KR100798894B1 - 재조합단백질 생산용 단백질융합인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 생산이 어려운 난발현성 단백질(non-producible protein)을 발현 및 분비생산 할 수 있는 맞춤형 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)에 관한 것이다.

단백질융합인자(translational fusion partner: TFP), 효모, 난발현성 단백질(non-producible protein), 인버테이즈

Description

재조합단백질 생산용 단백질융합인자{Translational fusion partner for producing recombinant proteins}

도 1은 인버테이즈 유전자의 결실과정 및 선별표지의 팝아웃 과정을 나타낸 그림이다.

도 2는 인버테이즈 활성측정을 위한 자이모그램이다.

레인 1,2,3 : 야생형 사카로마이세스 세레비시애(Saccaromyces. cerevisiae) 2805

레인 4,5,6 : 인버테이즈 결실변이주(에스. 세레비시애 2805△inv2)

도 3은 탄소원에 따른 균체의 성장을 보여주는 사진이다.

INV2 : 야생형 에스. 세레비시애 2805

△inv2: 인버테이즈 결실변이주(에스. 세레비시애 2805△inv2)

도 4는 인버테이즈 유전자 결실 확인을 위한 서던블롯팅 결과이다.

레인 1,2 : 에스. 세레비시애 Y2805 ura3 INV2,

레인 3,4 : 에스. 세레비시애 Y2805Δinv2U (URA3 △inv2),

레인 5,6 : 에스. 세레비시애 Y2805Δinv2 (ura3 △inv2)

도 5는 글루코스 및 수크로즈 배지에서 균체성장 여부를 확인한 사진이다.

도 6은 플라스미드 pYHTS-F0, F1 및 F2의 제조과정 및 효모 유전자 라이브러리 제조과정을 도식한 그림이다.

도 7은 4종의 단백질융합인자를 포함하는 균체의 배양상등액을 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯팅한 결과이다.

레인 1: 크기 표시자(size marker)

레인 2: 인터류킨-2

레인 3: pYIL-TFP1를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 4: pYIL-TFP2를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 5: pYIL-TFP3를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 6: pYIL-TFP4를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

도 8은 당쇄분석을 위해 엔도-에이치(Endo-H) 처리 전후의 SDS-PAGE 결과이다.

레인 1, -: pYIL-TFP1를 함유한 균체를 배양한 배양상등액, 엔도에이치 비처 리

레인 1, +: pYIL-TFP1를 함유한 균체를 배양한 배양상등액, 엔도에이치 처리

레인 2, -: pYIL-TFP3를 함유한 균체를 배양한 배양상등액, 엔도에이치 비처리

레인 2, +: pYIL-TFP3를 함유한 균체를 배양한 배양상등액, 엔도에이치 처리

레인 3, -: pYIL-TFP4를 함유한 균체를 배양한 배양상등액, 엔도에이치 비처리

레인 3, +: pYIL-TFP4를 함유한 균체를 배양한 배양상등액, 엔도에이치 처리

도 9는 Kex2p 프로세싱 사이트 유무에 따른 균체 배양상등액의 SDS-PAGE 분석 결과이다.

레인 M: 크기 표시자

레인 1: pYIL-TFP1를 함유한 균체의 배양상등액

레인 2: pYIL-KRTFP1를 함유한 균체의 배양상등액

레인 3: pYIL-TFP3를 함유한 균체의 배양상등액

레인 4: pYIL-KRTFP3를 함유한 균체의 배양상등액

레인 5: pYIL-TFP4를 함유한 균체의 배양상등액

레인 6: pYIL-KRTFP4를 함유한 균체의 배양상등액

도 10은 TFP1의 특성분석을 위한 유전자 결실 후 제조된 플라스미드들을 나 타낸 모식도이다.

도 11은 TFP1으로부터 유래된 단백질융합인자들(TFP1-1, 2, 3 및 4)에 의한 인터류킨-2 분비능을 확인한 SDS-PAGE 결과이다.

레인 M: 크기 표시자

레인 S: 인터류킨-2

레인 1-1: pYIL-KRT1-1 (달리 pYIL-KRTFP1-1라 명명)을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 1-2: pYIL-KRT1-2 (달리 pYIL-KRTFP1-2라 명명)를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 1-3: pYIL-KRT1-3 (달리 pYIL-KRTFP1-3라 명명)을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 1: pYIL-KRTFP1을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 1-4: pYIL-KRT1-4 (달리 pYIL-KRTFP1-4라 명명)를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

도 12는 pYIL-KRT1-4를 함유한 재조합 균주를 유가식 발효배양 프로필 및 배지로 분비된 단백질을 발효시간별로 SDS-PAGE 분석한 결과이다.

도 13는 단백질융합인자 TFP1, 2, 3, 및 4를 이용한 난분비 단백질 인체 콜 로니자극인자(G-CSF)의 분비를 확인한 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯팅 결과이다.

레인 M: 크기 표시자

레인 1: pYGCSF-KRTFP1을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 2: pYGCSF-KRTFP2을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 3: pYGCSF-KRTFP3을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 4: pYGCSF-KRTFP4를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

도 14는 pYGCSF-TFP3을 함유한 재조합 균주를 유가식 발효배양 프로필 및 배지로 분비된 단백질을 발효시간별로 SDS-PAGE 분석한 결과이다.

도 15는 단백질 융합인자 TFP3이 유래한 유전자 전체를 확보하고 G-CSF와의 융합지점을 변경하여 G-CSF의 분비율을 향상시킨 결과이다.

(A) 레인 T3: pYGCSF-KRTFP3을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-1: pYGCSF-KRTFP3-1을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-2: pYGCSF-KRTFP3-2를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-3: pYGCSF-KRTFP3-3을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-4: pYGCSF-KRTFP3-4를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

(B) 레인 T3: pYGCSF-KRTFP3을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-1: pYGCSF-KRTFP3-1을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-1-1: pYGCSF-KRTFP3-1-1을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-1-2: pYGCSF-KRTFP3-1-2을 함유한 균체를 배양한 배양상등액

레인 T3-2: pYGCSF-KRTFP3-2를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

도 16은 단백질융합인자 TFP3를 이용하여 산업효소 CalB14를 분비생산한 발효배지의 SDS-PAGE 결과이다.

레인 M: 크기 표시자

레인 1, 2: pYGA-CalB14를 함유한 균체를 20℃ 저온배양한 배양상등액

레인 12-58: pYGT3-CalB14를 함유한 균체를 배양한 배양상등액

도 17은 단백질융합인자 TFP1을 함유한 G-CSF 발현벡터 pGAP-TFP1-GCSF 및 pGAP-MFalpha-GCSF를 각각 함유한 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 회분배양하여 시간별로 취한 시료내에 존재하는 단백질을 SDS-PAGE 분석한 결과이다.

레인 Sc: pYGCSF-KRTFP1을 함유한 효모 에스. 세레비시애 배양상등액 10 ul

레인 6-24: pGAP-TFP1-GCSF 및 pGAP-MFalpha-GCSF를 함유한 피. 파스토리스를 배양한 배양상등액 200 ul 농축액

도 18은 pYIL-KRTFP1의 맵을 나타낸다.

도 19는 pYIL-KRTFP2의 맵을 나타낸다.

도 20은 pYIL-KRTFP3의 맵을 나타낸다.

도 21은 pYIL-KRTFP4의 맵을 나타낸다.

도 22는 pYIL-KRT1-3 (달리 pYIL-KRTFP1-3라 명명)의 맵을 나타낸다.

도 23은 pYIL-KRT1-4 (달리 pYIL-KRTFP1-4라 명명)의 맵을 나타낸다.

도 24는 pYGT3-1-1-GCSF의 맵을 나타낸다.

도 25는 pYGT3-1-2-GCSF의 맵을 나타낸다.

본 발명은 재조합 생산이 어려운 단백질을 발현 및 분비생산 할 수 있는 맞춤형 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)에 관한 것이다.

최근 인체게놈 프로젝트에서 확보된 유전체 염기서열 정보와 유전체 단위에 서 밝혀지는 다양한 단백질의 기능을 분석하고 인체 의약학적으로 중요한 단백질 제품생산을 위해서는 재조합 미생물을 이용하는 고효율 단백질 생산 시스템 개발이 필요하다. 인체와 같은 고등생물 유래의 재조합단백질을 생산하기 위해서 발현시스템을 선정할 때 숙주세포의 성장특성, 단백질 발현정도, 세포내외 발현가능성, 해독 후 수식(post-translational modification) 가능성, 발현된 단백질의 생물학적 활성 및 발현단백질의 용도 등과 같은 다양한 요인들이 고려되어야 한다. 대표적 미생물 유전자 발현시스템으로 대장균 및 효모 시스템이 주로 이용되고 있는데 대장균은 많은 발현시스템이 개발되어 있고 외래단백질의 발현율이 매우 높은 장점이 있지만 고등생물 유래의 단백질을 재조합 생산하고자 할 때 해독 후 수식 과정이 불가능하며 세포의 배양배지로 단백질의 완전한 분비가 어렵고 이황화 결합(disulfide bond)이 많은 단백질의 폴딩이 불가능하며 봉합체(inclusion body) 등의 불용성 단백질 형태로 생산하는 등의 단점이 지적되고 있다 (Makrides, Microbial Rev., 1996, 60, 512). 또한, 인체단백질 중 질병과 연관되어 의약학적으로 가치가 높은 대부분의 단백질이 당단백질이거나 막단백질이기 때문에 완전한 활성을 갖기 위해서는 당쇄부가(glycosylation)를 반드시 요구하거나 이황화 결합을 통한 완전한 3차원 구조를 요구할 경우 대장균에서는 생산이 불가능하며 효모와 같은 진핵미생물 발현 시스템을 반드시 필요로 한다.

진핵 미생물인 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)는 인체에 대해 안전성이 입증된 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로서 유전자 조작이 용이하며 다양한 발현시스템이 개발되어 있고 대량배양이 용이하다. 뿐만 아니라 인체단백질과 같은 고등세포 유래의 단백질을 재조합 생산할 때 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 분비기능과 당쇄부가 등과 같은 단백질의 해독 후 수식 기능을 수행할 수 있는 장점을 제공한다. 단백질의 분비시그날과 목표단백질을 인위적으로 융합(fusion)함으로써 세포외 분비가 가능한데 단백질의 분비과정을 통해서 단백질의 폴딩이나 이황화 결합의 형성 및 당쇄부가 과정이 진행되며 따라서 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합단백질을 생산할 수 있는 장점을 제공한다. 이는 또한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 배지로부터 직접 얻을 수 있기 때문에 경제적으로 효율이 낮은 세포의 분쇄나 재접힘 단계를 필요로 하지 않아 매우 경제적이다 (Eckart and Bussineau, Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7, 525).

그러나, 상기한 많은 장점에도 불구하고 효모 사카로마이세스 세레비시애를 이용한 인체단백질 분비시스템에 관한 현 기술의 문제점으로 지적되고 있는 것이 인체단백질의 종류에 따라서 전혀 생산되지 않거나 수 그램/리터까지 생산되는 등 분비율이 수천 배 이상 차이를 보여 분비생산성을 예측하기 힘든 것이다. 외래단백질이 수 그램/리터 수준까지 분비 생산이 가능한 것으로 판단할 때 분비 생산성 측면에서 충분한 경제성이 있는 것으로 판단되나 단백질의 종류에 따라서 분비효율이 낮은 문제와 특히 고부가가치의 인체의약용 단백질을 생산하고자 할 때 발현 및 분비가 힘든 문제가 자주 발생한다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 단백질의 분 비에 관여하는 분비인자에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 소포체에서 새로 합성된 단백질의 폴딩을 돕는 분비인자인 BiP(KAR2) 의 과발현 방법( Robinson 등, Biotechnol. prog., 1996, 271, 10017)과 시스테인 결합의 형성을 돕는 PDI(protein disulfide isomerase)의 과발현 방법 (Robinson 등, Bio/Technology, 1994, 12, 381; Schultz 등, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, 721, 148; Hayano 등, FEBS Lett., 1995, 377, 505) 등의 chaperone에 대한 연구 및 분비를 유도하는 융합인자의 제조와 원래 분비가 잘되는 단백질들과의 융합을 통해서 분비를 증진시키는 연구가 많이 진행되고 있다 (Gouka 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 47, 1). 이러한 방법은 현재까지 외래단백질의 분비를 증진시킨 매우 성공적인 방법으로 인식되고 있는데 이러한 융합기술의 분자 기작에 대한 연구는 아직 미비하지만 실험적으로 이러한 융합기술은 단백질의 이동을 용이하게 하고 폴딩을 돕는 등 단백질의 해독단계나 해독후 단계에서의 한계점을 개선하는 것으로 알려져 있다.

Kjeldsen 등 (Protein Expr. Purif., 1997, 9, 331)은 인슐린 또는 인슐린 전구체(insulin precursor, IP)를 효모에서 효율적으로 분비 생산하기 위하여 이론적 근거에 의해 제작된 합성 리더(leader)를 인슐린에 융합하여 인슐린의 분비율을 개선하였는데 이러한 합성 리더에는 당쇄부가 부위(N-glycosylation site)와 BiP 인식부위를 첨가하여 소포체에서 머무르는 시간을 길게 함으로써 단백질이 제대로 폴딩이 되도록 유도하였다. 또한 합성 리더에 추가적인 당쇄부가 부위를 도입하여 아스퍼질러스 나이저 및 사카로마이세스 세레비지애에서 인슐린의 분비율이 상당히 증가되었다고 보고하였다(Kjeldsen 등, Protein Expr. Purif., 1998, 14, 309). 유사한 결과가 아스퍼질러스 아와모리(Ward 등, Bio/Technology, 1989, 8, 435) 및 소수성 큐티나제(cutinase)를 효모에서 발현한 경우에도 보고되었다 (Sagt 등, Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 4940). 이는 당쇄부가 부위의 도입으로 인하여 재조합 단백질의 소포체내에서의 용해성이 증가되고 단백질의 폴딩이 유도되어 결과적으로 분비가 증가되는데 기인하였다.

원래 분비가 잘되는 단백질을 융합파트너로 이용하는 연구로는 아스퍼질러스 나이저의 글루코아밀레이즈와 융합발현하여 소 유래의 프로카이모신(bovine prochymosin) (Ward 등, Bio/Technology, 1989, 8, 435), 돼지 췌장유래의 포스포리파제 A2(porcine pancreatic phospholipase A2) (Roberts 등, Gene, 1992, 122, 155), 인체 인터류킨-6(human interleukin-6) (Contreras 등, Bio/Technology 1991, 9, 378; Broekhuijsen 등, J. Biotechnol., 1993, 31, 135), 닭 유래의 라이소자임(hen egg-white lysozyme) (Jeenes 등, FEMS Microbiol Lett, 1993, 107, 267) 및 인체 락토페린(human lactoferrin) (Ward 등, Bio/Technology, 1995, 13, 498)을 효율적으로 분비시켰다. 분비증가율은 단백질에 따라 차이를 보여 5배에서 1000배까지 증가하였다. 효모에서도 인체 인터류킨-1베타(interleukin-1β)의 아미노말단 24개의 아미노산을 융합파트너로 이용하여 인체 성장인자(human growth hormone) 및 콜로니 자극인자(Granulocyte colony-stimulatinf factor, G-CSF)의 분비를 증가시켰다 (Lee 등, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 884). 인체 인터류킨-1베타는 특별한 분비 시그날이 없이 분비되는 것으로 알려져 있으며 (Muesch 등, Trends Biochem. Sci., 1990, 15, 86) 효모에서도 매우 효과적으로 재조합 분비생산되는 것으로 보고되었다 (Baldari 등, Protein Eng., 1987, 1, 433). 단백질이 제대로 폴딩하기 위해서는 단백질이 원래 보유한 융합 파트너가 반드시 필요한 경우도 보고되었는데 (Takahashi 등, Appl Microbiol. Biotechnol., 2001, 55, 454) 라이조퍼스 오라이제 유래의 리파제(ROL)를 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 발현하기 위해 사카로마이세스 유래의 교배인자 알파(mating factor alpha)의 프리-프로-리더(pre-pro-leader) 서열을 ROL의 성숙단백질에 해당하는 유전자와 결합하여 발현한 경우에는 전혀 ROL이 분비되지 않았으나 ROL 자체의 pro 서열을 결합한 경우에는 적절하게 분비되었다. 이는 ROL 자체의 pro 서열이 자기 단백질의 폴딩에 절대적으로 필요하다는 것을 보여주었다.

상기한 연구결과에서 보는 바와 같이 재조합단백질의 분비를 유도하기 위해서 다양한 분비인자가 개발되었다. 그러나, 개발된 분비인자들이 특정단백질의 분비증진에는 효과가 있으나 모든 단백질에 일률적으로 적용될 수 없는 문제가 있었다. Dorner 등은 CHO 세포에서 BiP를 과발현한 결과 오히려 단백질 분비율이 감소하였다고 보고하였고 (Dorner 등, EMBO J., 1992, 11, 1563), 반면 BiP의 발현을 감소시켰을 때 단백질 분비가 증가하였다 (Dorner 등, Mol. cell. Biol., 1988, 8, 4063). 효모에서도 KAR2(BiP)의 과발현이 식물 타우마틴(plant thaumatin)의 경우 에는 분비가 향상되지 않았다 (Harmsen 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, 46, 365). 배큘로바이러스에서 BiP를 과발현하였을 때 세포추출물에서 가용성 항체의 양이 증가하였으나 항체의 분비효율은 증가하지 않았다 (Hsu 등, Protein Expr. Purif., 1994, 5, 595). 또 다른 분비인자인 폴데이즈(PDI)를 과발현하는 경우에도, 아스퍼질러스 나이저에서 폴데이즈를 과발현 하였으나 글루코아밀레이즈의 분비가 증가하지 않았다 (Wang and Ward, Curr. Genet. 2000, 37, 57). 또한 단백질 융합파트너를 이용한 분비유도의 경우에도 특정단백질에만 분비효율이 증진되는 문제가 보고되고 있다.

상기한 결과에서 보는 바와 같이 분비인자의 효과에 대한 많은 연구가 있었으나 단백질의 종류에 따라서 분비에 미치는 영향이 서로 상이했기 때문에 개발된 분비인자가 모든 단백질에 적용될 수 없는 문제가 있다. 따라서 목적하는 각 단백질 분비증진 최대화를 위해서는 목적단백질에 특이적으로 적용될 수 있는 최적의 분비인자를 선별하는 기술이 필요하다. 이에 본 발명자들은 재조합단백질의 종류에 따라서 최적의 분비융합인자를 유전체 단위에서 초고속으로 선별하는 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 효모에서 발현율이 낮아 경제적 대량 생산이 불가능한 단백질을 대상으로 단백질 생산을 강력하게 유도할 수 있는 적절한 단백질융 합인자(TFP)를 효모를 포함한 다양한 유전자원으로부터 초고속 발굴할 수 있는 방법의 제공과 이를 이용하여 난발현성인 단백질의 분비생산을 촉진할 수 있는 단백질융합인자를 제공하는 것이다.

발명의 상세한 설명

하나의 양태로서, 본 발명은 난발현성 목적 단백질 유전자(X)를 자동선별용 리포터 유전자(R)에 결합하여 X-R의 난발현성 융합 단백질을 제조하고, X-R의 융합물에 또 다른 유전자의 융합을 통해 X-R 난발현성 융합 단백질을 세포 밖으로 분비를 유도하는 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)를 유전자 라이브러리로부터 선별하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구체적 양태에서, 본 발명은

(1) 난발현성 목적 단백질의 유전자(X)와 인프레임(in-frame)으로 연결된 자동선별용 리포터 유전자(R)의 융합 유전자(X-R)를 포함하는 자동 선별 벡터를 제조하는 단계;

(2) 난발현성 융합 단백질(X-R)의 분비를 유도하는 단백질융합인자를 포함한 유전자 라이브러리를 자동 선별 벡터와 연결하여 단백질융합인자 라이브러리를 제조하는 단계;

(3) 단백질융합인자 라이브러리를 리포터 유전자의 활성이 없는 세포를 형질 전환시켜 리포터 단백질의 활성을 검출하는 단계; 및

(4) 리포터 단백질의 활성을 나타내는 형질전환 세포로부터 유전자를 분리하여 단백질융합인자의 특성을 분석하는 단계를 포함하여, 난발현성 단백질 생산용 맞춤형 단백질융합인자를 선별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)" 는난발현성 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 난발현성 단백질의 분비생산을 유도하는 유전자를 의미한다.  또한, "단백질융합인자 단백질"은 상기한 바와 같은 단백질융합인자 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 단백질을 의미한다. 

본 발명에서 "난발현성 단백질"이란 인체 또는 다양한 생명체 유래의 단백질을 재조합 생산하고자 할 때 단백질 자체의 특성으로 인해서 대장균이나 효모 등의 숙주세포에서 재조합 발현 생산이 어려운 단백질을 의미한다.  특히, 본 발명의 목적상 효모 등의 숙주세포에서 재조합 발현 생산이 어려운 단백질을 의미한다.  본 발명의 선별 방법 및 이로부터 수득한 단백질융합인자는, 대장균 등의 원핵세포와 효모 등의 진핵세포에서 재조합적 생산이 가능하지 않은 단백질뿐만 아니라, 대장균 등 다른 숙주에서 재조합 생산이 가능하더라도 효모와 같은 진핵세포에서는 생산성이 낮아 경제성이 없는 다수의 단백질을 재조합적으로 생산하는데 이용된다.  본 발명에서 "발현"이란 특정 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 및 해독 산물이 분비되어 최종 목적물로서 얻어지는 것을 포함하는 의미이다.

본 발명의 자동선별용 리포터 유전자는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니나, 인버테이즈, 수크레이즈, 셀루레이즈, 자일라네이즈, 말테이즈, 아밀레이즈, 글루코아밀레이즈, 갈락토시데이즈 등으로 구성된 세포외부로 분비가 가능한 단백질을 코딩하는 유전자군으로부터 선택된다.

상기한 선별방법에서, 난발현성 융합 단백질의 분비를 유도하기 위한 단백질융합인자를 포함하는 유전자 라이브러리는 다양한 기원, 예를 들어 효모 또는 인체를 포함한 다양한 동식물 및 미생물 유래로부터 얻을 수 있으며, 효모 기원의 유전자 라이브러리가 바람직하다.  이들 유전자 라이브러리는 게놈성(염색체성) DNA 또는 cDNA 형태일 수 있다.

하나의 구체적 예시로서, 재조합 생산이 힘든 난발현성 단백질(X)와 인버테이즈(I)를 융합하여 효모에서 발현하는 경우 융합된 난분비단백질(X)로 인하여 정상적으로 분비되던 인버테이즈의 분비가 억제되어 수크로즈를 단일탄소원으로 함유하는 배지에서 난발현의 정도에 따라서 효모가 성장하지 못하거나 또는 성장이 매우 지연된다.  그러나, X-I의 발현 및 분비를 유도할 수 있는 효율적인 단백질융합인자를 도입할 경우 세포는 수크로즈 배지에서 빠르게 성장하는데, 이러한 특징을 이용하여 난발현단백질과 인버테이즈가 융합된 단백질(X-I)에 다양한 기원으로부터 확보되는 단백질융합인자 라이브러리를 추가적으로 융합하여 TFP-X-I 또는 X-I-TFP 의 형태로 제조한 후 효모에 도입, 발현하여 수크로즈 배지에서 빠르게 성장하는 세포를 선별하면 다양한 기원의 라이브러리로부터 난발현성 단백질에 가장 적합한 TFP를 초고속으로 선별할 수 있다. 

따라서, 보다 바람직한 양태에서, 본 발명은

(1) 효모 인버테이즈를 이용한 자동선별 시스템 개발을 위한 리포터 유전자로 사용하기 위하여 효모 자체가 갖는 인버테이즈 유전자인 INV2(I)를 결실시킨 효모변이주를 제조하는 단계;

(2) 효모 GAL10 프로모터에 의해서 발현이 조절되며 인버테이즈(I) 유전자와 난발현성 유전자(X)가 인프레임(in-frame)으로 융합된 유전자(X-I)를 함유하는 자동선별 벡터인 효모 HTS (high throughput selection) 벡터 (pYHTS-F0, pYHTS-F1 및 pYHTS-F2)의 제조 단계;

(3) 인버테이즈와 난발현성 단백질의 융합 유전자(X-I)를 분비시킬 수 있는 효모 유전자로부터의 단백질융합인자 라이브러리를 pYHTS 벡터에 제조하는 단계;

(4) 제조된 라이브러리를 단계 (1)에서 제조된 효모에 형질전환하고 수크로즈를 단일탄소원으로 포함하고 있는 배지에서 자동선별하는 단계;

(5) 수크로즈 배지에서 성장한 효모를 배양하여 배지로 분비된 단백질의 확인 단계; 및

(6) 효모로부터 유전자를 분리하여 단백질융합인자 특성의 분석 단계를 포함하는, 난발현성 단백질 생산용 맞춤형 TFP를 초고속으로 선별하는 방법에 관한 것 이다. 

본 발명자는 효모 인버테이즈 결여 변이주 제조하고, 인버테이즈 유전자가 결실된 효모 균주에서 인버테이즈와 융합된 단백질의 발현을 통해 인버테이즈를 자동선별 시스템의 마커로 사용할 수 있음을 확인한 후, 난발현성 단백질인 인체 인터류킨-2를 이용한  단백질융합인자 자동선별 벡터인 pYHTS-F0, F1 및 F2를 제조하고, 이에 효모 기원의 절단된 염색체 DNA를 연결하여 단백질융합인자 라이브러리 제조하고, 이로부터 난분비성 단백질 인체 인터류킨-2에 적합한 단백질융합인자 단백질 TFP1, TFP2, TFP3 및 TFP4를 확인하였다.

본 발명에서 "인버테이즈를 이용한 자동선별 시스템"이란 효모가 수크로즈를 단일탄소원으로 이용하기 위해서는 효모 INV2 유전자에 의해서 코딩되는 단백질인 인버테이즈라는 효소를 필요로 하는데 효모의 염색체 상에 존재하는 INV2 유전자를 결실시키고 벡터에 INV2 유전자를 도입하여 INV2 유전자의 발현 여부에 따라서 수크로즈 배지에서 성장하는 균주를 선별하는 시스템을 의미한다.  

인버테이즈는 리포터 단백질로서 이용되어 왔으며, 예를 들어 미국 특허 제6,228,590호 및 EP 제0 907 727 B1에서는 인버테이즈 자체의 분비시그날을 제거하여 분비되지 않도록 한 후 이의 분비를 유도하는 융합 파트너를 선별하는 방법에 대해 기술하고 있다.  본 발명은, 이와는 대조적으로, 인버테이즈를 난발현성 단백 질과 융합하여 분비되지 않도록 난발현성 융합 단백질을 형성하여 이를 난발현성 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 단백질융합인자의 선별에 이용한다.  그 결과, 인버테이즈가 발현되는 형질전환체의 수가 현저히 감소하는 변별력을 가져, 난발현성 단백질에 특이적으로 적용되는 단백질융합인자를 고속으로 확보할 수 있다.

본 발명에서 확보된 단백질융합인자 TFP1, TFP2, TFP3, TFP4 및 이의 유도체의 적용범위는 다양한 상업적 용도로 대량 생산되는 단백질을 포함한다.  이러한 단백질들은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 사이토카인(예, 인터류킨), 혈청단백질(예, 인자 VII, VIII 및 IX를 포함한 혈액인자), 면역글로불린, 사이토카인 리셉터, 락토페린, 인터페론(예, α- , β- 및 γ- 인터페론), 콜로니자극인자(예, GM-CSF, G-CSF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자(예, TGFα 또는 TGFβ 같은 조직 성장 인자 및 내피 성장 인자, 표피성장인자: EGF, 혈소판 유도된 성장 인자: PDGF, 섬유아세포 성장인자: FGF), 락토페린, 호르몬(예, 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬 및 부갑상선 호르몬, 황체호르몬 분비 호르몬 및 이의 유사체), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide; CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 항암 및 항생 펩타이드 등이 포함된다.   또한, 이러한 단 백질은 효소를 포함할 수 있으며, 예로는 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 리파제, 산화환원 효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제, 리가제 등이 포함된다.   구체적인 효소로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제 및 빌리루빈 옥시다제를 들 수 있다.   탄수화합물-특이적 효소의 예로는 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제 등이 포함된다.

        

난발현성 단백질 유전자는 인체 의학적 또는 산업적 중요성이 있으며 재조합 생산의 필요성이 있는 인체를 포함한 다양한 동식물 및 미생물 유래의 유전자로부터 분리되거나 화학 합성되는 것으로서, 상기한 단백질들을 코딩하는 유전자이다. 

본 발명의 자동 선별 벡터는 프로모터 유전자, 해독개시 및 종결코돈이 제거된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 이에 인프레임으로 융합된 리포터 유전자를 포함하며,  프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하다.

본 발명의 자동선별 방법에서 형질전환에 사용한 숙주세포는 캔디다 (Candida), 디베리오마이세 스(Debaryomyces), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로 마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로이야 (Yarrowia) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속 등의 효모류, 아스퍼질러스 (Aspergillus), 페니실리엄 (Penicillium), 라이조퍼스 (Rhizopus) 및 트리코더마 (Trichoderma) 속 등의 균류 또는 에셔리키아 (Escherichia) 및 바실러스 (Bacillus) 속 등의 세균류를 사용할 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.        

본 발명의 난발현성 단백질 생산용 맞춤형 TFP의 초고속 선별 방법은 발현이 불가능하거나 발현율이 매우 낮은 난발현성 단백질용으로 사용하는 것이 적합하지만 발현이 어느 정도 되지만 발현율을 높일 수 있는 TFP를 선별하기 위해서도 이용될 수 있다.  본 발명의 구체예에서 실시하고 있는 바와 같이 인버테이즈를 리포터로 사용할 경우 수크로스 배지에서 성장이 빠른 순서대로 구별하여 보다 효율적인 TFP를 선별할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 난발현성 단백질 인터류킨-2의 분비생산 촉진을 위한 맞춤형 융합인자 초고속 선별벡터 pYHTS-F0, F1 및 F2에 관한 것이며, 이러한 선별 벡터는 난발현단백질 인체 인터류킨-2와 인버테이즈가 융합된 유전자를 함유하고 있으며 인터류킨-2 유전자의 아미노말단에 세 가지 서로 다른 리딩프레임으로 제조된 제한효소 BamHI 절단부위를 함유하고 있다.

본 발명의 구체적 실시에서는 인체 인터류킨-2를 효모에서 분비생산 촉진하는 맞춤형 융합인자를 초고속 선별하기 위하여 선별벡터 3 종(pYHTS-F0, F1 및 F2)에 효모 염색체 DNA를 무작위로 절단한 후 삽입한 다음 인버테이즈가 결여된 균주에 형질전환하고 수크로즈 배지에서 성장하는 균체를 선별함으로써 난발현성 인터류킨-2 및 인버테이즈의 융합단백질을 배지로 분비할 수 있는 맞춤형 융합인자를 선별하였다.

인체 인터류킨-2는 소수성이 강한 단백질로서 효모에서 발현이 어려운 이유는 강력한 프로모터에 의해서 재조합 대량 발현된 단백질이 소포체내에서 빠르게 활성형으로 폴딩(folding) 되지 못하고 서로 응집되어 소포체 기능을 마비시키는 문제 때문으로 추정되고 있다. 따라서 인터류킨-2에 융합된 인버테이즈도 분비되지 못해 세포가 수크로즈 배지에서 성장할 수 없다. 이러한 융합단백질을 효율적으로 분비시킬 수 있는 단백질융합인자는 인터류킨-2 유전자의 앞부분에 효모 유전체 라이브러리를 삽입하고 효모에 형질전환한 후 수크로즈 배지에서 성장하는 형질전환체를 확보함으로써 가능하게 된다.

구체적 실시에서, 본 발명자는 난발현단백질인 인터류킨-2의 분비를 유도하는 융합인자를 확보하기 위하여 수크로스 배지에서 성장하는 형질전환체로부터 유전자를 분리하고 대장균으로 재형질전환하여 서로 다른 네 종류의 플라스미드 (pYHTS-TFP1, TFP2, TFP3 및 TFP4)를 회수하였다. 각각의 플라스미드에 삽입된 4종의 서로 다른 단백질융합인자 유전자 TFP1(서열번호 2), TFP2(서열번호 4), TFP3(서열번호 6) 및 TFP4(서열번호 8)를 확보하였으며, 이들 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 각각 서열번호 1, 3, 5 및 7에 나타나 있다.

상기 수득된 벡터 pYHTS-TFP1, TFP2, TFP3 및 TFP4로부터 인버테이즈를 제거하고 인터류킨-2 유전자에 해독종결코돈을 삽입한 pYIL-TFP1, TFP2, TFP3 및 TFP4를 제작하였으며, 이러한 벡터는 단백질융합인자와 융합된 형태의 인터류킨-2를 분비하기 때문에 단백질융합인자를 자동제거할 수 있도록 단백분해효소 Kex2p 인식부위를 삽입한 벡터 pYIL-KRTFP1, KRTFP2, KRTFP3 및 KRTFP4를 제작하였다. 나아가, 인체 콜로니 자극인자(G-CSF)를 단백질융합인자 TFP1 내지 4와 융합한 벡터 pYGCSF-TFP1 내지 4을 제작하여 TFP이 인체 인터류킨-2 이외의 단백질의 분비 생산에도 효과적임을 입증하였다.

한편, 산업용 리파제 효소로서 각광을 받고 있는 캔디다 앤탁티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B(CalB)를 분자진화를 통해 비활성이 약 6배 이상 증가된 변이주 CalB14를 재조합 효모를 이용하여 대량분비 생산하기 위해, 기존 발현분비시스템(AMY, 아밀레이즈 분비시그날)을 이용할 경우 효모의 배양적온인 30℃에서는 단백질이 제대로 분비되지 못하고, 22℃ 저온배양 할 경우 분비 생산되는 특징이 있다. 따라서, 대규모 발효 배양시 세포배양이 느리고 특히 하절기에 발효조 온도조절을 위한 고비용 문제가 발생하므로 배양적온에서 분비생산이 가능한 분비시스템이 요구된다. 본 발명에서는 이러한 문제를 CalB와 TFP3와 융합한 벡터 pYGT3-CalB4를 제작하여 해결하였다.

따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 단백질융합인자 TFP1 단백질 또는 이의 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 단백질융합인자 TFP1 단백질 또는 이의 유사체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성(homologous), 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 단백질융합인자 TFP1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 바람직하게는, 상기한 유전자는 서열번호 2의 유전자이다. 또한, 본 발명은 상기한 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 2의 유전자이다. 재조합 벡터 pYIL-TFP1, pYIL-KRTFP1, pYGCSF-TFP1, pYGCSF-KRTFP1, pGAP-TFP1-GCSF 등을 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. pYIL-KRTFP1으로 형질전환된 에셔리키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2003 년 11월 11일자로 기탁번호 KCTC 10544BP로 기탁되었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 단백질융합인자 TFP2 단백질 또는 이의 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 단백질융합인자 TFP2 단백질 또는 이의 유사체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 3로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP2 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 단백질융합인자 TFP2 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 바람직하게는, 상기한 유전자는 서열번호 4의 유전자이다. 또한, 본 발명은 상기한 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 4의 유전자이다. 재조합 벡터 pYIL-TFP2, pYIL-KRTFP2, pYGCSF-TFP2, pYGCSF-KRTFP2 등을 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. pYIL-KRTFP2로 형질전환된 에셔리키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 11월 11일자로 기탁번호 KCTC 10545BP로 기탁되었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 단백질융합인자 TFP3 단백질 또는 이의 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 단백질융합인자 TFP3 단백질 또는 이의 유사체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 단백질융합인자 TFP3 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 바람직하게는, 상기한 유전자는 서열번호 6의 유전자이다. 또한, 본 발명은 상기한 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 6의 유전자이다. 재조합 벡터 pYIL-TFP3, pYIL-KRTFP3, pYGCSF-TFP3, pYGCSF-KRTFP3, pYGT3-CalB14 등을 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. pYIL-KRTFP3으로 형질전환된 에셔리키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 11월 11일자로 기탁번호 KCTC 10546BP로 기탁되었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 단백질융합인자 TFP4 단백질 또는 이의 유사체편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 7로 기재되 는 단백질융합인자 TFP4 단백질 또는 이의 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP4 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 단백질융합인자 TFP4 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 바람직하게는, 상기한 유전자는 서열번호 8의 유전자이다. 또한, 본 발명은 상기한 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 8의 유전자이다. 재조합 벡터 pYIL-TFP4, pYIL-KRTFP4, pYGCSF-TFP4, pYGCSF-KRTFP4 등을 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. pYIL-KRTFP4로 형질전환된 에셔리키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 11월 11일자로 기탁번호 KCTC 10547BP로 기탁되었다.

본 발명에서 단백질융합인자 단백질 또는 유전자에 대해 사용된 용어 “유사체”란 단백질융합인자 유전자를 난발현성 단백질의 유전자와 융합하는 경우 난발현성 단백질의 분비생산을 유도하여 단백질융합인자 활성을 나타내는 작용적 등가물을 의미하며, 단백질융합인자 단백질의 경우 예를 들어 동일한 성질을 갖는 아미노산끼리의 치환(예: 소수성 아미노산의 다른 소수성 아미노산으로의 치환, 친수성 아미노산의 다른 친수성 아미노산으로의 치환, 염기성 아미노산의 다른 염기성 아미노산으로의 치환, 산성 아미노산의 다른 산성 아미노산으로의 치환), 아미노산의 결실, 삽입 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질융합인자 단백질의 치환 유사체와 관련하여, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있으며 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979), 가장 통상적으로 일어나는 치환으로서 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 치환을 예시할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질융합인자 단백질의 결실 유사체와 관련하여, 게놈성 라이브러리(염색체 라이브러리) 또는 cDNA 라이브러리를 통해 밝혀진 단백질융합인자 유전자의 전체 서열 중 일부 서열을 제거하더라도 난발현성 단백질의 분비에 영향을 끼치지 않거나 나아가 분비를 촉진시킬 수 있으며, 본 발명자들은 단백질융합인자 TFP1, TFP2, TFP3 및 TFP4의 결실 유사체 단편이 난발현성 단백질의 분비에 끼치는 영향을 조사하였다. TFP1의 경우 세린, 알라닌-리치 서열, N-당쇄부가 부위 또는 이둘 모두가 제거된 유전자를 포함하는 벡터의 경우 난발현성 단백질을 분비하지 못하였으나, 5‘-UTR(5'-untranslated region)을 제거하는 경우(pYIL-KRT1- 4) 난발현성 단백질의 발현율이 3배 이상 증가하였으며, 추가의 3‘ 말단의 추가의 서열을 제거한 경우(pYIL-KRT1-3)에도 난발현성 단백질의 분비를 유도하였다. 따라서, 본 발명의 단백질융합인자 단백질은 난발현성 단백질의 분비에 부정적 영향을 끼치지 않는 한, 5'-UTR 영역, 3’-말단 영역의 결실체를 본 발명의 범위에 포함한다.

구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 9로 기재되는 단백질융합인자 TFP1-3 단백질 또는 이의 유사체를 제공한다. 또한, 본 발명은 단백질융합인자 TFP1-3 단백질 또는 이의 유사체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명은 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1-3 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 9로 기재되는 단백질융합인자 TFP1-3 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 상기한 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 9로 기재되는 단백질융합인자 TFP1-3을 코딩하는 유전자이다. 재조합 벡터 pYIL-KRT1-3 (달리 pYIL-KRTFP1-3라 명명)를 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. pYIL-KRT1-3으로 형질전환된 에셔리 키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 11월 11일자로 기탁번호 KCTC 10548BP로 기탁되었다.

또 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 10으로 기재되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질융합인자 TFP1-4 단백질 또는 이의 유사체를 제공한다. 또한, 본 발명은 단백질융합인자 TFP1-4을 코딩하는 서열번호 10으로 기재되는 유전자 또는 이의 유사체를 제공한다. 본 발명은 서열번호 10으로 기재되는 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1-4 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 10로 기재되는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 10으로 기재되는 단백질융합인자 TFP1-4을 코딩하는 유전자 또는 이의 유사체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 달리, 본 발명은 서열번호 10으로 기재되는 단백질융합인자 TFP1-4을 코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 재조합 벡터 pYIL-KRT1-4 (달리 pYIL-KRTFP1-4라 명명)를 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. pYIL- KRT1-4으로 형질전환된 에셔리키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 11월 11일자로 기탁번호 KCTC 10549BP로 기탁되었다.

또한, 본 발명의 단백질융합인자 단백질의 삽입 유사체와 관련하여, 게놈성 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 통해 밝혀진 단백질융합인자 유전자의 전체 서열 또는 활성을 나타내는 부분 서열에 일부 서열을 추가하더라도 난발현성 단백질의 분비에 영향을 끼치지 않거나 나아가 분비를 촉진시킬 수 있으며, 본 발명자들은 단백질융합인자의 삽입 유사체가 난발현성 단백질의 분비에 끼치는 영향을 조사하였다. TFP3(104aa)의 경우 TFP3-3(189aa) 및 TFP3-4(222aa) 삽입 유사체는 분비 효율이 감소하였으나, TFP3의 길이를 26개 아미노산 추가한 TFP3-1의 경우 추가적인 N-당쇄부가 부위가 포함되어 G-CSF 분비율이 TFP3에 비해서 약 3배 정도 증가하였다. 나아가 TFP3-1에 추가적으로 4개의 아미노산이 추가된 TFP3-1-1(134개 아미노산 포함) 및 13개의 아미노산이 추가된 TFP3-1-2(143개 아미노산 포함)은 G-CSF의 분비량의 감소 없이 분비과정중에 Kex2p에 의해 프로세싱되지 않은 융합단백질의 양도 대폭 감소되었다. 따라서, 본 발명의 단백질융합인자 단백질은 난발현성 단백질의 분비에 부정적 영향을 끼치지 않는 한, N-당쇄부가 영역, 융합부위를 절단하기 위한 절단 효소인 Kex2p의 접근을 가능하게 하는 영역이 추가된 삽입 유사체를 본 발명의 범위에 포함한다.

구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 40로 기재되는 단백질융합인자 TFP3- 1-1 단백질 또는 이의 유사체를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 40로 기재되는 단백질융합인자 TFP3-1-1 단백질 또는 이의 유사체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명은 서열번호 40로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3-1-1 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 40로 기재되는 단백질융합인자 TFP3-1-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 바람직하게는, 상기한 유전자는 서열번호 41의 유전자이다. 또한, 본 발명은 상기한 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 41의 유전자이다. 재조합 벡터 pYGT3-1-1-GCSF를 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. pYGT3-1-1-GCSF로 형질전환된 에셔리키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2004년 12월 21일자로 기탁번호 KCTC 10753BP로 기탁되었다.

또 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 42로 기재되는 단백질융합인자 TFP3-1-2 단백질 또는 이의 유사체를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 42로 기재되는 단백질융합인자 TFP3-1-2 단백질 또는 이의 유사체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명은 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3-1-2 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 42로 기재되는 단백질융합인자 TFP3-1-2 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다. 바람직하게는, 상기한 유전자는 서열번호 43의 유전자이다. 또한, 본 발명은 상기한 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 43의 유전자이다. 재조합 벡터 pYGT3-1-2-GCSF를 예시할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. pYGT3-1-2-GCSF로 형질전환된 에셔리키아 콜라이가 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2004년 12월 21일자로 기탁번호 KCTC 10754BP로 기탁되었다.

본 발명에서 단백질융합인자 단백질 또는 유전자에 대해 사용된 용어 “상동성”이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 단백질의 경우 본 발명의 TFP 단백질의 아미노산 서열과 바람직하게는 75%이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 것이다. 유전자의 경우 본 발명의 TFP 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 바람직하게는 75%이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

난발현성 단백질의 분비 생산을 위해 본 발명에 따라 밝혀진 단백질융합인자는 난발현성 단백질의 유전자와 융합하여 사용되며 난발현성 단백질의 분비 생산을 위해 벡터에 삽입된다. 본 발명에서 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열(regulatory sequences)에 작동 가능하도록 연결된 DNA 서열 및 기타 유전자 조작을 용이하게 하거나 단백질의 발현을 최적화하기 위해 도입되는 서열들을 함유하는 DNA 작제물을 의미한다. 그러한 조절 서열에는 전사를 조절하기 위한 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위해 선택적으로 부가된 오퍼레이터(operator), 적절한 mRNA 리보좀 결합 부위 및 전사/해독의 종료를 조절하는 서열들이 포함된다. 외래 유전자를 삽입하기 위한 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하며, 클로닝 벡터는 외래 DNA가 삽입되어 복제될 수 있는 플라스미드로서, 형질전환 시 숙주 세포로 외래의 DNA를 전달시킨다. 발현 벡터는 통상 외래 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 외래 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이 종 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 삽입된 외래 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다.

단백질융합인자를 포함하는 재조합 벡터로의 형질전환과 관련하여 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 형질전환에 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포 모두를 포함할 수 있다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 에스케리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명에 따라 난발현성 단백질을 대량 생산하기 위한 숙주 세포는 캔디다 (Candida), 디베리오마이세스 (Debaryomyces), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로이야 (Yarrowia) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속 등의 효모류가 바람직하게 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단백질융합인자 TFP 단백질을 이용하여 난발현성 단백질을 재조합 방법으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

이러한 난발현성 단백질의 재조합적 생산 방법은 상기 단백질융합인자 TFP 단백질을 코딩하는 유전자와 융합된 난발현성 단백질 코딩 유전자가 삽입된 발현벡터를 제작하는 단계 및 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모를 배양하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 40 또는 42로 기재되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열번호 10으로 기재되는 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열 또는 이의 상동성, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용하여, 난발현성 단백질을 재조합 방법으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 서열번호 1에 기재되는 단백질은 서열번호 2에 기재되는 유전자에 의해 코딩되며, 서열번호 3에 기재되는 단백질은 서열번호 4에 기재되는 유전자에 의해 코딩되고, 서열번호 5에 기재되는 단백질은 서열번호 6에 기재되는 유전자에 의해 코딩되며, 서열번호 7에 기재되는 단백질은 서열번호 8에 기재되는 유전자에 의해 코딩되며, 서열번호 40에 기재되는 단백질은 서열번호 41에 기재되는 유전자에 의해 코딩되고, 서열번호 42에 기재되는 단백질은 서열번호 43에 기재되는 유전자에 의해 코딩된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 효모 인버테이즈 결여 변이주 제조

난발현성 단백질에 대한 단백질융합인자를 초고속 선별하기 위해서 효모 인버테이즈(invertase)를 리포터로 사용하여 수크로즈 배지에서의 세포 성장여부를 이용한 자동선별시스템을 제조하였다.

벡터에 포함된 인버테이즈 유전자를 형질전환 후의 선별 리포터유전자로 사용하기 위해서 인버테이즈 활성이 결여된 효모가 필요하며 이를 위해 염색체에 존재하는 INV2 유전자를 결실시켰다. 유전자 결실 유도용 카세트 제조를 위해 플라스미드 pRB58 (Carlson 등, Cell, 1982, 20, 145)을 제한효소 EcoRI 과 XhoI으로 처리하여 INV2 코딩유전자를 회수하여 pBluescript KS+(스트라타진사, 미국)의 EcoRI/XhoI 부위에 도입하여 pBI△BX를 제조하였다. 도 1 에서 보는 바와 같이 pBI△BX에 포함된 INV2 유전자의 HindIII-XbaI 부위에 190 bp의 반복서열(Tc190)을 양 말단에 포함하는 URA3 유전자를 삽입하여 pBIU를 제조하였다. pBIU를 제한 효소 EcoRI-XhoI으로 처리한 후 사카로마이세스 세레비시에 Y2805Δgal1 (Mat a ura3 INV2 pep4::HIS3 gal1 can1) 균주(SK Rhee, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 형질전환하여 우라실이 없는 선택배지에서 형질전환체 Y2805Δgal1Δinv2U(Mat a inv2::URA3 pep4::HIS3 gal1 can1)를 선별하였다.

선별된 형질전환체의 인버테이즈 활성이 소멸되었는지 여부를 확인하기 위하여 단일 콜로니를 글루코스와 수크로즈를 단일 탄소원으로 공급한 각각의 배지에서 배양한 결과 글루코스에서는 정상적으로 성장하였고 수크로즈에서도 대조구에 비해 성장이 매우 느렸지만 성장할 수 있었다. 그러나 배양 중 배지로 분비되는 인버테이즈의 양을 조사하기 위해서 INV2+ 균주와 Δinv2 균주를 배양하고 배양 상등액에 존재하는 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후 젤을 수크로즈 용액에서 30분간 반응한 다음 TTC (2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride)로 발색한 자이모그램(zymogram) 분석을 한 결과 (도 2) Δinv2 균주의 경우 대부분의 인버테이즈 활성이 소실되었음을 알 수 있었다. 그러나 수크로즈 배지에서 매우 느리지만 성장하는 문제가 있는데 이는 미토콘드리아의 기능을 통한 글루코네오제네시스(gluconeogenesis)에 의해 세포가 부분적으로 성장하는 것으로 추정되었다. 따라서 이러한 문제를 제거하기 위해 미토콘드리아 전자전달계 작용 억제물질인 안티마이신 A를 첨가한 후 인버테이즈의 발현이 없는 균주의 성장여부를 확인한 결과 균주의 성장을 완전히 억제할 수 있었다(도 3).

선별된 Y2805Δgal1Δinv2U(Mat a inv2::URA3 pep4::HIS3 gal1 can1) 균주에 인체 cDNA 라이브러리를 함유하는 URA3 벡터를 재형질전환하기 위해서는 INV2 유전자 결실용으로 사용한 URA3 유전자를 제거할 필요가 있는데 이를 위해 배양세포를 불화오르틱산(5-fluoroorotic acid, 5-FOA) 배지에서 배양하여 URA3 유전자가 팝아웃(pop-out)된 균주 Y2805Δgal1Δinv2(Mat a ura3 inv2::Tc190 pep4::HIS3 gal1 can1)를 선별하였다(도 1). 염색체상의 INV2 유전자가 예상한 바와 같이 결실되고 URA3 유전자가 다시 팝아웃되었는지 여부를 서던블롯팅(Southern blotting)을 통해서 확인하였다(도 4). Y2805 균주의 염색체를 EcoRI으로 처리하고 INV2 유전자를 프로브로 사용할 경우 약 4.3 kb의 절편이 확인되는데 URA3 유전자가 삽입된 후(Y2805Δgal1Δinv2U) 약 5.0 kb로 증가되었다가 URA3 유전자가 팝아웃되면(Y2805Δgal1Δinv2) 약 3.7 kb로 줄어든다. 도 4의 결과에서 보는 바와 같이 INV2 유전자가 예상한 바와 같이 정확히 결실되었고 URA3 유전자가 팝-아웃되었음을 확인하였다.

<실시예 2> 인버테이즈와 융합을 통한 자동선별 시스템의 확인

인버테이즈 유전자가 결실된 균주에서 인버테이즈와 융합된 단백질의 발현을 통해 수크로즈 배지에서의 자동선별을 확인하기 위하여 효모에서 발현이 잘 되는 인체단백질인 인체 혈청알부민(human serum albumin, HSA)과 난발현단백질인 인체 인터류킨-2(IL-2)를 이용하였다.

알부민과 인버테이즈가 융합된 벡터 pGHSA-INV2를 만들기 위한 과정으로 우선 인체혈청알부민 유전자의 양 말단에 SfiI 인식서열을 삽입하기 위하여 SfiI 인식서열을 갖는 중합효소 연쇄반응용 센스 프라이머 JH97(Sfi-HSA-forward primer)(서열번호 11)과 안티센스 프라이머 JH119(Sfi-HSA-reverse primer)(서열번호 12)를 사용였으며 pYHSA5(Kang 등, J. Microbiol. Biotechnol., 1998, 8, 42)를 주형으로 하고 Pfu 중합효소(스트라타진사, 미국)을 이용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 2분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)하여 알부민유전자 약 1.8kb의 절편을 얻었다. 또한, 프라이머 JH99(Sfi-INV-forward)(서열번호 13) 및 JH100(SalI-INV-reverse primer)(서열번호 14)과 주형으로 pRB58을 사용하여 인버테이즈 유전자를 동일한 방법으로 중합효소 연쇄반응하여 회수한 후 제한효소 SfiI/SalI으로 처리하고 PstI/SfiI으로 처리된 알부민 유전자와 함께 PstI/SalI으로 처리된 pBluescript(스트라타진사, 미국)에 삽입하였다. pYHSA5를 제한효소 SacI/PstI으로 처리하여 GAL 프로모터 및 알부민유전자 일부를 포함하는 절편을 얻고 앞서 제조된 알부민 유전자 일부 및 인버테이즈 유전자를 함유하는 PstI/SalI 절편을 다시 SacI/SalI 처리된 YEGα-HIR525 벡터(Choi 등, Appl Microbiol Biotechnol., 1994, 42, 587)에 동시에 삽입하여 pGHSA-INV2를 제조하였다.

인터류킨-2와 인버테이즈의 융합발현 벡터 제조를 위해서 프라이머 JH106(Sfi-IL2-forward primer)(서열번호 15) 및 JH107(Sfi-IL2-reverse primer)( 서열번호 16)을 사용하여 pT7-hIL-2(JK Jung, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)를 주형으로 중합효소 연쇄반응하였고 회수된 인터류킨 유전자를 pBluescript(스트라타진사, 미국)의 EcoRV 부위에 삽입하여 pBKS-IL2를 제조하였다. pBKS-IL2를 SfiI으로 처리한 절편과 pGHSA-INV2를 SacI-SfiI로 처리하여 얻은 GAL 프로모터 및 INV 분비시그날을 함유하는 절편을 SacI/SfiI으로 처리된 pGHSA-INV2에 동시에 삽입하여 pGIL2-INV2를 제조하였다.

알부민과 인버테이즈의 융합단백질을 발현하는 벡터 pGHSA-INV2와 인터류킨-2와 인버테이즈의 융합단백질을 발현하는 pGIL2-INV2 및 인버테이즈 만을 발현하는 pRB58을 인버테이즈 유전자가 결실되어 수크로즈 배지에서 성장할 수 없는 균주(Y2805Δinv2)에 각각 형질전환하고 글루코스를 탄소원으로 첨가한 배지(UD)와 수크로즈를 탄소원으로 첨가한 배지(YPSA)에 도말하여 세포의 성장여부를 관찰하였다(도 5). 인버테이즈를 정상적으로 발현하는 벡터인 pRB58의 경우에는 두 가지 탄소원에서 모두 제대로 성장하였으며, 또한 인버테이즈가 효모에서 발현이 잘되는 단백질인 알부민과 융합된 경우(pGHSA-INV2)에도 역시 두가지 탄소원을 모두 잘 이용하며 성장하였다. 그러나 효모에서 발현되기 어려운 단백질인 인터류킨-2의 경우(pGIL2-INV2)에는 글루코스 배지에서는 정상적으로 성장하지만 수크로즈 배지에서는 전혀 성장하지 못하였다. 이는 예상한 바와 같이 인터류킨-2가 세포내에서 발현이 불가능하여 이에 융합된 인버테이즈도 발현되지 못하기 때문으로 판단되었다. 따라서 인버테이즈 유전자가 결실되어 수크로즈 배지에서 성장할 수 없는 균 주(Y2805Δinv2)에 형질전환한 인버테이즈 유전자의 발현여부를 이용하여 자동선별이 가능함을 알 수 있었다.

<실시예 3> 난발현단백질 인체 인터류킨-2를 이용한 단백질융합인자 선별 벡터의 제조

인터류킨-2와 인버테이즈가 융합된 벡터 pGIL2-INV2에 융합단백질의 분비를 유도할 수 있는 적절한 단백질융합인자를 확보하기 위하여 세가지 리딩프레임(reading frame)을 갖는 라이브러리 제조 벡터 pYHTS-F0, F1 및 F2를 제조하였다(도 6).

세 개의 리딩프레임과 BamHI 인식서열을 갖는 중합효소 연쇄반응용 센스 프라이머 JH120(BamHI-IL2-1-forward primer)(서열번호 17), JH121(BamHI-IL2-2-forward primer)(서열번호 18) 및 JH122(BamHI-IL2-3-forward primer)(서열번호 19)와 안티센스 프라이머 JH123(INV-1-reverse primer)(서열번호 20)를 이용하고 pGIL2-INV2를 주형으로 사용하여 Pfu 중합효소(스트라타진사, 미국)를 이용한 중합효소 연쇄반응(94℃에서 3분 동안 1회; 94℃ 30 초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)하여 인터류킨-2와 일부의 인버테이즈 유전자를 포함하는 약 1.2 kb의 절편을 각각 얻었다. 다시 JH124(INV-forward primer)(서열번호 21)와 JH95(INV-2-reverse primer)(서열번호 22)를 프라이머로 이용하고 pGIL2- INV2를 주형으로 사용하여 동일한 조건으로 중합효소 연쇄반응하여 일부의 인버테이즈 유전자를 포함하는 약 0.9 kb의 절편을 각각 얻었다. 각각의 유전자를 아가로스젤로부터 회수한 다음 세 가지 리딩프레임을 갖는 1.2 kb 절편 세 종류와 0.9 kb 절편을 각각 혼합하여 센스 프라이머 JH120(서열번호 17), JH121(서열번호 18) 및 JH122(서열번호 19)와 안티센스 프라이머 JH95(서열번호 22)를 이용하여 2차 중합효소 연쇄 반응을 수행하였고 아가로스젤 전기영동을 통해 각각 2.1 kb 절편 세 종류를 회수하였다. 회수된 3종의 2.1kb 절편을 제한효소 BamHI과 SalI으로 처리하여 BamHI과 SalI으로 처리된 pGIL2-INV2에 각각 결합하여 pYHTS-F0, F1 및 F2를 제조하였다.

<실시예 4> 효모 유전체로부터 맞춤형 단백질융합인자 라이브러리 제조

단백질융합인자 라이브러리 제조를 위해서 효모 사카로마이세스 세레비시에 Y2805(SK Rhee, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 및 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC26012) 유래의 염색체 DNA를 이용하였다. 각각의 염색체를 제한효소 Sau3AI으로 부분절단 후 아가로스 젤에서 0.5 내지 1.0 kb 크기의 DNA를 회수한 다음 BamHI 으로 절단하고 송아지 장 유래의 포스파테이즈(calf intestine phosphatase)로 처리한 pYHTS-F0, F1 및 F2 혼합 벡터에 연결하였다(도 6). 연결된 DNA를 대장균 DH5α에 형질전환하고 엠피실린이 포함된 LB배지(1% Bacto-tryptone, 0.5 % yeast extract, 1% NaCl)에 도말한 후 37℃에서 하루 배양 하였다. 각각의 염색체로부터 제조된 라이브러리 DNA를 이용하여 약 5×10⁴ 세포의 형질전환체 라이브러리를 확보하였다. 모든 형질전환체를 멸균증류수를 이용하여 회수하고 회수된 균체로부터 라이브러리 DNA를 플라스미드 추출 키트(바이오니어)를 이용하여 분리하였다.

<실시예 5> 난분비성 단백질 인체 인터류킨-2에 적합한 맞춤형 단백질융합인자 자동선별

상기한 방법으로 제조된 라이브러리 DNA를 효모 사카로마이세스 세레비시에 Y2805Δgal1Δinv2(Mat a ura3 inv2::Tc190 pep4::HIS3 gal1 can1)에 리튬 아세테이트 방법(Hills 등, Nucleic acids Res. 1991, 19, 5791)으로 형질전환한 다음 우라실이 결핍된 UD 최소배지(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 기질, 적정농도의 각종 아미노산 혼합체, 2% 글루코스)와 수크로즈 및 antimycin A를 포함하는 복합배지 YPGSA(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 수크로즈, 0.03% 갈락토즈, 1μg/mL antimycin A)에 각각 도말하여 30℃에서 5일간 배양하였다. 배양 후 각 배지에서 형성된 균체의 수는 표 1(단백질융합인자 도입 전후의 형질전환체 수의 비교)에 표시한 바와 같다. 라이브러리 제작을 위해 사용한 벡터 (pYHTS-F0, F1 및 F2)만을 형질전환한 경우에는 글루코스 배지에서는 약 1×10⁴ 정도의 균체가 형성되었으나 탄소원으로 수크로즈를 사용한 배지에서는 예상한 바와 같이 전혀 성장하지 못하였다. 그러나 효모 유전체 라이브러리를 삽입한 경우에는 약 11개의 형질전환체가 성장하여 삽입된 단백질융합인자의 도움으로 인버테이즈가 분비되었음을 예상할 수 있었다.

<실시예 6> 단백질융합인자의 분석

수크로즈 배지에서 성장한 각 균체를 YPD(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스)배지에서 24시간 배양한 후 회수된 세포를 파쇄한 다음 도입된 플라스미드를 분리하고 대장균에 재형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리한 후 제한효소 처리하여 삽입된 유전자의 유무를 확인하였고 염기서열 분석을 통해 4 종류의 서로 다른 서열을 갖는 유전자가 삽입되어 단백질융합인자 역할을 하는 것을 알 수 있었다(표 2: 수크로즈배지에서 성장한 균체로부터 분리된 플라스미드에 삽입된 신규 단백질융합인자).

6-1. 단백질융합인자 1(translational fusion partner 1, TFP1)

본 발명자들은 인터류킨-2와 인버테이즈 융합단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 단백질융합인자 1(TFP1)(서열번호 2)을 발굴하였다. TFP1 유전자는 효모 사카로마이세스 세레비지에 유전자 Yar066w의 부분 서열과 동일하다. Yar066w 유전자는 α1,4-글루칸 글루코시다제 (STA1) 유전자와 유사하고, 이에 의해 코딩되는 단백질은 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-앵커 (glycosyl- phosphatidylinositol(GPI)-anchor)를 함유한 단백질이다. Yar066w 유전자는 아직 기능이 알려지지 않은 유전자이며, 효모 사카로마이세스 세레비지에의 기능이 알려지지 않은 유전자들인 Yol155c와 Yil169c와 각각 70.3 및 72.7%의 서열 유사성을 보인다. Yar066w 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열 중, 인터류킨과 융합된 아미노산의 수는 전체 203개 중 105개이며, 단백질 분비를 위한 시그날로 23개 아 미노산의 분비 시그날을 함유하고 있으며 N-당쇄부가 부위와 세린, 알라닌-리치(serine-rich) 서열을 함유하고 있다.

6-2. 단백질융합인자 2(TFP2)

본 발명자들은 인터류킨-2와 인버테이즈 융합단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 단백질융합인자 2(TFP2)(서열번호 4)를 발굴하였다. TFP2 유전자는 효모 사카로마이세스 세레비지에 유전자 Yar026c의 부분 서열과 동일하다. Yar026c 유전자는 아직 기능이 알려지지 않은 유전자이다. Yar026c 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열 중, 인터류킨-2와 융합된 아미노산의 수는 전체 169개 중 117개이며, 단백질 분비를 위한 시그날로 19개 아미노산의 분비 시그날을 함유하고 있으며 3개의 N-당쇄부가 부위를 함유하고 있다.

6-3. 단백질융합인자 3(TFP3)

본 발명자들은 인터류킨-2와 인버테이즈 융합단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 단백질융합인자 3(TFP3)(서열번호 6)을 발굴하였다. TFP3 유전자는 효모 사카로마이세스 세레비지에 유전자 Yjl158c(PIR4/CIS3)의 부분 서열과 동일하다. Yjl158c 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포벽에 공유결합된 O-만노실화된 단백질이다. Yjl158c 유전자는 세포분열에 관여하는 Cik1 결여변이주에 대 한 멀티카피 서프레서(multicopy suppressor)로 알려진 유전자이다. Yjl158c 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열 중, 인터류킨-2와 융합된 아미노산의 수는 전체 227개 중 104개이며, 단백질 분비를 위한 시그날로 23개 아미노산의 프리(pre) 분비 시그날과 41개의 프로(pro) 분비서열을 함유하고 있고 Lys-Arg로 구성된 Kex2p 절단서열을 함유하고 있으며 PIR 반복서열을 가지고 있다.

6-4. 단백질융합인자 4(TFP4)

본 발명자들은 인터류킨-2와 인버테이즈 융합단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 단백질융합인자 4(TFP4)(서열번호 8)를 발굴하였다. TFP4은 효모 한세눌라 폴리모르파 유래의 유전자이며 기능은 알려진 바 없으나 인터류킨-2와 융합된 아미노산의 수는 50개이며 이 중 18개의 아미노산으로 구성된 단백질 분비시그날을 포함하고 있다.

<실시예 7> 배지로 분비된 융합단백질의 분석

수크로즈 배지에서 성장한 균체가 분비하는 단백질을 분석하기 위해서 상기한 4가지 단백질융합인자를 함유하는 균체를 YPDG 배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스, 0.03% 갈락토즈)에서 40시간 배양한 후 세포를 제거하고 남은 배양 상등액에 녹아있는 전체 단백질을 아세톤(최종농도 40%)으로 침전시킨 후 SDS-PAGE 하였으나 인버테이즈가 융합된 상태에서는 인버테이즈 부분의 과다한 당쇄부가로 인해서 단일 단백질 밴드를 확인하기 힘든 문제가 있었기 때문에 각 벡터(pYHTS-TFP1, 2, 3 및 4)에서 인버테이즈를 제거하고 인터류킨-2 유전자에 해독종결코돈을 삽입하였다. 이를 위해 프라이머 JH132(SacI-GAL-forward primer)(서열번호 23) 및 JH137(IL2-Term-reverse primer)(서열번호 24)을 이용하여 각각의 벡터로부터 GAL promoter, 각 TFP 및 해독종결코돈을 함유한 인터류킨-2 유전자를 포함하는 절편을 얻기 위하여 각 벡터(pYHTS-TFP1, 2, 3 및 4)를 중합효소 연쇄반응한 후 회수된 유전자 절편을 SacI/SalI으로 처리하고 SacI/SalI으로 처리된 YEGα-HIR525 벡터에 삽입하여 pYIL-TFP1, 2, 3 및 4를 제조하였다. 제조된 4종의 IL-2 발현 벡터를 효모에 형질전환한 후 단일 콜로니를 확보하고 상기한 바와 같은 방법으로 배양하여 배양상등액에 분비된 단백질을 SDS-PAGE하여 분석하였다(도 7). 도 7의 결과에서 보는 바와 같이 pYIL-TFP2를 제외한 각각의 벡터를 함유한 균체의 배양 상등액에서 단백질의 크기가 서로 다른 강한 밴드들이 관찰되었으며 이들은 IL-2 항체를 이용한 웨스턴블롯팅(도 7)에서 밴드로 확인되어 각각의 분비유도 융합단백질과 IL-2가 융합된 상태임을 확인할 수 있었다. 그러나 각각의 단백질융합인자 및 IL-2 유전자 크기로부터 유추되는 단백질 크기보다 SDS-PAGE 상에서 나타난 실제 크기가 상당한 차이가 있었는데 이는 당쇄부가로 인한 차이일 것으로 추정되어 N-당쇄부가에 의해서 단백질에 부가된 당을 제거하기 위해서 각 단백질에 엔도에이치(Endo-H) 효소를 처리한 후 다시 SDS-PAGE 분석하였다(도 8). 단백질 서열상 TFP1에는 한 개의 N-당쇄부가 유발 서열(28-30번째 아미노산)이 있으며 TFP3은 O-당쇄 부가 유도서열을 함유하고 있으며 TFP4에는 당쇄부가 유도서열이 없었다. 예상한 바와 같이 pYIL-TFP1의 경우에는 엔도에이치 처리 후 분자량이 상당히 감소함을 알 수 있었다. 따라서 pYIL-TFP1의 경우에는 발현된 단백질이 N-당쇄부가되어 있음을 확인할 수 있었으나 pYIL-TFP3의 경우에는 O-당쇄부가에 의한 당쇄부가이기 때문에 엔도에이치 처리하여도 분자량의 변화가 없었고 pYIL-TFP4의 경우에도 아무런 변화가 없었다.

<실시예 8> 세포내에서 Kex2p 절단에 의한 원형(authentic) 단백질 생산

본 발명자들은 실시예 7에서 사용한 벡터가 각 단백질 융합인자와 IL-2가 융합된 상태로 배지로 분비되기 때문에 이를 인체 인터류킨-2와 동일한 상태의 원형(authentic)단백질을 생산하기 위해서 세포내에서 단백질융합인자를 자동으로 제거 할 수 있도록 융합인자와 IL-2 사이에 효모가 자체적으로 생산하는 단백분해효소 Kex2p가 인식할 수 있는 절단 부위 (Leu-Asp-Lys-Arg)를 각각 삽입하였다. pYIL-TFP1에 Kex2p 절단서열을 넣기 위해서 pYIL-TFP1을 주형으로 하고 프라이머 JH132(서열번호 23) 및 HY22(TFP1-LDKR-reverse primer)(서열번호 25), HY23(TFP1-LDKR-forward primer)(서열번호 26) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 각각 중합효소 연쇄반응하고 전기영동후 젤로부터 회수된 GAL promoter 및 TFP1을 함유하는 절편과 인터류킨-2 유전자를 함유하는 절편을 주형으로 하고 JH132(서열번호 23) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 2차 중합효소 연쇄반응하였다. 얻어진 GAL promoter-TFP1-IL2 절편을 제한효소 SacI/SalI으로 처리하고 SacI/SalI으로 처리된 YEGα-HIR525 벡터에 삽입하여 pYIL-KRTFP1을 제조하였다. 또한 pYIL-TFP2에 Kex2p 절단서열을 넣기 위해서 pYIL-TFP2를 주형으로 하고 상기한 방법과 동일한 방법으로 프라이머 JH132(서열번호 23) 및 HY20(TFP2-LDKR-reverse primer)(서열번호 27), HY21(TFP2-LDKR-forward primer)(서열번호 28) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 각각 중합효소 연쇄반응하고 회수된 2개의 유전자절편을 주형으로 하고 JH132(서열번호 23) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 2차 중합효소 연쇄반응한 후 얻어진 절편을 제한효소 SacI/SalI으로 처리하고 SacI/SalI으로 처리된 YEGα-HIR525 벡터에 삽입하여 pYIL-KRTFP2를 제조하였다. 또한 pYIL-TFP3에 Kex2p 절단서열을 넣기 위해서 pYIL-TFP3을 주형으로 하고 상기한 방법과 동일한 방법으로 프라이머 JH132(서열번호 23) 및 HY17(TFP3-LDKR-reverse primer)(서열번호 38), HY18(TFP3-LDKR-Forward primer)(서열번호 39) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 각각 중합효소 연쇄반응하고 회수된 2개의 유전자절편을 주형으로 하고 JH132(서열번호 23) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 2차 중합효소 연쇄반응한 후 얻어진 절편을 제한효소 SacI/SalI으로 처리하고 SacI/SalI으로 처리된 YEGα-HIR525 벡터에 삽입하여 pYIL-KRTFP3를 제조하였다. 또한 pYIL-TFP4에 Kex2p 절단서열을 넣기 위해서 pYIL-TFP4를 주형으로 하고 상기한 방법과 동일한 방법으로 프라이머 JH132(서열번호 23) 및 HY24(TFP4-LDKR-reverse primer)(서열번호 29), HY25(TFP4-LDKR-forward)(서열번호 30) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 각각 중합효소 연쇄반응하고 회수된 2개의 유전자절편을 주형으로 하고 JH132(서열번호 23) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 2차 중합효소 연쇄반응한 후 얻어진 절편을 제한효소 SacI/SalI으로 처리하고 SacI/SalI으로 처리된 YEGα-HIR525 벡터에 삽입하여 pYIL-KRTFP4를 제조하였다.

제조된 4가지 벡터 중 pYIL-KRTFP1, pYIL-KRTFP3 및 pYIL-KRTFP4를 각각 효모 2805Δgal1Δinv2 균주에 도입하여 단일콜로니를 선별하여 YPDG 배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스, 0.03% 갈락토즈)에서 40시간 배양한 후 세포를 제거하고 남은 배양 상등액을 SDS-PAGE 한 결과 도 9 에서 보는 바와 같이 인체 인터류킨-2와 동일한 크기의 단백질이 분비생산됨을 확인하였다. 인체 인터류킨-2를 분비 생산하는 3가지 단백질융합인자 중 TFP1이 가장 효율적으로 원형의 인터류킨-2를 분비 생산할 수 있음을 확인하였다.

상기 벡터 pYIL-KRTFP1, pYIL-KRTFP2, pYIL-KRTFP3 및 pYIL-KRTFP4는 2003년 11월 11일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 각각 수탁번호 KCTC 10544BP, 10545BP, 10546BP 및 10547BP로 기탁하였다.

<실시예 9> 단백질융합인자 1 (TFP1)의 특성분석

IL-2를 가장 효율적으로 분비 생산하는 단백질융합인자로 TFP1을 선별하여 TFP1 서열에 존재하는 분비시그날 (a), N-당쇄부가 부위 (b), 및 세린, 알라닌-리치 서열 (c), 추가서열 (d) 및 5‘-UTR(5’-비해독 서열) 서열(e) 중 어떤 서열이 난분비단백질인 인터류킨-2의 분비에 절대적인 영향을 주는지 확인하기 위하여 도 10에서 보는 바와 같이 TFP1의 각 특징서열을 하나씩 제거한 결여 유전자를 제조하였다. 먼저 TFP1에서 서열상 별 특징이 없는 추가서열 d를 제거하기 위해 pYIL-KRTFP1을 주형으로 하고 프라이머 JH143(XbaI-TFP1-d-reverse primer)(서열번호 31) 및 JH132(서열번호 23)를 사용하여 중합효소 연쇄반응하였다. 획득된 DNA 절편은 GAL 프로모터와 TFP1에서 서열 d 가 제거된 절편인 TFP1-1을 포함하고 있다. TFP1에서 추가서열 (d) 및 세린, 알라닌-리치 서열(c)을 제거하기 위해 pYIL-KRTFP1을 주형으로 하고 프라이머 JH142(XbaI-TFP1-c-reverse primer)(서열번호 32) 및 JH132(서열번호 23)를 사용하여 중합효소 연쇄반응하였으며 획득된 절편은 GAL 프로모터와 서열 c 및 d 가 제거된 절편 TFP1-2를 포함하고 있다. 또한 TFP1에서 d, c 및 N-당쇄부가 부위 (b)를 제거하기 위해 pYIL-KRTFP1을 주형으로 하고 프라이머 JH141(XbaI-TFP1-b-reverse primer)(서열번호 33) 및 JH132(서열번호 23)를 사용하여 중합효소 연쇄반응하였으며 획득된 절편에는 GAL 프로모터 및 서열 c, d 및 b가 제거된 절편을 TFP1-3를 포함하고 있다. Kex2p 절단부위를 포함하는 IL-2 유전자를 제조하기 위해서 pYIL-KRTFP1을 주형으로 하고 프라이머 JH140(SpeI-XbaI-LDKR-forward primer)(서열번호 34) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 중합효소 연쇄반응하였다. 회수된 IL-2 절편을 제한효소 SpeI 및 SalI으로 처리한 절편과 앞서 획득된 3가지 절편(TFP1-1, 2, 및 3)을 각각 제한효소 SacI 및 XbaI으로 처리하고 SacI 및 SalI으로 처리된 YEGα-HIR525에 각각 삽입하여 도 10에서 보는 바와 같이 pYIL-KRT1-1, pYIL-KRT1-2, 및 pYIL-KRT1-3를 제조하였다. TFP1의 5’-UTR을 제거하기 위해서 pYIL-KRTFP1을 주형으로 하고 프라이머 HY38(TFP1-UTR-forward primer)(서열번호 35) 및 JH137(서열번호 24)을 이용하여 중합효소 연쇄반응하였으며 회수된 유전자를 BamHI/SalI으로 처리한 후 SacI/BamHI으로 처리된 GAL10 프로모터와 같이 SacI/SalI으로 처리된 YEGα-HIR525에 삽입하여 pYIL-KRT1-4를 제조하였다(도 10).

제조된 4종의 플라스미드 pYIL-KRT1-1, pYIL-KRT1-2, pYIL-KRT1-3 및 pYIL-KRT1-4를 효모에 형질전환하고 단일콜로니를 배양하여 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과 도 11 에서 보는 바와 같이 분비시그날, N-당쇄부가 및 세린, 알라닌-리치 서열을 모두 포함하고 있는 pYIL-KRT1-3의 경우에만 IL-2 밴드가 확인되었고 세린, 알라닌-리치 서열이 제거된 pYIL-KRT1-2 및 세린, 알라닌-리치 서열 및 N-당쇄부가 서열이 제거된 pYIL-TFP1-1의 경우에는 전혀 밴드가 확인되지 않았다. 따라서 IL-2 분비를 효과적으로 유도하기 위해서는 TFP1에 존재하는 세 가지 특징적인 서열(분비시그날, N-당쇄부가 및 세린, 알라닌-리치 서열)이 모두 필요함을 알 수 있었다. 또한 TFP1의 5'-UTR을 제거한 경우 발현율이 약 3배 이상 증가함을 확인하였다.

상기 벡터 pYIL-KRT1-3 및 pYIL-KRT1-4는 2003년 11월 11일자로 국제기탁기 관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 각각수탁번호 KCTC 10548BP 및 10549BP로 기탁하였다.

<실시예 10> 단백질융합인자 TFP1-4를 이용한 인체 인터류킨2의 발효생산

상기벡터 pYIL-KRT1-4를 형질전환한 재조합 효모균주를 5L 자 발효조(jar fermentor)에서 유가식 발효배양을 통해서 인터류킨-2의 분비생산성을 조사하였다. 발효조에 접종하기 위한 씨드 배양은 플라스크에서 씨드 배지(효모 nitrogen base without amino acid 6.7%, 카사미노에시드 0.5% 및 포도당 2%)를 사용하여 배양하였고 초기 발효배지로는 배지로는 발효배양배지(효모추출물 4%, 펩톤 1%, 포도당 2%)를 사용하여 약 15 OD600까지 배양한 후 유가배지(효모추출물 15%, 포도당 30%, 갈락토스 30%)를 세포의 성장속도에 따라 공급량을 다르게 공급하여 배양하였다. 약 64시간 배양후 세포는 약 200 OD600까지 성장하였고 각 시간별로 배지시료 5 ul를 취하여 분비단백질을 SDS-PAGE 분석하였다(도 12). 결과적으로 약 500 mg/l의 인터류킨-2가 배지로 분비생산되었음을 표준시료의 양과 비교하여 확인하였다. 효모 발효를 통해 분비생산된 인터류킨-2는 아미노산말단 분석을 통해 Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser로 구성되었음을 확인하여 인체에서 분비되는 인터류킨-2와 동일하다는 것을 확인하였다.

<실시예 11> 단백질융합인자 TFP1 내지 4를 이용한 인체 콜로니자극인자(G-CSF)의 분비능 비교

난분비 단백질인 인체 인터류킨-2를 이용하여 확보된 4종의 단백질융합인자(TFP1, 2, 3 및 4)가 또 다른 난분비 인체단백질의 분비에도 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 난분비단백질인 인체 콜로니자극인자(G-CSF)를 4종의 TFP에 융합하여 효모에서 발현 및 분비를 확인하였다. 인체 콜로니자극인자 유전자는 인체 cDNA 라이브러리로부터 프라이머 JH144(GCSF-forward primer)(서열번호 36) 및 JH145(GCSF-reverse primer)(서열번호 37)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 확보하였으며 확보된 유전자를 제한효소 XbaI/SalI으로 처리하고 pYIL-KRTFP1, 2, 3 및 4의 XbaI/SalI 부위에 삽입하여 pYGCSF-TFP1, 2, 3 및 4를 제조하였다.

인체 콜로니자극인자를 발현하기 위해 제조된 벡터 pYGCSF-TFP1, 2, 3, 및 4를 효모에 형질전환하고 단일콜로니를 분리하여 배양한 후 배양상등액을 SDS-PAGE 하고 G-CSF 항체를 이용한 웨스턴블롯팅 결과는 도 13 에서 보는 바와 같다. 각각의 TFP에 의해서 G-CSF가 분비생산되었음을 알 수 있고 TFP1 및 TFP3에 의해서 효율적으로 G-CSF가 분비생산됨을 알 수 있었다. 특히 TFP3의 경우 가장 효율적으로 G-CSF를 분비생산할 수 있음을 G-CSF에 대한 항체(케미콘, 미국)를 이용하여 웨스턴블롯팅한 결과 확인할 수 있었다. 따라서 단백질의 종류에 따라서 서로 다른 TFP가 최대의 분비효율을 나타낸다는 것이 입증되기 때문에 본 발명에서 얻은 4종의 TFP는 IL-2 또는 G-CSF 이외의 다양한 난분비성 단백질의 분비를 촉진할 수 있 는 단백질융합인자로 매우 유용할 것으로 판단되었다.

<실시예 12> 단백질융합인자 TFP3을 이용한 인체 콜로니성장인자(G-CSF)의 발효생산

실시예 11에서 기술된 벡터 pYGCSF-TFP3로 형질전환된 재조합 효모균주를 5L 자 발효조에서 유가식 발효배양을 통해서 인체 콜로니성장인자의 분비생산성을 조사하였다. 발효조에 접종하기 위한 씨드 배양은 플라스크에서 씨드 배지(효모 질소 베이스(아미노산 부재) 6.7%, 카사미노에시드 0.5% 및 포도당 2%)를 사용하여 배양하였고 초기 발효배지로는 배지로는 발효배양배지(효모추출물 4%, 펩톤 1%, 포도당 2%)를 사용하여 약 15 OD600까지 배양한 후 유가배지(효모추출물 15%, 포도당 30%, 갈락토스 30%)를 세포의 성장속도에 따라 공급량을 다르게 공급하여 배양하였다. 약 64시간 배양후 세포는 약 200 OD600까지 성장하였고 각 시간별로 배지시료 5 ul를 취하여 분비단백질을 SDS-PAGE 분석하였다(도 14). 결과적으로 약 300 mg/l의 인체 콜로니성장인자가 배지로 분비생산 되었음을 표준시료의 양과 비교하여 확인하였다. 효모 발효를 통해 분비생산된 인체 콜로니성장인자는 아미노산말단 분석을 통해 Thr-Pro-Leu-Gly-Pro로 구성되었음을 확인하여 인체에서 분비되는 콜로니성장인자와 동일하다는 것을 확인하였다.

<실시예 13> 단백질융합인자 TFP3 유도체를 이용한 인체 콜로니자극인자(G-CSF)의 분비효율 분석

상기 실시예 11에서 G-CSF의 최적분비를 위해서 TFP3가 가장 우수함을 확인함에 따라 효모 사카로마이세스 세레비지에 유전체로부터 PCR을 이용하여 TFP3이 유래한 유전자 Yjl158c(CIS3) 전체를 확보하고 도 15에서 보는 바와 같이 TFP3의 길이를 점차적으로 변화시킨 TFP3의 유도체를 6종(TFP3-1, 2, 3, 4 및 TFP3-1-1(서열번호 40), TFP3-1-2(서열번호 42) 제조하였다. 처음 얻어진 TFP3은 Yjl158c(CIS3)로부터 얻어지는 227개의 아미노산 중 104개를 함유하고 있으나 이를 점차적으로 길게 만든 각 TFP3-1(130개 아미노산 포함), TFP3-2(157개 아미노산 포함), TFP3-3(189개 아미노산 포함) 및 TFP3-4(222개 아미노산 포함)를 제조하고 각각을 G-CSF 유전자에 연결하고 융합부위에 Kex2p 인식부위를 삽입하였다. 도 15의 (A)결과에서 보는 바와 같이 TFP3의 길이를 26개 아미노산 추가한 TFP3-1의 경우 추가적인 N-당쇄부가 부위가 포함되어 G-CSF 분비율이 TFP3에 비해서 약 3배 정도 증가하였다. 그러나, TFP3의 길이를 더 길게 한 경우에는 별 효과가 없었으며 오히려 TFP3-3 및 TFP3-4의 경우에는 분비효율이 낮아지는 결과를 보였다.

또한, 도 15의 (A)에서 보는 바와 같이 발현 및 분비효율이 증진됨에 따라 Kex2p에 의해 완전히 절단되지 않은 TFP3-1-GCSF의 융합단백질이 배지로 분비되는 것이 관찰되었다. 이는 두 유전자의 융합부위에 존재하는 다수의 O-당쇄부가 부위에 부가된 당에 의해 효소접근이 힘들기 때문으로 판단되어 TFP3에 추가적으로 4 개의 아미노산이 추가된 TFP3-1-1(134개 아미노산 포함) 및 13개의 아미노산이 추가된 TFP3-1-2(143개 아미노산 포함)를 제조하여 G-CSF 분비능 및 융합단백질 감소여부를 조사한 바 도 15의 (B)에서 보는 바와 같이 TFP3-1-1 및 TFP3-1-2에서 G-CSF의 분비량의 감소 없이 융합단백질의 양이 대폭 감소되었다. 따라서 확보된 TFP와 목적단백질의 융합부위의 정교한 조작에 의해서 목적단백질의 분비율을 더욱 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 단백질융합인자 TFP3-1-1을 함유하는 G-CSF 발현벡터 pYGT3-1-1-GCSF 및 TFP3-1-2를 함유하는 G-CSF 발현벡터 pYGT3-1-2-GCSF는 2004년 12월 21일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 각각 수탁번호 KCTC 10753BP 및 KCTC 10754BP로 기탁하였다.

<실시예 14> 단백질융합인자 TFP3를 이용한 산업효소 리파제의 분비생산

단백질 분비융합인자 TFP3를 함유한 G-CSF 발현벡터 pYGCSF--KRTFP3의 XbaI-SalI 부위에 pYGA-CalB14(ES Choi, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)를 XbaI-SalI으로 처리하여 얻은 CalB 유전자를 삽입하여 pYGT3-CalB14를 제조하였다. 각 발현벡터를 사용하여 배양온도에 따른 CalB14의 분비율을 비교하였다. TFP3를 이용한 CalB14 분비생산의 경우 배양적온인 30℃에서도 기 존 발현시스템에 비해 2배 이상의 높은 분비율을 보였다(표 3: 각 발현 벡터를 함유한 균주의 배양온도에 따른 CalB 활성).

pYGT3-CalB14를 함유한 재조합 효모를 5L 자 발효조에서 유가배양 및 적온배양(30℃)하여 CalB14의 분비정도를 분석하였다. 사용배지로는 발효배양배지(효모추출물 4%, 펩톤 1%, 포도당 2%)를 사용하여 약 15 OD600까지 배양한 후 유가배지(효모추출물 15%, 포도당 30%, 갈락토스 30%)를 세포의 성장속도에 따라 공급량을 다르게 공급하여 배양하였다. 재조합 균주는 30℃에서 아주 빠르게 성장할 수 있었으며 배양온도의 이동(shift) 없이도 고효율로 CalB14를 배지로 분비생산할 수 있었다. 단백질 활성 및 농도 분석 결과 약 1.5-2.0 g/L의 CalB14가 배지로 분비되어 CalB14의 경제적인 대량생산이 가능하였다(도 16).

<실시예 15> 단백질융합인자 TFP1의 활성을 피키아 파스토리스에서 확인

본 발명에서 개발된 TFP가 다른 효모 피. 파스토리스에서도 작동하는지를 확인하기 위하여 피. 파스토리스 벡터인 pPIC9(Invitrogen, 미국)를 BglII-EcoRI으로 처리하여 AOX 프로모터를 제거하고 여기에 피. 파스토리스 염색체로부터 프라이머 (BglII-GAP-forward primer: 서열번호 44) 및 (GAP-EcoRI-reverse primer: 서열번호 45)를 사용하여 확보된 GAP(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유래의 프로모터를 삽입하여 pPIC9-GAP을 제작하였다. 이 벡터를 EcoRI-NotI으로 처리하고 여기에 EcoRI-NotI으로 처리된 MFalpha(mating factor alpha)-GCSF 및 TFP1-GCSF 유전자를 각각 삽입하여 pGAP-MF-GCSF 및 pGAP-TFP1-GCSF를 제작하였다. 각각의 벡터를 SalI으로 처리한 후 피. 파스토리스 GS115(Invitrogen, 미국)에 형질전환하였다. 확보된 형질전환체를 플라스크 배양하여 배지로 분비된 G-CSF를 SDS-PAGE 분석을 통해 최종균주를 선별하였다. 각각의 벡터가 도입된 선별균주를 발효조에서 발효배지(효모추출물 4%, 박토펩톤 1%, 글리세롤 4%)를 사용하여 회분배양(batch culture)하였고 시간별로 시료를 취하여 배지로 분비된 G-CSF를 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다(도 17). 도 17 결과에서 보는 바와 같이 TFP1의 경우 MFalpha 보다 높은 분비율을 나타내어 효모 에스. 세레비시애 유래의 TFP가 피. 파스토리스에서도 매우 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 현재까지 재조합 생산이 불가능하거나 발현율이 낮았던 다양한 단 백질을 맞춤형 TFP 초고속 발굴 및 이용을 통하여 경제적으로 대량생산이 가능하도록 하는데 기여한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. 진핵세포에서 재조합단백질 인터류킨-2, 콜로니 자극인자(G-CSF) 또는 리파제 B(CalB)의 분비를 유도하는, 하기의 단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 단백질융합인자 TFP 단백질:

   (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1 단백질;

   (b) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP2 단백질;

   (c) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3 단백질;

   (d) 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP4 단백질;

   (e) 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1-3 단백질;

   (f) 서열번호 10으로 기재되는 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1-4 단백질;

   (g) 서열번호 40으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3-1-1 단백질; 및

   (h) 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3-1-2 단백질.
2. 진핵세포에서 재조합단백질 인터류킨-2, 콜로니 자극인자(G-CSF) 또는 리파제 B(CalB)의 분비를 유도하는 단백질융합인자 TFP를 코딩하는, 하기의 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 단백질융합인자 TFP 유전자:

   (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1 단백질을 코딩하는 유전자;

   (b) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP2 단백질을 코딩하는 유전자;

   (c) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3 단백질을 코딩하는 유전자;

   (d) 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP4 단백질을 코딩하는 유전자;

   (e) 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP1-3 단백질을 코딩하는 유전자;

   (f) 서열번호 10으로 기재되는, 단백질융합인자 TFP1-4 단백질을 코딩하는 유전자;

   (g) 서열번호 40으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3-1-1 단백질을 코딩하는 유전자; 및

   (h) 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질융합인자 TFP3-1-2 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 41 및 서열번호 43의 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 단백질융합인자 TFP 유전자.
4. 제2항의 (a) 내지 (h)의 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 41 및 서열번호 43의 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 재조합 벡터.
6. 제4항에 있어서, pYIL-KRTFP1(KCTC 10544BP), pYIL-KRT1-3(KCTC 10548BP), pYIL-KRT1-4(KCTC 10549BP), pYIL-KRTFP2(KCTC 10545BP), pYIL-KRTFP3(KCTC 10546BP), pYGT3-1-1-GCSF(KCTC 10753BP), pYGT3-1-2-GCSF(KCTC 10754BP) 및 pYIL-KRTFP4(KCTC 10547P)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 벡터.
7. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
8. 제7항에 있어서, 캔디 다(Candida), 디베리오마이세 스(Debaryomyces), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로이야 (Yarrowia) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 중에서 선택되는 효모인 형질전환체.
9. 제1항의 단백질융합인자 TFP 단백질을 코딩하는 유전자와 융합된 난발현성 단백질 코딩 유전자가 삽입된 발현벡터를 제작하는 단계 및 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모를 배양하는 단계를 포함하여, 난발현성 단백질을 제조하는 방법.

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