KR100762965B1 - 생리활성 성분 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼류를 95 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 증삼 처리하면서 발생하는 증기를 냉각 포집하는 단계가 2회 반복되는 공정에 의하여 생리활성 성분의 함량이 증진된 인삼 추출물을 경제적으로 제조하는 방법, 상기 추출물을 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 피부 주름 개선용 화장품에 관한 것이다.

인삼, 생리활성, 주름개선, 콜라겐

Description

생리활성 성분 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법 {Preparation methods of Panax ginseng extract increased contents of physiologically active substances Rb1, Rb2, Rc and Rd}

도 1은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 인삼 추출물에 의한 콜라겐 프로모터 활성효과를 나타낸 것이다(GE: 인삼추출물, ETOH: ethanol).

도 2는 본 발명의 방법에 의하여 제조된 인삼 추출물에 의한 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타낸 것이다(UA: ursolic acid, ETOH: ethanol).

도 3은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 인삼 추출물에 의한 콜라게네이즈 활성억제 효과를 나타낸 것이다(TNF alpha: tumor necrosis factor alpha).

본 발명은 인삼(Panax ginseng)에 존재하는 생리활성성분의 함량을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼류에 미량 존재하는 인삼사포닌 중 파낙스 디올(Panax Diol)계 인삼사포닌인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 함량을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

인삼은 한국과 중국을 비롯한 동양제국에서 오랫동안 보혈강장제로 이용해 온 약초로서, 미국, 일본, 중국, 러시아 등의 지역에도 인삼과 유사한 것들이 있지만 한국에서 생산되는 고려인삼과는 계통, 형태, 및 성분상으로 차이가 있으며, 고려인삼을 인삼 중의 제일로 취급하고 있다. 고려인삼은 오가피과(Araliaceae) 파나스속, 인삼종으로 분류되어 Panax ginseng C.A. Meyer라는 식물 이름을 갖고 있는데, 파낙스속에는 6개의 종이 있다. 고려인삼 (P. ginseng), 미국삼 (P. quinquefolium), 삼칠 (P. notoginseng), 죽절삼 (P. japonicum), 삼엽삼 (P. trifolium) 및 히말리아삼 (P. Pseudoginseng) 등이 이에 포함된다.

고려인삼에 들어 있는 인삼사포닌(ginsenoside, G)의 종류는 크게 3종류로 나누어진다. 프로토파낙스아디올(Protopanaxadiol; PD)계 사포닌 19종(G-Ra1, G-Ra2, G-Ra3, G-Rb1, G-Rb2, G-Rb3, G-Rc, G-Rd, 20(S)G-Rg3, 20(R)G-Rg3, G-Rh2, G-Rs1, G-Rs2, Quinquenoside-R1, Notoginsenoside-R4, Malonyl-G-Rb1, Malonyl-G-Rb2, Malonyl-G-Rc, Malonyl-G-Rd), 프로토파낙스아트리올(protopanaxatriol; PT)계 사포닌 10종(G-Re, G-Rf, G-Rg1, G-Rg2, G-Rh1, 20-Glc-G-Rf, Notoginsenoside-R1, 20(R)G-Rg2, 20(R)G-Rh1, Rh2) 및 올레아네인(Oleanane)계 사포닌 1종(G-Ro)으로 구성되어 있다.

전통적인 홍삼제조법은 4년 이상 6년 근의 수삼을 쪄서 건조하는 방식으로 제조하는데, 수삼을 수 차례의 증삼(찜)하는 과정과 건조과정을 거쳐 가공하게 된다.

대한민국 등록특허 제10-0545324호에서는 항암활성을 가지는 진세노사이드 함량을 증진시키는 위해, 95 내지 100℃의 온도에서 1 내지 12시간 동안 1차 증삼 처리한 다음, 50 내지 80℃의 온도에서 수분 함량이 70 내지 80%가 되도록 2차 건조시키고, 2차 건조된 가공삼을 영하 10 내지 영하 30℃에서 10 내지 30시간 동안 방치하여 주근의 섬유조직을 단리시키고, 2차로 100 내지 120℃의 온도에서 2 내지 12시간 동안 증삼처리한 후, 50 내지 80℃의 온도에서 1 내지 5시간 동안 증숙시키는 과정을 포함하여 제조하는 방법을 개시하고 있다. 또한 대한민국 등록특허 제10-336086호에서는 물을 가열하여 발생시킨 증기로 수삼 또는 백삼을 증삼하는 공정, 상기 증삼된 삼을 건조시키는 과정, 상기 건조된 삼을 가열하여 중탕시켜 유효성분을 주출하는 공정을 포함하여 홍삼 엑기스를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나 상기에 기술된 선행기술들은 통상의 홍삼제조방법에 비하여 공정이 단축되고 일부 진세노사이드의 함량을 증가시키지만, 보다 효율적인 함량 증가 방법 및 공정의 단축에 대한 필요성이 요구되어 지고 있었다. 이에 본 발명자는 종래의 방법에 비하여 공정이 단축되어 경제적인 제조방법을 개발하였으며, 또한 이 제조방법에 의하여 제조된 성분이 콜라겐 형성을 촉진한다는 사실을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은, 인삼류를 95 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 증삼 처리하면서 발생하는 증기를 냉각 포집하는 단계가 2회 반복되는 것을 포함하는 생리활성 성분의 함량이 증진된 인삼추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조된 추출물을 포함하는 콜라겐 형성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 콜라겐 형성 촉진용 조성물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장품을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 인삼류를 95 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 증삼 처리하면서 발생하는 증기를 냉각 포집하는 단계를 2회 반복하는 것을 포함하는 생리활성 성분의 함량이 증진된 인삼류 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "인삼류"는 오가피과(Araliaceae) 파낙스(Panax) 속 식물로서, 이에는 수삼, 산삼 또는 장뇌산삼 등을 포함한다. 본 발명의 구체적 실시에서는 가공하지 않은 인삼인 수삼을 사용하였으며, 건조하지 않은 수삼을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 "생리활성 성분"은 인삼류에 포함된 성분으로서, 중추신경억제 작용, 최면작용, 진통작용, 정신안정 작용, 해열작용, 호르몬 분비촉 진 작용, 해열작용 및 중성지방분해 억제 작용 등의 활성을 가지고 있는 파낙스 디올(Panax Diol)계 인삼사포닌인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 말한다.

본 발명의 구체적 실시에서는 건조하지 않은 인삼류를 95 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 증삼 처리하고, 이 과정에서 발생하는 증기를 냉각 포집한다. 이후 이 과정을 1회 동일하게 반복하여 실시한다. 이후 각각의 공정에서 포집한 추출물을 혼합하여 본 발명의 생리활성 성분의 함량이 증진된 인삼 추출물을 제조할 수 있다.

가공하지 않은 인삼인 수삼은 상기의 인삼사포닌의 함량이 매우 낮다. 하지만 이러한 수삼을 증숙하여 홍삼으로 가공하게 되면 상기 활성물질의 함량이 증가된다. 홍삼을 제조하는 전통적인 방법은 '증삼'과 '식힘'과정을 9회 반복하는 것으로 공정이 지나치게 복잡하였다. 이러한 9회의 증삼과 식힘 과정을 7회로 단축시킨 기술이 한국 등록특허 제529475호에 개시되어 있다. 또한 한국 등록특허 제545324호는 2회의 증삼과 식힘 과정을 거치되 특히 1차 증삼 후 냉각 공정을 거친 다음 2차 증삼과정을 거침으로써 공정을 단축시키겨 유효 활성물질의 함량을 증가시키는 방법에 대하여 개시하였다. 그러나, 본 발명의 제조방법은 상기 방법에 비하여 2회의 증삼과 냉각 공정으로 공정이 더욱 단축되어 경제적이다. 또한, 본 발명의 제조방법은 2회의 "증삼과 냉각과정"을 통해서 증삼과정에서 발생하는 증기 포집을 통해 파낙스 디올(Panax Diol)계 인삼사포닌인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 함량을 현저하게 증가시켰다(표 1).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 인삼류를 95 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 증삼 처리하면서 발생하는 증기를 냉각 포집하는 단계를 2회 반복하여 제조된 인삼 추출물을 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 "콜라겐 합성 촉진용 조성물"이란 콜라겐의 합성을 증진시킴과 동시에 콜라겐의 분해 효소인 콜라게네이즈(collagenase)의 활성을 억제함으로써 콜라겐의 합성을 증가시키는 것을 말한다.

본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 인삼 추출물은 종래의 인삼 추출물에 비하여 파낙스 디올(Panax Diol)계 인삼사포닌인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd가 많이 포함되어 있으며, 이들 포함된 성분들에 의하여 인체의 생리활성을 촉진한다. 특히, 본 발명의 인삼 추출물은 사람의 정상 섬유 아세포에서 콜라겐 프로모터의 활성화를 유도함(실시예 2 및 도 1참조)과 동시에 콜라겐 I의 합성을 증가시켰으며(실시예 3 및 도 2 참조), 또한 콜라겐의 분해 효소인 콜라게네이즈(collagenase)의 활성을 억제하는 효과가 우수하였다(실시예 4 및 도 3 참조).

본 발명의 인삼 추출물은 콜라겐 합성 촉진용 조성물의 전체 건조 중량에 대하여 0.001 내지 20.0 w/w으로 포함되어 있다. 바람직하게는 0.001 내지 10.0 w/w로 포함되어 있으며, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5.0 w/w로 포함되어 있다.

본 발명의 콜라겐 합성 촉진용 조성물은 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 인삼 추출물 이외에 추가적으로 공지된 콜라겐 합성을 촉진하는 물질을 포함할 수 있다. 이들 콜라겐 합성을 촉진하는 물질은, 예를 들면, 아시아틱산 (asiatic acid), 아시아티코사이드 (asiaticoside), 호장추출물 등이 있다.

하나의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장품에 관한 것이다.

본 발명의 피부 주름 개선용 화장품에 포함되는 콜라겐 합성 촉진용 조성물은 화장품의 총 중량에 대해서 0.001 내지 20.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10.0 중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 5.0 중량% 범위로 포함될 수 있으나, 이러한 비율로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장품에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기의 조성물 이외에 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함한다. 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함한다.

본 발명의 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아 니다. 보다 구체적으로, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 에센스, 영양젤, 로션 또는 마사지 크림을 제조하였다.

본 발명의 화장품 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장품 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 의하여 제조된 인삼 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으며(실시예 6 및 표 11 참조), 항산화 효과도 우수하고(실시예 5 참조), 피부의 주름 개선 효과가 우수하여(실시예 7 및 표 12 참조), 이를 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 조성물이 포함된 피부 주름 개선용 화장품에 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명을 이에 제한하고자 함이 아니다.

실시예 1 : 인삼 추출물의 제조 및 종래 제조방법에 의한 추출물의 성분 비교

1-1. 본 발명의 인삼 추출물 제조

인삼으로부터 생리활성 성분인 Rb1, Rb2, 및 Rc 등을 고함유하고, 총 진세노사이드의 수율증대를 위한 인삼 추출물의 제조를 위하여, 가압증기장치에 건조하지 않은 수삼 100g을 정량하여 담고 95 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 증삼하면서 발생하는 증기를 냉각 포집하였다. 냉각방법으로는 증기관을 통해 이동되는 증기를 냉각수로 쿨링된 응축기를 이용하여 냉각시켰다. 이러한 증삼 및 냉각 포집 과정을 1회 더 반복하였다. 각 회에서 포집된 추출물을 혼합하여 본 발명의 인삼 추출물을 제조하였다.

인삼 추출물의 제조에 이용되는 장치는 크게 다음의 5부분으로 구성할 수 있다.

가. Steam부분 : 스팀을 생산해서 증류기로 보내는 장치

나. 증류기(Retort) 부분 : 천공된 기판(perforated floor)을 통해 증기가 통과하면서 기판 위의 식물시료와 접촉함으로써, 식물시료로부터 휘발성 성분들이 기화된 수증기의 형태로 발생하는 장치를 말한다.

다. 증기관(vapour tube) 부분 : 기화된 수증기가 응축기(Condenser)로 이동하는 부분(관)을 말한다.

라. 응축기 (condenser) : 기화된 수증기가 액체상태로 전환되는 곳을 말한다.

마. 분액기 (separator) : 액체를 오일 부분과 물 부분으로 분리하는 장치를 말한다.

1-2. 종래 제조방법에 의한 인삼 추출물의 제조(비교예 1 및 2)

비교예 1

대한민국 등록특허 제10-0545324호에 개시된 방법을 이용하여 추출물을 제조하였다. 가압증기 멸균기에서 인삼을 수삼상태에서 50% 건조한 후 100g 정량하여 담고, 95 내지 100℃에서 6시간 동안 1차 증삼한 후, 60℃가 유지되는 온풍건조기에서 수분함량 75% 상태로 건조하였다. 1차 가공 건조된 삼을 영하 20℃ 내외로 유지되는 냉동고에서 24시간 방치하여 주근의 섬유조직을 단리시키고, 2차로 110℃의 고온에서 6시간 동안 증삼한 후 70℃ 전후에서 2시간 동안 증숙과정을 거쳐 인삼추출물을 제조하였다.

비교예 2

대한민국 등록특허 제10-0529475호에 개시된 방법을 이용하여 추출물을 제조 하였다. 기존의 전통적인 홍삼의 제조방법에서 증삼과 식힘 과정을 7회로 단축시킨 제조방법이다.

1-3. 제조된 인삼 추출물의 유효 성분의 비교

진세노시드(ginsenoside)의 함량 분석은 가스 크로마토그래피 방법과 고속 액체 크로마토그래피 방법으로 수행하였으며, 그 조건은 각각 다음과 같다. 분석 결과를 표 1에 나타내었다.

[가스 크로마토그래피 방법]

주입기 : 스플릿 비율 1:50

검출기 : FID(Flame Ionization Detector)

컬 럼 : 30m DBWAX 0.25mm LD

컬럼 압력 : 10psi

주입기 온도 : 250도

검출기 온도 : 250도

오븐 온도 프로그램

시작 : 200도

가열 속도 : 4도/분, 250도 까지

[고속 액체 크로마토그래피 방법]

기기: Dionex P530 pump, ASI-100 automated sample injector

컬럼 : Phenomenex Luna 5u (C18(2)), 150x 4.6 mm

이동상 : 10 mM KH2PO4 : water = 92:8 (0-6.5 min) -40:60 (7.5-12 min) - 92:8 (12.5-15 min) gradient system

유속 : 0.5 ml/min

검출기 : UV/Vis Detector UVD 340S 260 nm

주입 부피:10 ul

가동시간: 25 min

Ginsenosides	실시예 1(%)	비교예 1(%)	비교예 2 (%)
Rb1	11.13	0.48	0.84
Rb2	13.39	0.31	0.69
Rc	10.01	0.40	0.37
Rd	3.64	0.33	0.48
Re	1.05	0.23	0.74
Rf	2.16	2.68	0.66
Rg1	0.35	3.83	1.04
Rg2	2.25	2.04	0.97
Rg3	1.16	3.75	1.06
합계	45.14	14.05	6.85

표 1에 제시된 것과 같이, 본 발명을 통해 인삼으로부터 유효성분을 추출한 결과, 총 진센노사이드(ginsenoside) 함량의 경우, 비교예 1 및 2와 비교하여 본 발명의 방법에 의하여 제조된 인삼 추출물에 약 3배 정도 높게 함유되어 있으며, 파낙스 디올(Panax Diol)계 인삼사포닌인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 함량 또한 비교예 1 및 2에 비하여 본 발명의 방법에 의하여 제조된 인삼 추출물이 현저하게 높게 함유하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 2 : 인삼 추출물의 콜라겐 프로모터(collagen promoter) 활성 증진 효과

인간의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 2 X 10⁵세포/웰로 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기의 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 FBS를 포함하지 않는 DMEM에 바꾼 후, COL1A2 프로모터 루시퍼라아제 리포터 DNA (COL1A2 promoter luciferase reporter DNA) 2ug을 superfect^TM (Qiagen)을 이용하여 인간의 정상 섬유 아세포를 형질전환(transfection)을 유도하였다. 형질전환된지 24시간 후에, 상기 실시예 1에 의해 제조된 인삼 추출물을 100 ppm, 500 ppm, 1000 ppm으로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 수집한 후, Luminometer (Berthold, Germany)를 이용하여 450nm에서 루미네선스(luminescence)를 측정하였다(참고: Planta medica 2005; 71:338-343).

도 1에서 보는 바와 같이 인삼추출물에 의해 COL1A2 프로모터 활성이 농도 의존적으로 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터 상기 실시예 1의 인삼추출물은 콜라겐 생산을 유도할 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다.

실시예 3 : 인삼 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과

인간의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 2 X 10⁵세포/웰로 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기의 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 FBS 0.05%를 포함하는 DMEM에 상기 실시예 1에 의해 제조된 인삼 추출물을 100 ppm, 500 ppm, 1000 ppm으로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.

콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit (MK101), Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide; PICP)의 양을 측정하였다. 콜라겐 키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 표준농도 곡선을 작성하였다. 각 웰에 POD 효소가 붙어 있는 항체용액을 100㎕ 첨가하고 농도별로 희석한 표준용액과 상기 샘플의 상층액을 각각 20㎕씩 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합액을 37℃에서 3시간 방치한 후 내용물을 모두 제거하고 각각의 웰을 PBS 400㎕로 4회 세척하였다. 상기 웰에 100㎕의 기질 용액을 첨가한 후 상온에서 15분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위하여 1N 황산용액 100㎕를 첨가하여 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 실험은 동시에 2회씩 수행하여 그 평균값을 구하였다. PICP 양은 표준농도 곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였으며 ng/2X10⁵세포로 환산하였다.

이에 대한 결과를 도 2에 나타내었는데, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 인삼추출물은 사람의 정상 섬유 아세포에서 콜라겐 I의 합성을 증진하였음을 알 수 있었다.

실시예 4 : 콜라게네이즈 활성 억제 효과

사람의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 2 X 10⁵세포/웰로 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기의 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 FBS 0.05%를 포함하는 DMEM 배지에서 16시간 동안 혈청-스타베이션(serum-starvation)을 유도하였다. 16시간 후에 TNF-α 20ng/㎖를 단독 또는 시료(본 발명의 공정에 의해 제조된 인삼추출물 100ppm, 500ppm 및 1000ppm)와 함께 24시간 처리하였다. 이후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.

콜라젠을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게네이즈에 대한 항체를 이용하였다. 본 시험에서는 타입 I 콜라게네이즈 분석 키트(Type I Collagenase assay kit; Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 리더로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균 ± 표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ program를 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 의하면, 본 발명의 인삼추출물은 콜라게네이즈의 활성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 5 : 항산화 효과

본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 인삼추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 방법을 이용하였다.

DPPH은 색을 띄는 라디칼로 이를 이용해 시료의 라디칼 제거능력을 직접 확인할 수 있다. 시료를 증류수 또는 용매 4 ㎖에 녹인 후, 100μM DPPH 1㎖를 섞은 후, 상온에서 30분간 항온배양(incubation) 하였다. 517nm에서 흡광도를 측정하여 남아있는 DPPH의 양을 측정하였다. 본 실험의 공시료(blank)는 증류수 또는 용매이고, 대조군은 시료를 넣지 않고 DPPH와 증류수 또는 용매로만 구성된 실험군이었다. 항산화력(Radical Scavenging activity: RSA)을 하기 수학식 1을 사용하여 각 대조구의 흡광도와 비교하여 낮아진 비율로 표 2에 나타내었다.

RSA(%)= [hydroxylate의 흡광도 / 대조군의 흡광도] X 100

인삼추출물의 항산화 효과

인삼추출물의 농도 (%)	0	0.01	0.025	0.05	0.1	0.25	0.5	비타민 C (1 mM)
RSA (%)	100	85	65	45	40	32	28	35

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 인삼추출물은 농도 의존적으로 생성된 라디칼을 제거하는 능력을 나타내었다.

제조예 : 인삼추출물을 함유한 화장료 조성물

1-1. 인삼 추출물을 함유한 크림

인삼추출물을 함유한 영양 크림의 성분 및 함량은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리 에탄올 아민, 프로필렌 글리콜을 70℃로 가열 용해하고, 이에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료되면 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후 인삼추출물과 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

인삼추출물을 함유한 영양크림의 성분 및 함량

성분	함량 (중량%)
인삼 추출물	2% 또는 5.0 또는 10%
호호바 오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세틸아릴 알코올	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
프로필렌 글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리 에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100

1-2. 인삼 추출물을 함유한 화장수

가. 유연 화장수

인삼 추출물을 함유한 유연 화장수의 성분 및 함량은 하기 표 4에 나타낸 바와 같다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였고, 인삼 추출물, 유성성부, 유화제, 방부제 및 향을 실온에서 용해한 다음 수상에 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

인삼 추출물을 함유한 유연 화장수의 성분 및 함량

성분	함량 (중량%)
인삼 추출물	2.00
EDTA	0.05
피이지 1500	4.00
카보머	0.16
1,3 부틸렌 글라이콜	3.00
폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터 오일	0.45
트리에탄올아민	0.12
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

나. 수렴 화장수

인삼 추출물을 함유한 수렴 화장수의 성분 및 함량은 하기 표 5에 나타낸 바와 같다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였다. 인삼 추출물, 유상성분, 유화제, 방부제 및 향에 에탄올을 가하면서 실온에서 용해하여 알코올상을 제조한 다음 수상에 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

인삼 추출물을 함유한 수렴화장수의 성분 및 함량

성분	함량 (중량%)
인삼 추출물	2.00
글리세린	2.00
1,3 부틸렌글라이콜	3.00
EDTA	0.05
에탄올	7.00
폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터 오일	0.40
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

다. 로션

인삼 추출물을 함유한 로션의 성분 및 함량은 하기 표 6에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민, 부틸렌 글라이콜을 70℃로 가열 용해하였다. 이에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료되면 친수성 증점제인 산탄검 2% 용액을 첨가하여 전체에 대해 0.05 중량%가 되도록 조절하였다. 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후 인삼추출물, 향 및 색소를 첨가하고 혼합한 다음 30℃로 냉각하였다.

인삼 추출물을 함유한 로션의 성분 및 함량

성분	함량 (중량%)
인삼 추출물	5.00
글리세린	3.00
카보머	0.10
산탄검	0.05
1,3 부틸렌 글라이콜	3.00
폴리글리세린-3 메칠글루코스 디스테아레이트	1.50
글리세린 스테아레이트	0.50
세테아릴 알코올	0.30
호호바 오일	3.00
유동 파라핀	2.00
스쿠알란	3.00
디메치콘	0.50
토코페릴아세테이트	0.20
트리에탄올아민	0.10
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

라. 겔

인삼 추출물을 함유한 겔의 성분 및 함량은 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.

인삼 추출물을 함유한 젤의 성분 및 조성

성분	함량 (중량 %)
인삼 추출물	2.50
EDTA	0.02
1,3 부틸렌 글라이콜	4.00
카보머	0.60
글리세린	5.00
하이드록시에틸 셀룰로오스	0.15
트리에탄올 아민	0.50
트리클로산	0.20
에탄올	5.00
폴리옥시 에틸렌하이드로제네이티드 캐스터 오일	4.00
방부제, 향, 색소	미량
정제수	미량
합계	100

마. 에센스

인삼 추출물을 함유한 에센스의 성분 및 함량은 하기 표 8에 나타낸 바와 같다. 정제수에 점증제를 천천히 교반하면서 가하여 균일하게 분산시키고, 수상 성분들을 혼합하여 수상을 제조하였다. 이에 유화제, 피부 유연제, 향 및 방부제를 첨가하면서 에탄올을 가하여 용해시켰다. 수상에 알코올상을 교반하면서 가하고 알칼리제를 첨가하였다. 최종적으로 인삼 추출물과 색소를 첨가하였다.

인삼 추출물을 함유한 에센스의 성분 및 함량

성분	함량 (중량 %)
인삼 추출물	10.00
EDTA	0.05
포타슘-세틸포스페이트	0.30
글리세린	5.00
1,3 부틸렌 글라이콜	4.00
글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	0.50
소르비탄스테아레이트	0.30
호호바 오일	0.50
마카데미아 넛 오일	0.50
토코페릴아세테이트	0.50
부틸레이티드하이드록시 톨루엔	0.05
디메치콘	3.00
폴리아크릴아마이드/C13-14 이소파라핀/라우레쓰-7	1.50
글리세릴폴리메타아크릴레이트/프로필렌 글라이콜	5.00
에탄올	3.00
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

바. 팩

인삼 추출물을 함유한 팩의 성분 및 함량은 하기 표 9에 나타낸 바와 같다. 정제수를 70℃로 가열하고 피막형성제, 보습제를 가하여 투명하게 용해시켜 수상을 제조하였다. 이후, 알코올에 인삼 추출물, 유화제, 방부제, 향을 용해시킨 다음 수상에 혼합하고 30℃로 냉각하여 제조하였다.

인삼 추출물을 함유한 팩의 성분 및 함량

성분	함량 (중량 %)
인삼 추출물	5.00
벤조페논-5	0.10
1,3 부틸렌 글라이콜	5.00
카보머	1.00
트리에탄올아민	0.85
글리세린	4.00
알란토인	0.10
DL-판테놀	0.50
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

비교 제조예 : 정제수를 함유한 크림

상기 제조예 1-1의 제조 과정에 있어서, 인삼 추출물을 첨가하지 않고 정제수로 대체한 크림의 성분 및 함량은 다음의 표 10과 같다.

성분	함량 (중량 %)
호호바 오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세틸아릴 알코올	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이트	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
프로필렌 글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리 에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100

실시예 6 : 인삼 추출물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

인삼 추출물이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 시험방법으로는 피부누적자극시험을 실시하였다.

스쿠알렌을 베이스로 인삼 추출물을 각각 1%, 5%, 10%를 첨가한 제형을 제조하고, 이를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적첩포를 시행하는 것에 의하여 인삼 추출물이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15ul씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 아래의 수학식 2를 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

평균반응도=[[반응지수 X 반응도 / 총피검자수 X 최고점수 (4점)] X 100 ] ÷ 검사회수 (9회)

이때, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정하였다.

상기의 표 11에서 보는 바와 같이, 시험군 1, 2, 3 모두 ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 2명, 0명, 0명이었고, 그 평균 반응도가 0.18로서 3이하이므로 안전한 조성물로 판단되었다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 인삼 추출물은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않았으며 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.

실시예 7 : 인삼 추출물을 함유한 화장료의 주름개선 효과 측정

인삼 추출물을 함유한 화장료의 주름 개선효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 제조예 1-1(인삼 추출물을 각각 2%, 5%, 10% 함유한 영양 크림) 및 비교 제조예 (정제수를 함유한 영양 크림)에서 제조한 영양 크림을 사용하였다. 주름개선 효과는 피부탄력 변화의 측정을 통해 평가하였다. 피부탄력의 측정은 24 내지 26℃, 습도 38 내지 40%로 일정하게 유지되는 건강한 여성 30명 (25~35세)을 대상으로 제조예 1-1의 3종류와 비교 제조예의 영양 크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일 2회씩 3개월 동안 사용하게 한 후, Cutometer SEM 474를 이용하여 측정함으로써 이루어졌으며, 판정기준은 피부탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 이에 대한 결과를 표 12에 나타내었다.

인삼 추출물의 피부탄력 개선 효과

시험 항목	피부탄력도
제조예 1-1 (인삼 추출물 2% 함유 크림)	4.1
제조예 1-1 (인삼 추출물 5% 함유 크림)	4.5
제조예 1-1 (인삼 추출물 10% 함유 크림)	4.8
비교 제조예 (인삼 추출물 0% 함유 크림)	1.45

표 12에 나타난 바와 같이, 본 발명의 제조예 1-1의 인삼 추출물 함유 크림이 비교 제조예의 크림에 비해 주름개선 효과가 훨씬 우수한 것으로 판명되었고, 인삼 추출물의 함유 농도가 증가함에 따라 피부탄력도 향상되는 것을 볼 때, 인삼 추출물이 주름개선 효과를 보이고 있음을 제시하고 있다.

본 발명에 의한 간단한 공정으로 인삼의 유효성분인 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 고함유하면서 총 진세노사이드의 함량을 뚜렷하게 증가시킬 수 있다. 또한 본 발명에 의한 공정으로 추출된 인삼추출물이 콜라겐 형성을 촉진하여 우수한 주름개선 효과가 있고, 피부에 대한 자극이 거의 없어 새로운 주름 개선용 원료로 이용할 수 있다.

Claims (7)

1) 건조시키지 않은 인삼류를 95 내지 100℃에서 1 내지 24시간 동안 증삼 처리하면서 발생하는 증기를 냉각 포집하는 단계,

2) 상기 1)단계를 1회 더 반복하는 단계, 및

3) 상기 1)단계 및 2)단계에서 포집된 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 생리활성 성분 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 인삼류가 수삼인 것을 특징으로 하는 인삼 추출물의 제조방법.

삭제

제 1항의 방법에 의해 제조된 생리활성 성분 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 함량이 증가된 인삼 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.

제 4항에 있어서, 상기 인삼 추출물은 조성물의 전체 건조 중량에 대하여 0.001 내지 20.0 (w/w)의 양으로 포함되는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.

삭제

제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.

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