KR100683236B1 - 당 전이물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

페놀 유도체 배당체 제조 방법이 제공되어진다. 상기 방법은 당과 페놀 유도체를 효소 존재하에 서로 반응시켜 페놀 유도체 배당체를 제조하는 단계를 포함한다. 상기 효소는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 및 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.

페놀 유도체 배당체, 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제, 당화형 아밀라아제

Description

당 전이물의 제조방법{Process for producing glycosyl transfer product}

본 발명은 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 또는 사이클로덱스트린 합성능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 사용하는 페놀 유도체 배당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

페놀 유도체 배당체는 종래부터 색소, 감미료, 진통제, 산화방지제 등으로서 사용되어져오고 있고 또한 우수한 미백효과를 나타내기 위한 화장품의 성분으로서도 사용되어왔다. 페놀 유도체의 배당화가 배당화되기 전의 화합물의 안정성, 맛의 질 및 흡수성을 개선시킬 수 있다는 것은 알려져 있다.

본 출원인은 고초균(bacillus subtilis) 주 X-23에 의해 제조된 당화형 α-아밀라아제를 사용하는 폴리페놀 배당체를 제조하는 방법을 제안하였다(일본 특허 제2662667호 및 일본 특허 제2805273호).

또한 사이클로덱스트린 합성능력을 갖지 않는 당화형 아밀라아제가 폴리페놀을 배당화한다는 것이 알려져있다(일본 공고공보 제7-36758호 및 J. Ferment. Bioeng., 78:31(1994)). 그러나, 폴리페놀 형태인 히드로퀴논이 전통적으로 알려진 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖지 않는 당화형 아밀라아제를 사용하여 배당화되었을 때 두개의 배당체, 즉 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드 및 히드로퀴논-O- α-D-말토시드가 제조되었다(일본 공고공보 제7-36758호). 이 제조된 물질의 중량은 각각 110㎎과 51㎎이었다. 그리하여 전통적인 방법은 그 방법이 관심있는 생성물의 정제 비용을 요구하는 문제점을 초래하는 수많은 형태의 히드로퀴논 배당체를 함유하는 혼합물을 제조한다.

고초균으로부터 유래된 몇가지 당화형 아밀라아제는 사이클로덱스트린 합성능력을 갖는다는 것이 알려져있다(J. Ferment. Bioeng., 81:26(1996)). 그러나 고초균의 사이클로덱스트린 합성능력을 갖는 아밀라아제가 또한 페놀 유도체를 배당화할 수 있다는 것은 알려진 적이 없었다.

또한, 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제 및 말토제닉 α-아밀라아제가 당을 폴리페놀로 전이하여 배당체를 제조할 수 있다는 것은 결코 알려지지 않았다.

다른 전통적으로 알려진 배당화 방법은 첨가된 당을 분자내에 당을 함유하는 폴리페놀 화합물의 당질 부분으로 전이하는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제를 사용하는 배당화 방법이다(일본 공개 공보 제3-7593호). 그러나 이 방법은 당을 당질 부분을 함유하지 않는 폴리페놀 화합물에 전이하는데에는 효과적일 수 없다. 다양한 생리학적 활성을 갖는 수많은 페놀 유도체는 당질 부분을 함유하지 않는다. 이러한 페놀 유도체의 안정성과 흡수성에서의 개선에 대한 요구가 있다.

배당체를 제조하기 위한 수많은 효소반응에서, 효소반응의 종결 후 부산물로서 얻어지는는 말토-올리고당은 유용성이 없다. 그러므로 유용한 부산물을 생성하는 페놀 유도체 배당화 방법에 대한 요구가 있다.

전통적으로, 양이온 교환 수지를 사용하는 리간드 교환 크로마토그래피는 글루코오스와 프럭토오스의 분리와 같은 당의 분리에 사용되어진다. 배당체를 정제하기 위한 크로마토그래피에는 소수성 흡착 수지가 일반적으로 사용된다.

본 발명자들은 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 및 사이클로덱스트린 합성능력을 갖는 당화형 아밀라아제(이들은 전통적으로는 산업분야에서 실질적으로 이용되어지지 않음)가 페놀 유도체 배당체를 합성하는 능력을 가짐을 발견하였고 이 발견을 기초로하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 사이클로덱스트린 합성능력을 갖는 당화형 아밀라아제가 사용될 때, 단일형의 배당체, 즉 페놀 유도체 배당체가 반응 종결시에 제조된다는 것을 발견하였다. 만약 사이클로덱스트린 합성능력을 갖는 당화형 아밀라아제가 히드로퀴논을 배당화하는데에 사용된다면 단일형의 히드로퀴논 배당체, 즉 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드가 제조된다. 하나의 형태의 생성물만이 제조되기 때문에 배당체는 전통적인 방법보다 더 쉬운 방법에 의해 정제될 수 있고 그 결과 저렴하게 고순도의 배당체를 공급하는 것을 가능하게 만든다.

본 발명자들은 또한 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제 또는 말토제닉 α-아밀라아제가 사용될 때, 페놀 유도체 배당체 및 이소말토-올리고당이 반응 종결시에 제조된다.

또한, 본 발명자들은 카테킨형 화합물, 카페인산, 누룩산, 히드로퀴논, 카테콜형 화합물, 레조르시놀형 화합물, 프로토카테쿠산, 갈산, 바닐린, 다이제인, 제 니스테인, α-레조르실산 및 플로로글루시놀과 같은 페놀 유도체를 배당화함으로써 페놀 유도체 배당체 및 양이온 교환 수지 또는 금속(예: 칼슘, 납, 아연 및 나트륨) 또는 양이온 교환 수지와 결합된 수소 사이의 상호작용이 페놀 유도체와 수지 사이의 상호작용과 다르다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 앞에서 기술한 바와 같이 페놀 유도체를 배당화함으로써 페놀 유도체 배당체와 음이온 교환 수지의 부분 또는 전체사이의 소수성 상호작용이 페놀 유도체와 음이온 교환 수지의 부분 또는 전체 사이의 상호작용과 다르다는 것을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여 본 발명자들은 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 배당화 반응으로 수득된 효소반응 생성물을 첨가함으로써 한 단계에 배당체를 정제할 수 있는 정제방법을 완성하였다.

네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제 또는 말토제닉 α-아밀라아제가 페놀 유도체 배당체를 제조하는데에 사용되면, 많은 양의 이소말토-올리고당이 공여체로서 동시에 첨가되는 기질로부터 제조되어진다. 이소말토-올리고당은 유익한 장내세균의 성장을 강화하는 비피더스 인자로서 주목을 받아오고 있다. 그러므로, 본 발명의 방법으로 페놀 유도체 배당체 뿐만 아니라 유용한 부산물인 이소말토-올리고당을 얻는 것이 가능하다.

본 발명의 방법은 전술한 효소의 작용으로 분자가 당 잔기를 함유하든지 않든지간에 당류가 당 수용체로서 작용하는 분자의 히드록시 그룹으로 전이되는 것을 특징으로 한다. 수용체 분자가 당 잔기를 함유할 때조차 당류는 당 잔기의 히드록시 그룹과는 다른 히드록시 그룹으로 전이된다. 이 작용은 통상의 방법에서 사용되 는 효소의 작용과는 꽤 다른 것이다.

본 발명의 방법은 당과 페놀 유도체를 효소 존재하에 서로 반응하도록 하여 페놀 유도체 배당체를 제조하는 단계를 포함하는 페놀 유도체 배당체를 제조하는 방법이다. 상기 효소는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 및 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

한 양태에서, 효소는 네오풀룰라나아제이다. 네오풀룰라나아제는 써모악티노미세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris), 박테로이드스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 써모아밀로리퀴페션스(Bacillus thermoamyloliquefaciens) 및 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터 유래될 것이다.

한 양태에서, 효소는 시클로말토덱스트리나아제이다. 시클로말토텍스트리나아제는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 써모필러스(Bacillus thermophilus), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulane), 대장균, 플라보박테리움(Flavobacterium), 알칼로필릭 바실러스(Alkalophilic Bacillus) 및 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터 유래될 것이다.

한 양태에서, 효소는 말토제닉 α-아밀라아제이다. 말토제닉 α-아밀라아제는 써모악티노미세스 불가리스, 박테로이드스 테타이오타오미크론, 슈도모나스, 바실러스 폴리믹사, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모아밀로리퀴페션스 및 써머스 써모필러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터 유래될 것이다.

한 양태에서, 효소는 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제가다. 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 고초균, 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토미세스 히그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus), 스트렙토미세스 프래콕스(Streptomyces praecox), 리조퍼스 델레마(Rhizopus delemar), 아스페르길러스 델레마(Aspergillus delemar) 및 아스페르길러스 니거(Aspergillus niger)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터 유래될 것이다.

한 양태에서, 페놀 유도체는 플라본형 화합물, 이소플라본형 화합물, 플라보놀형 화합물, 플라바논형 화합물, 플라바노놀형 화합물, 카테킨형 화합물, 오론형 화합물, 칼콘형 화합물, 디히드로칼콘형 화합물, 누룩산, 디메톡시 페놀, 아세트아미노펜, 바닐린, 히드로퀴논, 에피칼로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 안토시아니딘형 화합물, 안토시아닌형 화합물, 카페인산, 카테콜, 레조르시놀, 프로토카테쿠산, 갈산, 레조르실산 및 플로로글루시놀로 이루어진 그룹으로부터 선택될 것이다.

한 양태에서, 당은 말토-올리고당, 덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 천연 전분, 전분 분해물 및 가공 전분으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 것이다.

한 양태에서, 본 발명의 방법은 이온 교환 수지를 사용하여 효소반응 생성물을 분획하는 단계를 더 포함한다.

한 양태에서, 본 발명의 방법은 이온 교환 수지를 사용하여 효소반응 생성물을 적어도 부산물을 함유하는 분획, 미반응 페놀 유도체를 함유하는 분획 및 페놀 유도체 배당체를 함유하는 분획으로 분획하는 단계를 더 포함한다.

이하, 본 발명은 구체적으로 설명될 것이다.

본 발명의 방법은 페놀 유도체 배당체를 제조하기 위한 방법이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "페놀 유도체 배당체"는 페놀 유도체 부분이 글리코시드 결합으로 당 부분에 연결되어진 물질이다. 페놀 유도체 배당체는 모노-글루코피라노시드(예: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드, 카페인산-O-α-D-글루커피라노시드, 3,4-디메톡시페놀-O-α-D-글루코피라노시드 및 카테킨-O-α-D-글루코피라노시드), 디글루코피라노시드 또는 트리글루코피라노시드이고 이의 당 부분은 전술한 모노-글루코피라노시드 등에 첨가적으로 연결되어진다.

본 발명의 방법은 당과 페놀 유도체가 효소의 존재하에 서로 반응하여 페놀 유도체 배당체를 형성하는 단계를 포함한다.

(1) 당

본 명세서에서 사용되어진 것과 같이, "당"은 C_n(H₂O)_m의 일반식을 갖는 화합물을 가리키는 것이다. 당은 구성 요소, 즉 당 단위의 수에 따라서 단당류, 올리고당 및 다당류로 나뉜다. 본 발명에서는 올리고당과 다당류가 바람직하다. 그러므 로, 상기 일반식에서 n은 적어도 12 그리고 m은 적어도 11인 것이 바람직하다.

단당류의 예는 D-글루코오스이다.

본 명세서에서와 같이, 올리고당은 2 내지 10의 단당류의 탈수-축합에 의해 얻어지는 물질로서 적어도 α-1,4 결합을 갖는 물질을 가리키는 것이다. 올리고당은 바람직하게는 3 내지 9의 당 단위, 보다 바람직하게는 4 내지 8의 당 단위, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 7의 당 단위를 갖는다. α-1,4 결합을 갖는 올리고당의 예는 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토옥타오스, 말토나노오스 및 말토데카오스와 같은 말토-올리고당을 포함한다. 올리고당은 직쇄 올리고당 또는 분지상 올리고당이다. 올리고당은 분자내 고리 구조를 가질 것이다.

본 명세서에서 사용되어진 바와 같이 다당류는 적어도 11의 단당류의 탈수-축합에 의해 생성되는 화합물로서 적어도 하나의 α-1,4 결합을 갖는 화합물을 가리키는 것이다. 다당류의 예는 덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴 및 전분을 포함한다. 바람직한 다당류는 덱스트린이다.

덱스트린은 화학적 또는 효소적 방법에 의해 전분의 분자량을 작게함으로써 얻어진다. 덱스트린의 예는 영국 검, 옐로우 덱스트린, 화이트 덱스트린, 파인-덱스(PINE-DEX, 매츠타니 화학공업주식회사(Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.)), 선테크(SUNDECK, 산와 콘스타치 주식회사(Sanwa Cornstarch Co., Ltd.)) 및 테트럽(Tetrup, 하야시바라 쇼지 주식회사(Hayashibara Shoji Co., Ltd.))를 포함한다.

아밀로오스는 α-1,4 결합에 의해 함께 결합된 글루코오스 단위로 이루어진 직쇄 분자이다.

아밀로펙틴은 α-1,4 결합에 의해 연결되어진 글루코오스 단위에 α-1,6 결합으로 글루코오스 단위가 연결되어진 분지상 분자이다. 아밀로펙틴은 천연 전분에 함유되어져 있다. 아밀로펙틴으로는 예를 들면, 100% 아밀로펙틴으로 이루어진 납빛의 옥수수 전분이 사용된다.

전분은 아밀로오스와 아밀로펙틴의 혼합물이다. 전분으로서, 일반적으로 입수가능한 어떠한 전분이라도 사용된다. 전분에 함유된 아밀로오스 대 아밀로펙틴의 비율은 전분을 생산하는 식물의 종류에 따라 다양하다. 납빛 쌀, 납빛 옥수수 등에 함유된 전분의 대다수는 아밀로펙틴이다. 전분은 천연 전분, 전분 분해물 및 가공 전분으로 나뉘어진다.

천연 전분은 그것이 유래되는 원료 물질에 따라서 괴경(tuber) 전분 및 곡물 전분으로 나뉘어진다. 괴경 전분의 예로는 감자 전분, 타피오카 전분, 고구마 전분, 칡 전분, 고사리 전분 등을 포함한다. 곡물 전분의 예로는 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 등을 포함한다.

가공 전분은 천연 전분을 가수분해, 에스테르화, 젤라틴화 등으로 처리하여 그 성질을 이용하기에 더 용이하게 만듦으로써 얻어지는 전분이다. 특성, 예를 들면, 젤라틴화를 시작할 때의 온도, 전분 페이스트의 투명성, 노화 안정성 등과 같은 특성의 다양한 조합을 갖는 광범위한 가공 전분이 사용될 수 있다. 다양한 형태의 가공 전분이 있다. 이러한 전분의 예는 전분 입자를 전분의 젤라틴화 온도보다 높지 않은 온도에서 산에 침지시켜 전분 분자는 분해하나 전분 입자는 절단되지 않도록 함으로써 얻어지는 전분이다.

전분 분해물은 효소 처리, 가수분해 등으로 처리하여 처리 전보다 더 적은 분자량을 갖도록 하여 얻어지는 올리고머 또는 폴리머이다. 전분 분해물의 예로는 가지절단 효소에 의해 분해된 전분 및 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분을 포함한다.

가지절단 효소에 의해 분해된 전분은 가지절단 효소가 전분에 작용하도록 함으로써 얻어진다. 가지절단 효소의 작용시간을 다양하게 변화시킴으로써 분지 부분(즉, α-1,6-글루코시드 결합)이 절단되는 정도에 따라 가지절단 효소에 의해 분해된 전분을 얻을 수 있다.

가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분은 염산, 아세트산, 옥살산, 황산, 질산 등의 산의 작용에 의해 전분을 부분적으로 분해함으로써 얻어지는 분해물을 가리키는 것이다. 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분은 결과 얻어지는 분해물의 분자량의 분포가 분해될 전분의 형태에 따라 다양하다. 가수분해에 의해 부분적으로 분해된 전분은 다양한 길이를 갖는 당 사슬의 혼합물일 것이다.

(2) 페놀 유도체

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "페놀 유도체"는 페놀 골격(즉, 벤젠 고리) 또는 플라보노이드 골격을 갖고 페놀 골격 또는 플라보노이드 골격에 결합된 히드록시 그룹을 갖는 페놀 및 누룩산을 포함하는 화합물을 가리키는 것이다. 페놀 유도체의 예로는 단일 페놀 또는 플라보노이드 골격에 하나의 페놀성 히드록시 그 룹을 갖는 화합물 및 단일 페놀 또는 플라보노이드 골격에 적어도 2개의 페놀성 히드록시 그룹을 갖는 화합물을 포함한다. 이하, 편의상, 단일 페놀 또는 플라보노이드 골격에 하나의 페놀성 히드록시 그룹을 갖는 화합물은 모노페놀형 화합물이라 칭하고, 단일 페놀 또는 플라보노이드 골격에 적어도 두개의 페놀성 히드록시 그룹을 갖는 화합물은 폴리페놀형 화합물이라 칭한다.

단일 페놀 또는 플라보노이드 골격에 두개의 페놀성 히드록시 그룹을 갖는 화합물은 디페놀형 화합물이라 칭한다.

페놀성 히드록시 그룹을 갖는 페놀 유도체 배당체는 또한 페놀 유도체로서 포함되어진다.

단일 페놀 또는 플라보노이드 골격에 하나의 페놀성 히드록시 그룹을 갖는 모노페놀형 화합물의 예는 페놀, 누룩산, 디메톡시 페놀, 아세트아미노펜, 바닐린 및 데이제인(daidzein)을 포함한다.

또한 모노페놀형 화합물의 예로는 모노페놀형 플라보노이드형 화합물을 포함한다. 모노페놀형 플라보노이드형 화합물은 모노페놀형 플라본형 화합물, 모노페놀형 이소플라본형 화합물, 모노페놀형 플라보놀형 화합물, 모노페놀형 플라바논형 화합물, 모노페놀형 플라바노놀형 화합물, 모노페놀형 카테킨형 화합물, 모노페놀형 오론형 화합물, 모노페놀형 칼콘형 화합물 및 모노페놀형 디히드로칼콘형 화합물을 포함한다.

디메톡시페놀의 예로는 2,3-디메톡시페놀, 2,4-디메톡시페놀, 2,5-디메톡시페놀, 2,6-디메톡시페놀, 3,4-디메톡시페놀 및 3,5-디메톡시페놀을 포함한다. 3,4- 디메톡시페놀 및 3,5-디메톡시페놀이 바람직하다.

단일 페놀 또는 플라보노이드 골격에 적어도 두개의 페놀성 히드록시 그룹을 갖는 폴리페놀형 화합물의 예로는 히드로퀴논, 에피칼로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 안토시아니딘형 화합물, 안토시아닌형 화합물, 카페인산, 카테콜, 레조르시놀, 프로코카테쿠산, 갈산, 제니스테인, β-레조르실산 및 프롤로글루시놀을 포함한다.

디페놀 화합물의 예로는 또한 디페놀형 플라보노이드형 화합물을 포함한다. 디페놀형 플라보노이드형 화합물의 예로는 디페놀형 플라본형 화합물, 디페놀형 이소플라본형 화합물, 디페놀형 플라보놀형 화합물, 디페놀형 플라바논형 화합물, 디페놀형 플라바노놀형 화합물, 디페놀형 카테킨형 화합물, 디페놀형 오론형 화합물, 디페놀형 칼콘형 화합물 및 디페놀형 디히드로칼콘형 화합물을 포함한다.

레조르실산의 예로는 α-레조르실산, β-레조르실산 및 γ-레조르실산을 포함한다. 본 발명에서는 β-레조르실산이 바람직하다.

히드로퀴논, 카테킨형 화합물, 에피칼로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 3,4-디메톡시페놀, 3,5-디메톡시페놀 및 아세트아미노펜이 본 발명의 방법에 바람직하다. 히드로퀴논이 더 바람직하다.

페놀 유도체는 천연물로부터 단리되거나 천연 화합물을 변형(즉, 반-합성(semi-synthesis))함으로써 얻어지거나 또는 새롭게 합성되어진다. 더 복잡한 구조의 페놀 유도체는 천연물로부터의 추출 또는 반-합성된 것이 더 바람직하다.

페놀 유도체를 단리하는 방법, 페놀 유도체를 반-합성하는 방법 및 페놀 유 도체를 합성하는 방법은 당해 기술분아에 공지되어 있고 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다.

(3) 효소

본 발명의 방법에 사용되는 효소는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 및 사이클로텍스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명에 사용되는 효소는 페놀 유도체를 배당화하는 활성이 효소에서 검출될 수 있다면 정제된 효소일 필요는 없다. 정제되지 않은 박테리아 배양물이나 정제 단계를 어느정도 통과한 조 효소조차 본 발명의 제조방법에서 사용된다. 상기한 효소는 당해 기술분야의 공지된 방법에 따라 박테리아로부터 제조되거나 시판되는 효소를 이용할 수 있다.

네오풀룰라나아제는 풀룰란의 α-1,4-글루코시드결합을 주로 가수분해하고 파노즈(panose)를 제조하는 능력을 갖는 효소를 가리키는 것이다. 또한, 효소는 당 전이 반응을 수행한다.

네오풀룰라나아제의 예로는 써모악티노미세스 불가리스, 박테로이드스 테타이오타오미크론, 슈도모나스, 바실러스 폴리믹사, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모아밀롤리퀴페션스 및 써머스 써모필러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 박테리아로부터 유래된 네오풀룰라나아제를 포함한다.

특히 바람직한 네오풀룰라나아제의 예로는 바실러스 스테아로써모필러스 TRS40(기탁번호 FERM P-9609)으로부터 유래된 네오풀룰라나아제(Journal of Bacteriology, Vol. 170, p.1554, 1998), 써모악티노미세스 불가리스로부터 유래된 α-아밀라아제(Agriculture and Biological Chemistry, Vol. 42, p. 1681, 1978), 써모악티노미세스 불가리스로부터 유래된 네오풀룰라나아제형 α-아밀라아제(Biosci.Biotechnol.Biochem., Vol. 57, p. 395, 1993), 바실러스 스테아로써모필러스 KP1064의 풀룰란 히드로라아제(Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 21, p. 20, 1985), 박테로이드스 테타이오타오미크론 95-1의 네오풀룰라나아제(Journal of Bacteriology, Vol. 173, p. 2926, 1991), 바실러스 폴리믹사로부터 유래된 네오풀풀라나아제(Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 68, p. 113, 1997), 바실러스 리케니포르미스로부터 유래된 아밀라아제(J.Biol. Chem., Vol. 267, p. 22108, 1992), 바실러스 sp. KSM-1876으로부터 유래된 네오풀룰라나아제(Biosci.Biotechnol.Biochem., Vol.56, p. 514, 1992) 등을 포함한다.

네오풀룰라나아제는 아밀로오스에 대한 반응성이 아밀로펙틴에 대한 반응성보다 현저하게 높다는 것을 특징으로한다. 네오풀룰라나아제를 전분과 반응시키면, 전분에 있는 아밀로오스는 대부분 말토오스로 분해된다. 네오풀룰라나아제에 의한 아밀로펙틴의 가수분해가 말토오스와 같은 이당류의 것보다 많거나 같은 중합화도를 갖는 당의 존재에서 억제되는 것으로 여겨지고 실제로 그러한 억제는 아밀로펙틴에 대한 반응성보다 아밀로오스에 대한 더 높은 반응성을 더 이끈다. 네오풀룰라나아제는 아밀로펙틴에 대한 작용이 반드시 전적으로 부족한 것은 아니고 아밀로펙 틴을 어느 정도 분해시켜 아밀로펙틴의 분자량을 감소하게 한다. 그러므로, 대부분 또는 거의 전적으로 아밀로펙틴으로 이루어진 전분이 기질이라고 하더라도 네오풀룰라나아제는 감소된 분자량을 갖는 특정 생성물을 제조할 것이다.

네오풀룰라나아제는 공지의 방법, 예를 들면, 일본 특허 제1853673호 또는 제1985401호의 방법에 따라 제조되어진다.

시클로말토덱스트리나아제는 말토트리오스 및 사이클로덱스트린의 중합도보다 크거나 같은 중합도를 갖는 말토-올리고당을 분해시키고 아밀로펙틴, 글리코겐, 파노오스 및 이소파노오스를 거의 분해시키지 않는 효소를 가리키는 것이다. 시클로말토덱스트리나아제는 일본 공개공보 제5-68486호에 기재되어 있다. 일본공개공보 제7-289280호에는 시클로말토덱스트리아나아제가 사이클로덱스트린의 중합도와 동일한 중합도를 갖는 직쇄 올리고당 또는 다당류보다 가수분해율이나 사이클로덱스트린에 대한 친화도에서 더 큰 기질 특이성을 갖는 것으로 정의되어 있다. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:197-203(1993)에는 시클로말토덱스트리나아제가 전분과 아밀로펙틴보다 사이클로덱스트린(CD)을 더 빨리 가수분해하고; 시클로말토덱스트리나아제가 전분으로부터 CD를 제조하지 않으므로 CGTase와 다르며; 시클로말토덱스트리나아제가 아미노산 서열의 일차구조에서 네오풀룰라나아제와 비슷하다는 것이 기재되어있다.

시클로말토덱스트리나아제의 예로는 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모필러스(써머스 써모필러스), 바실러스 코아굴런스, 대장균, 플라보박테리움, 알칼로필릭 바실러스 및 바실러스 스패리커스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박 테리아로부터 유래된 시클로말토덱스트리나아제를 포함한다.

바람직한 시클로말토덱스트리나아제의 예로는 바실러스 스패리커스로부터 유래된 시클로말토덱스트리나아제(Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:197-203(1993): 이하 BSCDase라 함)와 알칼로필릭 바실러스 sp. A2-5a 주로부터 유래된 시클로말토덱스트리나아제(기탁번호: FERM-P-13846, Bioscience Biotech. Biochem., 58(3), 517-520(1994): 이하 A2-5a CDase라 함)를 포함한다.

말토제닉 α-아밀라아제는 엔도형 반응에서 글루칸에 작용하여 α-아노머 말토오스를 생성하는 효소를 가리키는 것이다. J. Biol. Chem. 267(31) 22108-22114, 1992는 말토제닉 α-아밀라아제가 (α-1,6-글리코시드 결합 다음의 α-1,4-글리코시드 결합을 절단할 수 없다는 것을 조건으로)α-1,4-글리코시드 결합을 절단하고;말토제닉 α-아밀라아제가 전이 활성을 가지며; α-아밀라아제가 사이클로덱스트린을 분해시키고; 말토제닉 α-아밀라아제가 아미노산 서열의 일차 구조에서 네오풀룰라나아제와 유사하다는 것을 기재하고 있다.

말토제닉 α-아밀라아제는 써모악티노미세스 불가리스, 박테로이드스 테타이오타오미크론, 슈도모나스, 바실러스 폴리믹사, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모아밀로리퀴페션스, 써머스 써모필러스 및 바실러스로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터 유래된 말토제닉 α-아밀라아제를 포함한다.

바람직한 말토제닉 α-아밀라아제는 바실러스 리케니포르미스-유래 말토제닉 α-아밀라아제(BLMA라고 칭함)이다.

네오풀룰라나아제. 시클로말토덱스트리나아제 및 말토제닉 α-아밀라아제는 모두 α-아밀라아제과에 있는 것을 포함한다. α-아밀라아제과는 과에 포함된 효소의 구조 및 촉매 매카니즘에서의 유사성에 의해 정의되어진다. 특히, α-아밀라아제과는 다음 특성을 갖는 것으로 정의되어진다.

과의 멤머

1. α-글루코시드 결합에 작용하고;

2. α-글리코시드 결합을 가수분해하여 α-아노머 글루코오스 또는 말토-올리고당을 제조하거나 당 전이 반응을 촉매하여 새로운 α-글루코오스를 형성하며;

3. 각 효소에 공통인 일차 구조에 네개의 보존 영역을 가지고, 보존 영역에는 모든 촉매 부위 및 대부분의 기질 결합 부위가 존재하고;

4. 촉매 부위로서 타카아밀라아제 A의 Asp206, Glu 230 및 Asp 297에 상응하는 Asp, Glu 및 Asp 잔기를 가진다.

전술한 바와 같이, α-아밀라아제과에 포함되는 효소는 아미노산 서열의 일차 구조의 비교 결과로서 높은 상동성을 갖는 네개의 영역, 즉, 보존영역을 가지는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, α-아밀라아제과 효소의 보존 영역은 Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 87, pp. 557-565(1999)의 도 1에 나타낸 영역 1, 2, 3 및 4를 가리키는 것이다(이하 보존 영역 1, 2, 3 및 4라고 함). 보존 영역 1 내지 4은 β가닥과 α나선의 8번 반복을 함유하는 구조(β/α)₈-통구조라 칭함)를 갖는 A 영역에 존재한다. α-아밀라아제과의 몇몇 효소에서 는, 보존 영역 1은 N 말단으로부터 약 아미노산 부위 120부터 시작한다(예: 아스페르길러스 오리재로부터 유래하는 α-아밀라아제). 그러나, α-아밀라아제과는 또한 보존 영역 1이 N 말단으로부터 약 240 아미노산 위치부터 시작한다(바람직하게는, 239부터 242까지의 아미노산 부위). 전술한 효소에서 아미노산의 번호매김은 성숙한 형태의 N 말단부터 시작한다. 본 발명에서 사용되는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제 및 말토제닉 α-아밀라아제는 후자의 아미노산 서열의 특성을 갖는다. 이러한 효소는 또한 A 영역앞에 적어도 100개의 아미노산으로 이루어진 다른 영역(N 영역)을 갖는다.

본 발명에서 사용되는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제 및 말토제닉 α-아밀라아제는 N 말단으로부터 α-아밀라아제과의 보존 영역 1, 2, 3 및 4를 순서대로 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제 및 말토제닉 α-아밀라아제에는 α-아밀라아제과 효소의 보존 영역 1이 N 말단으로부터 239 내지 242의 아미노산 위치 또는 그 위치와 실질적으로 동일한 위치부터 시작한다. 실질적으로 동일한 위치는 표시된 위치(즉, 239 내지 242 아미노산 위치)로부터 1 내지 10 아미노산, 바람직하게는 1 내지 5 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 3 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 아미노산 그리고 훨씬 더 바람직하게는 1 아미노산 떨어지게 위치하는 위치이다. 가장 바람직하게는, 아밀로오스-특이 효소에서, 보존 영역은 N 말단으로부터 239 내지 242 위치부터 시작한다.

사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 반응의 초기 단계 에서 적어도 6의 중합도를 갖는 사이클로덱스트린을 합성하여 결과적으로는 글루코오스, 말토오스 및 말토트리오스를 제조하는 α-아밀라아제를 가리키는 것이다.

사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제의 예는 주 IFO14140으로 표시되는 고초균, 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토미세스 히드로스코피커스, 스트렙토미세스 파래콕스, 리조퍼스 델레마 및 아스페르길러스 니거로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터 유래된 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제가다.

사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 제조하는 고초균 주의 예는 주 IFO14140(Institute For Fermentation, Osaka, Japan(IFO로 약칭)으로부터 입수가능), 오하이오 대학, 바실러스 지네틱 스톡 센터로부터 바실러스 주 1A289 및 오카다 등의 "Journal of Fermentation Technology Vol.41, No. 8, 427(1963)"에 기재된 주 K02, K05, K12 및 D11을 포함한다. 오카다 등에 기재된 주 K02, K05, K12 및 D11가 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 합성한다는 것은 본 명세서에서 처음 개시하는 것이다. 오카다 등은 당화 α-아밀라아제를 제조하는 박테리아가 박테리아용 스크리닝 방법과 α-아밀라아제의 활성을 측정하는 방법에 의해 얻어졌다는 소스를 기재하고 있다. 오카다 등에 따르면, 제1 스크리닝은 당화형 아밀라아제를 제조하는 박테리아 주를 얻기 위해 수행될 수 있다. 당화형 아밀라아제를 제조하는 얻어진 박테리아 주는 니시무라 등의 J. Ferment. Bioeng., 71, 26(1996)에 기재된 방법에 따라 제2 스크리닝을 할 수 있고 그 결과 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 효소를 제조하는 박테리아 주를 선택 할 수 있다. 고초균에 의해 제조된 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 J. Ferment. Bioeng., 81, 26(1996)에 기재되어 있다.

스트렙토코커스 보비스, 스트렙토미세스 히드로스코피커스, 스트렙토미세스 프래콕스, 리조퍼스 델레마 및 아스페르길러스 니거와 같은 박테리아 중에서 당화형 아밀라아제를 제조하는 박테리아가 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 많이 제조할 것으로 보인다. 그러므로 당화형 아밀라아제를 제조하는 박테리아가 또한 바람직하게 사용될 것이다. 당화형 아밀라아제를 제조하는 박테리아가 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 제조하는지 하지 않는지는 니시무라 등의 J. Ferment. Bioeng., 81, 26(1996)에 기재된 방법에 의해 확인될 것이다.

사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 광범위한 당 기질을 가수분해하여 글루코오스를 다양한 페놀 유도체로 전이하고 그 결과 다양한 페놀 유도체 배당체를 얻을 수 있다.

사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 공지된 방법, 예를들면, 오카다 등의 "Journal of Fermentation Technology Vol. 41, No. 8, 427(1963)에 기재된 방법에 기초하여 제조될 것이다.

본 발명에 사용되는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 및 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 유전자 재조합 방법에 의해 이들의 효소를 코딩하는 유전자가 미생물로 도입되게 함으로써 제조될 것이다. 예를 들면, 네오풀룰라나아제에 대해서, 바실러스 스테아로써모필 러스로부터 유래된 네오풀룰라나아제의 염기 서열(J. Gen. Microbiol., Vol. 135, p. 1521(1989)) 및 이의 아미노산 서열(일본공개공보 제7-177891호: 재조합 방법이 또한 기재되어 있음)이 이용된다. 선택적으로, 공지된 서열에 기초하여 설계된 프라이머를 사용하는 식물, 미생물 등으로부터의 DNA라이브러리를 검색함으로써, 새로운 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 또는 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 얻을 수 있다. 이러한 새로운 효소의 이용 역시 본 발명의 범위내에 속한다.

본 발명에 사용되는 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 또는 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제와 같은 폴리펩티드 효소는 1 내지 약 10 아미노산 잔기 첨가, 1 내지 약 10 아미노산 잔기 결실 또는 1 내지 약 10 아미노산 잔기 치환에 의해 아밀로오스 특이성과 같은 원하는 생물학적 활성을 나타낸다. 약 10 에서 수개 내지 1 아미노산 잔기 첨가, 결실 또는 치환은 전술한 폴리펩티드 효소에 포함될 것이다. 바람직하게는, 10, 8, 5, 3, 2 또는 1 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 치환이 전술한 폴리펩티드 효소에 포함될 것이다. 바람직하게는, 이러한 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환은 α-아밀라아제과의 비보존 영역에 존재한다. 치환이 일어나면 치환은 바람직하게 보존 치환이다. 보존 치환은 당해 기술분야의 기술자들에게 잘 알려져 있다.

당해 기술분야의 기술자들은 스크리닝에 의해 천연으로부터 이러한 효소를 용이하게 얻을 수 있다. 또한 이러한 폴리펩티드는 당해 기술분야의 기술자들에게 공지된 유전공학기술에 의해 제조될 것이다.

본 발명에서 사용된 효소는 예를 들어 다음의 방법에 의해 제조될 것이다. 처음에, 본 발명에 사용되는 효소를 제조하는 박테리아를 배양한다. 이 박테리아는 효소를 직접 제조하는 박테리아일 것이다. 선택적으로 효소를 코딩하는 유전자가 클론되고 효소 발현에 잇점이 있는 박테리아가 결과적인 유전자로 형질전환되어 본 발명을 수행하기 위해 사용되는 형질전화된 박테리아를 얻을 수 있다.

클론된 유전자를 사용하는 박테리아의 형질전환은 당해 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 수행될 것이다. 클론된 유전자를 사용하면, 유전자가 구성성 또는 유도성 프로모터에 작용적으로 결합되어 바람직하다. "작용적으로 결합된"은 프로모터가 유전자 발현을 조절할 수 있는 방법으로 유전자에 결합되는 것을 가리킨다. 유도성 프로모터가 사용되면 배양은 유도성 조건하에서 바람직하게 수행된다. 다양한 유도성 프로모터가 당해 기술분야의 기술자들에게 공지되어 있다.

신호 펩티드는 제조된 효소가 박테리아 외부로 분비될 수 있도록 클론된 유전자에 결합될 것이다. 신호 펩티드는 당해 기술분야의 기술자들에게 잘 알려져 있다.

당해 기술분야의 기술자들은 효소를 제조할 목적으로 박테리아를 배양하기 위한 적절한 조건을 설정할 것이다. 박테리아 배양을 위한 적절한 배지, 각 유도성 프로모터의 유도를 위한 적절한 조건 등은 당해 기술분야의 기술자들에게 알려져 있다.

효소는 적절한 시간동안 배양한 후에 배양액으로부터 회수된다. 제조된 효소가 박테리아 외부로 분비되면 박테리아는 원심분리에 의해 제거되어 상청액을 얻는 다. 제조된 효소가 분비되지 않으면, 박테리아는 음파처리, 기계적 파괴, 화학적 파괴 등에 의해 파괴되어 세포 균질물로서 얻어진다. 그에 따라 세포 균질물을 원심분리하여 세균파편을 제거하고 그 결과 상청액을 얻는다. 결과 얻어진 상청액으로부터 본 발명의 효소를 황산 암모늄 침강 또는 에탄올 침강, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 어피니티크로마토그래피, 히드록실 아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지된 방법에 의해 회수한다. 회수된 생성물은 임의로 정제될 것이다.

본 발명에 사용되는 효소는 정제된 효소 또는 조 효소이고 고정화이거나 고정화가 아닐 것이다. 반응은 배치식 반응이거나 연속 반응일 것이다. 고정화 방법으로는, 당해 기술분야의 기술자들에게 공지된 담체 결합 방법(예: 공유결합법, 이온결합법 또는 물리적 흡착법), 가교결합법, 포괄법(entrapment method, 격자형 또는 미소캡슐형) 등이 사용된다.

(효소 활성 측정법)

효소 활성은 다음 방식으로 측정되어진다.

40℃에서 인큐베이트된 1.5% w/w 가용성 전분 수용액 200㎕(가용성 전분은 머크에서 제조되었고 40mM 아세트산-나트륨 완충 용액으로 pH 5.5로 조정하였다)를 40℃에서 인큐베이트된 효소 용액 50㎕에 첨가하여 40℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응생성물에 0.5N 아세트산과 0.5N 염산이 5:1의 비율로 혼합된 용액 2㎖를 첨가한 다음, 얻어진 혼합물을 교반하였고 그 결과 반응이 종결되었다. 결과 얻어 진 용액 0.1㎖를 모으고 여기에 0.005% 요오드와 0.05% 요오드화칼륨을 함유하는 용액 5㎖를 첨가한 다음, 결과 얻어진 혼합물을 교반하였다. 혼합물을 20분동안 상온에 세워 두었더니 요오드-전분 반응에 의해 색깔이 나타났다. 그런 다음, 용액의 흡광도를 660㎚에서 측정하였다. 얻어진 흡광도는 C로 나타내었다. 이와 별도로 상기 효소 용액 대신에 정제된 물을 사용하는 용액을 블랭크로서 동일한 방법으로 제조하여 그것의 흡광도를 측정한다. 얻어진 흡광도는 B로서 나타낸다. 그렇게 얻어진 C와 B에 기초하여 효소의 활성(A로 나타냄)을 다음 식에 따라 얻었다.

A=(B-C)/B ×10

효소 활성의 1 단위는 B값의 10%이다.

(당 전이율의 측정 방법)

당 전이율은 다음과 같이 측정된다.

가용성 전분 또는 말토펜타오스와 같은 공여체 및 히드로퀴논 또는 카테킨과 같은 수용체를 함유하는 용액과 효소 용액을 함께 혼합하여 16 내지 24시간동안 40℃에서 반응시킨다. 반응 생성물은 HPLC(머크에 의해 제조된 ODS 칼럼 RP-18과 pH 2.5로 조정된 10% 메탄올을 용리액으로 사용함)에 의해 분석된다. HPLC 분획의 흡광도는 280㎚에서 측정되어 배당체를 검출하고 정량한다. 배당체의 피크 면적이 얻어진다. 대조로서, 효소 용액 대신에 정제된 물을 사용하고 전술된 동일한 방법으로 용액을 제조하여 수용체의 양을 측정한다. 수용체의 피크 면적이 얻어진다.

당 전이율은 다음 식에 의해 계산된다.

당 전이율=배당체의 피크 면적/대조 수용체의 피크 면적 ×100

(페놀 유도체와 당의 반응)

본 발명에 따라서 페놀 유도체 배당체를 제조하는 방법에서, 상기한 당과 상기한 페놀 유도체를 효소 존재하에 서로 반응하도록 하는 단계에서는 페놀 유도체 배당체가 제조되기만 하면 어떠한 반응 조건(pH와 온도와 같은)이라도 사용될 수 있다. 당과 페놀 유도체의 농도는 반응 조건 등을 고려함으로써 결정될 것이다. 효소 반응의 시작에서 글리코실 공여체(예: 덱스트린)와 페놀 유도체의 전체 양이 반응계의 용매에 용해될 필요는 없다. 매우 적은 양의 덱스트린만이 용해된다고 하더라도 반응은 시작될 수 있다. 예를 들면, 덱스트린의 일부가 용해되지 않는다고 하더라도 약간 용해된 덱스트린은 반응을 출발하게 한다. 효소 반응이 진행됨에 따라 용해되지 않은 덱스트린이 점점 용해되고 이는 반응이 더 진행되도록 한다. 유사하게, 페놀 유도체의 일부가 용해되지 않을지라도 효소반응이 진행됨에 따라 용해되지 않은 페놀 유도체가 점점 용해되고 이는 반응을 더 진행시킨다.

효소가 네오풀룰라나아제이면, 반응시스템의 pH는 바람직하게는 약 4.0 내지 약 8.0이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 5.0 내지 약 7.5이며, 보다 더 바람직하게는 5.5 내지 7.0이다. 온도는 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 80℃이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 60℃이며, 보다 더 바람직하게는 약 40℃이다. 반응시간은 바람직하게는 약 1 내지 100 시간, 더 바람직하게는 약 1 내지 50시간, 보다 더 바람직하게는 약 16시간이다. 페놀 유도체의 농도는 바람직하게는 약 0.1중량% 내지 약 50중량%, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는 것의 용이함 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 1 내지 약 20중량%, 보다 더 바람직하게는 약 1 내지 약 5중량%이다. 당의 농도는 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 70중량%, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는 것의 용이함 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 20중량%, 보다 더 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 10중량%이다.

사용되는 효소의 양은 반응시간과 기질 농도의 관계에 의해 결정되어진다. 전형적으로, 효소의 양은 반응이 약 1시간 내지 약 72시간에 종결되도록 선택되어지는 것이 바람직하다. 사용되는 효소의 양은 기질의 1g당 약 50 내지 10,000단위인 것이 일반적으로 바람직하다.

효소가 시클로말토덱스트리나아제이면, 반응시스템의 pH는 바람직하게는 약 4.0 내지 약 8.0이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 5.0 내지 약 7.5이며, 보다 더 바람직하게는 6.0 내지 7.0이다. 온도는 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 80℃이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 60℃이며, 보다 더 바람직하게는 약 40℃이다. 반응시간은 바람직하게는 약 1 내지 100 시간, 더 바람직하게는 약 1 내지 50시간, 보다 더 바람직하게는 약 16시간이다. 페놀 유도체의 농도는 바람직하게는 약 0.1중량% 내지 약 50중량%, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는것의 용이함 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 1 내지 약 20중량%, 보다 더 바람직하게는 약 1 내지 약 5중량%이다. 당의 농도는 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 70중량%, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는것의 용이함 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 20중량%, 보다 더 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 10중량%이다. 사용되는 효소의 양은 반응시간과 기질 농도의 관계에 의해 결정되어진다. 전형적으로, 효소의 양은 반응이 약 1시간 내지 약 72시간에 종결되도록 선택되어지는 것이 바람직하다. 사용되는 효소의 양은 기질의 1g당 약 50 내지 10,000단위인 것이 일반적으로 바람직하다.

효소가 말토제닉 α-아밀라아제이면, 반응시스템의 pH는 바람직하게는 약 4.0 내지 약 8.0이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 5.0 내지 약 7.5이며, 보다 더 바람직하게는 5.5 내지 7.0이다. 온도는 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 80℃이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 60℃이며, 보다 더 바람직하게는 약 40℃이다. 반응시간은 바람직하게는 약 1 내지 100 시간, 더 바람직하게는 약 1 내지 50시간, 보다 더 바람직하게는 약 16시간이다. 페놀 유도체의 농도는 바람직하게는 약 0.1중량% 내지 약 50중량%, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는것의 용이함 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 20중량%, 보다 더 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 5중량%이다. 당의 농도는 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 70중량%, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는것의 용이함 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 20중량%, 보다 더 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 10중량%이다. 사용되는 효소의 양은 반응시간과 기질 농도와의 관계에 의해 결정되어진다. 전형적으로, 효소의 양은 반응이 약 1시간 내지 약 72시간에 종결되도록 선택되어지는 것이 바람직하다. 사용되는 효소의 양은 기질의 1g당 약 50 내지 10,000단위인 것이 일반적으로 바람직하다.

효소가 사이클로텍스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제이면, 반응시스템의 pH는 일반적으로 약 3.0 내지 약 11.0이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 바람직하게는 약 4.0 내지 약 7.0이고, 더 바람직하게는 약 4.0 내지 약 6.5이다. 온도는 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 80℃이고, 반응률, 효율, 효소 안정성 등의 관점에서, 더 바람직하게는 약 30℃ 내지 60℃이다. 반응시간은 일반적으로 약 3 내지 72시간이고, 바람직하게는 약 10 내지 24 시간, 더 바람직하게는 약 16시간이다. 페놀 유도체의 농도는 일반적으로 약 1중량% 내지 약 40중량%이고, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는것의 용이함 등의 관점에서, 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 40중량%, 더 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 20중량%이다. 당의 농도는 일반적으로 약 1중량% 내지 약 50중량%, 반응률, 효율, 기질 용액을 취급하는것의 용이함 등의 관점에서, 바람직하게는 약 10중량% 내지 약 50중량%이다. 사용되는 효소의 양은 반응시간과 기질 농도의 관계에 의해 결정되어진다. 전형적으로, 효소의 양은 반응이 약 10시간 내지 약 24시간에 종결되도록 선택되어지는 것이 바람직하다. 사용되는 효소의 양은 기질의 1g당 약 10 내지 10,000단위인 것이 일반적으로 바람직하다.

(생성물의 단리 및 정제)

상기한 반응에 의해 얻어진 페놀 유도체 배당체는 당해 기술분야의 기술자에게 공지된 단리 방법에 의해 단리되고 정제된다. 예를 들면, 정제는 다양한 용매(예: 메탄올 및 에탄올)를 사용하는 분배와 크로마토그래피(예: 겔 여과 크로마토그래피 및 HPLC) 각각이나 이들의 조합을 사용함으로써 성취된다.

상기 반응에 의해 얻어지는 페놀 유도체 배당체는 이온 교환 수지를 사용하는 크로마토그래피에 의해 바람직하게 정제된다. 이온교환수지는 양이온 교환수지이거나 음이온 교환 수지이다. 양이온 교환 수지가 더 바람직하다. 이는 양이온 교환수지 또는 금속(예: 칼슘, 납, 아연 및 나트륨) 또는 음이온 교환 수지에 결합된 수소와 페놀 유도체 사이의 상호작용 또는 음이온 교환 수지의 일부 또는 전체와 페놀 유도체 배당체 사이의 상호작용이 페놀 유도체의 배당화에 의해 변하기 때문이다. 음이온 교환 수지의 일부 또는 전체와 페놀 유도체 배당체사이의 상호작용은 아마도 수지 전체와 페놀 유도체 배당체사이의 소수성 작용에 기초되어지는 것으로 여겨진다. 양이온 교환 수지나 음이온 교환 수지를 사용하는 크로마토그래피가 정제를 위해 사용된다면 배당체는 단일 단계에 의해 정제될 수 있다.

페놀 유도체 배당체로부터 페놀 유도체를 분리할 수 있는 것이라면 어떠한 양이온 교환 수지라도 사용할 수 있다. 양이온 교환 수지의 예로는 상업적으로 입수할 수 있는 DIAION SK1B, DIAION SK104, DIAION SK110, DIAION PK208, DIAION PK212, DIAION PK216, DIAION UBK530 및 DIAION UBK550(미츠비시 화학주식회사에 의해 제조); 및 CR-1310, CR-1320, 암베르라이트(Amberlite) IR120B, 암베르라이트 200CT 및 IRC50(올가노 코포레이션에 의해 제조)을 포함한다.

페놀 유도체 배당체로부터 페놀 유도체를 분리할 수 잇는 것이라면 어떠한 음이온 교환 수지라도 사용할 수 있다. 음이온 교환 수지의 예로는 상업적으로 입수할 수 있는 PA412, WA-30 및 PA-308(미츠비시 화학 주식회사에 의해 제조) 뿐만 아니라 IRA96SB, IRA910CT, XT6050RF 및 IRA900(올가노 코포레이션에 의해 제조)을 포함한다. 예를 들면, 음이온 교환을 억제하기 위해서 Cl형, 아세트산형, 탄산형 또는 질산형으로 전환되도록 미리처리된 스티렌계 음이온 교환 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 음이온 교환 수지는 Cl형으로 전환되도록 미리처리된 스티렌계 음이온 교환수지이다.

양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지를 사용하는 크로마토그래피에 의해 페놀 유도체 배당체, 부산물로서 당(예: 이소말토-올리고당) 및 미반응 페놀 유도체를 각각 별개의 분획에서 회수할 수 있다. 그러므로, 이 분획된 물질은 효과적으로 재사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 연속적으로 정제를 수행할 수 있는 의사 이동층 칼럼 크로마토그래피(simulated moving bed colum chromatography)가 임의로 수행될 수 있다.

(페놀 유도체 배당체의 용도)

본 발명의 방법에 의해 얻어진 페놀 유도체 배당체는 페놀 유도체에 대한 치환체로서 다양한 용도로 사용되어진다. 특히 이 페놀 유도체 배당체는 음식 및 음료 조성물, 식품첨가 조성물, 주입액, 접착 조성물, 전분용 노화방지제, 경구 조성물, 의약품, 의약부외품 및 화장품에서 사용되어진다. 이러한 용도에서 페놀 유도체 배당체는 개별적 사용에 적당한 농도로 사용된다.

(제조 실시예 1: 시클로말토덱스트리나아제의 제조)

알칼로필릭 바실러스 sp. 주 A2-5a(기탁 번호: FERM-P-13864)의 염색체를 통 상적인 방법을 사용하여 제조하였다. 알칼로필릭 바실러스 sp. 주 A2-5a의 시클로말토덱스트리나아제의 공표된 염기 서열(DBJ/EMBL/GenBank: AB015670)에 기초하여 다음 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적으로 사용하는 방법에 의해 합성하였고 PCR 프라이머로 사용하였다. PCR 프라이머의 서열은 다음과 같다.

NP6N-NCO: TGGCCATGGTAAAAGAAGCGATTTA; 및

NP6N-KPN: TTCGGTACCTTAAATCACCTTTATAACACC.

제조된 염색체 및 프라이머를 PCR을 행하는데 사용하였다(1분동안 94℃ 이어서 0.5분동안 94℃, 1분동안 50℃ 및 2분동안 72℃의 30 회반복). 그 결과, 시클로말토덱스트리나아제 유전자의 분절이 증폭되었다.

증폭된 유전자 분절은 제한효소 NcoI 및 KpnI로 절단하였고, 결과 얻어진 분절은 동일한 효소로 미리 절단된 벡터 pKK388-1(클론테크에 의해 제조)로 연결되어 재조합 플라스미드 pNPR63을 얻었다. 이 플라스미드를 E. coli 주 TG-1(아메르샴 팔마시아 바이오테크에 의해 제조)에 통상 사용하는 방법으로 도입하였다. 그리하여, 알칼로필릭 바실러스 sp. 주 A2-5a의 시클로말토덱스트리나아제 유전자를 갖는 재조합 TG-1을 얻었다.

결과 얻어진 재조합 주 TG-1 0.01g을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 L 배지(1.0% 트립톤, 0.5% 효모추출물 및 0.5% NaCl)의 10㎖와 혼합한 다음 37℃에서 진탕하면서 밤새도록 배양하여 전배양을 얻었다.

이 전배양 10㎖를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 테리픽(Terrific) 배지(라이프 테크날러지 오리엔탈, 인크.에 의해 제조)의 1 리터를 함유하는 2-리터 사카구 치(Sakaguchi) 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 인큐베이터 셰이커에서 37℃로 3시간동안 진탕하였다. 그런 다음 인큐베이터 셰이커의 설정온도를 15℃로 변경하였고 플라스크를 15℃에서 30분동안 진탕하였다. 그런 다음, 이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPGP, 와코 퓨어 케미칼 인터스트리, 리미티드에 의해 제조)를 플라스크에 첨가하여 최종 농도가 0.1mM이 되게 한 다음 15℃에서 20시간동안 더 진탕하였다.

그런다음, 결과 얻어진 생성물을 10,000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 박테리아를 회수하였다. 얻어진 박테리아를 10mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.5, 이하 완충용액 ML이라 함) 50㎖에 현탁시켰다. 이 현탁액을 음파처리하여 박테리아를 파괴시켰다. 그런 다음 생성물을 10,000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 불용성 세포 잔해를 제거하였고 그 결과 조 효소 용액을 얻었다.

황산암모늄을 70% 포화 농도로 조 효소 용액에 첨가하여 시클로말토덱스트리나아제를 침전시켰다. 시클로말토덱스트리나아제 침전을 약 20㎖의 완충용액 ML에 현탁시켰다. 그런 다음, 현탁액을 완충용액 ML에서 투석시켰고 완충용액은 3일동안 하루에 한번 바꿔주었다.

투석후, 현탁액을 완충용액 ML로 평형을 맞춘 Q-세파로오스 칼럼(아메르샴 팔마시아 바이오테크에 의해 제조)에 채웠다. 이 칼럼을 0.2M NaCl을 함유하는 완충용액 ML로 씻은 다음 0.4M NaCl을 함유하는 완충용액 ML을 흘려주어 시클로말토덱스트리나아제를 용리시켰다.

결과생성된 활성 분획을 3일동안 하루에 한번 완충용액을 바꿔주면서 완충용 액 ML로 투석하였다. 투석 후, 용액을 완충용액 ML로 평형을 맞춘 리소스 Q 칼럼(아메르샴 팔마시아 바이오테크에 의해 제조)에 채웠다. 이 칼럼을 0.2M NaCl을 함유하는 완충용액 ML로 씻었다. 그런 다음, 완충용액의 NaCl 농도를 0.4M까지 직선적으로 증가시킴으로써 용리시켰다. 결과생성된 활성 분획을 3일동안 하루에 한번 완충용액을 바꿔주면서 완충용액 ML로 투석하여 정제된 시클로말토덱스트리나아제 용액을 얻었다.

(제조실시예 2: 말토제닉 α-아밀라아제)

바실러스 리케니포르미스 주 ATCC27811의 염색제를 통상 사용하는 방법에 의해 제조하였다. 바실러스 리케니포르미스 주 ATCC27811의 말토제닉 α-아밀라아제의 공표된 염기서열(BLMA유전자라고 함, Kim, I.C. 등, J.Biol.Chem., 267, 11108-22114(1992))을 기초로하여 다음 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적으로 사용하는 방법에 의해 합성하였고 PCR 프라이머로 사용하였다. PCR 프라이머의 서열은 다음과 같다.

NP4N-NDE: TGGCATATGATCGAATTAGCAGCGATAC; 및

NP4N-ECO: CTTGAATTCTTAACAGAATTTAGACCGC.

제조된 염색체 및 프라이머를 PCR을 행하는데 사용하였다(1분동안 94℃ 이어서 0.5분동안 94℃, 1분동안 50℃ 및 2분동안 72℃의 30회 반복). 그 결과, 말토제닉 α-아밀라아제 유전자의 분절이 증폭되었다.

증폭된 유전자 분절은 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단하였고, 결과 얻어진 분절은 동일한 효소로 미리 절단된 벡터 pGEX-Nde2로 연결되어 재조합 플라스미드 pNPR63을 얻었다. pGEX-Nde2는 네개의 염기 CTGA가 DNA 중합효소를 사용하여 테라다 등, Applied and Environmental Microbiology, 165:910-915(1999)에 기재된 pGEX-Nde의 독특한 XbaI 제한 효소 난할부위에 도입되어진 플라스미드이다. 이 플라스미드를 E. coli 주 TG-1(아메르샴 팔마시아 바이오테크에 의해 제조)에 통상 사용하는 방법으로 도입하였다. 그리하여, 바실러스 리케니포르미스 주 ATCC27811의 말토제닉 α-아밀라아제 유전자를 갖는 재조합 주 TG-1을 얻었다.

재조합 주 TG-1 0.01g을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 L 배지의 10㎖와 혼합한 다음 37℃에서 진탕하면서 밤새도록 배양하여 전배양을 얻었다.

이 전배양 10㎖를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 테리픽 배지(라이프 테크날러지 오리엔탈, 인크.에 의해 제조)의 1리터를 함유하는 2-리터 사카구치(Sakaguchi) 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 인큐베이터 셰이커에서 37℃로 3시간동안 진탕하였다. 그런 다음 인큐베이터 셰이커의 설정온도를 15℃로 변경하였고 플라스크를 15℃에서 30분동안 진탕하였다. 그런 다음, 이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPGP, 와코 퓨어 케미칼 인터스트리, 리미티드에 의해 제조)를 플라스크에 첨가하여 최종 농도가 0.1mM이 되게 한 다음 15℃에서 20시간동안 더 진탕하였다.

그런다음, 생성물을 10,000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 박테리아를 회수하였다. 얻어진 박테리아를 10mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.5, 이하 완충용액 ML이라 함) 50㎖에 현탁시켰다. 이 현탁액을 음파처리하여 박테리아를 파괴시켰다. 그런 다음 생성물을 10,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 불용성 세포 잔해를 제거 하였고 그 결과 조 효소 용액을 얻었다.

황산암모늄을 70% 포화 농도로 조 효소 용액에 첨가하여 말토제닉 α-아밀라아제를 침전시켰다. 말토제닉 α-아밀라아제 침전을 약 20㎖의 완충용액 ML에 현탁시켰다. 그런 다음, 현탁액을 완충용액 ML에서 투석시켰고 완충용액은 3일동안 하루에 한번 바꿔주었다.

투석후, 현탁액을 완충용액 ML로 평형을 맞춘 Q-세파로오스 칼럼(아메르샴 팔마시아 바이오테크에 의해 제조)에 채웠다. 이 칼럼을 0.4M NaCl을 함유하는 완충용액 ML로 씻은 다음 0.1M NaCl을 함유하는 완충용액 ML을 흘려주어 말토제닉 α-아밀라아제를 용리시켰다.

결과생성된 활성 분획을 3일동안 하루에 한번 완충용액을 바꿔주면서 완충용액 ML로 투석하여 정제된 말토제닉 α-아밀라아제를 얻었다.

(실시예 1: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리, 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 10중량%의 히드로퀴논과 20중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 60 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 10㎖를 첨가하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140를 사용하여 제조하였다. 혼합물을 18시간동안 40℃에서 반응시켰다. 그런다음 3배 부피의 에틸 아세테이트를 반응생성물에 첨가한 후 용기를 강하게 진탕하여 효소반응을 억 제시켰다. 그런 다음, 반응 생성물을 실온에 30분동안 방치한 후 이어서 수성 상 분획(즉, 아래층)을 회수하였다. 이 과정을 3번 수행하여 미반응 히드로퀴논을 완전히 제거하였다. 얻어진 수성 상 분획을 진공건조하여 샘플을 얻었다.

샘플을 정제된 물 10㎖에 녹여 샘플 용액을 얻었다. 이 샘플용액을 정제된 물로 평형을 맞춘 활성 목탄 칼럼(와코 퓨어 케미칼 인더스트리, 리미티드)에 적용하여 배당체를 활성 목탄 칼럼에 흡수되도록 하였다. 그런 다음 20% 메탄올 수용액 200㎖를 사용하여 활성 목탄 칼럼에 흡수된 미반응 당을 용리시켰다. 그런 다음, 100% 메탄올 300㎖를 사용하여 배당체를 용리시켰다. 배당체를 함유하는 100% 메탄올 분획을 진공 건조하였다. 잔여물은 다시 정제된 물에 용해시켜 동결건조시켰다. 이 방법으로 약 250㎎의 흰색 분말을 얻었다.

이 분말 1㎎과 α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조)의 20단위를 인산염 완충용액(pH 7.0)에 용해시켜 용액을 얻었다. 이 용액을 4시간동안 40℃에서 인큐베이트하였다. 인큐베이션후에 용액을 이동상으로 pH를 2.5로 조정한 10% 메탄올 수용액을 사용하는 ODS 칼럼 RP-18(머크 제조)을 사용하는 HPLC에 적용하였다.용출액의 각 분획의 흡광도는 히드로퀴논 배당체를 검출하기 위하여 280㎚에서 측정하였다. 그 결과, 히드로퀴논 모노배당체의 피크는 완전히 사라졌고 히드로퀴논의 새로운 피크가 나타났다. 따라서, 결과 얻어진 분말이 글루코오스가 α-결합으로 히드로퀴논에 연결되어진 배당체(히드로퀴논 모노글루코시드)였다는 것을 발견하였다.

또한, 히드로퀴논 모노글루코시드의 구조를 NMR(JEOL 제조 JNM-GX270)로 확 인하였고 상기한 결과와 유사한 결과를 확인하였다.

그 결과, 결과 생성된 히드로퀴논 모노글루코시드의 순도가 96%임을 발견하였다.

(실시예 2: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리, 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 10중량%의 히드로퀴논과 40중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 60 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 10㎖를 첨가하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140를 사용하여 제조하였다. 니시무라 등의 J.Ferment.Bioeng., 71, 26(1996)에 기재된 방법을 사용하여 효소 용액이 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는다는 것을 확인하였다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런다음 반응 생성물을 세파덱스 G-15를 사용하는 겔 여과시켜 약 800㎎의 히드로퀴논 배당체를 얻었다(순도 90%).

(실시예 3: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리, 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 5중량%의 히드로퀴논과 5중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 60 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 10㎖를 첨가하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 바실러스 스테아로써모필러스 TRS40를 사용하여 Journal of Bacteriology, Vol. 170, p.1554, 1988에 기재된 방법에 의해 제조되어졌다. 이 혼합물을 40℃에서 반응시켰다. 혼합물 2중량%와 네오풀룰라나아제 30단위에 상응하는 말토펜타오스를 반응시작 후 3, 8 및 12시간에 혼합물에 첨가하였고 반응은 총 24시간동안 수행되었다.

그런다음 반응 생성물을 세파덱스 G-15를 사용하는 겔 여과시켜 약 100㎎의 히드로퀴논 배당체를 얻었다(순도 85%).

겔 여과에서, 히드로퀴논 배당체를 함유하는 것과 다른 분획은 당을 함유하였다. 이 당-함유 분획에 함유된 당의 약 60%가 이소말토-올리고당이었다.

(실시예 4: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리, 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 5중량%의 히드로퀴논과 50중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 10 단위의 시클로말토덱스트리나아제를 함유하는 효소 용액 5㎖를 첨가하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 제조실시예 1에서 얻어진 알칼로필릭 바실러스 sp. A2-5a-유래 효소용액이었다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런다음 반응 생성물을 세파덱스 G-10를 사용하는 겔 여과시켜 약 50㎎의 히드로퀴논 배당체를 얻었다(순도 85%).

겔 여과에서, 히드로퀴논 배당체를 함유하는 것과 다른 분획은 당을 함유하였다. 이 당-함유 분획에 함유된 당의 약 50%가 이소말토-올리고당이었다.

(실시예 5: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리, 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 3중량%의 히드로퀴논과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 10 단위의 말토제닉 α-아밀라아제 효소 용액 10㎖를 첨가하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 실시예 2에서 얻어진 바실러스 리케니포르미스 ATCC27811 유래된 효소용액이었다. 반응 혼합물 1중량%에 상응하는 히드로퀴논, 반응혼합물 1중량%에 상응하는 말토펜타오스 및 말토제닉 α-아밀라아제의 10 단위를 매 3시간마다 혼합물에 첨가하였고 반응은 24시간동안 40℃에서 수행되었다.

그런 다음, 반응 생성물을 세파덱스 G-15를 사용하는 겔 여과시켜 약 30㎎의 히드로퀴논 배당체를 얻었다(순도 80%).

겔 여과에서, 히드로퀴논 배당체를 함유하는 것과 다른 분획은 당을 함유하였다. 이 당-함유 분획에 함유된 당의 약 50%가 이소말토-올리고당이었다.

(실시예 6: 카테킨-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

카테킨(푸나코시 코., 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 2중량%의 카테킨과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 1㎖에 효 소 활성 10 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 1㎖를 첨가하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC에는 ODS 칼럼 RP-18을 사용하였고 아세토니트릴/에틸아세테이트/0.05% 인산이 12/2/86으로 용리시켰다. 생성물을 280㎚에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 그 결과, 미반응 카테킨외에 카테킨 피크가 새롭게 관찰되었다.

또한, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조)의 40 효소 활성 단위를 반응 생성물의 2㎖에 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 40℃에서 반응시켰다. α-글루코시드 가수분해효소는 비환원성 말단에 존재하는 α-D-글루코시드를 가수분해하는 효소이다. 그런 다음 반응 생성물을 상기한 바와 동일한 방법으로 HPLC에 의해 분석하였다. 그 결과, 카테킨 배당체의 피크가 사라지고, α-글루코시드 가수분해효소 처리 전의 반응 생성물의 피크와 비교하면 미반응 카테킨의 피크가 증가하였다. 그 결과, 카테킨 배당체가 글루코오스가 α-D-글루코시드 결합으로 카테킨에 연결되어진 화합물임을 확인할 수 있었다. 반응의 당 전이율은 약 28%였다.

반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 양이온 교환수지(미츠비시 화학주식회사 제조; DIAION UBK530)로 분획하였다. 그 결과 정제된 카테킨 배당체(5㎎)를 얻었다(순도 70%).

(실시예 7: 에피갈로카테킨-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

에피갈로카테킨(푸나코시 코., 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 2중량%의 에피갈로카테킨과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 1㎖에 효소 활성 10 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 1㎖를 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC에는 ODS 칼럼 RP-18을 사용하였고 아세토니트릴/에틸아세테이트/0.05% 인산이 12/2/86으로 용리시켰다. 생성물을 280㎚에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 그 결과, 미반응 에피갈로카테킨외에 에피갈로카테킨 배당체 피크가 새롭게 관찰되었다.

또한, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조)의 40 효소 활성 단위를 반응 생성물의 2㎖에 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 40℃에서 반응시켰다. 그런 다음 반응 생성물을 상기한 바와 동일한 방법으로 HPLC에 의해 분석하였다. 그 결과, 에피갈로카테킨 배당체의 피크가 사라지고, α-글루코시드 가수분해효소 처리 전의 반응 생성물의 피크와 비교하면 미반응 에피갈로카테킨의 피크가 증가하였다. 그 결과, 에피갈로카테킨 배당체는 글루코오스가 α-D-글루코시드 결합으로 에피갈로카테킨에 연결되어진 화합물임을 확인할 수 있었다. 반응의 당 전이율은 약 20%였다.

반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 양이온 교환수지(미츠비시 화학주 식회사 제조; DIAION UBK530)로 분획하였다. 그 결과 정제된 에피갈로카테킨 배당체(7㎎)을 얻었다(순도 70%).

(실시예 8: 에피카테킨 갈레이트-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

에피카테킨 갈레이트(푸나코시 코., 리미티드 제조)와 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 2중량%의 에피카테킨 갈레이트와 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 1㎖에 효소 활성 20 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 1㎖를 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC에는 ODS 칼럼 RP-18을 사용하였고 아세토니트릴/에틸아세테이트/0.05% 인산이 12/2/86으로 용리시켰다. 생성물을 280㎚에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 그 결과, 미반응 에피카테킨 갈레이트외에 에피카테킨 갈레이트 배당체 피크를 새롭게 관찰하였다.

또한, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조)의 40 효소 활성 단위를 반응 생성물의 2㎖에 첨가하였다. 혼합물을 6시간동안 40℃에서 반응시켰다. 그런 다음 반응 생성물을 상기한 바와 동일한 방법으로 HPLC에 의해 분석하였다. 그 결과, 에피카테킨 갈레이트 배당체의 피크가 사라지고, α-글루코시드 가수분해효소 처리 전의 반응 생성물의 피크와 비교하면 미반응 에피카테킨 갈레이트의 피크가 증가하였다. 그 결과, 에피카테킨 갈레이트 배당체는 글루코오스가 α-D-글루코시드 결합 으로 에피카테킨 갈레이트에 연결되어진 화합물임을 확인할 수 있었다. 반응의 당전이율은 약 20%였다.

반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 양이온 교환수지(미츠비시 화학주식회사 제조; DIAION SK1B)로 분획하였다. 그 결과 정제된 에피카테킨 갈레이트 배당체(8㎎)을 얻었다(순도 70%).

(실시예 9: 3,4-디메톡시페놀-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

3,4-디메톡시페놀(시그마 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 2중량%의 3,4-디메톡시페놀과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 1㎖에 아밀라아제 활성 15 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 1㎖를 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC에는 ODS 칼럼 RP-18을 사용하였고 25% 메탄올 수용액으로 용리시켰다. 생성물을 280㎚에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 그 결과, 미반응 3,4-디메톡시 페놀 외에 3,4-디메톡시 페놀 배당체 피크를 새롭게 관찰하였다.

또한, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조)의 40 효소 활성 단위를 반응 생성물의 2㎖에 첨가하였다. 혼합물을 4시간동안 40℃에서 반응시켰다. 그런 다음, 반응 생성물을 상기한 바와 동일한 방법으로 HPLC에 의해 분석하였다. 그 결 과, 3,4-디메톡시 페놀 배당체의 피크가 사라지고, α-글루코시드 가수분해효소 처리 전의 반응 생성물의 피크와 비교하면 미반응 3,4-디메톡시 페놀의 피크가 증가하였다. 그 결과, 3,4-디메톡시 페놀 배당체는 글루코오스가 α-D-글루코시드 결합으로 3,4-디메톡시 페놀에 연결되어진 화합물임을 확인할 수 있었다. 반응의 당 전이율은 약 12%였다.

반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 양이온 교환수지(미츠비시 화학주식회사 제조; DIAION UBK530)로 분획하였다. 그 결과 정제된 3,4-디메톡시 페놀 배당체(2㎎)을 얻었다(순도 90%).

(실시예 10: 3,5-디메톡시 페놀-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

3,5-디메톡시페놀(시그마 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 2중량%의 3,5-디메톡시페놀과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 1㎖에 아밀라아제 활성 15 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 1㎖를 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC에는 ODS 칼럼 RP-18을 사용하였고 25% 메탄올 수용액으로 용리시켰다. 생성물을 280㎚에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 그 결과, 미반응 3,5-디메톡시 페놀 외에 3,5-디메톡시 페놀 배당체 피크를 새롭게 관찰하였다.

또한, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조)의 40 효소 활성 단위를 반응 생성물의 2㎖에 첨가하였다. 혼합물을 4시간동안 40℃에서 반응시켰다. 그런 다음, 반응 생성물을 상기한 바와 동일한 방법으로 HPLC에 의해 분석하였다. 그 결과, 3,5-디메톡시 페놀 배당체의 피크가 사라지고, α-글루코시드 가수분해효소 처리 전의 반응 생성물의 피크와 비교하면 미반응 3,5-디메톡시 페놀의 피크가 증가하였다. 그 결과, 3,5-디메톡시 페놀 배당체는 글루코오스가 α-D-글루코시드 결합으로 3,5-디메톡시 페놀에 연결되어진 화합물임을 확인할 수 있었다. 반응의 당전이율은 약 18%였다.

반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 양이온 교환수지(미츠비시 화학주식회사 제조; DIAION UBK530)로 분획하였다. 그 결과 정제된 3,5-디메톡시 페놀 배당체(4㎎)을 얻었다(순도 90%).

(실시예 11: 아세트아미노펜-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

아세트아미노펜(시그마 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 2중량%의 아세트아미노펜과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 1㎖에 아밀라아제 활성 10 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액 1㎖를 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 16시간동안 40℃에서 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC에는 ODS 칼럼 RP- 18을 사용하였고 25% 메탄올 수용액으로 용리시켰다. 생성물을 280㎚에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 그 결과, 미반응 아세트아미노펜과는 다른 아세트아미노펜 배당체 피크를 새롭게 관찰하였다.

또한, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조)의 40 효소 활성 단위를 반응 생성물의 2㎖에 첨가하였다. 혼합물을 4시간동안 40℃에서 반응시켰다. α-글루코시드 가수분해효소는 비환원 말단에 존재하는 α-D-글루코시드 결합을 가수분해하는 효소이다. 그런 다음, 반응 생성물을 상기한 바와 동일한 방법으로 HPLC에 의해 분석하였다. 그 결과, α-글루코시드 가수분해효소 처리 전의 반응 생성물의 피크와 비교하면 아세트아미노펜 배당체의 피크가 사라지고 미반응 아세트아미노펜의 피크가 증가하였다. 그 결과, 아세트아미노펜 배당체는 글루코오스가 α-D-글루코시드 결합으로 아세트아미노펜에 연결되어진 화합물임을 확인할 수 있었다. 반응의 당전이율은 약 5%였다.

반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 양이온 교환수지(미츠비시 화학주식회사 제조; DIAION UBK530)로 분획하였다. 그 결과 정제된 아세트아미노펜 배당체(1㎎)를 얻었다(순도 85%).

(실시예 12: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 10중량%의 히드로퀴논과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 30 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 분말을 첨가하여 혼합물을 얻었다. 이 분말은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 40℃에서 반응시켜 여기에 1g의 말토펜타오스 및 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 30단위를 호합물의 중량을 기준으로하여 반응 시작 후 3, 9 및 15시간에 더 첨가하였다. 반응은 총 19시간동안 수행되었다.

그런 다음, 반응 생성물을 세파덱스 G-25를 사용하는 겔 여과시켜 히드로퀴논 모노배당체 약 600㎎을 얻었다(순도 96%).

(실시예 13: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 전분 분해물(매츠타니 화학 공업주식회사 제조; PINE-DEX 1)을 물에 용해시켜 15중량%의 히드로퀴논과 40중량%의 전분 분해물을 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 30 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 분말을 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 분말은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 40℃에서 20시간동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 미츠비시 케미칼 코포레이션에 의해 제조된 DIAION UBK530으로 분획화하여 히드로퀴논 모노글루코시드를 함유하는 분획을 얻었다. 이 분획을 DIAION PA308을 통과시켜 탈색시켰다. 그 결과 약 1g의 히드로퀴논 모노배당체를 얻었다(순도 95%).

(실시예 14: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 대규모 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 전분 분해물(매츠타니 화학 공업주식회사 제조; PINE-DEX 100)을 물에 용해시켜 15중량%의 히드로퀴논과 40중량%의 전분 분해물을 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 30000 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 분말을 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 분말은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 40℃에서 20시간동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 미츠비시 케미칼 코포레이션에 의해 제조된 DIAION UBK530으로 모조 이동층 칼럼 크로마토그래피에 의해 연속적으로 분획화하여 히드로퀴논 모노글루코시드를 함유하는 분획을 얻었다. 이 분획을 DIAION PA308을 통과시켜 탈색시켰다. 그 결과 약 1㎏의 히드로퀴논 모노배당체를 얻었다(순도 98%).

(실시예 15: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 전분 분해물(산와 콘스타치 주식회사 제조; SUNDECK 70)을 물에 용해시켜 15중량%의 히드로퀴논과 40중량%의 전분 분해물을 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 효소 활성 30 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 분말을 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 분말은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 40℃에서 20시간동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 암베르라이트 1310Na(올가노 코포레이션 제조)로 분획화하였다. 그 결과 약 1g의 히드로퀴논 모노배당체를 얻었다(순도 96%).

(실시예 16: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 대규모 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 전분 분해물(매츠타니 화학 공업주식회사 제조; MAX 1000EX)을 물에 용해시켜 15중량%의 히드로퀴논과 40중량%의 전분 분해물을 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10리터에 효소 활성 30000 단위의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 분말을 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 분말은 오카다 등(supra)에서 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 40℃에서 20시간동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 암베르라이트 1310Na(올가노 코포레이션 제조)로 모조 이동층 크로마토그래피에 의해 연속적으로 분획화하여 히드로퀴논 모노글루코시드를 함유하는 분획을 얻었다. 그 결과 약 1㎏의 히드로퀴논 모노배당체를 얻었다(순도 94%).

(실시예 17: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 5중량%의 히드로퀴논과 50중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 20 단위의 효소 활성을 갖는 시클로말토덱스트리나아제를 함 유하는 효소 용액 5㎖를 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 제조실시예 1에서 얻은 알칼로필릭 바실러스 sp. A2-5a-유래 효소 용액이었다. 혼합물을 40℃에서 16시간동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 암베르라이트 1310Na(올가노 코포레이션 제조)로 칼럼 크로마토그래피함으로써 분획화하였다. 그 결과 약 75㎎의 히드로퀴논 배당체를 얻었다(순도 80%).

칼럼 크로마토그래피에서, 히드로퀴논 배당체를 함유하는 것과 다른 분획이 당을 함유하였다. 이 당-함유 분획에 함유된 당의 약 50%가 이소말토-올리고당이었다.

(실시예 18: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 말토펜타오스(엔수이코 슈가 리파이닝 코., 리미티드 제조)를 20mM 아세트산-Na 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 3중량%의 히드로퀴논과 10중량%의 말토펜타오스를 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10㎖에 10 단위의 효소 활성을 갖는 말토제닉 α-아밀라아제 효소 용액 10㎖를 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 효소 용액은 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology(기탁번호: FERM P-13717)에 기탁된 E.coli를 사용하여 J.Biol.Chem.267(31),22108-22114에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 이 E. coli는 써모악티노미세스 불가리스 R-47주-유래 말토제닉 α-아밀라아제에 대한 유전자를 가지고 그 말토제닉 α-아밀라아제를 발현한다. 혼합물 중량에 기초하여 2%에 상응 하는 히드로퀴논, 혼합물 중량에 기초하여 4%에 상응하는 말토펜타오스 및 말토제닉 α-아밀라아제의 10 효소 활성 단위를 매 3시간마다 혼합물에 첨가하였고 이 반응은 총 24시간 동안 40℃에서 수행하였다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 암베르라이트 1310Na(올가노 코포레이션 제조)로 칼럼 크로마토그래피함으로써 분획화하였다. 그 결과 약 30㎎의 히드로퀴논 배당체를 얻었다(순도 96%).

칼럼 크로마토그래피에서, 히드로퀴논 배당체를 함유하는 것과는 다른 당을 함유하는 분획을 얻었다. 이 당-함유 분획에 함유된 당의 약 50%가 이소말토-올리고당이었다.

(실시예 19: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 전분 분해물(매츠타니 케미칼 공업주식회사; MAX 1000EX)을 물에 용해시켜 20중량%의 히드로퀴논과 50중량%의 전분 분해물을 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10리터에 50,000 단위 효소 활성의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 분말을 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 분말을 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 40℃에서 20시간동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 HCl로 평형을 맞춤으로서 Cl형으로 전환된 DIAION WA-30(미츠비시 화학주식회사 제조)으로 칼럼 크로마토그래피하여 분획화함으로써 히드로퀴논 모노글루코시드를 함유하는 분획을 얻었다. 그 결과, 약 1.2㎏의 히드로퀴논 모노배당체를 얻었다(순도 96%).

(실시예 20: 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

히드로퀴논(와코 퓨어 케미칼 인더스트리 리미티드 제조)과 전분 분해물(매츠타니 케미칼 공업주식회사 제조; MAX 1000EX)을 물에 용해시켜 20중량%의 히드로퀴논과 50중량%의 전분 분해물을 함유하는 용액을 얻었다. 이 용액 10리터에 50,000 단위 효소 활성의 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 분말을 첨가한 다음 교반하여 혼합물을 얻었다. 이 분말을 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 고초균 주 IFO14140을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 40℃에서 20시간동안 반응시켰다.

그런 다음, 반응 생성물을 이동상으로 물을 사용하는 HCl로 평형을 맞춤으로서 Cl형으로 전환된 DIAION PA-412(미츠비시 화학주식회사 제조)으로 칼럼 크로마토그래피하여 분획화함으로써 히드로퀴논 모노글루코시드를 함유하는 분획을 얻었다. 그 결과, 약 1.0㎏의 히드로퀴논 모노배당체를 얻었다(순도 95%).

(실시예 21: 고초균 주 K02를 사용하는 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

고초균 주 IFO14140-유래 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 대신에 오카다 등(supra)에 기재된 고초균 K02로부터 유래된 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같은 방법으로 반응을 수행하였다. 효소 용액은 고초균 K02를 사용하는 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 제조되었다.

이 반응 용액에, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조) 20단위를 첨가하였고 4시간동안 40℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 이동상으로 pH 2.5로 조정된 20% 메탄올 수용액을 사용하는 ODS 칼럼 RP-18로 HPLC를 수행하였다. 대조로서, α-글루코시드 가수분해효소를 처리하지 않은 용액을 HPLC 하였다. 용출액의 각 분획의 흡광도를 280㎚에서 측정하여 히드로퀴논 배당체를 검출하였다. 그 결과, α-글루코시드 가수분해효소를 처리할 때 히드로퀴논 모노글루코시드 피크는 완전히 사라졌고 히드로퀴논의 피크는 처리되지 않은 용액과 비교하였을 때 증가하였다. 그러므로, 히드로퀴논 배당체는 또한 주 K02를 사용할 때 제조된다는 것을 발견하였다.

게다가, 히드로퀴논 글리코시의 HPLC 용리시간과 α-글루코시드 가수분해효소에 기인한 이의 분해로부터 상기 배당체는 글루코오스가 α결합을 갖는 히드로퀴논에 연결되어진 배당체임을 발견하였다.

(실시예 22: 고초균 주 K05를 사용하는 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

고초균 주 IFO14140-유래 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 대신에 오카다 등(supra)에 기재된 고초균 K05로부터 유래된 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액(효소 용액은 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 제조하였다)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같은 방법으로 반응을 수행하였다. 효소 용액은 고초균 K05를 사용하는 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 제조되었다.

이 반응 용액에, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조) 20단위를 첨가한 후 4시간동안 40℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 이동상으로 pH 2.5로 조정된 20% 메탄올 수용액을 사용하는 ODS 칼럼 RP-18(머크 제조)로 HPLC하였다. 대조로서, α-글루코시드 가수분해효소를 처리하지 않은 용액을 HPLC 하였다. 용출액의 각 분획의 흡광도를 280㎚에서 측정하여 히드로퀴논 배당체를 검출하였다. 그 결과, α-글루코시드 가수분해효소를 처리할 때 히드로퀴논 모노글루코시드 피크는 완전히 사라졌고 히드로퀴논의 피크는 처리되지 않은 용액과 비교하였을 때 증가하였다. 그러므로, 히드로퀴논 배당체는 또한 주 K05를 사용할 때 제조된다는 것을 발견하였다.

(실시예 23: 고초균 주 K12를 사용하는 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

고초균 주 IFO14140-유래 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 대신에 오카다 등(supra)에 기재된 고초균 K12로부터 유래된 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액(효소 용액은 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 제조하였다)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같은 방법으로 반응을 수행하였다. 효소 용액은 고초균 K12를 사용하는 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 제조되었다.

이 반응 용액에, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조) 20단위를 첨가한 후 4시간동안 40℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 이동상으로 pH 2.5로 조정된 20% 메탄올 수용액을 사용하는 ODS 칼럼 RP-18(머크 제조)로 HPLC하였다. 대 조로서, α-글루코시드 가수분해효소를 처리하지 않은 용액을 HPLC 하였다. 용출액의 각 분획의 흡광도를 280㎚에서 측정하여 히드로퀴논 배당체를 검출하였다. 그 결과, α-글루코시드 가수분해효소를 처리할 때 히드로퀴논 모노글루코시드 피크는 완전히 사라졌고 히드로퀴논의 피크는 처리되지 않은 용액과 비교하였을 때 증가하였다. 그러므로, 히드로퀴논 배당체는 또한 주 K12를 사용할 때 제조된다는 것을 발견하였다.

(실시예 24: 고초균 주 D11을 사용하는 히드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드의 제조)

고초균 주 IFO14140-유래 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제 대신에 오카다 등(supra)에 기재된 고초균 D11로부터 유래된 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제를 함유하는 효소 용액(효소 용액은 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 제조하였다)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같은 방법으로 반응을 수행하였다. 효소 용액은 고초균 D11을 사용하는 오카다 등(supra)에 기재된 방법에 의해 제조되었다.

이 반응 용액에, α-글루코시드 가수분해효소(토요보 제조) 20단위를 첨가한 후 4시간동안 40℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 이동상으로 pH 2.5로 조정된 20% 메탄올 수용액을 사용하는 ODS 칼럼 RP-18(머크 제조)로 HPLC하였다. 대조로서, α-글루코시드 가수분해효소를 처리하지 않은 용액을 HPLC 하였다. 용출액의 각 분획의 흡광도를 280㎚에서 측정하여 히드로퀴논 배당체를 검출하였다. 그 결과, α-글루코시드 가수분해효소를 처리할 때 히드로퀴논 모노글루코시드 피크는 완전히 사라졌고 히드로퀴논의 피크는 처리되지 않은 용액과 비교하였을 때 증가하였다. 그러므로, 히드로퀴논 배당체는 또한 주 D11을 사용할 때 제조된다는 것을 발견하였다.

본 발명은 페놀 유도체 배당체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에서, 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 또는 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 히드로퀴논, 카테킨 및 에피갈로카테킨과 같은 페놀 유도체의 α결합을 통해 당 전이를 행한다.

네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제 또는 말토제닉 α-아밀라아제가 사용되면, 이소말토-올리고당 뿐만 아니라 배당체가 동시에 얻어질 수 있다.

Claims (9)

1. 당과 페놀 유도체를 효소 존재하에 서로 반응시켜 페놀 유도체 배당체를 제조하는 단계를 포함하는 페놀 유도체 배당체의 제조방법으로서, 상기 효소가 네오풀룰라나아제, 시클로말토덱스트리나아제, 말토제닉 α-아밀라아제 및 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 효소가 네오풀룰라나아제이고, 네오풀룰라나아제는 써모악티노미세스 불가리스, 박테로이드스 테타이오타오미크론, 슈도모나스, 바실러스 폴리믹사, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모아밀로리퀴페션스 및 써머스 써모필러스로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 박테리아로부터 유래되는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 효소가 시클로말토덱스트리나아제이고, 시클로말토덱스트리나아제는 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모필러스, 바실러스 코아굴런스, 대장균, 플라보박테리움, 알칼로필릭 바실러스 및 바실러스 스패리커스로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 박테리아로부터 유래되는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 효소가 말토제닉 α-아밀라아제이고, 말토제닉 α-아밀라아제는 써모악티노미세스 불가리스, 박테로이드스 테타이오타오미크론, 슈도모나스, 바실러스 폴리믹사, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모아밀로리퀴페션스 및 써머스 써모필러스로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 박테리아로부터 유래되는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 효소가 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제이고, 사이클로덱스트린 합성 능력을 갖는 당화형 아밀라아제는 고초균, 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토미세스 히그로스코피커스, 스트렙토미세스 프래콕스, 리조퍼스 델레마, 아스페르길러스 델레마 및 아스페르길러스 니거로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 박테리아로부터 유래되는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 페놀 유도체가 플라본형 화합물, 이소플라본형 화합물, 플라보놀형 화합물, 플라바논형 화합물, 플라바노놀형 화합물, 카테킨형 화합물, 오론형 화합물, 칼콘형 화합물, 디히드로칼콘형 화합물, 누룩산, 디메톡시 페놀, 아세트아미노펜, 바닐린, 히드로퀴논, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 랄레이트, 안토시아니딘형 화합물, 안토시아닌형 화합물, 카페인산, 카테콜, 레조르시놀, 프로토카테쿠산, 갈산, 레조르실산 및 플로로글루시놀로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 당이 말토-올리고당, 덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 천연 전분, 전분 분해물 및 가공 전분로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
8. 제1항에 있어서, 효소 반응 생성물을 분획하기 위해서 이온 교환 수지를 사용하는 단계를 더 포함하는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.
9. 제1항에 있어서, 효소 반응 생성물을 적어도 부산물을 함유하는 분획, 미반응 페놀 유도체를 함유하는 분획 및 페놀 유도체 배당체를 함유하는 분획으로 분획하기 위해서 이온 교환 수지를 사용하는 단계를 더 포함하는 페놀 유도체 배당체의 제조방법.