KR100829543B1

KR100829543B1 - 감마-아미노부틸산 함량이 증가된 유산균 발효물을포함하는 기억력 향상제

Info

Publication number: KR100829543B1
Application number: KR1020060123052A
Authority: KR
Inventors: 오석흥; 박기범; 차연수
Original assignee: 우석대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-06
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2008-05-16

Abstract

본 발명은 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA) 함량이 증가된 유산균 발효물을 포함하는 기억력 향상제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 엠알에스 배지(MRS broth)에 모노 소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate)와 칼슘을 첨가하고, 락토바실러스 부크네리 OMP-2(Lactobacillus buchneri OPM-2)을 접종한 후 배양함으로써 얻어진 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA) 함량이 증가된 유산균 발효물의 학습 및 기억력 향상 효과를 확인한 감마-아미노부틸산 함량이 증가된 유산균 발효물을 포함하는 기억력 향상제에 관한 것이다.

감마-아미노부틸산, GABA, 발효물, 기억력

Description

감마-아미노부틸산 함량이 증가된 유산균 발효물을 포함하는 기억력 향상제 {A crude drug composition for promoting memory which contains lactic acid bacteria fermentation product with an enhanced level of gamma-aminobutyric acid}

도 1 은 기억력 감퇴 모델 동물을 사용하여 GABA 고함유 유산균 발효물 처리군의 회피시간 연장 정도를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA) 함량이 증가된 유산균 발효물을 포함하는 기억력 향상제에 관한 것이다.

감마아미노부틸산(Gamma-amino butyric acid, GABA)은 억제성 신경전달 물질로서, 혈압상승을 억제하고 시력증진에 효과가 있으며, 불안감, 초조감 등을 진정시키는 작용을 하는 것으로 알려진 물질이다. 동물의 경우 뇌, 심장, 폐, 신장 등에 분포되어 있으며, 식물의 경우 발아 현미, 녹차 등에서 주로 발견되고 있다.

스트레스에 시달리는 현대인, 특히 수험생, 알코올 과다 섭취자 등의 경우에는, 뇌와 혈중 GABA 농도가 낮은 것으로 보고되어 있으며, 체내 GABA 농도의 극심한 부족은 발작, 경련, 간질 증세를 일으키는 것으로 알려져 있어서, 이들 증세를 완화 내지는 치료하기 위해서, 체내 GABA 농도를 높이기 위한 목적의 식품 또는 약제 개발이 이루어지고 있다.

즉, 현재까지 GABA는 상기한 제 증상의 완화 내지는 치료를 위한 목적으로 개발되어 왔다.

한편, 락토바실러스속의 균주들은 다양한 발효식품의 제조에 사용되는 균주로서, 예를 들어 치즈와 같은 영양 식품의 제조에 유용하게 사용된다. 특히, 치즈는 단백질과 지방을 농축시켜 만든 것으로서 함유된 성분들이 발효과정 중에 분해되어 체내에서 소화흡수가 용이한 상태로 되어 있기 때문에 유제품의 꽃으로 불리우는 고급 식품이며, 저장성이 좋고 기타 식품첨가물이 없는 자연식품으로 인식된다. 또한, 치즈는 위산과다인 사람에게는 단백질 성분의 완충 역할을 수행하여 중화제로 작용하며, 칼슘을 다량 함유하여 골다공증 등과 질병의 방지에도 유익하다.

이에 본 발명의 발명자들은 GABA의 유용성에 대하여 연구 노력한 결과, GABA 가 다량 함유된 발효물을 사용하여 정상동물과 스코폴아민(scopolamine)에 의해 유도된 기억손상 동물에 대해서 조건회피반응(Passive Avoidance Test) 시험을 수행한 결과, GABA가 다량 함유된 유산균 발효물이 학습 능력 및 기억력 향상 효과를 나타냄을 알게되어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 감마-아미노부틸산 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 기억력 향상제 및 이를 포함하는 건강 보조 식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명은, 감마-아미노부틸산 함유 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P 발효물을 유효성분으로 하는 기억력 향상제를 그 특징으로 한다.

또한 본 발명은, 감마-아미노부틸산 함유 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P 발효물을 유효성분으로 하는 기억력 향상용 건강 보조 식품을 포함한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 엠알에스 배지(MRS broth)에 모노 소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate)와 칼슘을 첨가하고, 락토바실러스 부크네리 OMP-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P를 접종한 후 배양함으로써 얻어진 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA) 함량이 증가된 발효물이 가지는 학습 및 기억력 향상 효과를 확인한 감마-아미노부틸산 함량이 증가된 유산균 발효물을 포함하는 기억력 향상제에 관한 것이다.

이하 본 발명의 GABA 제조방법을 구체적으로 설명한다.

본 발명은, 엠알에스 배지(MRS broth)에 모노 소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate) 1 ~ 10 %(v/v), 칼슘 1 ~ 3 %(v/v)을 첨가하고, 락토바실러스 부크네리 OMP-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P를 접종한 후 30 ~ 37 ℃에서 36 ~ 96 시간까지 배양함으로써, 다량의 감마-아미노부틸산을 포함하는 유산균 발효물을 제조할 수 있다.

본 발명의 GABA 발효물 제조방법은 엠알에스 배지(MRS broth)에 MSG를 1 ~ 10 %(v/v), 바람직하기로는 3 ~ 7 %(v/v) 첨가하는데, 이때, MSG의 첨가량이 상기 범위미만이거나 상기 범위를 초과하면 락토바실러스 부크네리 OMP-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P의 성장속도가 더디게 되는 점에 영향을 미칠 수 있다.

또한 본 발명의 GABA 발효물 제조방법은 엠알에스 배지(MRS broth)에 칼슘 1 ~ 3 %(v/v)을 첨가하는데, 이때 칼슘은 파우더(powder)상태로 배지원으로 첨가하는 것이 바람직하며, 칼슘의 첨가로 인하여 세포 성장(cell growth) 증가와 GABA 생산량 증가의 효과를 더욱 향상시킬 수 있다. 이러한 칼슘의 첨가량이 상기 범위미만이거나 상기 범위를 초과하면 GABA 생산함량과 락토바실러스 부크네리 OMP-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P의 세포 성장(cell growth)에 영향을 미친다.

본 발명의 GABA 고함유 유산균 발효물 제조방법에 의하면 배양 시간이 길어질수록 감마-아미노부틸산 함량은 증가하는데, 발효 시간이 12시간 이내에는 GABA 전환율이 50 % 미만이나, 발효 36 시간 경과시 전환율은 급격히 증가하는 경향을 보였다. 바람직하기로 본 발명의 GABA 고함유 유산균 발효물 제조시 배양 시간은 36 ~ 50 시간으로 하는 것이 좋다.

본 발명에서 사용한 유산균은 락토바실러스 부크네리 OMP-2(Lactobacillus buchneri OPM-2)로서, 한국미생물보존센터에 2005년 8월 25일 제05-11호로 기탁한 (기탁번호 KFCC 11353P) 신균주이다. 이러한 신균주를 사용하고, 이를 고농도로 배양하여 성장곡선의 대수기에 있는 유산균체를 따로 분리하여 접종할 경우 단 시간에 GABA 함량이 높은 발효물을 얻을 수 있으며, 이때 균수가 5.09x107 ~ 7.09x109cfu/ml 수준인 것이 좋다.

이렇게 배양된 발효물은 동결건조를 통하여 파우더 형태로 이용하여도 좋고, 파우더를 70% 에탄올을 이용하여 단백질을 제거하고 회수된 상등액만을 농축하여 사용하여도 좋다. 또한, 인체에 해가 없는 것으로 알려진 유산균이므로, 독립적으로 사용하거나, 허용가능한 담체와 함께 사용할 수 있으며, 사람 또는 동물이 섭취하기에 적합한 다양한 조성물 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 신규의 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) 발효물 단독, 이를 함유하는 식품, 의약품, 동물약품, 유산균제제 및 건강보조식품 등으로 제공될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 특정 유산균인 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OMP-2)를 이용하여 MSG를 다양한 생리활성이 있는 GABA로 고효율로 전환시킬 수 있어 뇌대사 증진 작용 등을 통해 치매 예방효과가 있는 유산균 발효물을 만들 수 있으며, 뇌혈류 개선 및 뇌대사 증진 작용, 정신안정, 뇌졸증, 머리외상, 뇌동맥 휴유증, 고혈압 예방, 이뇨작용, 간기능 개선 작용, 비만방지작용, 알콜대사촉진 작용 등 매우 다양한 생리활성 기능을 갖고 있는 GABA가 다량 축적된 발효물을 이용하여 다양한 기능성 식품 소재 및 유산균 소재, 항암 활성을 가지는 의약품 소재, 노인성 질환 예방 소재, 수험용 소재 등 다양하게 이 용할 수 있다. 특히 본 발명에 의한 GABA 고함유 유산균 발효물은 학습 및 기억력 향상 효과를 얻을 수 있다.

이러한 본 발명의 GABA 고함유 유산균 발효물을 포함하는 기억력 향상제는 정제, 캅셀제, 산제, 분말상 제제, 등의 다양한 경구용 제제로 제제화 가능하며, 그 섭취량을 특별히 한정하지 아니하고 수시 복용가능하다.

또한 본 발명의 GABA 고함유 유산균 발효물을 포함하는 기억력 향상용 건강 보조 식품은 통상적으로 섭취 가능한 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 구체적으로 음료, 비스켓, 과자, 빵, 면, 유제품 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 이를 한정하는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 ~ 12 : MSG 의 GABA 로의 전환

엘알에스 배지(MRS broth)에 모노 소듐 글루타메이트(monosodium glutamate, MSG)를 3, 5, 7 및 9 %(v/v)로 각각 첨가하고, 칼슘(sigma사 제품)을 각각 1, 2 및 3 %(v/v)로 첨가한 뒤, 락토바실러스 부크네리 OMP-2(Lactobacillus buchneri OPM-2, KFCC 11353P)을 1~3%(v/v) 수준으로 접종한 후 35 ℃로 조절한 배양기에서 50 시간 배양하였다.

상기 배양이 끝난 후 배양액과 OPM-2 균주를 12000 rpm, 15 min, 4 ℃로 조 절한 원심분리 조건에서 원심분리하고, 배양액 내의 GABA 전환율(%)을 측정하여 다음 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 부크네리 OPM-2를 사용하고, 엠알에스 배지 내에 MSG와 칼슘을 함유하여 배양시킨 경우 배양액 내 높은 GABA의 함량을 나타내었으며, 높은 전환율을 나타냄을 알 수 있다.

시험예 1 : GABA측정방법

시약 및 기구

HPLC는 워터스사(AccQ Tag Amino Acid Analysis System, Waters, USA) 제품을 사용하였고, 동결건조기는 일신사(Ilsin 사, Korea) 제품을 사용하였다. GABA 표준품은 시그마사(Sigma 사, USA) 제품을 사용하였으며, MRS 배지는 Difco사 제품을 사용하였다. MSG는 시그마사(Sigma 사, USA) 제품을, 유리 아미노산 표준품은 피크르스사(Picrce사, USA) 제품을 사용하였다. 또한, 6-아미노퀴놀릴-N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 (AccQ?Flour Reagent) 및 아세테이트-포스페이트 버퍼 (AccQ?Tag Eluenta A)는 Waters 제품을 사용하였다.

본 발명에 따른 균주로부터 발효된 감마-아미노부틸산 함량 측정

감마-아미노부틸산의 형광 유도체화를 위해 AccQ 형광 시약을 사용하였으며, 이들 유도체 분리를 위하여 AccQ Tag 컬럼 (Waters 제)을 사용하였다. 분석의 민감성을 감안하여 사용되는 모든 샘플들은 0.45㎛ PVDF 필터 (Millipore)를 이용하여 여과 분석하였다. 유리 아미노산 측정 방법은 샘플 중의 유리 아미노산 함량을 측정하기 위해 저온 보관된 샘플로부터 유기 용매 혼합액을 가하여 섞어준 다음, 유리 아미노산을 포함하는 수용액 층을 원심분리하여 얻었고, 이를 다시 한번 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 상등액을 동결건조하여 소량의 물로 녹여준 후, 0.45㎛ PVDF 필터로 여과하여 분석에 사용하였다. 아미노산의 형광 유도체화를 위하여 AccQ·Tag 시약을 사용하였으며, 이들 유도체 분리를 위해 3.9×150 mm AccQ·TagTM (Nova-PakTM C18,Waters) 컬럼을 사용하였다. 컬럼으로부터 유도체를 용출시키기 위해서 AccQ·Tag Eluenta A와 60% 아세토니트릴 혼합액을 분당 1㎖의 유속으로 흘려 주었다.

시험예 2 : 조건회피 반응 시험( Passive Avoidance Test )

GABA 고함유 유산균 발효물의 학습 및 기억력 향상 효과를 알아보기 위해 정상동물과 스코폴아민(scopolamine)에 의해 유도된 기억손상 동물에 대해서 조건회피반응(Passive Avoidance Test) 시험을 수행하였다.

(1) 실험동물 및 사육조건

출생시기가 동일한 11주령 ICR계 수컷 마우스(n=47)를 대상으로 1주일 동안 식이 및 동물실의 적응기간을 거쳐 총 4군으로 나누었으며, 그 실험조건은 다음 표 2와 같았다. 사육실의 온도는 23± 1℃로 습도는 50± 10%로 유지하였으며 명암은 12시간 주기로 조절하였다. 선정된 실험동물은 실험기간 동안 AIN-93 식이(diet)와 충분한 물을 공급하였다.

	스코폴아민 처리 유무 (Scopolamine treatments)	샘플
N(n=5)	×	물(water)
S1(n=6)	○	물(water)
S2(n=6)	○	GABA 함유 유산균 발효물 (0.8 mg/ml GABA 함유)
S3(n=6)	○	GABA 표준품 (0.8ml/ml GABA 함유)

(2) 비활성 도피 시스템( Passive avoidance system , Gemini San Diego Instruments , USA )

비활성 도피 시스템은 좌우 서틀박스(shuttle box, 24× 24× 24 cm, electric grid floor), 칸막이 문(connecting guillotine door; 5× 9cm)으로 구성되어 있다.

(3) 적응( Training )

모든 동물에 대해서 시스템(open gate position, no light)의 구조를 적응시켰다. 각각의 동물을 오른쪽 밝은 곳에 넣고 5초 후에 칸막이문(guillotine door)을 열고 동물이 문을 거쳐서 왼쪽 어두운 곳으로 가는 시간을 측정하였다. 이때 전기자극은 가하지 않았다. 반대편으로 넘어가는데 100초 이상이 걸리는 동물은 실험에서 제외시켰다. 일단 동물의 네발이 다른 쪽으로 넘어가면 문을 닫고 20초 후에 동물을 어둔 쪽에서 꺼냈다.

(4) 시험( Testing )

체중이 약 45 ~ 50g인 마우스에게 테스트할 샘플을 2g/kg의 농도로 경구투여 하였고, 60분 후 0.1% DMSO에 녹인 스코폴아민(scopolamine)을 1mg/kg씩 피하주사하였다. 30분후 동물을 밝은 곳에 넣고 20초 후에 문을 열었다. 만약 동물이 어두운 곳으로 들어가면 문은 자동적으로 닫히고 전기 쇼크(0.1mA/10g body weight)가 3초 동안 가해지게 하였다. 24시간 후, 같은 조건으로 시험하면서 동물이 밝은 곳에 머무르는 시간(latency time)을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1 에 의하면, 본 발명의 GABA 고함유 유산균 발효물을 처리한 군의 학습 및 기억력 향상 효과가 월등히 현저함을 확인할 수 있다. 즉, 스코폴라민 투여로 인해 잠복기(latency time)가 비 투여군에 비해 유의적으로 감소하였으나 GABA 발효물(0.8mg/ml GABA)의 투여로 인해 약 42%의 회피시간 연장이 관찰되어 기억력 증진 가능성이 관찰되었다.

제조예 1 : 동결건조에 의한 GABA 발효물의 분말 제조

상기 실시예 1 ~ 12 에서 얻어진 배양액을 동결건조하여 GABA를 고함량 함유하는 분말상의 발효물을 얻었다.

제조예 2: 에탄올 추출에 의한 GABA 발효물의 분말 제조

상기 실시예 1 ~ 12에서 얻어진 배양액으로부터 70 % 에탄올을 이용하여 단백질을 제거하고 회수된 상등액을 농축하여 GABA를 고함량 함유하는 분말상의 발효물을 얻었다.

제조예 3 : 약제학적 조성물의 제조

하기 조성에 따라서 각각 정제, 캡슐제, 산제 및 주사제를 제조하였다.

1) 정제

제조예 2의 GABA 배양액 분말 500.0 ㎎

유당 500.0 ㎎

탈크 5.0 ㎎

마그네슘 스테아레이트 1.0 ㎎

2) 캡슐제

제조예 2의 GABA 배양액 분말을 체질하여 부형제와 혼합한 후, 젤라틴 캡슐 중에 하기 조성에 따라 충전함으로써 캡슐제를 제조하였다.

제조예 2의 GABA 배양액 분말 500.0 ㎎

전분 1500 10.0 ㎎

스테아르산마그네슘 100.0 ㎎

3) 산제

하기 성분을 통상의 산제 제조방법으로 혼합하고, 봉지에 넣어 밀봉한 후 산제를 제조하였다.

제조예 2의 GABA 배양액 분말 500.0 ㎎

유당 100.0 ㎎

탈크 5.0 ㎎

4) 주사제

하기 성분을 통상의 주사제 제조방법으로 2.0 ㎖의 용량의 앰플에 충전하고, 멸균시켜 주사제를 제조하였다.

제조예 2의 GABA 배양액 분말 50.0 ㎎

산화방지제 1.0 ㎎

트윈 80 1.0 ㎎

주사용 증류수 ≤2.0 ㎖

제조예 4 : 건강보조 식품의 제조

하기 성분을 물과 혼합하여 통상의 방법으로 음료를 제조하되, 총 100 ml로 맞춘 후 95 ℃에서 15초간 살균 및 냉각하여 드링크제를 제조하였다.

제조예 2의 GABA 배양액 분말 10.0 g

구연산 1.0 g

아라비아검 1.0 g

설탕 5.0g

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 속의 새로운 미생물인 락토바실러스 부크네리 OPM-2 발효물은 다량의 GABA를 함유하며, 이는 기억능력 향상 효과를 나타냄을 확인하였고, 이러한 결과는 학습 및 기억력 향상제와 이를 위한 건강 보조 식품으로서 사용 가능성을 확인할 수 있게 한다.

Claims

감마-아미노부틸산 함유 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P 발효물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 기억력 향상제.
제 1 항에 있어서, 상기 감마-아미노부틸산 함유 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P 발효물은,

엠알에스 배지(MRS broth)에 모노 소늄 글루타메이트(mono sodium glutamate) 1 ~ 10 %(v/v), 칼슘 1 ~ 3 %(v/v)을 첨가하고, 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P를 접종한 후 30 ~ 37 ℃에서 36 ~ 96 시간까지 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 기억력 향상제.
감마-아미노부틸산 함유 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P 발효물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 기억력 향상용 건강 보조 식품.
제 3 항에 있어서, 상기 감마-아미노부틸산 함유 유산균 발효물은, 엠알에스 배지(MRS broth)에 모노 소늄 글루타메이트(mono sodium glutamate) 1 ~ 10 5(v/v), 칼슘 1 ~ 3 %(v/v)을 첨가하고, 락토바실러스 부크네리 OPM-2(Lactobacillus buchneri OPM-2) KFCC 11353P를 접종한 후 30 ~ 37 ℃에서 36 ~ 96 시간까지 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 기억력 향상용 건강 보조 식품.