합된 숙주 세포.
  11. (a) 제1항 또는 제2항에 따른 DNA 분자를 제8항 또는 제9항에 따른 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및
    (b) 발현된 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 융합 단백질의 발효적 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 발현된 단백질을 분리하기 위해서 상층액을 숙주 세포로부터 분리하고, 발현된 단백질을 상층액으로부터 분리하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 침전 후 상층액에서 발현된 단백질을 농축시키는 공정 단계가 미세여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 발현된 단백질의 분리가, 발현된 단백질이 용액에 남아있는 동안 배양 배지 또는 상층액의 성분을 침전시키는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 발효 후, 머캅탄 또는 시스테인 하이드로클로라이드를 pH 6 내지 9에서 발효 상층액에 부가하여서, 유리 SH 그룹 농도가 0.05 내지 2.5 mM에 이르게 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 숙주 세포로부터 발효 상층액을 분리한 후, 숙주 세포를 반복적으로 새로운 배지에서 배양하고, 방출된 융합 단백질을 배양 기간동안 수득한 각각의 상층액으로부터 분리하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 머캅탄 또는 시스테인 하이드로클로라이드를 pH 6 내지 9에서 세포 배양물의 상층액에 부가하여서, 유리 SH 그룹 농도가 0.05 내지 2.5 mM에 이르게 하는 방법.
  18. (a) 제11항에 따른 방법에서 발현된 융합 단백질을 수득하는 단계,
    (b) 상기 (a)의 단계로부터 인슐린을 효소적 또는 화학적 분해로 방출시키는 단계, 및
    (c) 인슐린을 분리하는 단계를 포함하는, 인슐린의 생산 방법.
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