KR100744445B1 - 인간 배아 줄기 세포의 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지 중에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서, 상기 배지가 지지세포(feeder cell)가 바닥면에 부착된 다공성 막을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기 세포의 배양방법 및 이를 이용한 인간 배아 줄기 세포의 회수방법에 관한 것이다.

본 발명의 배양방법은 다공성 막의 바닥면에 지지세포를 부착시켜 배양액과 함께 인간 배아 줄기 세포를 배양함으로써, 배양되는 인간 배아 줄기 세포와 지지세포와의 지속적인 상호작용을 유지할 수 있으며 배양된 인간 배아 줄기 세포가 미분화 상태를 유지하면서 다공성 막에 점착 및 분포될 수 있도록 한다. 따라서 배양 완료 후 별도의 효소처리 없이 다공성 막으로부터 배양된 줄기세포만을 얻어낼 수 있으므로, 효소처리 및 지지세포에 의한 오염문제를 해결할 수 있다. 또한, 본 발명의 배양방법은 종래의 인간 배아 줄기 세포 배양 및 분리방법에 요구되는 노동력과 시간 소비적인 과정을 해결할 수 있으며, 안정적으로 인간 배아 줄기 세포를 대량으로 확보할 수 있도록 한다.

인간 배아 줄기 세포, 다공성 막

Description

인간 배아 줄기 세포의 배양방법{A method for culturing human embryonic stem cells}

도 1은 다공성 막의 공극을 통과하여 이동하는 지지세포의 이동 정도를 나타내는 그래프이다.

도 2는 다공성 막에 부착된 지지세포의 농도에 따른 인간 배아 줄기세포의 점착률을 나타내는 그래프이다.

도 3은 지지세포위의 다공성 막을 통해 배양된 인간 배아 줄기 세포의 광학현미경 사진 및 미분화세포의 발현을 보여주는 염색사진이다.

본 발명은 인간 배아 줄기 세포의 배양방법 및 이를 이용한 인간 배아 줄기 세포의 회수방법에 관한 것이다.

인간 배아 줄기 세포는 전분화능(totipotency)을 가지며 인간의 몸을 구성하는 삼배엽성(내배엽, 외배엽, 중배엽)으로 분화될 수 있는 능력을 지니고 있어, 이에 대한 연구는 인간의 초기분화에 대한 근본적인 부분에서 중요한 단서를 제공할 수 있으며, 난치병 등과 같은 질병에 있어 세포치료연구의 핵심기술을 마련할 수 있다. 그러므로 인간 배아 줄기 세포를 이용한 세포치료연구는 높은 주목을 받아 왔으나, 마우스 배아 줄기 세포 배양 성공에도 불구하고 인간 배아 줄기 세포 배양은 그 특이성에 의해 오랫동안 성공을 거두지 못하였다.

최근, 인간배아 줄기세포의 배양방법이 1998년 Thomson (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998) 282:1145-7)에 의해 성공을 거둔 이후로 인간줄기세포 치료연구는 전환점을 마련하며 세계적으로 그 무한한 가능성에 다시 높은 관심을 받고 있다.

이러한 인간 배아 줄기 세포의 배양방법 성공에도 불구하고 실제적 임상으로 적용하기 위해서는 해결되어야만 하는 몇몇 문제점이 있다. 이러한 문제점 중 하나는 세포배양시 수반되는 인간 배아 줄기 세포의 오염에 관한 것이다. Thomson의 방법을 기반으로 한 가장 일반적인 인간 배아 줄기 세포 배양법은 백혈병 억제 인자 (LIF)를 포함하는 조직배양 배지에서 마우스 배아섬유아세포(MEF)를 지지세포(feeder cell)로 이용하여 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법이다. 마우스 배아 줄기 세포 배양법과는 달리 인간 배아 줄기 세포는 LIF의 첨가만으로 분화를 억제할 수 없어 줄기세포가 빠르게 성장하는 것을 막을 수 있는 지지세포의 존재가 아직까지는 절대적으로 요구되고 있다 (Reubinoff BE, PEra MF, Fong C, Trounson A, Bongso A, Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol . (2000) 18(4):399-404).

새로운 배양액 조건 및 동물 기질세포와의 복합배양법을 통하여 다양한 인간 배아 줄기 세포 배양방법이 연구되고 있으나, 동물세포 영양분 및 동물세포의 사용 특히 인간 배아 줄기 세포 내에 동물 세포의 잔재 가능성 등의 문제점들은 여전히 임상 적용 시 한계가 있을 것으로 보고되고 있다. 그러므로, 동물세포에 의한 오염 및 감염을 줄이기 위해서 지지세포로 마우스의 섬유아세포를 대신하여 인간 섬유아세포, 인간 골수기질세포, 양수세포 등의 인간세포를 이용한 배양방법이 개발되고 있으나 이러한 방법을 통해서는 계대배양을 오랫동안 지속할 수 없어 치료목적으로 사용될 줄기세포를 다량 확보하기가 어려운 단점과, 인간세포 사용 시에도 여전히 배양된 줄기세포만을 지지세포로부터 효과적으로 분리해 내기는 어려운 실정이다. 이에 임상으로 사용되기 위한 적절한 배양 및 분리방법이 절대적으로 요구되고 있다.

그러므로 배양 과정뿐 아니라, 배양 후에도 어떠한 세포오염 및 손상 없이 배양된 인간 배아 줄기 세포를 선택적으로 분리하는 기술은 줄기세포의 임상적용을 실제적으로 가능하게 하는 매우 중요한 핵심기술일 것이다.

지지세포로부터 줄기세포를 효과적으로 분리해 내기 위한 기존의 방법으로 효소 처리방법과 기계적 방법이 사용되고 있다.

먼저 효소처리방법은 콜라게나아제, 트립신, 디스파아제 (Xu C, Inokuma MS, Denham J et al. Feeder free grwoth of undifferntiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol (2004), 19, 971-974; Richards M, Fong CY, Chan WK et al. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cell. Nat Biotechnol (2002), 20, 933-936; Hovatta O, Mikkola M, Gertow K et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod (2003), 18, 1404-1409)와 같은 효소용액을 배양접시에 처리함으로써 단시간에 많은 배아줄기세포를 회수할 수 있는 장점이 있으나, 효소처리과정에서 인간 배아 줄기 세포가 효소에 의해 오염 및 영향 (Karyotypic abnormalities)을 받을 수 있는 단점이 있다.

한편, 기계적 방법은 줄기세포부분만을 유리봉으로 긁어내는 기계적 분리방법이다 (Heins N, Englund MC, Sjoblom C et al. Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem cells. STEM CELLS (2004), 22, 367-376; Oh SK, Kim HS, Park YB et al. Method for expansion of human embryonic stem cells, STEM CELLS (2005), 23, 605-609). 이러한 방법은 얇고 뾰족한 유리봉을 사용해서 현미경으로 배양접시를 관찰하면서 인간 배아 줄기 세포부분만을 수작업으로 때어내는 방법이다. 이러한 방법은 효소에 의한 영향을 없앨 수는 있으나, 많은 노동력과 시간이 요구되며 얻어지는 줄기세포 안에 지지세포가 포함될 수 있는 단점을 지니고 있다.

따라서 최근에는 이러한 단점들을 개선하고 세포의 대량 확보를 위하여 효소처리 전에 수작업으로 줄기세포와 지지세포의 경계면에 어느 정도의 기계적 분리방법을 과정을 거친 다음 효소처리를 하여 시간을 다소 단축시켰으나 이러한 해결책은 여전히 노동력 및 시간이 많이 소요되며, 효소에 노출되는 점을 해결하지는 못하였다 (Oh SK, Kim HS, Park YB et al. Method for expansion of human embryonic stem cells, STEM CELLS (2005), 23, 605-609).

또한 자동화 시스템을 이용하여 배양된 줄기세포를 분리, 수집하는 방법으로 배양에 요구되는 시간을 크게 단축시켰으나 (Alexis J, Christelle F-H, Kristine W et al. Automated Mechanical Passaging: A Novel and efficient method for human embryonic stem cell expansion, STEM CELLS (2006), 24, 230-235), 자동화 장치의 정확도 부족은 수작업에 의한 것보다 오히려 심각한 세포오염을 일으킬 수 있을 것으로 우려되고 있다.

이와 같이 현재까지 개발된 방법들로는 위에서 지적한 근본적인 문제점을 해결하기 어려울 뿐 아니라 인간 배아 줄기 세포를 대량으로 확보하더라도 인간치료를 위한 임상으로 사용하기에는 부적절하다.

이에, 본 발명자들은 지지세포에 의한 오염이 없고 손쉽게 분리가 가능한 인간 배아 줄기 세포의 배양방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 다공성 막의 바닥면에 지지세포를 부착시켜 인간 배아 줄기 세포를 상기 막 위에서 배양할 경우, 배양된 줄기 세포를 손쉽게 효과적으로 분리할 수 있을 뿐 아니라 고순도의 인간 배아 줄기 세포를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 다공성 막을 사용한 인간 배아 줄기 세포의 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 배양방법에 의해 배양된 배양액으로부터 인간 배아 줄기 세포를 회수하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지 중에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서, 상기 배지가 지지세포(feeder cell)가 바닥면에 부착된 다공성 막을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기 세포의 배양방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 배양방법으로 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 다공성 막으로부터 인간 배아 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 배아 줄기 세포의 회수방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 배양방법은 다공성 막의 바닥면에 지지세포를 부착시켜 배양액과 함께 인간 배아 줄기 세포를 배양함으로써, 배양되는 인간 배아 줄기 세포와 지지세포와의 지속적인 상호작용을 유지할 수 있으며 배양된 인간 배아 줄기 세포가 미분화 상태를 유지하면서 다공성 막에 점착 및 분포될 수 있도록 한다 따라서 배양 완료 후 별도의 효소처리 없이 다공성 막으로부터 배양된 줄기세포만을 기계적 방법으로 걷어냄으로서, 효소처리 및 지지세포에 의한 오염문제를 해결할 수 있다.

인간 배아 줄기세포는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 말한다. 상기 인간 배아 줄기세포는 예를 들면, CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun . (2006) 10;340(2):403-408)등을 사용할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간 배아 줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.

본 발명의 배양방법은 지지세포가 부착된 다공성 막을 사용하며, 다공성 막 중의 공극을 통하여 인간 배아 줄기 세포의 영양공급 및 미분화 상태의 유지를 지속시킨다. 여기서 다공성 막의 재질로는 지지세포 등의 세포가 점착될 수 있는 막으로서, 다공성의 성질을 갖는 중합체라면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명의 배양방법에서 사용가능한 다공성 막의 예는 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 폴리비닐리덴 플로라이드, 셀룰로오즈, 나이론, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리카프로락톤 또는 이들의 공중합체 등의 세포 점착성 중합체를 포함한다. 상기 세포 점착성 중합체 중, 폴리에틸렌 테레프탈레이트를 더욱 바람직하게 사용할 수 있으며, 배양용 웰(well)의 크기에 맞도록 제작된 상업적으로 유용한 BD Falcon™ (BD Bioscience, 미국)을 사용할 수도 있다. 상기 다공성 막의 공극은 0.1 내지 2.5 ㎛, 바람직하게는 1 내지 2 ㎛의 직경을 갖는 것이 바람직하다.

지지세포(feeder cell)로는 인간 배아 줄기 세포의 지지세포로 사용되는 통상의 지지세포를 사용할 수 있으며, 예를 들면 마우스 섬유아세포, 마우스 배아 섬유아 세포, 인간 배아 섬유아세포, 인간 골수세포, 성체 상피 세포 등을 사용할 수 있다. 이중 마우스 섬유아세포가 인간 배아 줄기 세포의 미분화 상태 및 성장을 보다 안정적으로 유지시킬 수 있으므로, 마우스 섬유아세포 (STO cell) 을 바람직하게 사용할 수 있다.

지지세포를 다공성 막에 부착시키는 방법은 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 다공성 막에 지지세포 및 지지세포 배양용 배지를 가하여 12 ∼ 48 시간, 바람직하게는 약 24시간 동안 배양함으로써, 지지세포가 부착된 다공성 막을 얻을 수 있다. 상기 지지세포 배양용 배지는 사용되는 지지세포에 따라 상이하나 당업자는 공지의 지지세포 및 그의 배양방법으로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스섬유아세포 (STO cell)를 지지세포로 사용하는 경우에는, 소태아혈청 (FBS), 머캅토에탄올, 비-필수 아미노산이 첨가된 DMEM으로 이루어진 배지를 사용할 수 있다. 상기 지지세포가 부착된 다공성 막은 생리학적으로 적합한(physiologically compatible) 완충액, 예를 들어 인산 완충된 식염수로 세척함으로써, 소태아혈청 등의 불필요한 물질을 제거할 수 있다. 다공성 막에 부착되는 지지세포의 밀도는 웰(well) 당 1.0 X 10⁵ ∼ 5.0 X 10⁵ cells 이 사용될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 약 2.5 X 10⁵ cells의 범위일 수 있다.

상기와 같이 얻어진 다공성 막은 지지세포 부착면이 아래로 향하도록 뒷집어 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지에 넣어 사용하게 된다.

인간 배아 줄기 세포 배양용 배지로는 공지된 모든 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 혈청 대체물 (SR), 머캅토에탄올, 비-필수 아미노산, 및 bFGF로 보충된 KO-DMEM(KNOCKOUT Dulbecco's modified Eagle's medium, KO-DMEM)를 사용할 수 있다.

본 발명의 배양방법은 필요에 따라 다공성 막에 다양한 천연 혹은 합성 물 질, 예를 들어, 콜라겐, 파이브로넥틴, 라미딘, 또는 메트리겔 등을 코팅하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 지지세포가 부착된 다공성 막에 콜라겐, 파이브로넥틴 등을 코팅함으로써, 지지세포의 존재 하에서 인간 배아 줄기세포 배양시 물질에 의해 가해지는 영향력 조사 및 특정 세포 분화유도를 촉진하도록 할 수 있다.

본 발명은 상기 배양방법으로 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 다공성 막으로부터 인간 배아 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 배아 줄기 세포의 회수방법을 포함한다.

상기 다공성 막으로부터 인간 배아 줄기 세포를 분리하는 단계는 바람직하게는 기계적 분리방법, 예를 들어 유리봉 등을 사용하여 다공성 막으로부터 인간 배아 줄기 세포를 긁어냄으로써 수행할 수 있다. 즉, 기계적 분리방법을 사용함으로써 별도의 효소 처리를 배제할 수 있어, 효소에 의한 오염 문제를 회피할 수 있다. 특히, 상기 다공성 막은 배양된 세포를 기계적으로 긁어낼 수 있을 정도의 충분한 강도를 지니고 있으므로, 간단하게 인간 배아 줄기 세포를 회수할 수 있다.

상기와 같이 회수된 인간 배아 줄기 세포는 정상적인 핵형 및 미분화 세포의 특징을 지니고 있다. 즉, 상기와 같이 회수된 인간 배아 줄기 세포는, 면역화학염색법, RT-PCR등을 통해 확인한 결과, Oct-4을 정상적으로 발현하였으며, 인간 배아 줄기 세포의 성상을 그대로 유지하였다. 그밖에 인간 배아 줄기 세포의 마커인 APL(Alkaline phosphatase), SSEA(stage specific embryo antigen), TRA등을 발현하였으며, 배상체(Embryoid body) 형성에도 전혀 문제가 없었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.

6 웰 배양접시에 직경 1 μm 의 공극을 갖는 BD Falcon^™ (BD Bioscience, 미국)을 넣고, 마이토마이신-C (mitomycin-c)를 2 시간 동안 처리하여 증식을 억제시킨 마우스 섬유아세포 (STO cell) 2.5 X 10⁵ cells/well 및 지지세포 배양용 배지(10% 소태아혈청 (FBS), 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% 비-필수 아미노산(Gibco)이 첨가된 90% DMEM으로 이루어진 배지)를 가하고, 24 시간 동안 배양하였다. 마우스 섬유아세포가 부착된 막을 분리한 후, 인산 완충된 식염수(phosphate buffered saline)로 2 회 세척하였다. 얻어진 막을 지지세포가 아래로 향하도록 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지(20% 혈청 대체물 (SR), 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% 비-필수 아미노산(Gibco), 및 4 ng/ml bFGF로 보충된 80% KO-DMEM으로 이루어진 배지)에 충분히 담구었다. 클럼프를 형성한 인간 배아 줄기 세포(CHA-hES3)를 잘게 쪼갠 후 상기 배지 위에 약 30 개 정도 뿌려 주었다. 48 시간 후에 막 위에 인간 배아 줄기 세포가 잘 부착되었는지 확인하고, 상기 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지를 매일 갈아주면서, 5일 동안 배양하였다. 상기의 방법으로 자라난 인간 배아 줄기 세포 클럼프를 잘게 쪼개어 새로 준비된 지지세포가 부착된 다공성 막 위에 뿌려, 위와 같은 방법으로 배양하였다.

실시예 2.

배양용기에 직경 1 μm 의 공극을 갖는 BD Falcon^™ (BD Bioscience, 미국)에 파이브로넥틴, 콜라겐, 라미딘, 및 메트리겔을 각각 코팅하여 제조한 다공성 막을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 배아 줄기 세포를 배양하였다.

실시예 3.

실시예 1의 배양 배지로부터 다공성 막 위에서 배양된 인간 배아 줄기 세포를 유리봉을 사용하여 긁어냄으로써 효소처리 없이 인간 배아 줄기 세포를 회수하였다.

비교예 1.

직경이 각각 3 μm 혹은 8 μm의 공극을 갖는 BD Falcon^™ (BD Bioscience, 미국) insert를 사용하여 지지세포로 사용되는 마우스 섬유아세포의 이동을 관찰하였다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 3 μm 혹은 8 μm의 공극을 갖는 다공성 막은 마우스 배아세포의 이동으로 인한 인간 배아 줄기 세포의 오염을 유발시킬 수 있으나 1 μm에서는 다공성 마우스 세포의 이동이 전혀 없는 것을 알 수 있다.

비교예 2.

지지세포 사용되는 마우스 섬유아세포의 농도를 각각 1.5 X 10⁵, 3.5 X 10⁵ 혹은 4.5 X 10⁵ cells/well을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 배아 줄기 세포를 배양하였다. 도 2에서 확인하는 바와 같이 다공성 막위 에서 인간 배아 세포의 점착률은 2.5 X 10⁵ 에서 가장 높음을 알 수 있다.

비교예 3.

6 웰 배양접시에 마이토마이신-C (mitomycin-c)를 2 시간 동안 처리하여 증식을 억제시킨 마우스 섬유아세포 (STO cell) 2.5 X 10⁵ cells/well를 가한 다음, 지지세포 배양용 배지(10% 소태아혈청 (FBS), 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% 비-필수 아미노산(Gibco)이 첨가된 90% DMEM으로 이루어진 배지)를 가하고, 24 시간 동안 배양하였다. 6 well 배양접시를 인산 완충된 식염수(phosphate buffered saline)로 2 회 세척하여 소태아혈청을 완전히 제거하였다. 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지(20% 혈청 대체물 (SR), 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% 비-필수 아미노산(Gibco), 및 4 ng/ml bFGF로 보충된 80% KO-DMEM으로 이루어진 배지)를 가하고, 직경 1 μm 의 공극을 갖는 BD Falcon^™ (BD Bioscience, 미국)을 가하여 6 well 배양접시에 고정시켰다. 클럼프를 형성한 인간 배아 줄기 세포(CHA-hES3)를 잘게 쪼갠 후 상기 배지 위에 약 30 개 정도 뿌려 주었다. 48 시간 후에 막 위에 인간 배아 줄기 세포가 잘 부착되었는지 확인하였으나, 세포의 부착이 거의 이루지 않았다.

비교예 4.

6 well 배양접시에 20% 혈청 대체물 (SR), 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% 비-필수 아미노산(Gibco), 및 4 ng/ml bFGF로 보충된 80% KO-DMEM으로 이루어진 배양액을 가하고, 직경 1 μm 의 공극을 갖는 BD Falcon^™ (BD Bioscience, 미국)을 가하여 6 well 배양접시에 고정시켰다. 클럼프를 형성한 인간 배아 줄기 세포(CHA-hES3)를 잘게 쪼갠 후 상기 배지 위에 약 30 개 정도 뿌려 주었다. 48 시간 후에 막 위에 인간 배아 줄기 세포가 잘 부착되었는지 확인하였으나, 세포의 부착이 전혀 이루지 않았다.

상기 비교예 3 및 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다공성 막의 바닥면에 지지세포가 없으면 인간 배아 줄기 세포가 막 위에 점착하지 못하였으며, 또한 배양접시에 위치한 지지세포도 막 위의 인간 배아 줄기 세포의 점착에 크게 영향을 주지 못함을 알 수 있다. 즉, 이러한 결과는 막 아래의 지지세포가 다공성 공극을 통하여 인간배아 줄기세포의 점착 및 배양에 있어 중요한 역할을 하는 것을 확인해 준다.

시험예 . 1

인간 배아 줄기 세포의 미분화 상태를 확인하기 위하여, 실시예 1의 배양액 중의 다공성 막 상의 인간 배아 줄기 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 5분 동안 투과하였다. 상온에서 1% normal goat serum을 처리한 후에 인간 배아 줄기 세포를 인간 특이 항체인 Oct4 (1:100), SSEA-4 (1:100), Tra-1-81 (1:100) 을 4 ℃에서 12시간 동안 배양하였다. 샘플을 씻은 후에, 일차 항체를 검출하기 위하여 로다민-컨쥬게이티드 고우트 항-마우스 IgG (Rodamin-conjugated goat anti-mouse IgG) (1:800) 이차 항체를 넣어 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 염색된 샘플을 다시 세척하고, DAPI (1:5000)을 넣고 상온에서 5분간 배양하여 세포의 핵을 염색하였다. 이미지는 형광 현미경 (ApoTome, Carl Zeiss, Jena, Germany) 을 통해 분석하였다. 도 3은 지지세포가 부착된 다공성 막 위의 인간 배아 줄기 세포를 3일간 배양했을 때의 사진이다. 도 3 중 (B)∼(D)는 인간 배아 줄기 세포를 미분화 표지인 Oct4, SSEA-4 혹은 Tra-1-81(빨강)와 세포의 핵에 염색된 DAPI (파랑)를 함께 염색한 사진이다. 도 3의 (E) 는 형광 현미경을 이용하여 도 3(B)의 사진을 삼차원 구조로 다시 재구성한 사진이다.

본 발명의 배양방법은 다공성 막의 바닥면에 지지세포를 부착시켜 배양액과 함께 인간 배아 줄기 세포를 배양함으로써, 배양되는 인간 배아 줄기 세포와 지지세포와의 지속적인 상호작용을 유지할 수 있으며 배양된 인간 배아 줄기 세포가 미분화 상태를 유지하면서 다공성 막에 점착 및 분포될 수 있도록 한다. 따라서 배양 완료 후 별도의 효소처리 없이 다공성 막으로부터 배양된 줄기세포만을 얻어낼 수 있으므로, 효소처리 및 지지세포에 의한 오염문제를 해결할 수 있다. 또한, 본 발명의 배양방법은 종래의 인간 배아 줄기 세포 배양 및 분리방법에 요구되는 노동력과 시간 소비적인 과정을 해결할 수 있으며, 안정적으로 인간 배아 줄기 세포를 대량으로 확보할 수 있도록 한다.

Claims (7)

1. 인간 배아 줄기 세포 배양용 배지 중에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서, 상기 배지가 지지세포(feeder cell)가 바닥면에 부착된 다공성 막을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기 세포의 배양방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 다공성 막이 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 폴리비닐리덴 플로라이드, 셀룰로오즈, 나이론, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체로 이루어진 세포 점착성 중합체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배양방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 다공성 막의 공극이 0.1 내지 2.5 ㎛ 의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 배양방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 지지세포가 마우스 섬유아세포, 마우스 배아 섬유아 세포, 인간 배아 섬유아세포, 인간 골수세포, 또는 성체 상피 세포인 것을 특징으로 하는 배양방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 다공성 막에 콜라겐, 파이브로넥틴, 라미딘, 또는 메 트리겔이 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 배양방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 배양방법으로 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 다공성 막으로부터 인간 배아 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 배아 줄기 세포의 회수방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 다공성 막으로부터 인간 배아 줄기 세포를 분리하는 단계가 다공성 막으로부터 인간 배아 줄기 세포를 긁어냄으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기 세포의 회수 방법.

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