KR100647490B1 - A vector containing a chimeric enhancer element capable of specifically responding to hypoxia or other stress materials a pharmaceutical composition comprising the vector and a method of using the composition - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로모터 및 상기 프로모터의 상류에 연결되어 있는 EBS (초기 성장 반응 인자1 결합 부위), MRE (금속 반응 요소) 및 1 이상의 HRE (저산소 반응 요소)가 임의의 순서대로 조합되어 있는 키메라 인핸서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.The present invention relates to a promoter and a chimeric enhancer poly, in which any combination of EBS (initial growth response factor 1 binding site), MRE (metal response element) and one or more HRE (hypoxia response element) linked upstream of the promoter is combined. Provided are vectors comprising nucleotides.
저산소 조건, EBS, MRE, HRE, 키메라Hypoxic conditions, EBS, MRE, HRE, chimera
Description
도 1은 EBS, MRE, 3xHRE 올리고뉴클레오티드를 이용하여 본 발명의 일 구체예인 EBS-MRE-3xHRE-pGL3 벡터를 제작하는 과정을 나타내는 도면이다. 1 is a diagram illustrating a process of preparing an EBS-MRE-3xHRE-pGL3 vector, which is one embodiment of the present invention, using EBS, MRE, and 3xHRE oligonucleotides.
도 2는 지정된 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 2 is 24 hours after transient transfection of HeLa cells with the designated vector, cultured under normal oxygen condition (21% O 2 ) or hypoxic condition (1% O 2 ) for 21 hours, and analyzed for luciferase activity. It is a figure which shows.
도 3은 2 개 인핸서의 조합을 포함하는 각 지정된 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다.3 is 24 hours after transient transfection of HeLa cells with each designated vector comprising a combination of two enhancers, and cultured under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours. Is a diagram showing the results of the assay for luciferase activity.
도 4a는 3 개 인핸서의 조합을 포함하는 벡터 및 다른 지정된 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다.FIG. 4A shows 24 hours of transient transfection of HeLa cells with a vector comprising a combination of three enhancers and another designated vector, under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours. It is a figure which shows the result of having cultured and analyzed about luciferase activity.
도 4b는 배열 순서를 달리하여 제작된 3개 인핸서의 조합을 포함하는 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 4B shows normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O) for 21 hours after transiently transfecting HeLa cells with a vector comprising a combination of three enhancers prepared in a different arrangement order. It is a figure which shows the result of having cultured under 2 ) and analyzed about luciferase activity.
도 5a는 E-M-H-pGL3 벡터로 C2C12 세포 및 LLC1 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 5A shows incubation under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours, 24 hours after transient transfection of C 2 C 12 cells and LLC1 cells with EMH-pGL3 vector, It is a figure which shows the result analyzed about luciferase activity.
도 5b는 SV40 프로모터 말단에 bFGF를 포함하는 E-M-H-pGL3 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, bFGF 발현량을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.5B is cultured under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours after transient transfection of HeLa cells with EMH-pGL3 vector containing bFGF at the SV40 promoter end. It is a figure which shows the result of having analyzed bFGF expression amount.
도 6은 루시퍼라제 유전자를 SV40 프로모터의 하류에 포함하는 E-M-H-pGL3 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 MnCl2 (500 μM), NiCl2 (1 mM), 데페록사민 (DFX, 260 μM) 또는 CoCl2 (300 μM)의 존재하에서 배양한 다음, 세포를 수집하여 루시퍼라제 활성을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 6 shows MnCl 2 (500 μM), NiCl 2 (1 mM), deferoxamine for 21 hours 24 hours after transient transfection of HeLa cells with an EMH-pGL3 vector comprising the luciferase gene downstream of the SV40 promoter. After culturing in the presence of (DFX, 260 μM) or CoCl 2 (300 μM), cells are collected and analyzed for luciferase activity.
도 7은 루시퍼라제 유전자를 SV40 프로모터의 하류에 포함하는 E-M-H-pGL3 벡터 및 표시된 다른 벡터로 HeLa 또는 C2C12 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 정상 산소 조건 (21 % O2) 하에서 열 충격 (43 ℃에서 30 분 동안 배양한 다음 37 ℃에서 2 시간 동안 회복), 낮은 농도의 포도당 (1 g/L, 4 시간), 낮은 pH (6.0, 4 시간) 또는 H2O2 (500 μM, 4 시간) 하에서 배양한 다음, 세포를 수집하여 루시퍼라제 활성을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 7 shows heat under normal oxygen conditions (21% O 2 ) 24 hours after transient transfection of HeLa or C 2 C 12 cells with the EMH-pGL3 vector containing the luciferase gene downstream of the SV40 promoter and other vectors indicated. Shock (incubated at 43 ° C. for 30 minutes and then recovered at 37 ° C. for 2 hours), low concentration of glucose (1 g / L, 4 hours), low pH (6.0, 4 hours) or H 2 O 2 (500 μM , 4 hours), and then the cells were collected to show the results of assaying luciferase activity.
도 8은 C57BL/6 생쥐의 앞 정강근에 본 발명의 E-M-H-pGL3 벡터를 전달한 2일 후, 한쪽 뒷다리 허혈을 좌측 다리에 도입하고 (0 일), 3일까지 혈류를 모니터링한 결과와 허혈생체조직에서의 E-M-H-pGL3 벡터의 상대적 우수성을 보여주는 도면이다.8 shows two days after delivery of the EMH-pGL3 vector of the present invention to the anterior tibialis muscle of C57BL / 6 mice, one hind limb ischemia was introduced into the left leg (day 0), and blood flow was monitored until
본 발명은 저산소 조건 및 다른 스트레스 신호 물질에 특이적으로 반응할 수 있는 키메라 인핸서 요소를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 조성물을 이용한 저산소 조건 및 다른 스트레스 신호 물질에 관련되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a vector comprising a chimeric enhancer element capable of specifically reacting to hypoxic conditions and other stress signaling substances, a pharmaceutical composition comprising the vector and a disease associated with hypoxic conditions and other stress signaling substances using the composition. It relates to a method of treating or preventing.
저산소 조건 (hypoxia)은 다양한 범위의 생리적 반응을 유도하고, 여러 인간 질병의 발생에 중요한 역할을 한다 (Guillemin K 등, Cell 1997; 89: 9-12). 많은 저산소 조건-반응성 유전자는 저산소 조건-유도성 인자 1 (HIF-1)을 포함한, 저산소 조건-반응 요소 (HRE) (hypoxia response element) 및 염기성 헬릭스-루프-헬릭스/Per-Amt-Sim (bHLH-PAS) 단백질 패밀리의 전사 인자에 의하여 조절된다. 상기 HIF-1/HRE 시스템은 저산소 조건 하에서 치료 유전자 (therapeutic gene)를 선택적으로 발현시키는데 사용될 수 있다. 다른 유전자로부터 유래한 HRE가 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템에 위치되어지는 경우, 상기 HRE는 다양한 세포 형태에서 이질적 프로모터 (heterologous promoter)에 대하여 저산소 조건 유도성을 부여한다 (Boast K 등, Hum Gene Ther 1999; 10: 2197-2208). 최근, 생쥐 포스포글리세레이트 키나제 1 (PGK1) HRE가 인 비트로 및 인 비보에서 다른 프로모터에 대하여 저산소 조건 유도성을 부여하는데 성공적으로 사용된 바 있다 (Greco O 등, Gene Ther 2002). 더욱이, 아데노바이러스 벡터의 문맥에서, 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 프로모터의 발현 수준과 비교될만한 정도의 발현 수준을 유도하기 위하여 SV40 최소 프로모터에 도입된 바 있다. Hypoxia conditions induce a wide range of physiological responses and play an important role in the development of several human diseases (Guillemin K et al., Cell 1997; 89: 9-12). Many hypoxic condition-reactive genes include hypoxic condition-response factor (HIF-1) and hypoxia response element (HRE) and basic helix-loop-helix / Per-Amt-Sim (bHLH -PAS) is regulated by transcription factors of the protein family. The HIF-1 / HRE system can be used to selectively express therapeutic genes under hypoxic conditions. When HREs derived from other genes are located in plasmid and viral vector systems, they impart hypoxic condition inducibility for heterologous promoters in various cell types (Boast K et al., Hum Gene Ther 1999; 10: 2197-2208). Recently, mouse phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) HRE has been successfully used to confer hypoxic condition inducibility for other promoters in vitro and in vivo (Greco O Et al., Gene Ther 2002). Moreover, in the context of adenovirus vectors, it has been introduced into the SV40 minimal promoter to induce an expression level comparable to that of the human cytomegalovirus (HCMV) promoter.
저산소 조건은 또한 금속 전사 인자-1 (MTF-1) 및 초기 성장 반응 인자-1 (Egr-1)과 같은 다른 전사 인자를 유도한다. 비록 저산소 조건에 있어서 MTF-1 및 Egr-1의 역할이 완전하게 알려진 것은 아니지만, 여러 보고에 의하면 저산소 조건 반응에 관여하고 있다는 것이 암시되고 있다 (Murphy BJ 등, Cancer Res 1999; 59: 1315-1322; Green CJ 등, Cancer Res 2001). MTF-1은 중금속에 반응하여 금속 반응 요소 (MRE)에 결합함으로써 표적 유전자 발현을 조절하는 진화적으로 보존된 징크 핑거 전사 인자이다 (Saydam N 등, J Biol Chem 2001; 276: 25487-25495). 상기 Egr-1은 최초에는 다양한 자극에 반응하여 빠르게 유도되는 즉시-초기 유전자 (immediate-early gene)로 알려졌다. 최근에는, 저산소 조건 및 혈관 손상에 대한 반응을 조정하는 데에 있어서 Egr-1의 역할에 대하여 중점적으로 여러 연구가 진행된 바 있다 (Yan SF 등, Nat Med 2000; 6: 1355-1361; Okada M 등, Circ Res 2002; 91: 135-142). Hypoxic conditions also induce other transcription factors such as metal transcription factor-1 (MTF-1) and early growth response factor-1 (Egr-1). Although the role of MTF-1 and Egr-1 in hypoxic conditions is not fully known, several reports suggest that they are involved in hypoxic response (Murphy BJ et al., Cancer Res 1999; 59: 1315-1322). Green CJ et al., Cancer Res 2001). MTF-1 is an evolutionarily conserved zinc finger transcription factor that regulates target gene expression by binding to metal response elements (MRE) in response to heavy metals (Saydam N et al ., J Biol Chem 2001; 276: 25487-25495). The Egr-1 was initially known as an immediate-early gene that is rapidly induced in response to various stimuli. Recently, several studies have focused on the role of Egr-1 in modulating hypoxic conditions and response to vascular damage (Yan SF et al., Nat Med 2000; 6: 1355-1361; Okada M et al. , Circ Res 2002; 91: 135-142).
저산소 조건에 있어서 MTF-1 및 Egr-1의 잠재적 역할은 상기 저산소 조건 환경에서 다른 형태의 숙주 반응 기작을 나타낼 수 있다는 점에서 중요하다. 이들 징크 핑거 전사 인자에 의하여 조절되는 표적 유전자는 HIF-1 패밀리의 제어 하에 있는 표적 유전자와는 다른 것으로 생각되고 있다. 이들 다르지만 협동적인 기작은 저산소 조건 반응의 크기를 증가시키는데 기여할 수 있다. 더욱이, 대응되는 DNA 모티프를 통하여 유전자 발현을 조절할 수 있는 대체 수단이 개발될 수 있다. 그러나, 상기 저산소 조건 반응의 상기 다른 양상을 이용하여 발현을 상승시키고 유도 경로를 다양화하기 위한 종래 노력은 제한되어 있었다. The potential role of MTF-1 and Egr-1 in hypoxic conditions is important in that they may exhibit other forms of host reaction mechanisms in such hypoxic conditions. Target genes regulated by these zinc finger transcription factors are thought to be different from target genes under the control of the HIF-1 family. These different but cooperative mechanisms may contribute to increasing the magnitude of the hypoxic response. Moreover, alternative means of regulating gene expression through corresponding DNA motifs can be developed. However, previous efforts to raise expression and diversify induction pathways using the other aspects of the hypoxic condition response have been limited.
저산소 조건 외에, 코발트, 니켈, 망간 및 철 킬레이터인 데페록사민 (DFX)과 같은 물질들이 저산소 조건 환경을 모사할 수 있어, 저산소 조건 유도에 유용할 수 있다 (Gong P 등, J Biol Chem 2001; 276: 27018-27025). 이들 저산소 조건 모사물질 (mimetics)은 세포의 산소-감지 기작 및 여러 저산소 조건-반응성 유전자를 자극하도록 하는 저산소 조건 신호 전달 경로를 이용하는 것으로 생각되고 있다 (Zhu H 등, Respir Physiol 1999; 115: 239-247.). In addition to hypoxic conditions, materials such as cobalt, nickel, manganese and iron chelator deferoxamine (DFX) can simulate hypoxic conditions and may be useful in inducing hypoxic conditions (Gong P et al ., J Biol Chem 2001 276: 27018-27025). These hypoxic mimetics are thought to utilize hypoxic signal transduction pathways that allow cells to stimulate the oxygen-sensing mechanisms of cells and to stimulate various hypoxic condition-reactive genes (Zhu H et al., Respir Physiol 1999; 115: 239-). 247.).
저산소 조건에서 유전자 발현 효율이 높고 다양한 유도 물질에 의하여 조절될 수 있는 발현 벡터는 저산소 조건에서 치료 유전자를 특이적으로 발현시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 상기 발현 벡터는 고형 암 또는 허혈 질환과 같은 질병을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.Expression vectors that are highly efficient at low oxygen conditions and that can be regulated by various inducers can be used to specifically express therapeutic genes at low oxygen conditions. Therefore, the expression vector can be usefully used to treat diseases such as solid cancer or ischemic diseases.
본 발명자들은 종래 알려진 저산소 조건 발현 벡터 보다 유도 효율이 높고 다양한 유도 물질에 의하여 조절될 수 있는 저산소 조건 반응성 벡터를 개발하고자 집중적으로 연구하던 중 본 발명의 벡터를 완성하기에 이르렀다.The present inventors came to complete the vector of the present invention while intensively researching to develop a hypoxic condition reactive vector which is higher induction efficiency than the conventionally known hypoxic condition expression vector and can be controlled by various inducers.
본 발명의 목적은 유도 효율이 높고 다양한 유도 물질에 의하여 조절될 수 있는 저산소 조건 반응성 벡터를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide low oxygen condition reactivity vectors having high induction efficiency and which can be controlled by various inducers.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the vector of the present invention.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 약제학적 조성물을 개체에 투여하여 저산소 조건에서 유전자를 특이적으로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of specifically expressing a gene in hypoxic conditions by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 약제학적 조성물을 개체에 투여하여 저산소 조건과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of treating or preventing a disease associated with hypoxic conditions by administering a pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
본 발명은 프로모터 및 상기 프로모터의 상류에 연결되어 있는 EBS (초기 성장 반응 인자1 결합 부위), MRE (금속 반응 요소) 및 1 이상의 HRE (저산소 반응 요소)가 임의의 순서대로 조합되어 있는 키메라 인핸서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. The present invention relates to a promoter and a chimeric enhancer poly, in which any combination of EBS (initial
본 발명에 있어서, 상기 EBS, MRE 및 HRE는 포유동물의 Egr-1의 프로모터 영역, 메탈로티오닌 I 및 포스포글리세레이트 키나제 I 유전자로부터 각각 유래한 것일 수 있다. 상기 포유동물에는 인간 및 생쥐가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 EBS, MRE 및 HRE는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열 중 6번 내지 14번의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 15번 내지 21번의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 6번 내지 23번의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 EBS, MRE 및 HRE는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. In the present invention, the EBS, MRE and HRE may be derived from the promoter region, metallothionine I and phosphoglycerate kinase I gene of mammalian Egr-1, respectively. Such mammals include, but are not limited to, humans and mice. EBS, MRE and HRE of the present invention is an oligonucleotide having a base sequence of 6 to 14 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2 and 3, oligonucleotide having a base sequence of 15 to 21 and 6 to 23 It includes an oligonucleotide having a nucleotide sequence. Preferably, EBS, MRE and HRE of the present invention may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively.
본 발명에 있어서, EBS, MRE 및 HRE는 임의의 순서대로 조합되어질 수 있다. 이들 조합에는 EBS-MRE-HRE, EBS-HRE-MRE, MRE-EBS-HRE, MRE-HRE-EBS, HRE-MRE-EBS 및 HRE-EBS-MRE가 포함된다. 본 발명의 벡터에 있어서, 상기 HRE는 1 이상의 카피, 바람직하게는 1 내지 7개, 더욱 바람직하게는 3 내지 5개의 카피가 연속하여 포함되어 있는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 3 카피의 HRE가 포함되어 있는 서열번호 5 내지 10 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 5 내지 10의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 각각 EBS-MRE-3xHRE, EBS-3xHRE-MRE, MRE-EBS-3xHRE, MRE-3xHRE-EBS, 3xHRE-EBS-MRE 및 3xHRE-MRE-EBS의 염기서열을 나타내는 것이다. In the present invention, EBS, MRE and HRE can be combined in any order. These combinations include EBS-MRE-HRE, EBS-HRE-MRE, MRE-EBS-HRE, MRE-HRE-EBS, HRE-MRE-EBS and HRE-EBS-MRE. In the vector of the present invention, the HRE may be one or more copies, preferably 1 to 7, and more preferably 3 to 5 copies in succession. In one embodiment of the present invention, the polynucleotide may have a base sequence of any one of SEQ ID NOs: 5 to 10 containing 3 copies of the HRE. The polynucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 10 are of EBS-MRE-3xHRE, EBS-3xHRE-MRE, MRE-EBS-3xHRE, MRE-3xHRE-EBS, 3xHRE-EBS-MRE, and 3xHRE-MRE-EBS, respectively. It shows the nucleotide sequence.
본 발명의 벡터에 있어서, EBS, MRE 및 HRE가 임의의 순서대로 조합된 상기 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있는 것이면, 종래 알려진 임의의 벡터로부터 제조되어지는 벡터가 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 벡터의 예에는, pGL3-프로모터 벡터 및 pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, 미국)가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 5 내지 10 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 11 내지 16 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것인 벡터이다. In the vector of the present invention, as long as the polynucleotide including EBS, MRE and HRE in any order is included, a vector prepared from any conventionally known vector is included. Examples of vectors into which the polynucleotide may be introduced include, but are not limited to, pGL3-promoter vectors and pcDNA3.1 (+) vectors (Invitrogen, Carlsbad, USA). In one embodiment of the present invention, the vector of the present invention is a vector having any one of SEQ ID NO: 11 to 16 including a polynucleotide having a base sequence of any one of SEQ ID NO: 5 to 10.
본 발명은 상기 EBS, MRE 및 HRE가 조합되어 이루어진 키메라 인핸서를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 유전자 재조합 분야에서 있어서, 올리고뉴클레오티드를 조작함에 있어서 제한 효소 인지 서열을 도입 또는 제거하기 위하여 일부의 서열이 제거 또는 치환될 수 있음은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 상기 EBS, MRE 및 HRE 자체가 조합된 것 뿐만 아니라, 재조합 과정에서 도입 또는 치환된 일부의 서열을 포함하면서 실질적으로 동일한 활성을 갖는 키메라 인핸서를 포함하는 벡터를 포함한다. The present invention relates to a vector comprising a chimeric enhancer formed by combining the EBS, MRE and HRE. In the field of genetic recombination, it is well known to those skilled in the art that some sequences may be removed or substituted in order to introduce or remove restriction enzyme recognition sequences in engineering oligonucleotides. Thus, the present invention includes not only the combination of the EBS, MRE and HRE itself, but also a vector comprising a chimeric enhancer having substantially the same activity, including a part of the sequence introduced or substituted in the recombination process.
본 발명에 있어서, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 발명에서 벡터는, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of delivering another nucleic acid to which it is linked. From the standpoint of nucleic acid sequences that mediate the introduction of specific genes, in the present invention, a vector is interpreted to be used interchangeably with a nucleic acid construct and a cassette. Vectors include, for example, plasmids or viral derived vectors. Plasmid refers to a circular double stranded DNA ring to which additional DNA can be linked. Vectors used in the present invention include, for example, plasmid expression vectors, viral expression vectors (eg, replication-defective retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses) and viral vectors capable of performing their equivalent functions, but are not limited to these. It is not limited to.
본 발명의 벡터에 포함되는 프로모터는 종래 알려진 임의의 프로모터가 포함된다. 상기 프로모터에는 원핵 생물, 곰팡이, 식물 및 동물에서 작용하는 프로모터가 포함될 수 있다. 상기 프로모터의 예에는, SV40 최소 프로모터 및 HCMV 프로모터가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 서열번호 17의 염기서열을 갖는 SV40 최소 프로모터이다. Promoters included in the vector of the present invention include any conventionally known promoter. The promoter may include promoters that act on prokaryotes, fungi, plants and animals. Examples of such promoters include, but are not limited to, the SV40 minimum promoter and the HCMV promoter. Preferably, the SV40 minimum promoter has a nucleotide sequence of SEQ ID NO.
본 발명의 벡터는, 상기 프로모터의 하류에 임의의 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 유전자는 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 것이며, 임의의 유전자가 포함된다. 예를 들면, 저산소 영역에서 발현되어 질병의 치료에 유용한 치료 유전자가 포함될 수 있다. 상기 치료 유전자에는 고형암에 의하여 유발되는 저산소 영역에서 발현될 수 있는, 혈관 신생 관련 유전자 및 bFGF가 될 수 있다. 그러나, 상기 치료 유전자는 질병 및 상기 유전자의 발현을 유도하는 신호 물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 상기한 예들에 한정되는 것은 아니다. The vector of the present invention may further include any gene downstream of the promoter. The gene is operably linked to the promoter and includes any gene. For example, therapeutic genes that are expressed in the hypoxic region and useful for the treatment of a disease may be included. The therapeutic gene can be angiogenesis related genes and bFGF, which can be expressed in the hypoxic region caused by solid cancer. However, the therapeutic gene may vary depending on the disease and the type of signal substance that induces the expression of the gene, and is not limited to the examples described above.
본 발명의 벡터는 저산소 조건 (hypoxia) 및 고농도의 금속이 존재하는 조건하에서 프로모터의 하류에 작동가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 특이적이고 높은 효율로 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터는 저산소 조건 및 고농도의 금속이 존재하는 조건과 관련이 있는 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 벡터에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 자극들로는 낮은 농도의 산소, 허혈 모사물질들 (예를 들면, 코발트, DFX [데페록사민], 니 켈, 망간) 그리고, 과산화수소 및 아연 등이 있다. 이들 중 코발트, DFX (데페록사민) 및 니켈은 상기 유전자의 강력한 유도물질로서 작용할 수 있으며, 과산화 수소, 망간 및 아연은 적정한 유도물질인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이런 자극 및 물질들의 적절한 조합을 통해 본 발명의 벡터에 포함된 유전자의 발현을 정밀하게 조절할 수 있다. The vectors of the present invention can induce specific and high efficiency expression of genes operably linked downstream of the promoter under hypoxia conditions and high metal concentrations. Therefore, the vector of the present invention can be usefully used to treat or prevent diseases or symptoms associated with hypoxic conditions and conditions where high concentrations of metals are present. Stimuli that can induce gene expression in the vector include low concentrations of oxygen, ischemic mimics (eg cobalt, DFX [deferoxamine], nickel, manganese), hydrogen peroxide and zinc. Of these, cobalt, DFX (deferoxamine) and nickel can act as potent inducers of the gene, while hydrogen peroxide, manganese and zinc have been found to be suitable inducers. Thus, through appropriate combination of these stimuli and substances it is possible to precisely regulate the expression of the genes included in the vector of the present invention.
본 발명은 또한 치료 유전자를 포함하는 발명의 재조합 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 저산소 조건 또는 고농도의 금속과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 질환의 예에는 고형암을 포함하는 암 및 허혈 질환이 포함된다. The invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases associated with hypoxic conditions or high concentrations of metal, comprising a recombinant vector of the invention comprising a therapeutic gene and a pharmaceutically acceptable carrier. In the present invention, examples of the disease include cancer and ischemic disease, including solid cancer.
본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 치료 유전자는 표적으로 하는 질환의 치료 또는 예방에 유용한 임의의 유전자가 될 수 있다. 이들 유전자의 예에는 암 질환에 있어서 혈관신생 유전자 및 bFGF가 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 치료 유전자는 본 발명의 상기 키메라 인핸서에 의하여 영향을 받는 프로모터의 하류에 작동가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. In the pharmaceutical composition of the present invention, the therapeutic gene may be any gene useful for the treatment or prevention of the target disease. Examples of these genes include, but are not limited to, angiogenic genes and bFGF in cancer diseases. The therapeutic gene is preferably operably linked downstream of the promoter affected by the chimeric enhancer of the present invention.
본 발명의 조성물에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한, 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다. Pharmaceutically acceptable carriers for use in the compositions of the invention include lactose, glucose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, poly Vinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like. The composition may also further include lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, and preservatives.
본 발명의 조성물은 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있으나, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 인 비트로에서 배양된 세포에 투여되고, 상기 배양된 세포를 체내에 투여함으로써 간접적으로 개체내에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.The compositions of the present invention are administered directly to the subject by any means, such as, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. It may be, but is not limited to these methods. The composition of the present invention can be administered to cells cultured in vitro and indirectly administered to the individual by administering the cultured cells in the body. The compositions of the present invention can be administered systemically or locally.
본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 액제 또는 주사제의 형태일 수 있다.The composition of the present invention can be formulated into parenteral formulations, such as oral preparations such as granules, powders, solutions, tablets, capsules or dry syrups, or injections, but is not limited to such formulations. Preferably the composition of the present invention may be in the form of a liquid or injection.
활성 성분으로서 본 발명의 벡터의 효과적인 양은 약 0.001 내지 1000 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.05 내지 500 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.5 내지 50 mg/kg 체중일 수 있으며, 단일 투여량 및 배분된 투여량으로 투여될 수 있다. 그러나, 투여되는 활성 성분의 양은 치료될 조건, 환자의 나이 및 체중, 증상의 경중과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정하여야 하기 때문에 상기한 범위에 한정되는 것은 아니다. An effective amount of a vector of the present invention as an active ingredient may be about 0.001 to 1000 mg / kg body weight, preferably about 0.05 to 500 mg / kg body weight, preferably 0.5 to 50 mg / kg body weight, and a single dose and distribution In the prescribed dosage. However, the amount of the active ingredient to be administered is not limited to the above range because it must be determined in consideration of various factors such as the condition to be treated, the age and weight of the patient, the severity of the symptoms.
본 발명은 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 개체 투여하는 단계를 포함하는, 유전자를 저산소 조건 또는 고농도의 금속이 존재하는 조건에서 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of specifically expressing a gene under hypoxic conditions or in the presence of a high concentration of metal, comprising subjecting the pharmaceutical composition of the invention to a subject.
본 발명은 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 개체 투여하여, 유전자를 저 산소 조건에서 특이적으로 발현시켜, 개체 내의 암을 치료하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of treating cancer in a subject by subjecting the pharmaceutical composition of the invention to the subject, thereby specifically expressing the gene in low oxygen conditions.
본 발명은 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 개체 투여하여, 유전자를 저산소 조건에서 특이적으로 발현시켜, 개체 내의 허혈증을 치료하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for treating ischemia in a subject by subjecting the pharmaceutical composition of the invention to the subject and expressing the gene specifically in hypoxic conditions.
본 발명의 약제학적 조성물, 그의 효능, 투여 방법 및 투여량 등에 관한 내용은 상기한 바와 같다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 개체는 임의의 생물체가 될 수 있으나, 바람직하게는 포유동물이다. 상기 포유동물에는 예를 들면, 인간, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼가 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. The pharmaceutical composition of the present invention, its efficacy, method of administration, dosage and the like are as described above. In the method of the invention, the subject can be any organism, but is preferably a mammal. Such mammals include, but are not limited to, for example, humans, mice, pigs, cattle and rabbits.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 Example
실험 재료 및 방법Experimental Materials and Methods
(1) 화학물질(1) chemical substances
NiCl2, CoCl2, DFX, MnCl2 및 ZnCl2는 Sigma (Sigma-Aldrich Co., St Louis, 미국)사로부터 구입하였다. 모든 시약은 고농도로 증류수에 용해한 다음, 멸균 Millex-GV 필터 (공극 크기, 0.22 ㎛; Millipore Co., Billerica, MA)를 통하여 여과하였다. 신선하게 제조된 저장 용액은 다양한 농도로 무혈청 배지로 희석하였다. NiCl 2 , CoCl 2 , DFX, MnCl 2 and ZnCl 2 were purchased from Sigma (Sigma-Aldrich Co., St Louis, USA). All reagents were dissolved in distilled water at high concentration and then filtered through a sterile Millex-GV filter (pore size, 0.22 μm; Millipore Co., Billerica, Mass.). Freshly prepared stock solutions were diluted in serum-free medium at various concentrations.
(2) 세포 배양(2) cell culture
인간 상피세포암세포 (HeLa), 생쥐폐암세포 (LLC1) 및 생쥐 근육모세포 (myoblast) (C2C12)는 10 % 열불활성화된 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 유니트/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (BioWhittaker, Inc., Walkersville, 미국) 중에 배양하였다. 모든 세포는 5 % CO2를 포함하는 습한 대기 중에서 37 ℃에서 단층으로 유지하였다. Human epithelial carcinoma cells (HeLa), mouse lung cancer cells (LLC1) and mouse myoblasts (C 2 C 12 ) were 10% heat inactivated fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units / ml penicillin and 100 Cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (BioWhittaker, Inc., Walkersville, USA) supplemented with μg / ml streptomycin. All cells were maintained in monolayers at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% CO 2 .
(3) 저산소 조건 (hypoxia) 및 금속 처리(3) hypoxia conditions (hypoxia) and metal treatment
세포는 환경 챔버 (Anaerobic System, Thermo Forma, 독일)를 사용하여 21 시간 동안 저산소 조건 (1 % O2, 5 % CO2, 94 % N2) 하에 놓이도록 하였다. 저산소 조건은 또한 NiCl2 (1 mM), CoCl2 (300 μM), DFX (260 μM) 또는 MnCl2 로 21 시간 처리함으로써 모방되었다. 세포 생존율은 저산소 조건 또는 금속 이온에 노출시킴으로써 나쁘게 영향을 받지 않았다. Cells were placed under hypoxic conditions (1% 0 2 , 5% CO 2 , 94% N 2 ) for 21 hours using an environmental chamber (Anaerobic System, Thermo Forma, Germany). Hypoxic conditions were also mimicked by treatment with NiCl 2 (1 mM), CoCl 2 (300 μM), DFX (260 μM) or MnCl 2 for 21 hours. Cell viability was not adversely affected by exposure to hypoxic conditions or metal ions.
(4) 플라스미드(4) plasmid
본 발명의 실시예에 사용된 EBS, MRE 및 HRE는 각각 생쥐 Egr-1 프로모터의 -603/-595 위치를 포함하는 Egr-1 결합 부위 (EBS) (서열번호 1), 생쥐 메탈로티오닌-I (MT-1) 근접 프로모터로부터 유래한 MRE (서열번호 2), 생쥐 PGK-1의 5' 인접 (flanking) 영역으로부터 유래한 유래한 HRE (서열번호 3)이었으며, HRE는 3 카피를 인접하게 연결하여 얻어진 3xHRE (서열번호 4)를 사용하였다. 상기 인핸서 요소를 제조하기 위한 올리고뉴클레오티드는 Cosmo (서울, 한국)으로부터 합성된 것을 사용하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 각각 5' 및 3' 말단에 NheI 및 XbaI 접착 부위를 포함하도록 단일가닥으로 합성되어, 이중가닥 합성 인핸서를 생성하는데 사용되었다: 5' 및 3' 말단에 NheI 및 XbaI 접착 부위를 포함하는 이중가닥 EBS, MRE 및 3xHRE는 각각 서열번호 1 및 18의 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 및 19의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4 및 20의 폴리뉴클레오티드에 의하여 생성되었다. 모든 올리고뉴클레오티드는 각 인핸서가 pGL3-프로모터 벡터 (Promega, Madison, 미국) 내의 최소 SV40 프로모터으로부터 상류의 NheI 부위에 클로닝될 수 있도록 설계되었다. 상기 NheI (GCTAGC) 및 XbaI (TCTAGA) 접착말단은 연결될 수는 있으나 (G/CTAGA), 그 산물은 어느 효소에 의하여도 절단될 수 없다. 이 접근법에 의하여 상기 인핸서는 초기 Nhe I 부위를 상실하지 않고서 첨가될 수 있다. 도 1은 이들 올리고뉴클레오티드를 이용하여 본 발명의 일 구체예인 EBS-MRE-3xHRE-pGL3 벡터를 제작하는 과정을 나타내는 도면이다. EBS, MRE and HRE used in the Examples of the present invention are Egr-1 binding sites (EBS) (SEQ ID NO: 1), mouse metallothionine-, which include the -603 / -595 position of the mouse Egr-1 promoter, respectively. MRE (SEQ ID NO: 2) derived from the I (MT-1) proximity promoter, HRE derived from the 5 'flanking region of mouse PGK-1 (SEQ ID NO: 3), and HRE was adjacent to three copies 3xHRE (SEQ ID NO: 4) obtained by linking was used. Oligonucleotides for preparing the enhancer elements were synthesized from Cosmo (Seoul, Korea). These oligonucleotides were synthesized single stranded to contain NheI and XbaI adhesion sites at the 5 'and 3' ends, respectively, and used to generate double stranded synthetic enhancers: including NheI and XbaI adhesion sites at the 5 'and 3' ends. The double-stranded EBS, MRE and 3xHRE were produced by polynucleotides of SEQ ID NOs: 1 and 18, polynucleotides of SEQ ID NOs: 2 and 19, and polynucleotides of SEQ ID NOs: 4 and 20, respectively. All oligonucleotides were designed such that each enhancer could be cloned upstream of the NheI site from the minimum SV40 promoter in the pGL3-promoter vector (Promega, Madison, USA). The NheI (GCTAGC) and XbaI (TCTAGA) adhesion ends may be linked (G / CTAGA), but the product may not be cleaved by any enzyme. By this approach the enhancer can be added without losing the initial Nhe I site. 1 is a view showing a process for producing an EBS-MRE-3xHRE-pGL3 vector of one embodiment of the present invention using these oligonucleotides.
인핸서가 없는 pGL3-프로모터 벡터를 음성 대조군으로 사용하였다. 루시퍼라제 cDNA (상기 pGL3-프로모터 벡터로부터 유래)를 포함하는 pcDNA3.1(+)-Luc 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, 미국)를 양성 대조군으로서 사용하였다. Enhancer-less pGL3-promoter vectors were used as negative controls. The pcDNA3.1 (+)-Luc vector (Invitrogen, Carlsbad, USA) containing luciferase cDNA (derived from the pGL3-promoter vector) was used as a positive control.
염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor) (bFGF)를 발현하는 벡터인 pGL3-bFGF, 3xHRE-pGL3-bFGF 및 EBS-MRE-3xHRE-pGL3-bFGF를 제조하기 위하여, pcDNA3.1(+)-bFGF 벡터 (Ji Hyung Chung 및 Yang Soo Jang 박사로부터 공급 받음)로부터 유래한 HindIII/XbaI 단편을 각각 pGL3, 3xHRE-pGL3 및 EBS-MRE-3xHRE-pGL3 벡터의 HindIII/XbaI 부위에 삽입하였다. To prepare vectors pGL3-bFGF, 3xHRE-pGL3-bFGF and EBS-MRE-3xHRE-pGL3-bFGF, which express basic fibroblast growth factor (bFGF), pcDNA3.1 (+)- HindIII / XbaI fragments derived from bFGF vectors (supplied by Dr. Ji Hyung Chung and Yang Soo Jang) were inserted into the HindIII / XbaI sites of the pGL3, 3xHRE-pGL3 and EBS-MRE-3xHRE-pGL3 vectors, respectively.
(5) 일시적 형질감염 및 리포터 유전자 분석(5) transient transfection and reporter gene analysis
세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 (50,000 세포/웰), Effectene ReagentTM (Qiagen, Valencia, 미국)를 사용하여 30-300 ng의 시험 구조체 (construct)를 형질감염시킨 다음, 24 시간 동안 배양하였다. 배양 디쉬를 PBS로 두 번 세척하고 신선한 성장 배지로 채웠다. 다음으로, 세포를 정상 산소 조건 (normoxia) 및 저산소 조건 (hypoxia)에 21 시간 노출시켰다. 중금속, DFX, 저 pH 또는 저 포도당 농도와 같은 스트레스에 대하여, 정상 산소 조건에서의 배양물에 다음과 같이 처리하였다. 열 처리에 대하여는, 세포를 43 ℃에서 30 분 동안 열 충격에 노출시킨 다음 37 ℃에서 다시 2 시간 동안 배양하여 회복되도록 하였다. 세포 파쇄물을 준비하고, 제조사의 설명서에 따라 Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System (Promega) 에 의하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 반복 형질감염 (replicate transfection) 실험이 3 개의 독립적 DNA 준비물로 수행되었고, 세포 파쇄물 중의 단백질 농도로 노말라이즈하였다.Cells were seeded in 12-well plates (50,000 cells / well) and 30-300 ng of the test construct was transfected using Effectene Reagent ™ (Qiagen, Valencia, USA) and then incubated for 24 hours. . Culture dishes were washed twice with PBS and filled with fresh growth medium. Next, cells were exposed to normal oxygen conditions (normoxia) and hypoxia conditions (hypoxia) for 21 hours. For stresses such as heavy metals, DFX, low pH or low glucose concentrations, cultures under normal oxygen conditions were treated as follows. For heat treatment, cells were exposed to heat shock at 43 ° C. for 30 minutes and then incubated for another 2 hours at 37 ° C. to recover. Cell lysates were prepared and luciferase activity was measured by the Dual-Luciferase ™ Reporter Assay System (Promega) according to the manufacturer's instructions. Repeat transfection experiments were performed with three independent DNA preparations and normalized to protein concentration in cell lysates.
(6) ELISA(6) ELISA
상기 배지 중의 인간 bFGF의 양은 제조사의 설명서에 따라 인간 염기성 FGF ELISA kit (R&D, Minneapolis, 미국)에 의하여 측정하였다. 상기 적응된 배지 (conditioned medium)는 1.5 ml 튜브 중에 -70 ℃에서 저장한 후 사용하였다. 10 pg/ml 및 1,000 pg/ml의 범위의 표준물에서 좋은 직선 상관관계가 관찰되었다. The amount of human bFGF in the medium was measured by the human basic FGF ELISA kit (R & D, Minneapolis, USA) according to the manufacturer's instructions. The conditioned medium was used after storage at −70 ° C. in a 1.5 ml tube. Good linear correlations were observed for standards in the range of 10 pg / ml and 1,000 pg / ml.
(7) 전기천공 및 뒷다리 허혈 모델(7) Electroporation and hind limb ischemia model
본 발명의 실시예에서는 리포터 유전자의 인 비보에서의 저산소 조건 유도를 평가하기 위하여 뒷다리 허혈을 갖는 생쥐 모델을 사용하였다. 시험 플라스미드를 전기천공한 후, 개시된 바와 같이 대퇴부 동맥 절제에 의하여 12 주령 수컷 C57BL/6 생쥐에 한쪽 뒷다리 허혈을 도입하였다 (Couffinhal T 등, Am. J. Pathol. 1998; 152:1667-1679). 간단하게 요약하여 보면, 외과적 과정을 위하여 2.215 mg 케타민 (Ketalar 50 mg/ml ; Yuhan Co., 한국) 및 0.175 mg 자일라진 (Rompun 23.32 mg/ml; Bayer, 한국)을 포함하는 용액 100 ㎕를 복강 내 주사에 의하여 동물을 마취시켰다. 다리를 면도하여 털을 제거하여 앞 정강근을 노출시켰다. 30 ㎕의 반식염수 (0.4 % NaCl 또는 75 mM)에 녹아 있는 10 ㎍의 DNA를 30-게이저 인슐린 주사기 (Becton-Dickinson, Frankin Lakes, NJ, 미국)로 각 생쥐의 앞 정강근에 주입하였다. DNA 주사 30 초 후, ECM 830 electroporator (BTX Division of Genetronics, Inc., San Diego, CA, 미국)를 사용하여 상기 주사 부위의 표면에 경피 전기 펄스를 가하였다. 1 Hz에서 50 ms 동안 125 V/cm의 8개 전기적 펄스를 2개의 전극을 통하여 가하였다 (Tweezertrodes, BTX Division of Genetronics, Inc.). 전기천공 2일 후, 생쥐의 좌측 뒷다리의 중앙 부분을 절개하고 대퇴부 동맥의 가까운 쪽 말단 (proximal end) 및 두렁 동맥 (saphenous artery)의 먼쪽 부분에 연결하였다. 그 후, 상기 동맥 및 모든 측면 지류 (branch)를 절단하고 잘라 내었다. 생쥐의 우측 뒷다리는 비허혈성 대조군으로 사용하였다. 3일 후 생쥐를 희생시키고, 상기 좌측 앞 정강근을 리포터 유전자 발현 분석을 위하여 자르고 파쇄하였다. In the embodiment of the present invention, a mouse model with hind limb ischemia was used to evaluate the induction of hypoxic conditions in the in vivo of the reporter gene. After electroporation of the test plasmid, one hind limb ischemia was introduced into 12-week-old male C57BL / 6 mice by femoral artery resection as disclosed (Couffinhal T et al., Am. J. Pathol. 1998; 152: 1667-1679). In brief summary, 100 μl of a solution containing 2.215 mg ketamine (
(8) 인 비보 혈류 및 레이저 도플러 이미지화(8) In vivo blood flow and laser Doppler imaging
허혈 후 각각 0 및 3일에 LDI system (Moor Instruments, Axminster, Devon, England)을 사용하여 허혈성 및 비허혈성 뒷다리에서의 혈류를 측정하였다. 상기 관혈류 (perfusion) 신호는 짙은 파란색 (0)에서부터 적색을 거쳐 흰색 (1000)까지의 색깔 코드로 나타내었다. 상기 허혈성 다리의 혈류는 맞은편 비허혈성 다리의 혈류에 대하여 노말라이즈되었다. Blood flow in the ischemic and non-ischemic hind limbs was measured using the LDI system (Moor Instruments, Axminster, Devon, England) on
(9) 통계 분석(9) statistical analysis
모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SEM)로 나타내었다. 결과는 Prism software ver. 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, 미국)로 분석하였다. 스튜던트 t-시험 또는 일방 ANOVA를 군 간의 통계적 차이를 평가하기 위하여 사용하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. All data are expressed as mean ± standard deviation (SEM). The result is Prism software ver. 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Student's t-test or one-way ANOVA was used to assess statistical differences between groups. P values less than 0.05 were considered statistically significant.
실시예 1 : 단일 인핸서 요소가 저산소 조건 반응성에 미치는 영향Example 1 Effect of a Single Enhancer Element on the Reactivity of Hypoxic Conditions
본 실시예에서는 잠정적으로 저산소 조건과 관련된 시스-작용 요소의 인핸서 기능을 조사하기 위하여, 생쥐 Egr-1 프로모터로부터 EBS (이하 "E"라고도 한다) (서열번호 1), 생쥐 메탈로티오닌 I-프로모터 유래의 MRE (이하 "M"라고도 한다) (서열번호 2) 및 생쥐 PGK-1 HRE (서열번호 3)의 3 회 인접 반복 서열 (tandem repeat) (이하 "H"라고도 한다) (서열번호 4)을 합성하였다 (표 1).In this example, in order to investigate the enhancer function of cis-acting elements associated with hypoxic conditions, EBS (hereinafter also referred to as "E") (SEQ ID NO: 1), mouse metallothionine I- from the mouse Egr-1 promoter MRE from the promoter (hereinafter also referred to as "M") (SEQ ID NO: 2) and three contiguous repeats of the mouse PGK-1 HRE (SEQ ID NO: 3) (hereinafter also referred to as "H") (SEQ ID NO: 4) ) Was synthesized (Table 1).
표 1. 단일 인핸서 요소Table 1. Single enhancer elements
표 1에서 Egr-1, MTF-1 및 HIF-1가 결합하는 컨센서스 결합 부위는 볼드체로 나타내었다. HRE의 기능적 필수 서열은 밑줄로 표시하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 말단에 5′NheI 및 3′XbaI 부위를 갖도록 설계되어 각 인핸서가 NheI 부위에 클로닝되어 키메라 조합이 생성될 수 있도록 하였다. In Table 1, the consensus binding sites to which Egr-1, MTF-1, and HIF-1 bind are shown in bold. Functionally essential sequences of the HRE are underlined. All oligonucleotides were designed to have 5′NheI and 3′XbaI sites at their ends so that each enhancer could be cloned into the NheI site to generate chimeric combinations.
합성된 상기 단일 인핸서 서열을 각각 pGL3-프로모터 플라스미드 (이하 "pGL3"라고도 한다) 내의 최소 SV40 프로모터로부터 상류에 삽입하였다. 그 결과 얻어진 구조체, E-pGL3, M-pGL3 및 H-pGL3 각각을 HeLa 세포에 일시적 형질감염 (transient transfection)시킨 후 루시퍼라제 리포터의 저산소 조건 유도에 미치는 영향을 평가하였다. The synthesized single enhancer sequences were inserted upstream from the minimum SV40 promoter in each pGL3-promoter plasmid (hereinafter also referred to as "pGL3"). The resulting constructs, E-pGL3, M-pGL3 and H-pGL3, respectively, were transiently transfected into HeLa cells, and the effects of luciferase reporter on the induction of hypoxic conditions were evaluated.
도 2는 지정된 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에서 H/N 비율은 정상 산소농도 조건 (21 % O2)에 대한 저산소 조건 (1 % O2) 하에서의 상기 루시퍼라제 활성의 비율을 나타낸다. RLU/mg 단백질은 단백질 mg에 대하여 노말라이즈된 상대적 광 단위이다. 데이터는 평균 ± 표준편차 (SEM)이다. FIG. 2 is a diagram showing the results of analysis of luciferase activity after 24 hours of transient transfection of HeLa cells with a designated vector, cultured under normal oxygen condition or hypoxic condition (1% O 2 ) for 21 hours. In FIG. 2 the H / N ratio represents the ratio of the luciferase activity under hypoxic conditions (1% O 2 ) to normal oxygen concentration conditions (21% O 2 ). RLU / mg protein is a relative light unit normalized to mg protein. Data is mean ± standard deviation (SEM).
도 2에 나타낸 바와 같이, H-pGL3 구조체는 상기 분석의 저산소 조건 반응성에 대한 양성 대조군이고, 인핸서가 없는 pGL3 구조체는 음성 대조군이다. 저산소 조건에 21 시간 동안 노출된 후 H-pGL3는 루시퍼라제 발현을 20.2 배 증가시킨 반면, E-pGL3 및 M-pGL3 구조체는 낮은 수준의 루시퍼라제 활성을 발현하였으며, 대조군 (pGL3, 1.8 배) 보다 외견상 더 높은 저산소 조건 유도성 (각각 1.4 배 및 1.8 배)을 보이지 않았다. 이는 적어도 최소 SV40 프로모터의 문맥하에서는, E 및 M은 그 자체로서 효과적인 저산소 조건 인핸서가 아니라는 것을 나타낸다.As shown in Figure 2, the H-pGL3 construct is a positive control for the hypoxic condition reactivity of the assay, and the pGL3 construct without enhancer is a negative control. After 21 hours of exposure to hypoxic conditions, H-pGL3 increased luciferase expression by 20.2-fold, whereas E-pGL3 and M-pGL3 constructs expressed low levels of luciferase activity, compared to control (pGL3, 1.8-fold). There was no apparent higher hypoxic inducibility (1.4 and 1.8 times, respectively). This indicates that, at least in the context of the minimum SV40 promoter, E and M by themselves are not effective hypoxic condition enhancers.
실시예 2 : 2 개 인핸서의 조합이 저산소 조건 반응성에 미치는 영향Example 2 Effects of Combination of Two Enhancers on Reactive Oxygen Condition
본 실시예에서는 H의 존재하에서 E 또는 M이 저산소 조건에 대하여 반응성이 있는지 여부를 조사하였다. 인핸서의 E-H 및 M-H 조합이 루시퍼라제 리포터의 저산소 조건 유도에 미치는 영향에 대하여 시험하고, H에 의한 저산소 조건 유도의 정도와 비교하였다.In this example, it was examined whether E or M was reactive to hypoxic conditions in the presence of H. The effect of the enhancer's E-H and M-H combinations on the induction of hypoxic conditions of the luciferase reporter was tested and compared with the degree of hypoxic induction by H.
도 3은 2 개 인핸서의 조합을 포함하는 각 지정된 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서 H/N 비율은 정상 산소농도 조건 (21 % O2)에 대한 저산소 조건 (1 % O2) 하에서의 상기 루시퍼라제 활성의 비율을 나타낸다. RLU/mg 단백질은 단백질 mg에 대하여 노말라이즈된 상대적 광단위이다. 데이터는 평균 ± 표준편차 (SEM) (n = 3)이다. **, p < 0.001; ***, p < 0.0001 (스튜던트 t-테스트).3 is 24 hours after transient transfection of HeLa cells with each designated vector comprising a combination of two enhancers, and cultured under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours. Is a diagram showing the results of the assay for luciferase activity. In FIG. 3, the H / N ratio represents the ratio of the luciferase activity under hypoxic conditions (1% O 2 ) to normal oxygen concentration conditions (21% O 2 ). RLU / mg protein is the relative light unit normalized to mg protein. Data is mean ± standard deviation (SEM) (n = 3). **, p <0.001; ***, p <0.0001 (Student t-test).
도 3에 나타낸 바와 같이, H와 함께 E 또는 M을 조합함으로써 루시퍼라제 발현이 유의하게 증가하였으며, H의 유도 비율에 비하여 유도 비율이 90 % 이상 증가하였다. 반면, M-M 및 E-E 조합은 유의한 수준의 유전자 발현을 생성하지 않았으며, 저산소 조건에 의하여 유도되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이는 E 및 M이 H의 존재하에서 인핸서로서 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. As shown in FIG. 3, by combining E or M with H, luciferase expression was significantly increased, and the induction rate was increased by 90% or more compared to the induction rate of H. In contrast, the M-M and E-E combinations did not produce significant levels of gene expression and were not induced by hypoxic conditions (data not shown). This indicates that E and M can act as enhancers in the presence of H.
실시예 3 : 3 개 인핸서의 조합이 저산소 조건 반응성에 미치는 영향Example 3 Effect of Combination of Three Enhancers on Reactive Oxygen Condition
본 실시예에서는 실시예 2에 나타낸 바와 같은 2개 인핸서의 조합으로 이루어지는 키메라 인핸서 구조체에 의하여 달성되는 유도 비율 및 발현 수준을 추가적으로 증진시키기 위하여 3 개 다른 인핸서의 조합에 대하여 조사하였다. 상기 3개의 인핸서의 조합은 포함하는 벡터는 E-M-H-pGL3 벡터 (서열번호 11)를 사용하였다. 실험과정은 상기 E-M-H-pGL3 벡터 (서열번호 11)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 2에 나타낸 바와 동일하게 수행하였다. In this example, a combination of three different enhancers was investigated to further enhance the induction rate and expression level achieved by the chimeric enhancer construct consisting of a combination of two enhancers as shown in Example 2. The vector containing the combination of the three enhancers used an E-M-H-pGL3 vector (SEQ ID NO: 11). The experimental procedure was performed in the same manner as shown in Examples 1 and 2, except that the E-M-H-pGL3 vector (SEQ ID NO: 11) was used.
도 4a은 3 개 인핸서의 조합을 포함하는 벡터 및 다른 지정된 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, E-M-H-pGL3는 저산소 조건하에서 루시퍼라제 발현을 69 배 증가시켰으며, 이는 각각 대조군 (pGL3) 및 H-pGL3로 달성된 수준 보다 38 배 및 3.8 배 높은 것이다. 유도된 발현 수준의 관점에서, E-M-H-pGL3는 각각 HCMV-구동된 pcDNA3.1 및 H-pGL3 구조체에 의하여 이루어진 루시퍼라제 활성보다 3.5 배 및 2.4 배 높은 루시퍼라제 활성을 발현하였다. 정상 산소 조건하에서의 상기 E-M-H-pGL3로부터 발현된 루시퍼라제의 기저 수준은 대조군으로부터의 발현 수준 보다 높았으나, H-pGL3로부터 발현 수준 보다는 낮았다. 이는 E-M-H-pGL3가 H-pGL3에 비하여 유도 비율이 높은 점을 일부 설명하여 준다. 반면, 정상 산소 조건하에서, 단지 E-M-H 키메라 인핸서 만을 포함하는 프로모터가 없는 구조체는 검출한계에 가까운 루시퍼라제 활성으로 대조군 벡터 (pGL3)의 발현 수준 보다 훨씬 낮은 수준이어서, 루시퍼라제를 거의 발현하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 상기 E-M-H 키메라 인핸서는 프로모터로서 작용하는 것 같지는 않다. 이상의 결과를 요약하여 보면, 이들 데이터는 이질적 (heterologous) 인핸서 요소가 상승적 방식으로 하나의 SV40 최소 프로모터에 작용하여, 하류의 유전자의 전사를 증진시키는 것을 암시한다.4A shows 24 hours of transient transfection of HeLa cells with a vector comprising a combination of three enhancers and another designated vector, under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours. It is a figure which shows the result of having cultured and analyzed about luciferase activity. As shown in FIG. 4A, EMH-pGL3 increased
실시예 4 : 조합되는 인핸서의 순서가 저산소 조건 반응성에 미치는 영향Example 4 Influence of the Sequence of Enhancers Combined on Low Oxygen Condition Reactivity
이상과 같은 실시예의 결과로부터, 3개 인핸서의 조합이 저산소 조건 유도성을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 본 실시예에서는 3 개 인핸서의 가장 우수한 또는 적합한 배열 형태를 조사하였다. 이를 위하여 인핸서의 순서를 달리하는 구조체를 제조하였으며, 이들 제조된 구조체는 각각 M-E-H-pGL3, E-M-H-pGL3, H-M-E-pGL3, H-E-M-pGL3 및 M-H-E-pGL3 벡터 (각각 서열번호 13, 11, 16, 15, 및 14)이었다. From the results of the above examples, it was confirmed that the combination of three enhancers increased hypoxic condition inducibility. In this example, the best or suitable configuration of the three enhancers was investigated. To this end, constructs having different order of enhancers were prepared, and these prepared constructs were MEH-pGL3, EMH-pGL3, HME-pGL3, HEM-pGL3 and MHE-pGL3 vectors (SEQ ID NOs: 13, 11, 16, and 15, respectively) And 14).
도 4b는 배열 순서를 달리하여 제작된 3 개 인핸서의 조합을 포함하는 벡터 로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 4B shows normal oxygen condition (21% O 2 ) or hypoxic condition (1% O) for 21 hours after transient transfection of HeLa cells with a vector comprising a combination of three enhancers prepared in a different arrangement order. It is a figure which shows the result of having cultured under 2 ) and analyzed about luciferase activity.
도 4b에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도 상기 3 개 인핸서의 키메라 구조체를 포함하는 벡터 E-M-H-pGL3가 가장 높은 유도 비율 및 가장 높은 절대적 발현 수준을 보였다. 3xHRE (H-M-E 및 H-E-M)로 시작하는 상기 키메라 인핸서 조합은 다른 배열 형태, 즉 3xHRE가 키메라 인핸서의 중간 또는 끝에 위치하는 것에 비하여 낮은 유도 수준을 보였다. 동일한 위치 (첫 번째 또는 세 번째 위치)에 3xHRE를 갖는 것이면, MRE의 앞에 EBS가 위치하는 것이 유리한 것처럼 보였다. 그러나, 상기 군들 사이의 차이는 E-M-H-pGL3 또는 M-E-H-pGL3 및 H-M-E-pGL3 사이의 차이를 제외하고는 통계적으로 유의하지 않았다 (p<0.05). As shown in FIG. 4B, surprisingly, the vector E-M-H-pGL3 comprising the chimeric constructs of the three enhancers showed the highest induction rate and the highest absolute expression level. The chimeric enhancer combination starting with 3xHRE (H-M-E and H-E-M) showed a lower level of induction compared to other arrangements, ie 3xHRE is located at the middle or end of the chimeric enhancer. If it had 3xHRE in the same position (first or third position), it seemed advantageous to place EBS before the MRE. However, the difference between the groups was not statistically significant except for the difference between E-M-H-pGL3 or M-E-H-pGL3 and H-M-E-pGL3 (p <0.05).
실시예 5 : 다른 세포 및 치료 유전자를 이용한 본 발명의 벡터의 평가 (validation)Example 5 Evaluation of Vectors of the Invention Using Different Cells and Therapeutic Genes
본 실시예에서는 E-M-H에 대한 유도 결과가 HeLa 세포 이외의 세포에서도 동일하게 일어날 수 있는지를 시험하였다. 이를 위하여 C2C12 세포 및 LLC1 세포에 상기 E-M-H-pGL3를 임시적 형질감염시킨 후 루시퍼라제 리포터의 저산소 조건 유도에 미치는 영향을 평가하였다. C2C12 세포 및 LLC1 세포를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1 및 2에 따른 실험과정과 동일하였다. In this example, it was tested whether the result of induction for EMH could occur in cells other than HeLa cells. To this end, the effects of the temporary transfection of EMH-pGL3 on C 2 C 12 cells and LLC1 cells and the induction of hypoxic conditions of the luciferase reporter were evaluated. Except for using the C 2 C 12 cells and LLC1 cells were the same as the experimental procedure according to Examples 1 and 2.
도 5a는 E-M-H-pGL3 벡터로 C2C12 세포 및 LLC1 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 5A shows incubation under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours, 24 hours after transient transfection of C 2 C 12 cells and LLC1 cells with EMH-pGL3 vector, It is a figure which shows the result analyzed about luciferase activity.
도 5a에 나타낸 바와 같이, E-M-H-pGL3은 C2C12 세포 및 LLC1 세포에서 각각 H 구조체에 의하여 유도된 루시퍼라제 발현 보다 1.5 배 및 1.4 배 높은 저산소 조건 유도된 루시퍼라제 발현을 나타내었다. C2C12 세포 및 LLC1 세포에서도 HeLa 세포에서와 유사한 유도 양상이 관찰된다는 것은 본 발명의 키메라 인핸서가 다양한 세포에서 기능적일 수 있다는 것을 나타낸다. As shown in FIG. 5A, EMH-pGL3 showed hypoxic condition induced luciferase expression 1.5- and 1.4-fold higher than luciferase expression induced by H constructs in C 2 C 12 cells and LLC1 cells, respectively. Similar induction patterns were observed in C 2 C 12 cells and LLC1 cells as well as in HeLa cells, indicating that the chimeric enhancers of the invention can be functional in a variety of cells.
본 실시예에서는 또한, HeLa 세포에서 상기 E-M-H-pGL3의 저산소 조건 반응성을 bFGF와 같은 다른 리포터 유전자를 사용하여 평가하였다. In this example, the hypoxic condition reactivity of E-M-H-pGL3 in HeLa cells was also evaluated using other reporter genes such as bFGF.
도 5b는 SV40 프로모터 말단에 bFGF를 포함하는 E-M-H-pGL3 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 정상 산소 조건 (21 % O2) 또는 저산소 조건 (1 % O2) 하에서 배양하고, bFGF 발현량을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, E-M-H-pGL3에 의하여 유도되는 bFGF의 발현량은 H 구조체에 의하여 유도되는 발현량에 비하여 1.5 배 높았다. 이는 상기 루시퍼라제 유전자를 이용하여 얻은 결과와 유사한 것이다. 또한, lacZ 유전자를 SV40 프로모터의 하류에 포함하는 동일하게 수행된 실험에서도 강력한 유도 효과가 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음).5B is cultured under normal oxygen conditions (21% O 2 ) or hypoxic conditions (1% O 2 ) for 21 hours after transient transfection of HeLa cells with EMH-pGL3 vector containing bFGF at the SV40 promoter end. It is a figure which shows the result of having analyzed bFGF expression amount. As shown in FIG. 5B, the expression level of bFGF induced by EMH-pGL3 was 1.5 times higher than the expression level induced by the H construct. This is similar to the result obtained using the luciferase gene. In addition, a potent inducible effect was observed in the same performed experiments involving the lac Z gene downstream of the SV40 promoter (data not shown).
실시예 6 : 저산소 조건 모사물질 (mimetics)에 의한 조절Example 6: Control by hypoxic conditions mimetics
종래 전이 금속 및 철 킬레이터가 저산소 조건을 모사 (mimic)할 수 있는 것으로 알려져 있었다. 본 실시예에서는 본 발명의 키메라 인핸서 벡터가 그러한 저산소 조건 모사물질에 의하여 조절될 수 있는지를 조사하였다. It has conventionally been known that transition metals and iron chelators can mimic low oxygen conditions. In this example, it was examined whether the chimeric enhancer vector of the present invention could be controlled by such hypoxic condition mimics.
도 6은 루시퍼라제 유전자를 SV40 프로모터의 하류에 포함하는 E-M-H-pGL3 벡터로 HeLa 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 21 시간 동안 MnCl2 (500 μM), NiCl2 (1 mM), 데페록사민 (DFX, 260 μM) 또는 CoCl2 (300 μM)의 존재하에서 배양한 다음, 세포를 수집하여 루시퍼라제 활성을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 6 shows MnCl 2 (500 μM), NiCl 2 (1 mM), deferoxamine for 21 hours 24 hours after transient transfection of HeLa cells with an EMH-pGL3 vector comprising the luciferase gene downstream of the SV40 promoter. After culturing in the presence of (DFX, 260 μM) or CoCl 2 (300 μM), cells are collected and analyzed for luciferase activity.
도 6에서 유도 배수는 대조군 (N)에 대한 상대적 루시퍼라제 활성을 나타낸다. N: 처리하지 않음. 데이터는 평균 ± 표준편차 (SEM) (n = 3)이다. *, p < 0.05 (스튜던트 t-테스트).Induced folds in FIG. 6 show relative luciferase activity relative to control (N). N: Do not process. Data is mean ± standard deviation (SEM) (n = 3). *, p <0.05 (Student t-test).
도 6에 나타낸 바와 같이, 코발트 및 니켈과 같은 금속 이온으로 처리함으로써 E-M-H-pGL3에 의한 루시퍼라제 리포터의 발현이 현저하게 상승조절 (upregulation) (각각 73.2 배 및 25.4 배)되었다. 또한 DFX에 의해서도 높은 수준의 발현이 유도되었다(43.1 배). 모든 경우에 있어서, E-M-H-pGL3으로부터 유도된 발현은 H-pGL3로부터 유도된 발현에 비하여 유의하게 높았다. 이들 결과는 저산소 조건 모사물질이 상기 E-M-H-pGL3로부터 높은 수준의 발현을 성공적으로 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. As shown in FIG. 6, expression of the luciferase reporter by E-M-H-pGL3 was significantly upregulated (73.2 fold and 25.4 fold, respectively) by treatment with metal ions such as cobalt and nickel. High levels of expression were also induced by DFX (43.1 fold). In all cases, expression derived from E-M-H-pGL3 was significantly higher than expression derived from H-pGL3. These results indicate that hypoxic condition mimics can successfully induce high levels of expression from the E-M-H-pGL3.
또한, 본 실시예에서는 본 발명의 키메라 인핸서를 포함하는 벡터가 열, 저 농도의 포도당, 낮은 pH 및 과산화 수소와 같은 많은 다른 스트레스 조건에 의하여 또한 조절될 수 있는지를 조사하였다.In this example, it was also investigated whether the vector comprising the chimeric enhancer of the present invention could also be controlled by many other stress conditions such as heat, low concentration of glucose, low pH and hydrogen peroxide.
도 7은 루시퍼라제 유전자를 SV40 프로모터의 하류에 포함하는 E-M-H-pGL3 벡터 및 표시된 다른 벡터로 HeLa 또는 C2C12 세포를 일시적 형질감염시킨 24 시간 후, 정상 산소 조건 하에서 열 충격 (43 ℃에서 30 분 동안 배양한 다음 37 ℃에서 2 시간 동안 회복), 낮은 농도의 포도당 (1 g/L, 4 시간), 낮은 pH (6.0, 4 시간) 또는 H2O2 (500 μM, 4 시간) 하에서 배양한 다음, 세포를 수집하여 루시퍼라제 활성을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. FIG. 7 shows heat shock (at 43 ° C. at 30 ° C.) at 24 hours after transient transfection of HeLa or C 2 C 12 cells with the EMH-pGL3 vector containing the luciferase gene downstream of the SV40 promoter and other vectors indicated. Incubate for 2 min and then recover for 2 h at 37 ° C.), low glucose (1 g / L, 4 h), low pH (6.0, 4 h) or H 2 O 2 (500 μM, 4 h) Next, the cells are collected and analyzed for luciferase activity.
도 7에서 유도 배수는 대조군 (비처리군)에 대한 상기 상대 루시퍼라제 활성을 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준편차 (SEM) (n = 3)*, *, p < 0.05 (스튜던트 t-테스트).Induced fold in FIG. 7 shows the relative luciferase activity for the control (untreated group). Data are mean ± standard deviation (SEM) (n = 3) *, *, p <0.05 (Student t-test).
도 7에 나타낸 바와 같이, 과산화 수소는 HeLa (2.6 배) 및 C2C12 세포 (2.7 배)에서 E-M-H-pGL3 벡터의 적정한 (moderate) 유도 물질인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 열, 저농도의 포도당 및 낮은 pH는 유도성에 거의 영향을 미치지 않았다. 과산화 수소는 또한 H-pGL3의 유도 물질로서 작용하였으나, 유도 비율은 E-M-H-pGL3의 유도 비율 보다 낮았다 (p<0.05). As shown in FIG. 7, hydrogen peroxide was found to be a moderate inducer of EMH-pGL3 vector in HeLa (2.6 fold) and C 2 C 12 cells (2.7 fold). However, heat, low glucose and low pH had little effect on inducibility. Hydrogen peroxide also acted as an inducer of H-pGL3, but the induction rate was lower than that of EMH-pGL3 (p <0.05).
본 실시예의 결과는, 본 발명의 E-M-H-pGL3 벡터가 저산소 조건 뿐만 아니라, 저산소 조건 모사물질 및 과산화 수소에 의하여 성공적으로 조절될 수 있음을 나타내는 것이다. 이는 상기 금속 및 과산화 수소에 의하여도 E-M-H-pGL3에 포함된 유전자 발현을 조절할 수 있으며, 이는 본 발명의 키메라 인핸서 벡터의 유용성을 확장하는 것임을 나타내는 것이다.The results of this example indicate that the E-M-H-pGL3 vector of the present invention can be successfully controlled by hypoxic conditions as well as hypoxic condition mimics and hydrogen peroxide. This can also regulate the gene expression contained in E-M-H-pGL3 by the metal and hydrogen peroxide, indicating that this extends the usefulness of the chimeric enhancer vector of the present invention.
실시예 7 : 뒷다리 (hindlimb) 허혈을 갖는 생쥐 모델에서 인 비보에서 본 발명의 E-M-H-pGL3의 평가Example 7 Evaluation of E-M-H-pGL3 of the Invention in Vivo in a Mouse Model with Hindlim Ischemia
본 실시예에서는 본 발명의 E-M-H-pGL3를 뒷다리 허혈을 갖는 생쥐 모델에서 평가하였다. 주입하는 유전자의 전달 효율을 높이기 위하여 기존에 보고된 전기천공 방법 (Jang HS 등, Mol. Ther. 2004; 9 : 464-474)을 이용하였다. In this example, E-M-H-pGL3 of the present invention was evaluated in a mouse model with hind limb ischemia. In order to increase the delivery efficiency of the gene to be injected, the previously reported electroporation method (Jang HS et al., Mol. Ther. 2004; 9: 464-474) was used.
도 8은 C57BL/6 생쥐의 앞 정강근에 본 발명의 E-M-H-pGL3 벡터를 전달한 2일 후, 한쪽 뒷다리 허혈을 좌측 다리에 도입하고 (0 일), 3일까지 혈류를 모니터링한 결과를 나타내는 도면이다. 패널 A는 C57BL/6 생쥐의 좌측 다리 내의 대퇴부 동맥 (femoral artery)를 절제함으로써 한쪽 뒷다리 허열을 도입하고, 혈류를 모니터링한 레이저 도플러 이미지이다. 패널 B는 정상군에 대한 허혈군의 혈류 비율을 나타내고, 패널 C는 대퇴부 동맥 절제 3일 후 허혈성 앞 정강근을 회수하고, 루시퍼라제 리포터의 활성을 분석하고 얻어진 데이터를 비교한 것이다. 도 8에서 RLU/mg 단백질은 단백질 mg에 대하여 노말라이즈된 상대적 광단위이다. 데이터는 평균 ± 표준편차 (SEM) (n = 6)이다. **, p < 0.01 (스튜던트 t-테스트).8 is a diagram showing the results of monitoring blood flow up to 3 days after introducing the hind limb ischemia into the left leg (day 0) 2 days after delivery of the EMH-pGL3 vector of the present invention to the anterior tibialis muscle of C57BL / 6 mice. . Panel A is a laser Doppler image in which one hind limb is introduced by ablation of the femoral artery in the left leg of C57BL / 6 mice and blood flow is monitored. Panel B shows the blood flow ratio of the ischemic group to the normal group, and Panel C recovers the
도 8의 A에 나타낸 바와 같이, 지정된 시간 지점에서의 대표적 레이저 도플러 이미지에 의하면 파란색으로 표시된 조직 허혈이 관찰되고 있다. 3일 후 각 군에서 혈류가 약간 회복되었다. 상기 관혈류 (perfusion) 신호는 짙은 파란색 (0) 에서 흰색 (1000)까지의 색깔 코드로 나타내었다. 도 8의 B에 나타낸 바와 같이, 25 % 이하의 혈류가 상기 허혈성 다리에서 일어났으며, 이는 인 비보에서 저산소 조건이 성공적으로 유도되었음을 나타내는 것이다. 도 8의 C에 나타낸 바와 같이, 대조군 벡터 (pGL3)에 비하여, 본 발명의 E-M-H-pGL3 벡터는 290.7 배 높은 루시퍼라제 활성을 보였으며, HRE (H-pGL3) 및 HCMV (pcDNA3.1) 벡터에 비하여 각각 3.7 배 및 3.9 배 높은 루시퍼라제 활성을 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 키메라 인핸서를 포함하는 벡터가 동물 모델의 인 비보에서도 효과적으로 작용하고, HRE에 기초한 벡터 보다 더 좋은 유도 효율을 달성한다는 것을 나타낸다. As shown in FIG. 8A, representative isometric Doppler images at designated time points show tissue ischemia shown in blue. After 3 days, blood flow was slightly recovered in each group. The perfusion signal is represented by a color code from dark blue (0) to white (1000). As shown in FIG. 8B, up to 25% of blood flow occurred in the ischemic leg, indicating that hypoxic conditions were successfully induced in vivo. As shown in FIG. 8C, compared to the control vector (pGL3), the EMH-pGL3 vector of the present invention showed 290.7-fold higher luciferase activity, and the HRE (H-pGL3) and HCMV (pcDNA3.1) vectors. It showed 3.7 and 3.9 times higher luciferase activity, respectively. These results indicate that the vector comprising the chimeric enhancer of the present invention works effectively in the in vivo of animal models and achieves better induction efficiency than the vector based on HRE.
본 발명의 실시예에 나타낸 바와 같은, 본 발명의 신규한 키메라 인핸서를 포함하는 벡터는 저산소 조건을 보이는 특정한 영역에 유전자 발현을 표적화하는데 아주 유용한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 종양의 중앙부에서는 생리적 차이로 인하여 세포의 저산소 상태가 야기될 수 있으며, 이는 저산소 조건 반응성 벡터를 이용하여 선택적으로 유전자를 발현시키는데 이용될 수 있다 (Binley 등, Gene Ther. 10, 540-549. 2003). 본 발명의 강력한 키메라 인핸서 벡터는 치료 유전자의 발현을 현저하게 증가시킬 수 있는 수단을 제공하는데 사용될 수 있다. 유전자 발현의 엄격한 제어 (tight control)는 또한 주위 정상 조직에 대한 임의의 손상을 감소시킬 수 있어 치료 결과를 향상시킬 수 있다 (Roscilli 등, Mol Ther. 6, 653-663.2002). 더욱이, 고형 종양의 상기 저산소 영역에 유전자 발현을 표적화함으로써, 낮은 용량의 벡터가 사용될 수 있기 때문에 부작용의 위험이 감소될 수 있다 (Marples 등, Eur J Cancer. 38, 231-239.2002; Greco 등, J Cell Physiol. 197, 312-325. 2003). 이러한 관점에서, 본 발명의 상기 E-M-H 벡터가 LLC1 암 세포 (carcinoma cell)에서 성공적으로 거동한다는 것은 주목할만하다. 허혈질환이 또한 본 발명의 신규한 키메라 벡터의 사용으로부터 도움을 받을 수 있다 (Tang 등, Hypertension. 39, 695-698. 2002). 허혈 영역에서 측부혈관 (collateral vessel)을 증가시키기 위하여 사용된 치료적 혈관신생 (angiogenesis) 전략이 현재는 잘 확립되어 있기 때문에 (Iba 등, Circulation. 106, 2019-2025. 2002), 본 발명의 키메라 벡터는 혈관내피세포 성장 인자 및 bFGF와 같은, 혈관신생 유전자의 저산소 조건 유도에 효과적으로 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명의 실시예에서 C2C12 세포에서 실증된 E-M-H 벡터로부터의 저산소 조건 유도는 상기 허혈성 다리 근육 내에 주입되는 혈관신생 유전자 치료에 시사하는 바가 있다. As shown in the examples of the present invention, vectors comprising the novel chimeric enhancers of the present invention can be used as very useful tools for targeting gene expression to specific regions exhibiting hypoxic conditions. For example, physiological differences in the central part of the tumor can result in a hypoxic state of cells, which can be used to selectively express genes using hypoxic condition reactive vectors (Binley et al., Gene Ther. 10 , 540). -549. 2003). The powerful chimeric enhancer vectors of the present invention can be used to provide a means for significantly increasing the expression of therapeutic genes. Tight control of gene expression can also reduce any damage to surrounding normal tissue, thereby improving treatment outcome (Roscilli et al., Mol Ther. 6 , 653-663.2002). Moreover, by targeting gene expression to the hypoxic regions of solid tumors, the risk of side effects can be reduced because low dose vectors can be used (Marples et al., Eur J Cancer. 38 , 231-239.2002; Greco et al., J). Cell Physiol. 197 , 312-325. 2003). In this respect, it is noteworthy that the EMH vector of the present invention behaves successfully in LLC1 carcinoma cells. Ischemic diseases can also benefit from the use of the novel chimeric vectors of the invention (Tang et al., Hypertension. 39 , 695-698. 2002). Because therapeutic angiogenesis strategies used to increase collateral vessels in the ischemic region are now well established (Iba et al., Circulation. 106 , 2019-2025. 2002), the chimeras of the present invention. Vectors can be used effectively to induce hypoxic conditions of angiogenic genes, such as vascular endothelial growth factor and bFGF. Indeed, induction of hypoxic conditions from EMH vectors demonstrated in C 2 C 12 cells in embodiments of the invention suggests angiogenic gene therapy injected into the ischemic leg muscles.
본 발명의 상기 E-M-H 벡터에 대하여 관찰된 고유도 효과 (hyperinduction effect)는 EBS 및 MRE 자체에 의하여는 저산소 조건 반응성을 부여하지 않기 때문에, 단순히 EBS 및 MRE의 존재 및 독립적 기여에 의하여 설명될 수는 없다. 알려지지 않은 기작에 의하여, EBS 및/또는 MRE에 동원된 (recruit) 단백질 인자가 HRE에 결합된 HIF-1을 활성활시킬 수 있거나, 반대로 HIF-1에 동원된 단백질 인자들이 MTF-1 및 Egr-1을 활성화하는 것을 도울 수 있다. 또다른 가능성은 상기 E-M-H 벡터에서 관찰된 상승작용 (synergism)의 정도를 설명하기 위하여는 HIF-1, Egr-1 및 MTF-1외에, 단백질 인자들이 요구될 수도 있다는 것이다. 비록 Egr-1 및 MTF-1이 HIF-1 및 bHLH/PAS 패밀리와는 독립적으로 작용할 수 있을 지라도 (Bracken 등, , Cell Mol Life Sci. 60, 1376-1393.2003), 상기 3개의 전사 인자가 상호 배타적으로 작용하는지는 현재로는 알려지지 않았다. 한편, Egr-1 및 MTF-1가 활성화되도록 하는 자극 신호 물질을 발견하는 경우 (Bae 등, Cancer Res. 59, 5989-5994, 1999; Saydam 등, J Biol Chem. 277, 20438-20445.2002), 그러한 신호물질은 본 발명의 상기 E-M-H 벡터를 과활성화시키는데 사용될 수 있다. MRE 또는 EBS를 포함하는 유전자의 발현은 산화제, 포르볼 에스테르, 자외선 및 이온화 광선, 글루코코르티코이드 호르몬 및 감염 인자와 같은 다양한 생리적 및 환경적 스트레스에 의하여 유도될 수 있기 때문에, 그러한 신호 물질이 유도 비율을 증가시키고 다른 조절 물질로서 작용할 수 있는지 시험할 필요가 있다. Since the hyperinduction effect observed for the EMH vector of the present invention does not impart hypoxic reactivity by EBS and MRE itself, it cannot simply be explained by the presence and independent contribution of EBS and MRE. . By unknown mechanisms, protein factors recruited to EBS and / or MRE may activate HIF-1 bound to HRE, or conversely, protein factors recruited to HIF-1 may be associated with MTF-1 and Egr-. Can help activate one. Another possibility is that protein factors may be required in addition to HIF-1, Egr-1 and MTF-1 to account for the degree of synergism observed in the EMH vector. Although Egr-1 and MTF-1 can act independently of the HIF-1 and bHLH / PAS families (Bracken et al., Cell Mol Life Sci. 60 , 1376-1393.2003), these three transcription factors are mutually exclusive. It is unknown at this time. On the other hand, when stimulatory signal substances are detected that cause Egr-1 and MTF-1 to be activated (Bae et al., Cancer Res. 59 , 5989-5994, 1999; Saydam et al., J Biol Chem. 277 , 20438-20445.2002), such Signaling materials can be used to overactivate the EMH vector of the invention. Since expression of genes comprising MRE or EBS can be induced by a variety of physiological and environmental stresses such as oxidants, phorbol esters, ultraviolet and ionizing rays, glucocorticoid hormones and infectious agents, such signal substances can increase the rate of induction. It is necessary to test whether it can increase and act as another regulatory substance.
본 발명의 벡터의 일 예인 E-M-H-pGL3 벡터는 부다페스트조약에 의한 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2004년 8월 26일자로 기탁되었다 (수탁번호 KCCM-10590).An E-M-H-pGL3 vector, an example of the vector of the present invention, was deposited on August 26, 2004 to the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM), an international depository institution under the Budapest Treaty (Accession No. KCCM-10590).
본 발명의 벡터에 의하면, 저산소 조건 및 금속에 의하여 높은 효율로 유도될 수 있다. 본 발명의 벡터는 암 및 허혈 질환의 치료에서 치료 유전자를 선택적으로 발현시키는데 널리 적용될 수 있다.According to the vector of the present invention, it can be induced with high efficiency by low oxygen condition and metal. The vectors of the present invention can be widely applied to selectively express therapeutic genes in the treatment of cancer and ischemic diseases.
본 발명의 유전자를 저산소 조건 또는 고농도의 금속이 존재하는 조건에서 특이적으로 발현시키는 방법에 의하면, 저산소 영역 또는 고농도의 금속이 존재하는 조직에 특이적으로 유전자를 발현시킬 수 있다.According to the method of specifically expressing the gene of the present invention under conditions of low oxygen or high concentration of metal, the gene can be specifically expressed in tissues in which a low oxygen region or high concentration of metal is present.
본 발명의 개체 내의 암 또는 허혈증을 치료하는 방법에 의하면, 개체 내의 암 또는 허혈증을 치료할 수 있다. The method for treating cancer or ischemia in a subject of the invention can treat cancer or ischemia in a subject.
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