KR100639256B1 - Composition of Continuous Synthetic Solution for In Vitro Development of Human Embryos and Culture Method Using the Same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배아의 체외발생을 위한 배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법에 관한 것으로서, 보다 상세히는 시험관아기시술 프로그램에서 배아의 초기배, 상실배 및 후기배 성장 단계에서 합성배양완충액(synthetic culture buffer, 이후 "SCB")을 사용하고 각각의 단계별로 SCB에 각 단계에 적합한 각각의 합성첨가용액(synthetic additive solution)을 15％ (v/v)의 수준으로 사용함으로써 성장하는 배아에게 보다 생리적인 영양을 공급하여 시험관아기시술의 성공률을 높게 유지시킬 수 있으며 모든 단계에서 화학적으로 조성분이 분명한 용액을 사용하기 때문에 배양되는 배아의 영양적 요구를 숙지하고 연구해 나가는데 크게 기여할 수 있는 배양 조성물 및 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition of a culture medium for in vitro development of embryos and to a culture method using the same, more specifically, in the early embryonic, lost embryo and late embryonic growth stage of embryos in an in vitro embryo procedure program (synthetic culture buffer, "SCB") and then each step, using the appropriate synthetic additive solution for each step in the SCB at a level of 15% (v / v) for more physiological nutrition for growing embryos. It is possible to maintain the success rate of in vitro fertilization by using a chemically formulated solution at all stages, and to provide a culture composition and a culture method that can greatly contribute to understanding and studying the nutritional needs of cultured embryos. will be.
본 발명에 따른 배아의 체외발생을 위한 배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법에 의하면 이를 기초로 하여 각 단계에서 성장하는 배아에게 보다 생리적인 영양을 공급하고 이를 통해 착상율과 임신율을 전통적인 공배양체계보다 더 높게 유지시킬 수 있으며, 여러 가지 세포들과 공배양(coculture)이 가능하여 공배양으로부터 유래되는 성장인자(growth factor)나 생리활성물질(cytokine)들을 발견하고 그 기능들을 찾아내는데 크게 기여할 수 있다는 효과가 있다.According to the composition of the culture medium for the in vitro development of the embryo according to the present invention and the culture method using the same, the physiological nutrition is supplied to the embryo growing at each stage based on this, and the implantation rate and pregnancy rate are more than that of the conventional coculture system. It can be kept high and can be cocultured with various cells, which can greatly contribute to the discovery of growth factors or cytokines derived from cocultures and their functions. There is.
Description
도 1은 일반적인 시험관 아기 시술의 절차를 나타내는 흐름도.1 is a flow chart showing the procedure of a general in vitro baby procedure.
도 2는 과배란을 유도한 환자의 난자로부터 생산한 배아를 체외배양하고 난자채취 3일째에 배아를 이식했을 때, 전통공배양방법과 본 발명에 따른 배양액 및 방법의 비교 도면.Figure 2 is a comparison of the traditional co-cultivation method and the culture medium and the method according to the present invention when the embryo produced from the egg of the patient inducing over ovulation in vitro and transplanted the embryo on the 3rd day of egg collection.
도 3은 과배란을 유도한 환자의 난자로부터 생산한 배아를 체외배양하고 난자채취 5일째에 배아를 이식했을 때, 전통공배양방법과 본 발명에 따른 배양액 및 방법의 비교 도면.Figure 3 is a comparison of the traditional co-culture method and the culture medium and the method according to the present invention when the embryos produced from the oocytes of the patient inducing over ovulation in vitro and transplanted embryos on the 5th day of the oocyte extraction.
도 4는 과배란을 유도한 환자의 난자로부터 생산한 배아를 체외배양하고 난자채취 3일째나 5일째에 배아를 이식한 후 포배기 배아의 동결보존, 융해 및 이식에 대해 전통공배양방법과 본 발명에 따른 배양액 및 방법의 비교 도면.Figure 4 is a conventional co-cultivation method and the present invention for cryopreservation, thawing and transplantation of blastocyst embryos after in vitro culture of embryos produced from eggs of patients inducing hyperovulation and transplanting embryos on the third or fifth day of oocyte extraction. Comparative diagram of the culture medium and the method according to.
도 5는 본 발명에 따른 사람 배아의 체외발생을 위한 연속합성배양액들의 조성물을 나타내는 도면.Figure 5 is a view showing the composition of the continuous synthetic culture fluid for in vitro development of human embryos according to the present invention.
도 6은 본 발명에 따른 배아의 체외발생을 위한 연속합성배양액들의 기초가 되는 합성배양완충액의 조성을 나타내는 도면.Figure 6 is a view showing the composition of the synthetic culture buffer that is the basis of the continuous synthetic culture solution for in vitro development of the embryo according to the present invention.
도 7은 본 발명에 따른 배아의 체외 발생을 위한 연속합성배양액들의 기초가 되는 초기배, 상실배 및 후기배의 성장용 합성첨가용액들의 조성을 나타내는 도면.7 is a view showing the composition of the synthetic additive solution for the growth of the early embryo, the loss embryo and the late embryo as the basis of the continuous synthetic culture solution for the in vitro development of the embryo according to the present invention.
도 8은 합성배양완충액과 초기배 및 상실배의 성장용 합성첨가용액에 사용되는 합성비필수아미노산 용액(SNEaaS, x 66.67)의 조성을 나타내는 도면.8 is a view showing the composition of the synthetic non-essential amino acid solution (SNEaaS, x 66.67) used in the synthetic culture buffer solution and the synthetic additive solution for the growth of the initial embryo and the loss embryo.
도 9는 합성배양완충액과 초기배 및 상실배의 성장용 합성첨가용액에 사용되는 합성필수아미노산 용액(SEaaS, x 66.67)의 조성을 나타내는 도면.9 is a view showing the composition of the synthetic essential amino acid solution (SEaaS, x 66.67) used in the synthetic culture buffer solution and the synthetic additive solution for the growth of the initial embryo and the loss embryo.
도 10은 상실배 및 후기배 성장용 합성첨가용액에 사용되는 합성비필수아미노산 용액(SNEaaS46, x 66.67)의 조성을 나타내는 도면.10 is a view showing the composition of the synthetic non-essential amino acid solution (SNEaaS46, x 66.67) used in the synthetic additive solution for the loss and late embryo growth.
도 11은 상실배 및 후기배 성장용 합성첨가용액에 사용되는 합성필수아미노산 용액(SEaaS46, x 66.67)의 조성을 나타내는 도면.FIG. 11 is a diagram showing the composition of the synthetic essential amino acid solution (SEaaS46, x 66.67) used in the synthetic additive solution for growth and late pear growth. FIG.
본 발명은 배아의 체외발생을 위한 배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법에 관한 것으로서, 보다 상세히는 시험관아기시술 프로그램에서 배아의 발생단계에서 합성배양완충액(synthetic culture buffer, 이후 "SCB")을 사용하고 각각의 단계별로 SCB에 각 단계에 적합한 각각의 합성첨가용액(synthetic additive solution)을 15％ (v/v)의 수준으로 사용함으로써 성장하는 배아에게 보다 생리적인 영양을 공급하여 시험관아기시술의 성공률을 높게 유지시킬 수 있으며 모든 단계에서 화학적으로 조성분이 분명한 용액을 사용하기 때문에 배아의 영양적 요구를 숙지하고 연구해 나가는데 크게 기여할 수 있는 배양 조성물 및 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition of a culture solution for in vitro development of embryos and a culture method using the same, more specifically, using a synthetic culture buffer (hereinafter referred to as "SCB") in the embryonic development stage in an in vitro embryo procedure program For each step, the SCB uses 15% (v / v) of each synthetic additive solution suitable for each step to provide more physiological nutrition to growing embryos to improve the success rate of in vitro embryo procedures. The present invention relates to a culture composition and a method of cultivation that can be kept high and contribute significantly to knowing and studying the nutritional requirements of embryos because of the use of chemically clear solutions at all stages.
사람의 체외수정 및 배아이식(시험관아기시술) 프로그램은 체외에서 남편의 정자와 함께 난자를 배양하고 수정된 배아를 여성의 자궁 내에 이식하는 시술로써 불임을 극복하기 위한 매우 진보적인 방법이라 할 수 있다.Human in vitro fertilization and embryonic procedures are a very progressive way to overcome infertility by incubating eggs with her husband's sperm in vitro and transplanting fertilized embryos into the woman's womb. .
Steptoe와 Edwards(1978)는 시험관아기시술을 처음으로 성공하였다. 그러한 성공은 생식도관의 물리적 폐쇄, 내분비학적 불임, 원인불명의 불임, 남성 불임, 면역성 불임, 자궁 내막증, 자궁경부 이상, 다낭성 난소증, 착상 전 유전진단 및 난소의 기능부전 등의 다양한 새로운 불임치료와 그 연구들을 이끌었다.Steptoe and Edwards (1978) succeeded for the first time in vitro baby procedures. Such success has led to a variety of new infertility treatments, including physical obstruction of the reproductive tract, endocrine infertility, unexplained infertility, male infertility, immune infertility, endometriosis, cervical abnormalities, polycystic ovary, preimplantation genetic diagnosis and ovarian insufficiency. And led the studies.
시험관아기시술 프로그램은 일반적으로 도 1에서 보는 바와 같다.In vitro baby procedure programs are generally as shown in FIG. 1.
다배란 유도주기(hyperstimulated cycle) 혹은 자연주기(natural cycle)에서 난자를 채취할 수 있다. 일반적으로 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone, FSH)과 사람의 폐경기성선자극호르몬(human menopausal gonadotropin, HMG)을 성선자극호르몬 방출호르몬(gonadotropin releasing hormone, GnRH)의 유사체 (agonist) 혹은 길항체(antagonist)와 함께 투여하므로써 다배란유도(controlled ovarian hyperstimulation, COH)를 실시한다(도 1의 가). 10,000 IU의 사람의 융모막호르몬(human chorionic gonadotropin, HCG)을 투여(도 1의 나)한 36시간 후에 질식초음파를 이용하여 난자채취를 실시한다(도 1의 다). 성숙한 난자는 4∼6시간 후에 정자와 함께 배양(insemination)하거나 세포질내에 정자를 직접주입(intracytoplasmic sperm injection, 이하 "ICSI")함으로써 수정을 유도(도 1의 마 )한 반면, 미성숙한 난자는 성숙용 배양액에서 성숙을 유도하기 위하여 8∼24시간 동안 배양(도 1의 라)한 다음 정자를 배양접시에 주입하거나 ICSI를 실시함으로써 수정을 유도한다(도 1의 마). 정상적으로 수정된 난자의 판별은 수정을 유도한 18∼20시간 후에 자웅전핵 및 제 2극체의 존재여부로 실시된다(도 1의 바). 수정된 모든 난자는 20 microliter의 성장용 배양액에서 5일 동안 배양한다.Oocytes can be harvested in the hyperstimulated cycle or in the natural cycle. In general, follicle stimulating hormone (FSH) and human menopausal gonadotropin (HMG) can be used as an analog or antagonist of gonadotropin releasing hormone (GnRH). By administering in conjunction with controlled ovarian hyperstimulation (COH) is performed (a of Figure 1). After 36 hours of administering 10,000 IU of human chorionic gonadotropin (HCG) (Fig. 1B), egg harvesting is performed using choking ultrasound (Fig. 1). Mature eggs were fertilized by incubation with sperm after 4-6 hours or by intracytoplasmic sperm injection (“ICSI”) (Fig. 1), whereas immature eggs matured. In order to induce maturation in the solution culture for 8 to 24 hours (Fig. 1 D) and then fertilization by injecting sperm into the culture dish or by conducting ICSI (e) (Fig. 1). Normally fertilized eggs are identified by the presence of the uterine pronucleus and the second polar body 18 to 20 hours after induction of fertilization (Fig. 1). All fertilized eggs are incubated for 5 days in 20 microliter growth medium.
대부분의 시험관아기시술 프로그램은 수정을 유도한 2∼3일 후에 주로 4∼8 세포기까지 분열한 배아를 자궁에 이식하므로써 마무리하는 것이 일반적이다(도 1의 아). 이것은 체외에서 그 이상 배양하게 되면(도 1의 차) 배아에서 퇴화의 증후가 나타날 수 있다는 두려움이 앞서기 때문이다. 이식한 배아 당 아기의 출생빈도로 볼 때 상대적으로 아주 적은 배아만(10∼15％)이 시험관아기시술 프로그램을 통하여 착상하고 출생아기가 되고 있다(Gardner and Lane, 1997, 1998). 이와 같이 낮은 착상율은 적절한 임신율을 얻기 위하여 질적으로 다양한 배아들을 많이 이식하고 있기 때문이다. 배양한 배아들 중에 포배기까지 발달한 배아는 자궁과 생리적으로 일치할 뿐만 아니라 발육이 부진한 배아들과 구분되므로 낮은 착상율에 따른 문제점을 어느 정도 해결할 수 있다(Lopata, 1983; Gardner and Sakkas, 2003). 실제로 Buster 등(1985)은 체내에서 발생한 후에 인위적으로 채집한 포배기 배아(이하 "포배")를 수여자 (recipient)들의 자궁에 이식하였던 바 60％의 높은 착상율을 나타냈다고 보고하였다. 그러므로 시험관아기시술 프로그램에서 포배의 이식이 신중하게 고려되어야 한다(Gardner and Lane, 1997). 따라서 사람의 배아가 포배기까지 발달할 수 있는 배양체계를 확립하는 것은 매우 중요하다(Menezo 등, 1995; Karaki 등, 2002).Most in vitro pediatric program programs are usually completed by transplanting embryos divided into 4 to 8 cell stages into the uterus two to three days after induction of fertilization (Fig. 1). This is due to the fear that further culture in vitro (the tea of FIG. 1) may lead to degenerative symptoms in the embryo. Only a relatively small number of embryos (10-15%) are implanted and born through in vitro pediatric programs (Gardner and Lane, 1997, 1998). This low implantation rate is due to the fact that many different embryos are transplanted qualitatively to obtain a proper pregnancy rate. Among cultured embryos, embryos developed up to blastocyst are not only physiologically matched to the uterus but also distinguished from underdeveloped embryos, which can solve some of the problems caused by low implantation rate (Lopata, 1983; Gardner and Sakkas, 2003). In fact, Buster et al. (1985) reported that implantation of artificially collected blastocyst embryos (hereafter referred to as "blastocysts") after development in the body resulted in a high implantation rate of 60%. Therefore, transplantation of blastocysts in an in vitro baby program should be carefully considered (Gardner and Lane, 1997). Therefore, it is very important to establish a culture system in which human embryos can develop up to blastocysts (Menezo et al., 1995; Karaki et al., 2002).
시험관아기 연구실은 시험관 아기시술의 성공률을 결정하는데 결정적인 역할을 한다. 시험관아기시술의 성공에 가장 중요한 것은 사용하는 배양액의 조성물(composition)과 그 질(quality)이라 할 수 있다(Cooke 등, 2002).In vitro baby laboratories play a crucial role in determining the success rate of in vitro baby procedures. The most important factor for the success of an in vitro baby procedure is the composition and quality of the culture medium used (Cooke et al., 2002).
지금까지 대부분의 전통적인 배양체계는 배아가 자궁에 착상하기 전까지 모든 배양기간 동안에 한 종류의 배양액으로 배양함으로써 정적인 배양 상을 유지하였다. 모든 포유동물 배아가 착상하기 전에 난관을 따라 자궁으로 이동하며 생명을 유지하고 있기 때문에(Leese 등, 2001) 배아의 배양액들이 자성(female)생식도관의 환경에 맞는 보다 생리적인 근거에 기초가 되어야 할 것이다(Gardner and Lane, 1997). 그러므로 난자가 적절하게 포배로 발생하는 것은 수정에 특화된 배양액(정상수정과 ICSI), 초기 배아(이후 "초기배")의 발생에 특화된 배양액, 상실배기 배아(이후 "상실배")에 특화된 배양액 및 후기 배아(이후 "후기배")의 포배발생에 특화된 배양액이 필요로 할 것이다. 실질적으로 상실배나 포배에 유익한 조건, 즉 높은 수준의 포도당과 필수 아미노산들이 분열하고 있는 초기배의 발생에 손상을 주는 것으로 보고되어 왔다. 유사하게도 수정기간에 정자의 활력을 높여주기 위하여 상대적으로 높은 포도당이 필요하지만 초기배의 발생에는 그렇지 않다는 것이 보고되었다.Until now, most traditional culture systems have maintained a static culture by culturing with one type of culture for all culture periods before embryos implant in the uterus. Because all mammalian embryos move through the fallopian tubes to the uterus and maintain their life before implantation (Leese et al., 2001), embryo cultures should be based on more physiological grounds for the environment of the female reproductive tract. (Gardner and Lane, 1997). Therefore, the proper blastocyst development occurs in cultures specialized for fertilization (normal fertilization and ICSI), cultures specialized for the development of early embryos (hereafter "initial embryos"), cultures specialized for embryonic embryos (hereinafter "lost embryos"), and Cultures specialized for blastocysts of late embryos (hereinafter "late embryos") will be needed. Substantially beneficial conditions for loss and culturing have been reported, namely damaging the development of early embryos that cleave high levels of glucose and essential amino acids. Similarly, it has been reported that relatively high glucose is required to boost sperm vitality during fertilization but not early embryo development.
따라서 성공적인 시험관아기 시술을 위하여 성숙용 배양액, 수정용 배양액을 비롯하여 배아의 성장용 배양액을 특화하여 개발하는 것이 과제가 되었다.Therefore, it was a challenge to develop and develop an embryo culture medium, including a culture medium for fertilization, a fertilization solution for successful embryo therapy.
체세포와 배아의 공동배양(이하 "공배양")은 높은 착상율을 제공하는 포배를 생산하는 배양방법의 하나이다(Bongso 등, 1992a). 공배양세포들이 배아의 영양요인들(embryotrophic factors)을 방출하여 배아에게 유익한 영향을 주고(Lim 등, 1993) 배양액 내에 독성물질들을 섭취하여 그들이 배아에 노출되는 것을 막는 역할을 하는 것으로 알려져 왔다(Bavister, 1992). Quinn (1994)은 난구세포가 사람의 배아를 공배양할 수 있도록 이미 준비된 공배양 세포라고 제시하였다. 그러나 하나의 배양체계 내에서 배아와 공배양세포를 동시에 지지하는 배양액이 필요로 하기 때문에 공배양체계를 적용하는 것은 신중히 고려해야 한다. 또한 공배양체계는 공배양세포의 조건을 최적화해야 하기 때문에 한정된 배양액(defined medium)의 개발 및 적용에 있어서 많은 혼선을 초래할 수 있다. 따라서 시험관아기시술 프로그램에서 배아의 환경적 생리적 변화를 가만한 배양조건들을 확립하기 위해서는 궁극적으로 공배양체계를 이용하지 않는 것이 바람직할 것이다(Watson 등, 2004).Coculture of somatic cells and embryos ("coculture") is one of the culture methods that produce blastocysts that provide high implantation rates (Bongso et al., 1992a). Co-culture cells have been known to release embryos' nutritional factors that have a beneficial effect on embryos (Lim et al., 1993) and to ingest toxic substances in culture to prevent their exposure to embryos (Bavister , 1992). Quinn (1994) suggested that the oocytes were co-cultured cells ready for coculture of human embryos. However, the application of co-cultures should be carefully considered, because a culture medium that supports both embryos and co-culture cells in one culture system is required. In addition, the co-culture system may cause a lot of confusion in the development and application of the defined medium (defined medium) because it is necessary to optimize the conditions of the co-culture cells. Therefore, it may be desirable to ultimately avoid the use of co-culture systems in order to establish culture conditions that are likely to undergo environmental and physiological changes in embryos in in vitro program (Watson et al., 2004).
배아가 1-세포기에서 포배기까지 발달할 때 생리적 영양적 요구의 변화에 따른 몇 가지 배양액들이 개발되어 왔다. 이제 배아의 배양액들이 자성생식도관의 생리적 환경에 보다 접근하고 있다(Gardner and Lane, 1997). G1.2와 G2.2 배양액(Gardner 와 Lane, 2003), Universal IVF 와 M3 배양액 (Barak 등, 1998), P1 과 Blastocyst 배양액 (Alves da Motta 등, 1998; Boostanfar 등, 2001; Westphal 등, 2003)이 그러한 배양액들의 예이다. 자궁액 내에 들어 있는 모든 대사물질들은 난관액이 함유하고 있는 것들과 유의하게 차이가 있다고 보고되고 있다(Gardner 등, 1996).As embryos develop from the 1-cell stage to the blastocyst stage, several cultures have been developed in response to changes in physiological and nutritional needs. Embryonic cultures are now approaching the physiological environment of the female reproductive tract (Gardner and Lane, 1997). G1.2 and G2.2 cultures (Gardner and Lane, 2003), Universal IVF and M3 cultures (Barak et al., 1998), P1 and Blastocyst cultures (Alves da Motta et al., 1998; Boostanfar et al., 2001; Westphal et al., 2003) These are examples of such cultures. All metabolites in the uterine fluid have been reported to differ significantly from those contained in the fallopian juice (Gardner et al., 1996).
그러나 시험관아기시술 프로그램에서 이용하고 있는 상용화된 연속배양액들 (sequential media)을 구성하고 있는 조성분이나 보다 진전된 배양액의 연구를 시도하는데 있어서 각 성분들의 농도들을 알아내는 것이 매우 어려운 실정이다.However, it is very difficult to find out the concentrations of each component when attempting to study the composition of the commercially available sequential media or the more advanced cultures used in the in vitro pediatric program.
근래에 적합성이 정상에 미치지 않는 배양액에 상용화한 몇 가지 혈청조합물들을 첨가함으로써 배양환경이 긍정적으로 나아지고 있다. 그러나 합성혈청대체제(synthetic serum substitute, SSS)를 포함한 상용화한 모든 혈청조합물들은 어떤 조성분들이 얼마나 많이 그 용액에 포함하고 있는지를 인식하기가 어렵다. 인간 난자의 체외성숙 및 수정 그리고 배아에 대한 배양체계를 생화학적으로 명확하게 확립하기 위해서는 배양액과 첨가용액내의 조성분은 물론 각 성분의 농도 및 기능들을 인식하는 것이 매우 중요하다. 배양액이 아미노산, 바이타민, 인슐린, 상피세포성장인자 및 트렌스페린의 조합들을 다르게 포함하고 있을 때 난자 및 포배의 에너지 대사에 많은 차이가 있다(Gardner and Sakkas, 1993). 그러므로 최소한의 여러가지 성장인자들, 알부민, 글로불린 및 생리활성인자들을 배양액의 첨가제에 포함시키는 것이 시험관아기시술 프로그램에서 중요할 것 이다.Recently, the culture environment has been positively improved by adding several commercially available serum combinations to cultures that are less than adequate. However, all commercially available serum combinations, including synthetic serum substitutes (SSS), are difficult to recognize how much of a composition is contained in the solution. In order to clearly establish the in vitro maturation and fertilization of human eggs and the culture system for embryos, it is very important to recognize the concentration and functions of each component as well as the components in the culture solution and the addition solution. There are many differences in the energy metabolism of eggs and blastocysts when the cultures contain different combinations of amino acids, vitamins, insulin, epidermal growth factor and transferrin (Gardner and Sakkas, 1993). Therefore, the inclusion of a minimum of several growth factors, albumin, globulin and bioactive factors in the culture additives will be important in the in vitro baby program.
본 발명은 상기 기술의 문제점을 극복하기 위해 안출된 것으로, 시험관아기시술 프로그램에서 난자의 체외성숙, 체외수정, 초기 배아의 성장, 상실배 배아의 성장 및 후기 배아의 성장 중 특히 배아 발생에서 초기배, 상실배 및 후기배에 대한 각 단계에서 성장하는 배아에게 보다 생리적인 영양을 공급할 수 있는 연속합성 배양액들의 조성물 및 이를 이용한 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention has been made to overcome the problems of the above technique, and in vitro embryo maturation, in vitro fertilization, early embryo growth, embryonic embryo growth and late embryo growth, especially in embryo development An object of the present invention is to provide a composition of continuous synthetic cultures capable of supplying more physiological nutrition to embryos growing at each stage of the embryonic and late embryos, and a culture method using the same.
본 발명의 다른 목적은 배아가 자궁에 이식하였을 때 착상율과 임신율을 높 게 유지시키며 배양되는 배아의 영양적 요구를 연구하고 숙지해 나갈 수 있도록 모든 단계에서 화학적으로 조성분과 그 농도가 명백한 연속적 합성 배양체계를 구축하기 위한 배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to continuously maintain the implantation rate and pregnancy rate when the embryo is implanted into the uterus, and to continuously study and understand the nutritional requirements of the cultured embryos. It is to provide a composition of a culture solution for culturing the system and a culture method using the same.
이하 본 발명의 바람직한 실시 예를 상세하게 설명하도록 한다.Hereinafter will be described in detail a preferred embodiment of the present invention.
수정된 난자, 즉 "배아"의 판별은 수정을 유도한 18∼20시간 후에 자웅전핵 및 제2극체를 관찰함으로써 실시된다.The determination of the fertilized egg, ie the "embryo", is carried out by observing the herniated pronucleus and the second polar body 18 to 20 hours after induction of fertilization.
정상적인 모든 1일령 배아를 모아서 15％ (v/v)의 초기배 성장용 합성첨가용액(synthetic additive solution for early growth, 이후 "SAG13"라고도 표기)을 첨가한 20 microliter의 SCB에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 3일령 배아를 15％ (v/v)의 상실배 성장용 합성첨가용액(synthetic additive solution for morula growth, 이후 "SAG34"라고도 표기)을 첨가한 20 microliter의 SCB에서 24시간 동안 배양하며, 4일령 배아를 15％ (v/v)의 후기배 성장용 합성첨가용액(synthetic additive solution for late growth, 이후 "SAG46"라고도 표기)을 첨가한 20 microliter의 SCB에서 48시간 동안 배양한다. 구체적인 과정은 다음과 같다.All normal 1-day-old embryos were collected and incubated for 48 hours in 20 microliter SCB with 15% (v / v) synthetic additive solution for early growth (also referred to as "SAG13"). 3 days old embryos were then incubated for 24 hours in 20 microliter SCB with 15% (v / v) synthetic additive solution for morula growth (hereinafter also referred to as "SAG34"), Four-day-old embryos are incubated for 48 hours in 20 microliter SCB with 15% (v / v) synthetic additive solution for late growth (hereinafter also referred to as "SAG46"). The specific process is as follows.
도 5는 본 발명에 따른 배아의 체외 발생을 위한 각 단계에서 필요로 하는 합성배양액들의 조성물을 나타내는 도면이고, 도 6은 본 발명에 따른 배아의 체외발생을 위한 연속합성배양액들의 기초가 되는 합성배양완충액의 조성을 나타내는 도면이며, 도 7은 본 발명에 따른 배아의 체외발생을 위한 배양액들의 기초가 되는 초기배, 상실배 및 후기배의 성장용 합성첨가용액들의 조성을 나타내는 도면이다.5 is a view showing the composition of the synthetic culture solution required in each step for the in vitro development of the embryo according to the present invention, Figure 6 is a synthetic culture that is the basis of the continuous synthetic culture medium for the in vitro development of the embryo according to the present invention Figure 7 is a view showing the composition of the buffer, Figure 7 is a view showing the composition of the synthetic addition solution for the growth of the early embryo, the loss embryo and the late embryo that is the basis of the culture solution for the in vitro development of the embryo according to the present invention.
도 5 내지 도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 배아의 상태에서 초기배의 성장을 위한 배양액의 조성물, 즉 초기배 성장용 합성배양액은 합성배양완충액(SCB)과 초기배 성장용 합성첨가용액(SAG13)이 부피비(v/v) 85:15로 혼합되어 있는 것을 의미하며, 먼저 합성배양완충액은 초순수 1리터에 용해된 것으로, 각 성분의 배합농도는 NaCl 91.53 mM, KCl 5.00 mM, MgSO4.7H2O 0.80 mM, CaCl2.2H2O 1.80 mM, Na2HPO4 0.17 mM, KH2PO4 0.08 mM, KHCO3 5.00 mM, NaHCO3 20.00 mM, 피루브산나트륨(Sodium pyruvate) 0.10 mM, D,L-젖산나트륨(D,L-Sodium lactate) 11.74 mM, D-글루코스(D-glucose) 0.58 mM, SNEaaS(x 66.67) 15.0 ml, SEaaS(x 66.67) 15.0 ml, L-아라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 0.6110 mM, 글리실-L-글루타민.H2O(Glycyl-L-glutamine.H2O) 0.3594 mM, D-Ca-판토텐산(D-Ca-pantothenate) 3.00E-03 mM, 염화콜린(Choline chloride) 7.16E-04 mM, 엽산(Folic acid) 2.27E-04 mM, i-이노시톨(i-inositol) 1.11E-03 mM, 니코틴산아미드(Nicotinamide) 8.19E-04 mM, 피리독살염산(Pyridoxal HCl) 4.91E-04 mM, 리보플라빈(Riboflavin) 2.66E-05 mM, 티아민 염산(Thiamine HCl) 2.96E-04 mM, 페니실린-G(Penicillin-G) 0.1052 mM, 스트렙토미신-S(Streptomycin-S) 0.0172 mM, 페놀 레드(Phenol red) 0.003 mM 로 구성되어 있다 (도 6 참조).5 to 7, the composition of the culture solution for the growth of the early embryo in the state of the embryo according to the present invention, that is, the synthetic culture medium for the growth of the early embryo synthetic synthetic buffer (SCB) and the synthetic additive solution for the early embryo growth ( SAG13) is mixed in a volume ratio (v / v) of 85:15. First, the synthetic culture buffer is dissolved in 1 liter of ultrapure water, and the concentration of each component is 91.53 mM, KCl 5.00 mM, MgSO 4. 7H 2 O 0.80 mM, CaCl 2. 2H 2 O 1.80 mM, Na 2 HPO 4 0.17 mM, KH 2 PO 4 0.08 mM, KHCO 3 5.00 mM, NaHCO 3 20.00 mM, Sodium pyruvate 0.10 mM, D, L-Sodium lactate 11.74 mM, D-glucose 0.58 mM, SNEaaS (x 66.67) 15.0 ml, SEaaS (x 66.67) 15.0 ml, L-Aranyl-L-glutamine (L-alanyl-L-glutamine ) 0.6110 mM, glycyl -L- glutamine .H 2 O (glycyl-L- glutamine.H 2 O) 0.3594 mM, D-Ca- pantothenic Acid (D-Ca-pantothenate) 3.00E -03 mM, Choline chloride 7.16E-04 mM, Folic acid 2.2 7E-04 mM, i-inositol 1.11E-03 mM, Nicotinamide 8.19E-04 mM, Pyridoxal HCl 4.91E-04 mM, Riboflavin 2.66E- 05 mM, Thiamine HCl 2.96E-04 mM, Penicillin-G 0.1052 mM, Streptomycin-S 0.0172 mM, Phenol red 0.003 mM (See Figure 6).
여기서, 상기 합성배양완충액의 조성 중 SNEaaS(x 66.67)은 H2O 55555.56 mM, 37.5％로 희석된 염산(HCl) 100 mM, L-아스파라긴.H2O(L-asparagine.H2O) 6.5867 mM, L-아스파르트산(L-aspartic acid) 0.5400 mM, L-글루탐산(L-glutamic acid) 5.3 mM, L-프롤린(L-proline) 8.34 mM, L-세린(L-serine) 4.6467 mM, L-타우린(L-taurine) 1.5333 mM 으로 구성된다. (도 8 참조)In the composition of the synthetic culture buffer, SNEaaS (x 66.67) is H 2 O 55555.56 mM, 100 mM hydrochloric acid (HCl) diluted with 37.5%, L-asparagine. H 2 O (L-asparagine.H 2 O) 6.5867 mM, L-aspartic acid 0.5400 mM, L-glutamic acid 5.3 mM, L-proline 8.34 mM, L-serine 4.6467 mM, L It consists of 1.5333 mM L-taurine. (See FIG. 8)
또한, 상기 합성배양완충액의 조성 중 SEaaS(x 66.67)은 H2O 55555.56 mM, NaOH 100.0 mM, L-아르기닌(L-arginine) 4.3933 mM, L-시스테인 1.64 mM, L-히스티딘(L-histidine) 5.2733 mM, L-이소류신(L-isoleucine) 1.9867 mM, L-류신(L-leucine) 3.5600 mM, L-리신(L-lysine) 8.2467 mM, L-메티오닌(L-methionine) 1.0333 mM, L-페닐알라닌(L-phenylalanine) 2.3400 mM, L-트레오닌(L-threonine) 7.6533 mM, L-트립토판(L-tryptophan) 2.3000 mM, L-티로신(L-tyrosine) 1.9467 mM, L-발린(L-valine) 9.0600 mM 으로 구성된다. (도 9 참조)In addition, SEaaS (x 66.67) in the composition of the synthetic culture buffer H 2 O 55555.56 mM, NaOH 100.0 mM, L-arginine (L-arginine) 4.3933 mM, L-cysteine 1.64 mM, L-histidine (L-histidine) 5.2733 mM, L-isoleucine 1.9867 mM, L-leucine 3.5600 mM, L-lysine 8.2467 mM, L-methionine 1.0333 mM, L-phenylalanine (L-phenylalanine) 2.3400 mM, L-threonine 7.6533 mM, L-tryptophan 2.3000 mM, L-tyrosine 1.9467 mM, L-valine 9.0600 It consists of mM. (See FIG. 9)
배아의 발생 및 성장을 위한 배양액 중 초기배의 성장용 합성첨가용액(SAG13)은 초순수 1리터에 용해된 것으로, 각 성분의 배합농도는 NaCl 14.44 mM, KCl 5.00 mM, MgSO4.7H2O 3.5 mM, CaCl2.2H2O 1.8 mM, Na2HPO4 0.17 mM, KH2PO4 0.08 mM, KHCO3 5.00 mM, NaHCO3 20.00 mM, 피루브산나트륨(Sodium pyruvate) 1.57 mM, D,L-젖산나트륨(D,L-Sodium lactate) 73.47 mM, D-글루코스(D-glucose) 0.05 mM, Na2EDTA.2H2O 0.1 mM, SNEaaS(x 66.67) 15.0 ml, SEaaS(x 66.67) 15.0 ml, L-아라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 0.6110 mM, 글리실-L-글루타민.H2O(Glycyl-L-glutamine.H2O) 0.3594 mM, L-타우린(L-Taurine) 1.18 mM, D-Ca-판토텐산(D-Ca- pantothenate) 3.00E-03 mM, 염화콜린(Choline chloride) 7.16E-04 mM, 엽산(Folic acid) 2.27E-04 mM, i-이노시톨(i-inositol) 1.11E-0.3 mM, 니코틴산아미드(Nicotinamide) 8.19E-04 mM, 피리독살염산(Pyridoxal HCl) 4.91E-04 mM, 리보플라빈(Riboflavin) 2.66E-05 mM, 티아민 염산(Thiamine HCl) 2.96E-041 mM, 페니실린-G(Penicillin-G) 0.1052 mM, 스트렙토미신-S(Streptomycin-S) 0.0172 mM, 페놀 레드(Phenol red) 0.003 mM, 알부민(Almumin) 42.0 g/L, 글로불린(Globulin) 8.0 g/L, 히알루론산(Hyaluronic acid) 1.0 g/L, 인슐린(Insulin) 3.33E-05 g/L, 트랜스퍼린(Transferrin) 3.33E-05 g/L, 소디움 셀레나이트(Sodium selenite) 3.33E-08 g/L, 상피세포성장인자(EGF: Epidermal growth factor) 3.00E-05 g/L, 인슐린유사성장인자-Ⅱ(IGF-Ⅱ: Insulin-like growth factor-Ⅱ) 2.78E-06 g/L, 황체형성호르몬(LH) 7.60E-01 IU/L, 난포자극호르몬(FSH) 5.24E+00 IU/L, 겔라틴(Gelatine) 1.0 g/L 로 구성되어 있다 (도 7 참조).The synthetic additive solution for growth of early embryos (SAG13) in the culture medium for embryo development and growth was dissolved in 1 liter of ultrapure water, and the concentration of each component was 14.44 mM, KCl 5.00 mM, MgSO 4. 7H 2 O 3.5 mM, CaCl 2. 2H 2 O 1.8 mM, Na 2 HPO 4 0.17 mM, KH 2 PO 4 0.08 mM, KHCO 3 5.00 mM, NaHCO 3 20.00 mM, Sodium pyruvate 1.57 mM, D, L-sodium lactate (D, L-Sodium lactate) 73.47 mM, D-glucose 0.05 mM, Na 2 EDTA.2H 2 O 0.1 mM, SNEaaS (x 66.67) 15.0 ml, SEaaS (x 66.67) 15.0 ml, L- Ara carbonyl -L- glutamine (L-alanyl-L-glutamine ) 0.6110 mM, glycyl -L- glutamine .H 2 O (glycyl-L- glutamine.H 2 O) 0.3594 mM, L- taurine (L-taurine) 1.18 mM, D-Ca-pantothenate 3.00E-03 mM, Choline chloride 7.16E-04 mM, Folic acid 2.27E-04 mM, i-inositol (i- inositol 1.11E-0.3 mM, Nicotinamide 8.19E-04 mM, Pyridoxal HCl 4.91E-04 mM, Riboflavin 2.66E-05 mM, T Thiamine HCl 2.96E-041 mM, Penicillin-G 0.1052 mM, Streptomycin-S 0.0172 mM, Phenolic red 0.003 mM, Albumin 42.0 g / L, Globulin 8.0 g / L, Hyaluronic acid 1.0 g / L, Insulin 3.33E-05 g / L, Transferrin 3.33E-05 g / L, Sodium Selene Nitrite (Sodium selenite) 3.33E-08 g / L, epidermal growth factor (EGF) 3.00E-05 g / L, insulin-like growth factor-II (IGF-II) ) 2.78E-06 g / L, luteinizing hormone (LH) 7.60E-01 IU / L, follicle stimulating hormone (FSH) 5.24E + 00 IU / L, gelatin 1.0 g / L (See FIG. 7).
여기서, 상기 SNEaaS(x 66.67) 및 SEaaS(x 66.67)의 조성은 상기 합성배양완충액의 그것과 같다. 이는 하기에 동일 명칭으로 기재되어 있는 것에서도 마찬가지이다.Here, the composition of the SNEaaS (x 66.67) and SEaaS (x 66.67) is the same as that of the synthetic culture buffer. The same applies to those described under the same names below.
또한, 도 5 내지 도 7을 참조하면 본 발명에 따른 상실배의 성장을 위한 배양액의 조성물은 상술한 합성배양완충액(SCB)과 후술할 상실배 성장용 합성첨가용액(SAG34)이 부피비 85:15로 혼합되는데, 여기서 상실배의 성장용 합성첨가용액(SAG34)은 초순수 1리터에 용해된 것으로, 각 성분의 배합농도는 NaCl 14.44 mM, KCl 5.00 mM, MgSO4.7H2O 3.5 mM, CaCl2.2H2O 1.8 mM, NaH2PO4 2.5 mM, Na2HPO4 0.17 mM, KH2PO4 0.08 mM, KHCO3 5.00 mM, NaHCO3 20.00 mM, 피루브산나트륨(Sodium pyruvate) 0.84 mM, D,L-젖산나트륨(D,L-Sodium lactate) 42.61 mM, D-글루코스(D-glucose) 8.88mM, Na2EDTA.2H2O 0.05 mM, SNEaaS(x 66.67) 7.5 ml, SEaaS(x 66.67) 7.5 ml, SNEaaS46(x 66.67) 7.5 ml, SEaaS46(x 66.67) 7.5 ml, L-아라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 0.6110 mM, 글리실-L-글루타민.H2O(Glycyl-L-glutamine .H2O) 0.3594 mM, L-타우린(L-Taurine) 1.18 mM, D-Ca-판토텐산(D-Ca-pantothenate) 3.00E-03 mM, 염화콜린(Choline chloride) 4.30E-03 mM, 엽산(Folic acid) 1.36E-03 mM, i-이노시톨(i-Inositol) 6.66E-03 mM, 니코틴산아미드(Nicotinamide) 4.910E-03 mM, 피리독살염산(Pyridoxal HCl) 2.95E-03 mM, 리보플라빈(Riboflavin) 1.59E-04 mM, 티아민 염산(Thiamine HCl) 1.78E-03 mM, 페니실린-G(Penicillin-G) 0.1052 mM, 스트렙토미신-S(Streptomycin-S) 0.0172 mM, 페놀 레드(Phenol red) 0.003 mM, 알부민(Almumin) 42.0 g/L, 글로불린(Globulin) 8.0 g/L, 히알루론산(Hyaluronic acid) 2.0 g/L, 인슐린(Insulin) 3.33E-05 g/L, 트랜스퍼린(Transferrin) 3.33E-05 g/L, 소디움 셀레나이트(Sodium selenite) 3.33E-08 g/L, 상피세포성장인자(EGF: Epidermal growth factor) 3.00E-05 g/L, 인슐린유사성장인자-Ⅱ(IGF-Ⅱ: Insulin-like growth factor-Ⅱ) 2.78E-06 g/L, 황체형성호르몬(LH) 7.60E-01 IU/L, 난포자극호르몬(FSH) 5.24 IU/L, 겔라틴(Gelatine) 1.0 g/L 로 구 성되어 있다 (도 7 참조).5 to 7, the composition of the culture solution for the growth of the loss embryo according to the present invention is the above-described synthetic culture buffer (SCB) and the loss of growth additives (SAG34) to be described later volume ratio 85:15 In this case, the growth additives for growth loss (SAG34) was dissolved in 1 liter of ultrapure water, and the concentration of each component was 14.44 mM NaCl, 5.00 mM MgSO 4. 7H 2 O 3.5 mM,
여기서, 상기 SNEaaS46(x 66.67)은 H2O 55555.56 mM, 37.5％로 희석된 염산(HCl) 100 mM, L-아스파라긴.H2O(L-asparagine.H2O) 78.6 mM, L-아스파르트산(L-aspartic acid) 63.6666 mM, L-글루탐산(L-glutamic acid) 38.7666 mM, L-프롤린(L-proline) 31.7 mM, L-세린(L-serine) 70.0666 mM, L-타우린(L-taurine) 1.5333 mM 으로 구성된다. (도 10 참조)Wherein SNEaaS46 (x 66.67) is H 2 O 55555.56 mM, 100 mM hydrochloric acid (HCl) diluted to 37.5%, L-asparagine. H 2 O (L-asparagine. H 2 O) 78.6 mM, L-aspartic acid (L-aspartic acid) 63.6666 mM, L-glutamic acid 38.7666 mM, L-proline 31.7 mM, L-serine 70.0666 mM, L-taurine ) 1.5333 mM. (See FIG. 10)
또한, 상기 SEaaS46(x 66.67)은 H2O 55555.6 mM, NaOH 100 mM, L-아르기닌(L-arginine) 196.6 mM, L-이소류신(L-isoleucine) 62.8466 mM, L-리신(L-lysine) 2.8333 mM, L-메티오닌(L-methionine) 14.2 mM, L-페닐알라닌(L-phenylalanine) 6.2333 mM, L-트립토판(L-tryptophan) 0.82 mM, L-티로신(L-tyrosine) 11.7667 mM 으로 구성된다. (도 11 참조)In addition, the SEaaS46 (x 66.67) is H 2 O 55555.6 mM,
더불어, 도 5 내지 도 7을 참조하면 본 발명에 따른 후기배의 성장을 위한 배양액의 조성물은 상술한 합성배양완충액(SCB)과 후술할 후기배의 성장용 합성첨가용액(SAG46)이 부피비 85:15로 혼합되는데, 여기서 후기배 성장용 합성첨가용액(SAG46)은 초순수 1리터에 용해된 것으로, 각 성분의 배합농도는 NaCl 14.44 mM, KCl 5 mM, MgSO4.7H2O 3.5 mM, CaCl2.2H2O 1.8 mM, NaH2PO4 5.0 mM, Na2HPO4 0.17 mM, KH2PO4 0.08 mM, KHCO3 5 mM, NaHCO3 20 mM, 피루브산나트륨(Sodium pyruvate) 0.1 mM, D,L-젖산나트륨(D,L-Sodium lactate) 11.74 mM, D-글루코스(D-glucose) 17.71 mM, SNEaaS46(x 66.67) 15 ml, SEaaS46(x 66.67) 15 ml, L-아라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 0.611 mM, 글리실-L-글루타민.H2O(Glycyl-L-glutamine.H2O) 0.3594 mM, L-타우린(L-Taurine) 1.18 mM, D-Ca-판토텐산( D-Ca-pantothenate) 3.00E-03 mM, 염화콜린(Choline Chloride) 7.88E-03 mM, 엽산(Folic acid) 2.49E-03 mM, i-이노시톨(i-Inositol) 1.22E-02 mM, 니코틴산아미드(Nicotinamide) 9.01E-03 mM, 피리독살염산(Pyridoxal HCl) 5.40E-03 mM, 리보플라빈(Riboflavin) 2.92E-04 mM, 티아민 염산(Thiamine HCl) 3.26E-03 mM, 페니실린-G(Penicillin-G) 0.1052 mM, 스트렙토미신-S(Streptomycin-S) 0.0172 mM, 페놀 레드(Phenol red) 0.003 mM, 알부민(Almumin) 42 g/L, 글로불린(Globulin) 8 g/L, 히알루론산(Hyaluronic acid) 3 g/L, 인슐린(Insulin) 3.33E-05 g/L, 트랜스퍼린(Transferrin) 3.33E-05 g/L, 소디움 셀레나이트(Sodium selenite) 3.33E-08 g/L, 상피세포성장인자(EGF: Epidermal Growth Factor) 3.00E-05 g/L, 인슐린유사성장인자-Ⅱ(IGF-Ⅱ: Insulin-like Growth Factor-Ⅱ) 2.78E-06 g/L, 황체형성호르몬(LH) 7.60E-01 IU/L, 난포자극호르몬(FSH) 5.24 IU/L, 겔라틴(Gelatine) 1 g/L 로 구성되어 있다 (도 7 참조).In addition, referring to Figures 5 to 7 of the composition of the culture solution for the growth of the late embryo according to the present invention, the above-described synthetic culture buffer (SCB) and the growth of the synthetic additive solution (SAG46) of the later embryo to be described later volume ratio 85: It is mixed with 15, where the late pear growth additive (SAG46) is dissolved in 1 liter of ultrapure water, and the concentration of each component is 14.44 mM NaCl, 5 mM KCl, MgSO 4. 7H 2 O 3.5 mM, CaCl 2 . 2H 2 O 1.8 mM, NaH 2 PO 4 5.0 mM, Na 2 HPO 4 0.17 mM, KH 2 PO 4 0.08 mM, KHCO 3 5 mM, NaHCO 3 20 mM, sodium pyruvate (sodium pyruvate) 0.1 mM, D , L Sodium lactate (D, L-Sodium lactate) 11.74 mM, D-glucose 17.71 mM, SNEaaS46 (x 66.67) 15 ml, SEaaS46 (x 66.67) 15 ml, L-Aranyl-L-glutamine ( L-alanyl-L-glutamine) 0.611 mM, glycyl -L- glutamine .H 2 O (glycyl-L- glutamine.H 2 O) 0.3594 mM, L- taurine (L-taurine) 1.18 mM, D-Ca- Pantothenic Acid (D-Ca-pantothenate) 3.00E-03 mM, Choline Chloride 7.88E-03 mM, Folic Acid id) 2.49E-03 mM, i-Inositol 1.22E-02 mM, Nicotinamide 9.01E-03 mM, Pyridoxal HCl 5.40E-03 mM, Riboflavin 2.92E-04 mM, Thiamine HCl 3.26E-03 mM, Penicillin-G 0.1052 mM, Streptomycin-S 0.0172 mM, Phenol red 0.003 mM, Albumin 42 g / L, Globulin 8 g / L, Hyaluronic acid 3 g / L, Insulin 3.33E-05 g / L, Transferrin 3.33E-05 g / L, Sodium selenite 3.33E-08 g / L, Epidermal Growth Factor (EGF) 3.00E-05 g / L, Insulin-like Growth Factor-II (IGF-II: Insulin -like Growth Factor-II) 2.78E-06 g / L, luteinizing hormone (LH) 7.60E-01 IU / L, follicle stimulating hormone (FSH) 5.24 IU / L, gelatin 1 g / L It is configured (see Fig. 7).
상기 조성물을 이용한 구체적인 배양 방법은 다음과 같다.Specific culture method using the composition is as follows.
(실시예)(Example)
1. 배양액과 배양접시의 준비1. Preparation of culture solution and culture dish
난자의 채취 및 배양과정에서 다루어지는 용액과 배양액들이 대단히 많다.There are a lot of solutions and cultures to be dealt with during egg collection and incubation.
시험관아기 전문센터에서는 다양한 형태의 용액 및 배양액들을 매일 준비하여야 한다. 난자를 채취할 때 채취하는 바늘을 세척하는 용액, 난자를 찾았을 때 난자를 세척하는 용액, 미성숙 난자의 성숙용 배양액, 정액을 처리할 때 정자를 세척하는 용액, 수정을 유도하고자 할 때 수정용 배양액, 수정을 확인하고 정상적인 배아만을 선별하여 초기발생을 유도하고자 할 때 배아세척용 용액과 초기배 성장용 배양액이 필요하고 상실배 성장용 배양액과 후기배 성장용 배양액이 필요로 한다.In vitro baby specialist centers should prepare various types of solutions and cultures daily. Solution to wash eggs collected when oocytes are collected, solution to wash eggs when oocytes are found, culture medium for immature oocytes, solution to wash sperm when semen is processed, fertilization to induce fertilization When the culture medium and fertilization is confirmed and normal embryos are selected to induce early development, embryo washing solution and culture medium for early embryo growth are needed, and cultures for loss embryo growth and late embryo growth are required.
이 중, 본 발명에서는 배아의 초기배의 성장용 합성배양액, 상실배의 성장용 합성배양액 및 후기배의 성장용 합성배양액의 조성물과 그 조성물을 이용한 배양 방법에 대해 집중적으로 언급이 될 것이다.Among them, the present invention will focus on the composition of the growth medium synthetic culture medium, the growth culture medium culture medium and the late culture growth culture medium culture medium and the culture method using the composition.
2. 수정확인2. Confirmation of modification
정자와 함께 배양하거나 정자미세주입을 실시한 다음날 아침에 난구세포를 제거한 난자에서 제2극체와 자웅전핵을 관찰함으로써 정상적인 수정여부를 판정한다. 정자에서 분비한 hyaluronidase에 의해 대부분의 난구세포들이 분산되어 버린다. 투명대에 달라붙어 있는 환방사세포들(corona radiate cells)을 두 자루의 인슐린 주사기의 바늘이나 난자의 직경과 비슷한 미세파이펫을 이용하여 제거한다. 제2극체와 두 개의 전핵을 가지고 있는 난자만을 1 mililiter의 초기배 성장용 합성배양액(15％ SAG13을 첨가한 SCB)에 옮기고 임상배양에 이용한다. 이때 3개 이상의 전핵을 가지거나 1개의 전핵만을 지닌 배아와 수정되지 않은 난자들은 이용할 목적이 뚜렷하지 않을 경우에는 정확히 알코올로 사멸시켜 폐기한다.Normal fertilization is determined by observing the second polar body and the herniated pronucleus in the oocytes from which the sperm cells were removed the next morning after incubation with sperm or sperm microinjection. Hyaluronidase secreted by sperm disperses most of the cumulus cells. Corona radiate cells clinging to the zona pellucida are removed using a needle of two insulin syringes or a micropipette similar to the diameter of the egg. Only eggs containing the second polar body and two pronuclei are transferred to 1 mililiter of embryonic growth medium (SCB with 15% SAG13) and used for clinical culture. Embryos with three or more pronuclears or only one pronucleus and unfertilized eggs should be discarded with alcohol exactly when they are not obviously available.
3. 초기배의 배양3. Cultivation of early embryo
수정을 확인한 후 정상적인 배아만을 선발하여 1 mililiter의 초기배 성장용 합성배양액(15％ SAG13을 첨가한 SCB)에 옮겨서 수정배아를 2∼3회 세척하고 미리 만들어 놓은 배양접시(Falcon 3037)내의 5 microliter의 미세소적을 초기배 성장용 합성배양액으로 2회 세척한 다음 여기에 20 microliter의 초기배 성장용 합성배양액(15％ SAG13를 첨가한 SCB)과 함께 배아들을 옮긴 다음 6％ CO2, 5％ O2 및 89％ N2로 분압이 조절되고 36.8℃로 온도가 조절된 배양기에 넣고 48시간 동안 배양한다.After confirming the fertilization, only the normal embryos were selected and transferred to 1 mililiter's early embryo growth synthetic culture medium (SCB with 15% SAG13). The fertilized embryos were washed 2 or 3 times and 5 microliters in the prepared dish (Falcon 3037). The microdroplets were washed twice with the synthetic culture medium for initial embryo growth, and then embryos were transferred together with 20 microliter of the initial culture medium for growth culture (SCB with 15% SAG13), followed by 6% CO 2 , 5% O. 2 and 89% N 2 and the partial pressure was adjusted to 36.8 ℃ temperature incubator and incubated for 48 hours.
4. 3일령 배아의 이식과 배양4. Transplantation and Culture of Three-Day Embryos
3일째 아침에 6％ CO2 와 36.8℃의 온도로 조절된 조작상에 설치한 광학현미경하에서 3일령 배아를 관찰한다. Bolton의 등급화 기준에 근거하여 난세포의 균등성(blastomere regularity), 난세포의 파편화(blastomere fragmentation) 및 세포질의 입도(cytoplasmic granularity)를 관찰하고 다음과 같이 배아들의 질을 평가한다. 3일령 배아들을 5군으로 나눈다. 제1군의 배아들은 난세포의 크기가 일정하고 황금색을 띤 구형이며 난세포의 파편들이 나타나지 않은 것들이다(A급). 제2군의 배아들은 난세포의 크기가 일정하고 입도가 낮아 회백색을 띤 구형이며 난세포의 파편화는 일어나지 않은 것들이다(B급). 또한 제3군의 배아들은 구형이고 일정한 크기의 난세포를 가지고 있으며 황금색이나 회백색을 띠고 있지만 약간의 난세포의 파편화가 나타난 것들이다(C급). 제4군의 배아들은 황금색이나 회백색을 띠고 있지만 균등하지 못한 난세포를 지니며 상당한 난세포의 파편화가 일어난 것들이다 (D급). 제5군의 배아들은 매우 심한 난세포의 파편화가 일어나 뚜렷한 난세포를 거의 볼 수 없는 배아들이다(E급). 이와 같이 배아들을 평가하고 Pasteur 파이펫을 이용하여 미리 만들어 놓은 배양접시(Falcon 3037)내의 5 microliter의 미세소적을 상실배 성장용 배양액으로 2회 세척한 다음 여기에 20 microliter의 상실배 성장용 합성배양액(15％ SAG34를 첨가한 SCB)과 함께 배아들을 옮기고 6％ CO2, 5％ O2 및 89％ N2로 분압이 조절되고 36.8℃로 온도가 조절된 배양기에 넣고 24시간 동안 배양한다.In the morning of the third day, the three-day-old embryos are observed under an optical microscope mounted on a controlled operation at a temperature of 6% CO 2 and 36.8 ° C. Based on Bolton's grading criteria, blastomere regularity, blastomere fragmentation and cytoplasmic granularity were evaluated and embryo quality was evaluated as follows. Divide the three-day-old embryos into five groups. Embryos of the first group are egg cells of uniform size, golden globular, and no egg cell debris (Class A). Embryos of the second group are grayish-white globules with uniform egg size and low particle size, and do not cause fragmentation of egg cells (Class B). In addition, the third group of embryos are spherical, have uniform sized egg cells, and have golden or grayish white color, but have some fragmentation of egg cells (class C). Embryos of the fourth group are either golden or off-white, but have uneven egg cells and have undergone significant egg cell fragmentation (Class D). Embryos of the fifth group are embryos that have very severe egg cell fragmentation and hardly see distinct egg cells (class E). Thus, the embryos were evaluated, and the microdroplets of 5 microliters in the preliminarily prepared dish (Falcon 3037) using the Pasteur pipette were washed twice with the culture medium for the loss embryo growth, and then 20 microliter the synthetic culture solution for the loss embryo growth. Embryos are transferred with (SCB with 15% SAG34) and placed in an incubator with partial pressure adjusted to 6% CO 2 , 5% O 2 and 89% N 2 and temperature controlled to 36.8 ° C. and incubated for 24 hours.
시험관아기시술 프로그램에서 난자를 채취한 날을 기초로 주로 3일째와 5일째에 배아이식을 실시한다. 2일째에 배아를 이식할 날짜를 환자에게 미리 통보할 수도 있다. 이러한 경우는 2일째에 위에서와 같이 배아를 관찰하고 신선한 초기배 성장용 합성배양액(15％ SAG13을 첨가한 SCB)으로 교환하고 24시간 동안 배양한 다음, 3일령 배아를 관찰하여 그들 중에 가장 양호한 배아들을 이식에 이용하고 잉여배아를 20 microliter의 상실배 성장용 합성배양액(15％ SAG34를 첨가한 SCB)에서 6％ CO2, 5％ O2 및 89％ N2로 분압이 조절되고 36.8℃로 온도가 조절된 배양기에 넣고 24시간 동안 배양한다.Embryos are usually administered on the 3rd and 5th day of the day, based on the day of the oocyte extraction from the in vitro baby procedure program. On
5. 4일령 배아의 배양5. Cultivation of 4-day-old embryos
4일째 아침에 6％의 CO2와 36.8℃의 온도로 조절된 조작상에 설치한 광학현미경하에서 4일령 배아들을 관찰한 후 미리 만들어 놓은 배양접시(Falcon 3037)내의 5 microliter의 미세소적을 후기배 성장용 합성배양액으로 2회 세척한 다음 여 기에 20 microliter의 후기배 성장용 합성배양액(15％ SAG46를 첨가한 SCB)과 함께 배아들을 옮기고 6％ CO2, 5％ O2 및 89％ N2로 분압이 조절되고 36.8℃로 온도가 조절된 배양기에 넣고 24시간 동안 배양한다.In the morning on the 4th day, after observation of 4 day-old embryos under an optical microscope mounted on a controlled operation of 6% CO 2 and a temperature of 36.8 ° C, micro-droplets of 5 microliters in a prepared dish (Falcon 3037) were late-folded. After washing twice with the growth synthetic culture medium, embryos are transferred with 20 microliter of the late culture growth synthetic culture solution (SCB with 15% SAG46) and transferred to 6% CO 2 , 5% O 2 and 89% N 2 . Partial pressure was adjusted to 36.8 ℃ temperature incubator and incubated for 24 hours.
6. 5일령 배아의 배양6. Culture of 5-day-old embryos
5일째 아침에 6％의 CO2와 36.8℃의 온도로 조절된 조작상에 설치한 광학현미경하에서 포배를 관찰할 수 있다. 형성된 포배를 팽창화 정도에 따라 초기포배, 초기팽창포배, 중간팽창포배 및 팽창완성포배의 4군으로 나눈다. 또한 포배는 초기팽창포배부터는 그 질을 평가할 수 있는데 A, B, C 및 D급으로 구분한다. A급의 배아는 태아가 될 내부세포괴(inner cell mass, 이하 "ICM")가 크고 단단하게 형성되어 있고 태반이 될 영양배엽세포(trophectoderm cell, 이하 "TEC")들은 촘촘하게 구성되어 있으며 치밀하게 상피세포화되어 있다. B급의 배아는 TEC들이 A급과 같으나 ICM은 A급보다 약간 적은 편이다. C급의 배아는 ICM가 약간 느슨하게 형성되어 있고 세포수가 적으나 TEC들은 A급이나 B급과 같은 경우와 ICM가 A급이나 B급과 같으나 TEC들이 매우 적은 수로 느슨하게 엮여 있는 경우다. 마지막으로 D급의 포배는 TEC들이 A급이나 B급과 같으나 ICM가 육안으로 전혀 흔적이 없는 경우와 ICM도 TEC도 모두 빈약한 경우다. 그러나 D급의 배아는 액포(vacuole)의 형성을 보인 상실배와는 구별된다. 이와 같이 포배를 평가한 다음 가장 양호한 포배를 선발하여 이식에 이용하고 잉여배아들을 배양하면서 C급 이상의 중간팽창포배들이 발생하면 그들을 모두 냉동보관법에 의하여 보관한다. 미리 만들어 놓은 배양접시(Falcon 3037) 내의 5 microliter의 미세소적을 후기배 성장용 배양액으로 2회 세척한 다음 여기에 20 microliter의 후기배 성장용 합성배양액(15％ SAG46를 첨가한 SCB)과 함께 잉여배아들을 옮기고 6％ CO2, 5％ O2 및 89％ N2로 분압이 조절되고 36.8℃로 온도가 조절된 배양기에 넣고 24시간 동안 배양한다.Under a light microscopy provided on the control operation of a 6% CO 2 and a temperature of 36.8 ℃ on
(실험 예)(Experimental example)
본 실험은 1864명의 환자에서 과배란(hyperstimulation)을 유도하고 HCG를 투여한 36∼38시간 후에 난자를 채취하여 체외 수정 및 체외발생을 유도하는 과정에서 전통적인 공배양체계와 본 발명에 따른 새로운 연속합성배양체계을 비교하기 위하여 실시한 것이다.This study was conducted in 1864 patients to induce hyperstimulation and incubate eggs after 36 ~ 38 hours of HCG administration to in vitro fertilization and in vitro development. This was done to compare the systems.
본 발명에 따른 새로운 연속합성배양체계에서 배아의 초기배, 상실배 및 후기배의 성장 뿐 아니라 잉여 포배기 배아의 동결보존 및 융해와 이식을 포함하여 실험을 하였다.Experiments including cryopreservation, thawing and transplantation of excess blastocyst embryos, as well as the growth of early embryonic, lost and late embryos, were performed in the new continuous synthetic culture system according to the present invention.
1864명은 배아를 배양하는 과정에서 난자를 채취한 후 3일령 배아를 이식하였고 632명은 포배기까지 발생을 유도하여 난자를 채취한 후 5일령 배아를 이식하였다. 본 실험에서 환자를 무작위로 균등하게 두 군으로 나누었다. 제1군은 난자와 배아를 전통적인 공배양체계에서 배양하였고 제2군은 새로운 연속합성배양체계에서 난자와 배아를 배양하였다. 3일령 배아를 이식한 경우에서 제1군은 587명이었고 제2군은 645명이었던 반면(도 2 참조), 5일령 배아를 이식한 경우에서 제1군은 321명이었고 제2군은 311명이었다.(도 3 참조)During the embryo cultivation process, 1864 embryos were harvested and three-day-old embryos were transplanted, and 632 embryos were induced to develop blastocysts. In this experiment, patients were randomly divided into two groups.
본 실험에서 배아이식은 난자를 채취한 3일째와 5일째에 실시하였다. 3일째 배아이식에서 배아의 수는 4개가 넘지 않게 하고 5일째 배아이식에서 배아의 수는 3개가 넘지 않도록 하였다. 각 군에서 모든 잉여배아는 7일째까지 배양하였고 이 과정에서 C급 이상의 중간팽창포배들이 발생하면 그들을 모두 냉동보관법에 의하여 보관하였다. 냉동된 배아를 지닌 환자들 중에서 당 주기에서 임신이 되지 않아 보관된 배아를 융해한 주기는 제 1군에서 295명이었고, 제2군에서 474명이었다 (도 4 참조).In this experiment, embryonic expression was performed on the 3rd and 5th day of oocyte collection. The number of embryos in embryos on the third day should not exceed four, and the number of embryos on embryos on the fifth day should not exceed three. All surplus embryos in each group were incubated until
난자를 채취한 날로부터 14∼16일째에 혈청-HCG의 양을 검사하였으며 1 ml 당 20 mIU 이상의 양성반응을 보인 경우에는 1주일 후에 재검을 실시하였다. 재검의 결과가 임신으로 확인된 경우에는 난자를 채취한 28일과 42일에 초음파검사를 실시하였다. 난자를 채취한 4∼6주 후에 초음파상에서 태아의 심장박동이 확인되면 임상적으로 임신이 되었다고 판정 실시하였다. 임상임신율(clinical pregnancy rate)은 배아를 이식한 총 환자 중에서 임신한 환자의 수로 표현하고 배아의 착상율(implantation rate)은 이식한 배아들 중에서 심장이 박동하는 태아의 수에 근거하여 계산하였다. 12주 후에 다시 초음파 검사를 실시하고 심장이 박동하는 태아가 있을 경우에는 그 수를 조사하고 임신 진행률을 계산하였다.Serum-HCG levels were examined 14 to 16 days after the oocytes were collected. If the cells were positive for more than 20 mIU per ml, they were reviewed after one week. When the results of the retest confirmed pregnancy, sonography was performed on 28 and 42 days after the oocytes were collected. Four to six weeks after the oocytes were collected, the fetus's heart rate was confirmed and clinically determined to be pregnant. The clinical pregnancy rate was expressed as the number of pregnant patients among the total transplanted embryos, and the implantation rate of the embryos was calculated based on the number of fetal heartbeats among the transplanted embryos. After 12 weeks, sonography was performed again and the number of fetal heartbeats was checked and the pregnancy progression was calculated.
(실험결과)(Experiment result)
3일령 배아를 이식한 1232명의 환자들 중에서 전통적인 공배양체계를 이용한 경우는 587예(제 1군)였고 새로운 연속합성배양체계를 이용한 경우는 645예(제2군)였다. 도 2에서 보는 바와 같이 3일째에 배아를 이식했던 경우는 수정된 난자의 수 , 정상수정배아의 수 및 이식된 배아의 수가 제2군에 제1군보다 유의하게(P ＜ 0.001) 높게 나타났다.Of the 1232-year-old embryos transplanted, 587 cases (group 1) using the conventional coculture system and 645 cases (group 2) using the new continuous synthetic culture system. As shown in FIG. 2, when embryos were transplanted on the third day, the number of fertilized eggs, the number of normal fertilized embryos, and the number of transplanted embryos were significantly higher (P <0.001) in the second group than in the first group.
비슷하게도 임상임신의 수와 12주 진행임신의 수 및 임신낭의 수가 제2군에 제1군보다 높게 나타났으나 이들은 통계적으로 유의성은 인정되지 않았다. 전체적으로 3일령 배아를 이식했을 때 연속합성배양이 전통공배양보다 나쁘지 않다는 것을 확인 하였다.Similarly, the number of clinical pregnancy, the number of 12-week pregnant women, and the number of gestational sacs were higher in
5일령 배아를 이식하는 프로그램은 난자채취 3일째에 A급과 B급 배아의 합이 4개를 초과하였을 때 배아를 배양하는 과정에서 결정되었다. 5일령 배아를 이식한 632명의 환자들 중에서 전통적인 공배양체계를 이용한 경우는 321예(제 1군)였고 새로운 연속합성배양체계를 이용한 경우는 311예(제2군)였다.The program for transplanting 5-day-old embryos was determined during culturing of embryos when the sum of class A and class B embryos exceeded 4 on the third day of oocyte collection. Of the 632 patients transplanted with 5-day-old embryos, 321 cases (group 1) using the conventional coculture system and 311 cases (group 2) using the new continuous synthetic culture system.
도 3에서 보는 바와 같이 모든 배양의 과정을 마치면서 이식했던 경우에서 제1군과 제2군의 차이는 관찰할 수 없었다. 다만, 5일령 배아를 이식하는 경우(도 3)에 3일령 배아를 이식하는 경우(도 2)와는 달리 전통공배양에서 수정된 배아의 수와 정상수정 배아의 수가 연속합성배양보다 유의하게 높았다. 이러한 상반된 수정양상을 보인 것은 두 배양체계의 차이에서 비롯된 것이 아니라 배양 2일째나 3일째에 배양되고 있는 배아의 질을 토대로 두 군을 구분하였기에 비롯된 것으로서 큰 의미를 둘 필요가 없는 것으로 사료된다.As shown in FIG. 3, the difference between the first group and the second group was not observed in the case of transplantation after finishing all the culture processes. However, unlike the case of transplanting 5-day-old embryos (Fig. 3), unlike the case of transplanting 3-day-old embryos (Fig. 2), the number of embryos fertilized and the number of normal fertilized embryos in traditional co-culture were significantly higher than that of continuous synthesis. This opposite fertilization was not caused by the difference between the two culture systems, but because the two groups were divided based on the quality of embryos grown on the second or third day of culture.
포배기 배아가 생산된 수는 제2군에서 제1군보다 약 5％가 낮았다. 그러나 생산된 포배기의 배아의 이식 평균수는 제 1군에서 2.38개, 제2군에서 2.21개로 비슷하였으며, 배아를 이식한 환자에 대한 잉여배아를 동결 보존하게 된 환자의 수( 각각 58.2％와 53.4％)와 냉동배아의 평균 수(각각 4.58개와 4.23개)는 두 군이 비슷하였다. 또한, 임상임신율, 12주 진행임신율 및 착상율도 두 군 간에 유의차가 인정되지 않았다.The number of blastocyst embryos produced was about 5% lower in
그러나, 해당 주기에서 포배기 배아를 배양하고 이식하는 과정에서는 두 군 간의 차이가 나타나지 않았더라도 도 4에서 보는 바와 같이 냉동된 배아를 토대로 두 배양군을 검토했을 때 연속합성배양이 전통배양보다 배아의 생존율 및 착상율에서 유의한 차이를 나타냈다. 임상 임신율 및 12주 임신 진행율은 제 2군에서 각각 51.7％와 43.6％로 제1군의 각각 42.8％와 35.2％에 비하여 높았으나 유의차가 인정되지 않았지만, 제2군에서의 착상율은 26.1％로 제1군의 20.6％보다 유의하게 (P ＜ 0.01)높았으며, 12주 심박동을 지닌 태아는 제2군에서 22.2％로 제1군의 18.0％에 비하여 유의하게 높았다 (P ＜ 0.05).However, even though there was no difference between the two groups in culturing and transplanting blastocyst embryos in the corresponding cycle, when the two culture groups were examined based on the frozen embryos as shown in FIG. 4, the survival rate of the embryos was higher than that of the traditional cultures. And significant difference in implantation rate. The clinical pregnancy rate and the 12-week pregnancy progression rate were 51.7% and 43.6%, respectively, in the second group, higher than 42.8% and 35.2% in the first group, but no significant difference was recognized, but the implantation rate in the second group was 26.1%. It was significantly (P <0.01) higher than 20.6% of
지금까지 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 배아의 체외발생을 위한 배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법의 구성 및 작용을 상기 설명 및 도면에 표현하였지만 이는 예를 들어 설명한 것에 불과하여 본 발명의 사상이 상기 설명 및 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변화 및 변경이 가능함은 물론이다.As described so far, the composition and action of the composition of the culture solution for the in vitro development of the embryo according to the present invention and the culture method using the same are expressed in the above description and drawings, but this is merely an example and the idea of the present invention is The present invention is not limited to the description and drawings, and various changes and modifications are possible without departing from the technical spirit of the present invention.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 배아의 체외발생을 위한 배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법에 의하면 시험관아기시술 프로그램에서 배양되는 배아의 영양적 요구를 연구하고 숙지해 나갈 수 있도록 모든 단계에서 화학적으 로 조성분과 그 농도가 명백한 연속합성배양체계(sequential synthetic culture system)를 구축할 수 있다는 장점을 가진다.As described above, according to the composition of the culture medium for the in vitro development of the embryo according to the present invention and the culturing method using the same, the chemical requirements at all stages to study and understand the nutritional requirements of the embryos cultured in the in vitro baby surgery program This has the advantage that a sequential synthetic culture system can be constructed with a clear composition and concentration.
더불어, 이를 기초로 하여 각 단계에서 성장하는 배아에게 보다 생리적인 영양을 공급하고 이를 통해 착상율과 임신율을 전통적인 공배양체계보다 더 높게 유지시킬 수 있으며, 여러 가지 세포들과 공배양(coculture)이 가능하여 공배양으로부터 유래되는 성장인자(growth factor)나 생리활성물질(cytokine)들을 발견하고 그 기능들을 찾아내는데 크게 기여할 수 있다는 효과가 있다.In addition, based on this, physiological nutrition is provided to the embryos growing at each stage, thereby keeping the implantation rate and pregnancy rate higher than the conventional coculture system, and coculture with various cells is possible. Therefore, the growth factor (growth factor) or bioactive substances (cytokine) derived from co-culture can be found to contribute greatly to the discovery of its function.
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| CN118222489A (en) * | 2024-05-22 | 2024-06-21 | 广州市新甡命科技有限公司 | Embryo culture solution and culture method for improving embryo health |
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2005
- 2005-10-17 KR KR1020050097472A patent/KR100639256B1/en not_active IP Right Cessation
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|---|---|---|---|---|
| CN118222489A (en) * | 2024-05-22 | 2024-06-21 | 广州市新甡命科技有限公司 | Embryo culture solution and culture method for improving embryo health |
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