KR100590546B1

KR100590546B1 - 마이크로 ｐｃｒ 장치, 이를 이용한 핵산의 증폭방법 및ｐｃｒ 증폭산물의 농도를 측정하는 방법

Info

Publication number: KR100590546B1
Application number: KR1020040013779A
Authority: KR
Inventors: 한정임; 오광욱
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2004-02-28
Filing date: 2004-02-28
Publication date: 2006-06-19
Also published as: US20050191686A1; US7371530B2; KR20050087988A

Abstract

본 발명은 내부에 전극이 마련되어 있으며, 이 전극의 표면에는 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머가 고정되는 증폭반응 챔버를 포함하며, 이 증폭반응 챔버 내에는 PCR 프라이머 세트 중 나노입자가 표지된 제2 프라이머가 첨가되는 마이크로 PCR 장치를 제공한다.

Description

마이크로 ＰＣＲ 장치, 이를 이용한 핵산의 증폭방법 및 ＰＣＲ 증폭산물의 농도를 측정하는 방법{Micro PCR device, method for amplifying a nucleic acid and method for measuring concentration of PCR product using the same}

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 마이크로 PCR 장치의 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 2a 내지 도 2g는 본 발명의 실시예에 따른 핵산의 증폭과정을 보여주는 도면들이다.

도 3a 및 도3b는 각각 금 나노입자의 UV-vis 스펙트럼 및 티올로 개질된 올리고뉴클레오티드에 결합된 금 나노입자의 UV-vis 스펙트럼을 도시한 것이다.

도 4는 10nm 금 나노입자가 티올로 개질된 뉴클레이티드에 표지되기 전과 후의 UV-vis 스펙트럼을 도시한 것이다.

도 5a 내지 도 5c는 금 전극의 표면에 프로브 올리고뉴클레오티드를 고정한 후, 나노입자가 표지된 타겟 올리고뉴클레이오티드를 혼성화했을 경우, 각 과정에서의 금 전극의 표면을 찍은 FE-SEM 사진들이다.

도 6a 및 도 6b는 각각 HBV DNA 10⁶ 카피의 경우와 주형 DNA가 없는 경우의 PCR 결과를 임피던스로 측정하여 Bode plot으로 나타낸 결과이다.

도 7a 및 도 7b는 각각 도 6a 및 도 6b의 결과를 Nyquist plot으로 나타낸 결과이다.

도 8a 및 도 8b는 실험조건을 100,000Hz sweep, 교류 전압 10mV, 40회로 했을 때, 각각 HBV DNA 10⁶ 카피의 경우와 주형 DNA가 없는 경우의 증폭산물의 임피던스값을 PCR 회수에 따라 측정한 결과이다.

도 9a 및 도 9b는 실험조건을 10,000Hz sweep, 교류 전압 10mV, 40회로 했을 때, 각각 HBV DNA 10⁶ 카피의 경우와 주형 DNA가 없는 경우의 증폭산물의 임피던스값을 PCR 회수에 따라 측정한 결과이다.

도 10a 및 도 10b는 실험조건을 1,000Hz sweep, 교류 전압 10mV, 40회로 했을 때, 각각 HBV DNA 10⁶ 카피의 경우와 주형 DNA가 없는 경우의 증폭산물의 임피던스값을 PCR 회수에 따라 측정한 결과이다.

본 발명은 마이크로 PCR 장치, 이를 이용한 핵산의 증폭 방법 및 전기적 신호를 측정하는 PCR 증폭산물의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

기존의 PCR은 단지 반응 종결점에서 전기영동을 이용하여 증폭된 DNA의 정성적인 결과만을 보여주는 것으로서 DNA의 정량적 검출에서 정확성 등 많은 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 광학적 검출시스템을 이용하여 증폭 된 DNA의 농도에 비례하는 형광의 세기를 검출함으로써 DNA의 정량분석을 가능케 해주는 리얼타임(Real Time) PCR 장치가 개발되었다.

DNA의 정량분석은 질병의 치료와 DNA 발현의 연구에 필수적이다. 예를 들면, B 형 간염 바이러스 (HBV)에 감염된 간염 환자의 성공적인 약물치료를 위해서 정기적으로 혈장의 HBV의 농도를 리얼타임 PCR을 이용하여 정량 측정함으로써, 투여되는 약물에 대한 바이러스의 내성을 검사해야만 하는 경우를 들 수 있다.

종래의 리얼타임 PCR은 레이저 소스와 미세거울, 현미경 이외에 필터 등의 여러 광학장치가 필요함과 동시에 고가의 형광 염료가 사용되어지고 있었다. 또한, DNA 정량 분석을 위한 많은 PCR 칩이 개발되었으나, 종래의 리얼타임 PCR 칩은 형광 검출의 원리에 의한 방법이기에 소형화 (칩화)와 경제성에서 많은 단점을 가지고 있었다.

이 문제를 극복하고자 모세관 전기영동(CE: capillary electrophoresis)을 이용하여 전기적으로 DNA를 검출하고자하는 노력이 있었다. 그러나, 이 방법은 정성분석은 가능하지만 정량분석을 하기엔 많은 문제가 있을 뿐더러 PCR이 끝난 뒤 산물을 미세채널을 이용하여 모세관 전기영동 검출 시스템까지 옮겨야 하는 번거로움과 높은 전압이 필요하다는 점에서 경제성과 또 그에 따른 기기의 소형화에 문제가 있다.

밀스(Miles) 등은 PCR 과정 중에서 DNA의 농도가 증가함에 따라 저항값이 작아지고, 전도성은 증가한다는 개념에 근거하여 특허 출원하였다 (미국 특허공개번호 2002/0072054 A1). 그러나, 상기 출원은 리얼타임 PCR 칩이 아닌 반응 종결시점 검출 PCR 칩이라는 점에서, 리얼타임 PCR 칩과는 다르다. 또한, 상기 출원은 증폭된 PCR 산물을 검출하기 위하여 이온적으로 표지된 프로브를 사용해야 한다는 문제점이 있었다.

한편, 상기와 같은 종래의 전기적 또는 화학적 신호를 이용한 검출 방법에 의하면, 측정 감도가 낮고 재현성이 부족하여 신뢰성 있는 결과를 얻기가 어려웠다. 이는 PCR 반응액의 구성성분인 단백질, 이온, 안정제 등이 전기 신호를 감지할 수 있는 전극 표면에 비특이적인 흡착을 일으키기 때문이다. 이러한 흡착 현상은 열역학적으로 매우 불안정할 뿐만 아니라, 동역학적인 요인도 함께 존재한다. 따라서, 온도 또는 전자기력 등과 같은 외부의 미세한 자극에 의하여도 흡착 정도가 달라진다고 알려져 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 증폭반응 챔버 내에 마련된 전극 표면에 프라이머 세트(primer set) 중 한 쪽의 프라이머를 고정시키고, 나노입자(Nanoparticle)가 표지된 다른 쪽의 프라이머를 PCR 반응액에 첨가하여 전극 표면에서 PCR을 수행함으로써 실시간으로 PCR 증폭산물을 측정할 수 있으며, 높은 측정 감도와 재현성을 확보할 수 있다. 또한, 본 발명은 PCR 증폭산물의 측정에 있어서 다양한 전기화학적인 검출방법을 이용할 수 있기 때문에 측정 결과의 정확성을 높일 수 있다.

이와 같은 성능의 향상을 보이는 이유는 다음과 같다. 전극의 표면에 프라이머를 고정하여 자기조립 단층막(self-assembled monolayer)이 생성되면, 전극 표면에 다른 핵산이나 단백질의 비특이적 흡착이 거의 발생되지 않게 된다. 또한, 전기 화학적 반응의 측정을 용액이 아닌 전극에 고정된 성분에 대하여 수행하므로 측정 감도가 향상된다. 그리고, PCR 증폭산물이 전극에 고정되어 있으므로 전극의 세척 작업을 통해 전기신호 측정에 방해가 되는 요소를 제거할 수 있으므로 측정의 재현성이 향상될 수 있다.

본 발명은 나노입자을 이용하여 PCR 증폭 산물을 이동없이 실시간으로 높은 측정 감도와 재현성을 가지고 측정할 수 있는 마이크로 PCR 장치를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로 PCR 장치를 이용한 핵산의 증폭 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로 PCR 장치를 이용하여 PCR 증폭산물의 농도를 측정하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 내부에 전극이 마련되어 있으며, 상기 전극의 표면에는 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머가 고정되는 증폭반응 챔버를 포함하며, 상기 증폭반응 챔버 내에는 상기 PCR 프라이머 세트 중 나노입자가 표지된 제2 프라이머가 첨가되는 마이크로 PCR 장치를 제공한다.

본 발명에 따른 마이크로 PCR 장치는 상기 전극의 표면에 생성된 PCR 증폭산물을 전기화학적인 검출방법을 이용하여 실시간으로 측정하는 PCR 증폭산물 측정기기를 더 포함한다. 여기서, 상기 전기화학적인 검출방법에는 전압전류법(voltammetry), 전위차법(potentionmetry), 전류법(amperometry) 또는 임피던스 측정법(impedimetry detection)이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 마이크로 PCR 장치는 PCR 장치에 통상 요구되는 요소들, 예를 들면, 가열기(heater), 냉각기(cooler) 및 온도 조절기를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 증폭반응 챔버의 재질은 석영(quartz), 유리 또는 실리콘 등과 같은 PCR 과정 동안 열 순환에 견딜 수 있는 재질이면, 어느 것이나 사용할 수 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한, (a) 증폭반응 챔버에 마련된 전극의 표면에 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머를 고정화하는 단계; (b) 상기 증폭반응 챔버 내에 상기 PCR 프라이머 세트 중 나노입자가 표지된 제2 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 첨가하는 단계; 및 (c) PCR 반응을 수행하는 단계;을 포함하는 핵산의 증폭방법을 제공한다. 여기서, 상기 PCR 반응은 상기 전극의 표면에서 수행된다.

본 발명에 있어서, "PCR 반응액(PCR reation mixture)"이란 핵산 증폭을 위하여 열순환 반응(thermal cycling reation)을 수행하기 위한 반응용액으로서, dNTP, Mg²⁺와 같은 이온, 상기 제2 프라이머와 같은 핵산, 폴리머라제(polymerase)와 같은 단백질 등의 성분을 포함한다.

본 발명에 있어서, "PCR 반응"이란, 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 연장(extension) 반응을 반복하여 핵산을 증폭시키는 중합효소연쇄 반응을 의미 하는 것으로 당업자라면 용이하게 알 수 있으며, 각 단계으 온도 및 시간은 사용되는 중합효소, 증폭하고자 하는 표적 핵산 서열 및 사용한 프라이머의 서열 등을 고려하여 적당하게 조절할 수 용이하게 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 증폭반응 챔버에 마련된 전극의 표면에 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머를 고정화하는 단계; (b) 상기 증폭반응 챔버 내에 상기 PCR 프라이머 세트 중 나노입자가 표지된 제2 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 첨가하는 단계; (c) PCR 반응을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 PCR 반응에 의하여 상기 전극의 표면에 생성된 PCR 증폭산물의 농도를 전기화학적 방법으로 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭산물의 농도를 측정하는 방법을 포함한다. 상기 (d)단계에서, 상기 전기화학적 방법에는 전압전류법, 전위차법, 전류법 또는 임피던스 측정법이 포함될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 금 전극의 표면에 올리고뉴클레오티드의 고정화

본 실시예에서는 티올로 개질된 올리고뉴클레이오티드(Thiol modified oligonucleotide)를 다음과 같은 방법으로 금 전극의 표면에 고정화한다.

먼저, 황산과 과산화수소(H₂O₂)를 3:1의 부피비로 섞어서 만들어진 용액에 금 전극을 담가 놓고 60~70℃의 온도에서 15분 이상 반응시킨다. 그리고, 상기 금 전극을 증류수로 2~3회 깨끗이 씻은 후, 질소가스로 건조(drying)시킨다.

이어서, 티올로 개질된 올리고뉴클레이오티드를 금 전극의 표면에서 2시간 반응시킨다. 이후, 완충용액(buffer)으로 세척해서 반응하지 않은 올리고뉴클레이오티드를 제거한다.

다음으로, 머캅토헥산올(mercaptohexanol)을 0.1mM 수용액으로 만든 후, 30분간 금 전극의 표면에서 반응시킨 후, 다시 완충용액으로 세척하여 반응하지 않은 머캅토헥산올을 제거하고 건조시킨다.

실시예 2 : 금 나노입자(gold nanoparticle)가 표지된 올리고뉴클레오티드의 준비

먼저, 0.87mL 콜로이드상태의 금(colloidal gold)에 (알칸티올)올리고뉴클레오티드((alkanthiol)oligonucleotide) 300nM의 올리고뉴클레오티드 용액을 넣고 16시간 동안 실온에서 반응시킨다.

이어서, 위 용액을 0.1M NaCl, 10mM 인산(phosphate) 완충용액(pH 7.0)에 첨가하여 다시 40 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, 원심분리를 25분간 14000rpm 으로 시행하여 용액을 제거하게 되면 붉은색 유상(red oil)이 생성된다.

다음으로, 이 붉은색 유상에 0.1M NaCl, 10mM 인산 완충용액을 첨가한 후, 다시 원심분리를 시행하고 용액을 제거한다. 그리고, 이 처리 후에 남아 있는 붉은색 유상을 농도에 맞게 용출(elution)하여 사용한다.

실시예 3 : PCR 반응 수행 및 PCR 반응의 전기적 신호 검출 시행

실시예 1 및 실시예 2를 이용하여 PCR 반응을 수행하기 위한 마이크로 PCR 장치가 도 1에 도시되어 있다. 도 1을 참조하면, 유리 웨이퍼(110)로 둘러싸인 증폭반응 챔버(115) 내에는 복수의 금 전극(120)이 마련되어 있고, 이러한 금 전극들(120)의 표면에는 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머(P₁)가 고정되어 있다. 여기서, 상기 제1 프라이머(P₁)는 실시예 1에 나타낸 바와 같이 티올로 개질된 올리고뉴클레이오티드로 이루어져 있다. 그리고, 상기 증폭반응 챔버(115) 내에는 상기 PCR 프라이머 세트 중 제2 프라이머(P₂)를 포함하는 PCR 반응액이 첨가된다. 여기서, 상기 제2 프라이머(P₂)는 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자가 표지된 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있다. 도 1에서 참조부호 112 및 114는 각각 증폭반응 챔버(115)의 입구 및 출구를 나타낸다.

이하에서는, 도 2a 내지 도 2g를 참조하여 상기한 마이크로 PCR 장치를 이용하여 핵산을 증폭하는 과정을 설명한다. 먼저, 이중 가닥의 주형 HBV DNA(150)를 증폭반응 챔버에 첨가한 다음(도 2a), 증폭반응 챔버의 온도를 조절하게 되면 이중 가닥의 DNA(150)는 변성(denaturation)되어 2개의 단일 가닥 DNA로 분리되어 그 중 하나의 단일 가닥 DNA(160)가 금 전극(120)의 표면에 고정된 제1 프라이머(P₁)와 상보적으로 결합하게 된다(도 2b). 그리고, 세척과정을 통하여 금 전극(120)의 표면으로부터 불순물을 제거한다(도 2c). 이어서, DNA 폴리머라제(polymerase)에 의하여 상기 제1 프라이머(P₁)로부터 뉴클레오티드가 하나씩 연장(extension)되어 이중 가닥의 DNA가 합성된다(도 2d). 다음으로, 변성(denaturation)에 의하여, 증폭된 DNA(170)로부터 주형 DNA(160)가 분리되고(도 2e), 어닐링(annealing)에 의하여, 증폭된 DNA(170)에는 금 나노입자(130)가 표지된 제2 프라이머(P₂)가 상보적으로 결합하게 된다(도 2f). 다음으로, 연장, 변성 및 어닐링 반응이 반복적으로 수행되어 핵산의 증폭과정이 완료된다(도 2g).

한편, 본 실시예에서는 PCR 증폭산물의 농도를 실시간으로 측정하기 위하여 임피던스(impedance) 측정법으로 PCR 회수에 따른 신호의 변화를 측정하였다.

도 3a 및 도 3b에는 각각 금 나노입자의 UV-vis 스펙트럼 및 티올로 개질된 올리고뉴클레오티드에 결합된 금 나노입자의 UV-vis 스펙트럼이 도시되어 있다. 도 3a는 3가지 크기(5nm, 10nm, 20nm)의 금 나노입자의 UV-vis 스펙트럼을 도시한 것이고, 도 3b는 티올로 개질된 올리고뉴클레오티드(Thiol modified oligonucleotide)에 결합된 3가지 크기(5nm, 10nm, 20nm)의 금 나노입자의 UV-vis 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 3가지 크기의 금 나노입자는 동일하게 518nm의 파장에서 흡광을 보인다. 그러나, 티올로 개질된 올리고뉴클레오티드와 금 나노입자를 반응시키면, 도 3b에 도시된 바와 같이 5nm, 20nm의 금 나노입자는 침전으로 거의 가라앉아 10nm의 금 나노입자만이 티올로 개질된 올리고뉴클레오티드에 표지(labelling)되었다.

도 4는 10nm 금 나노입자가 티올로 개질된 뉴클레이티드에 표지되기 전과 후의 UV-vis 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 4를 참조하여 표지 전,후의 10nm 금 나노 입자의 흡광 파장을 비교하여 보면, 518nm에서 523nm로 이동한 것을 알 수 있다.

도 5a 내지 도 5c는 금 전극의 표면에 프로브 올리고뉴클레오티드를 고정한 후, 나노입자가 표지된 타겟 올리고뉴클레이오티드를 혼성화했을 경우, 각 과정에서의 금 전극의 표면을 찍은 FE-SEM(Field Emission Scanning Electron Microscope)사진들로서, 도 5a는 최초 금 전극의 표면, 도 5b는 프로브 올리고뉴클레오티드의 고정화된 후의 상태, 도 5c는 나노입자가 표지된 타겟 올리고뉴클레오티드를 혼성화된 후의 상태를 보여준다.

도 6a 및 도 6b는 각각 HBV DNA 10⁶ 카피(주형 DNA)의 경우와 주형 DNA가 없는 경우의 PCR 결과를 임피던스로 측정하여 Bode plot으로 나타낸 결과이다. 여기서, 실험 조건은 1,000~100,000Hz sweep, 교류 전압 10mV, 40회로 하였다. 그리고, 도 7a 및 도 7b는 도 6a 및 도 6b의 결과를 Nyquist plot으로 나타낸 결과이다.

도 6a 내지 도 7b를 참조하면, DNA 10⁶ 카피의 경우에는 PCR 회수마다 임피던스 값의 변화를 보이지만 주형 DNA가 없는 경우에는 PCR 회수가 변화하여도 임피던스 값의 변화는 거의 없는 것을 알 수 있다.

도 8a 및 도 8b, 도 9a 및 도 9b, 도 10a 및 도 10b는 HBV DNA 10⁶ 카피(주형 DNA)의 경우와 주형 DNA가 없는 경우의 증폭산물의 임피던스 크기값을 PCR 회수에 따라 측정한 결과로서, 도 8a 및 도 8의 경우는 실험조건을 100,000Hz, 교류 전압 10mV, 40회로 하였고, 도 9a 및 도 9b의 경우는 실험조건을 10,000Hz, 교류 전압 10mV, 40회로 하였으며, 도 10a 및 도 10b는 실험조건을 1,000Hz, 교류 전압 10mV, 40회로 하였다.

도 8a 내지 도 10b를 참조하면, DNA 10⁶ 카피의 경우에는 PCR 회수가 증가하여 임피던스 값이 감소하지만, 주형 DNA가 없는 경우에는 PCR 회수가 증가하여도 임피던스 값이 거의 변화하지 않는 것을 알 수 있다.

이상과 같이, 본 실시예에 따라 증폭반응 챔버 내에 마련된 전극 표면에 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머를 고정시키고, 나노입자가 표지된 제2 프라이머를 PCR 반응액에 첨가하여 전극 표면에서 PCR을 수행함으로써 PCR 증폭산물을 실시간으로 측정할 수 있으며, 높은 측정 감도와 재현성을 확보할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 나노입자가 표지된 프라이머를 이용하여 전극의 표면에서 PCR을 수행함으로써 PCR 증폭 산물을 이동없이 실시간으로 높은 측정 감도와 재현성을 가지고 측정할 수 있다. 또한, 나노입자는 다양한 전기화학적 방법으로 신호의 검출이 가능하므로, 측정 결과를 높은 정확도로 분석할 수 있다.

<110> Samsung Electronic Co. Ltd. <120> Micro PCR device, method for amplifying a nucleic acid and method for measuring concentration of PCR product using the same <130> PN052636 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe polynucleotide which is immobilized on the electrod surface <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> HS-(CH2)6- attached at 5' OH site : -SH group is used for the immobilized of the probe to the electrode <400> 1 agcagaggcg gtgtcgagga gat 23 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> HS-(CH2)15- attached at the 5 OH site : -SH group is used for the nanoparticle attachment <400> 2 tttttttttt gctttggggc atggacattg acc 33

Claims

내부에 전극이 마련되어 있으며, 상기 전극의 표면에는 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머가 고정되는 증폭반응 챔버를 포함하며,

상기 증폭반응 챔버 내에는 상기 PCR 프라이머 세트 중 나노입자가 표지된 제2 프라이머가 첨가되는 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 전극의 표면에 생성된 PCR 증폭산물을 전기화학적인 검출방법을 이용하여 실시간으로 측정하는 PCR 증폭산물 측정기기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제 2 항에 있어서,

상기 전기화학적인 검출방법은 전압전류법(voltammetry), 전위차법(potentionmetry), 전류법(amperometry) 또는 임피던스 측정법(impedimetry detection)인 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 제2 프라이머는 티올로 개질된 올리고뉴클레이오티드에 금 나노입자가 표지된 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제 4 항에 있어서,

상기 금 나노입자는 그 크기가 대략 10 nm인 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 전극은 금으로 이루어진 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
제 6 항에 있어서,

상기 제1 프라이머는 티올로 개질된 올리고뉴클레이오티드인 것을 특징으로 하는 마이크로 PCR 장치.
(a) 증폭반응 챔버에 마련된 전극의 표면에 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머를 고정화하는 단계;

(b) 상기 증폭반응 챔버 내에 상기 PCR 프라이머 세트 중 나노입자가 표지된 제2 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 첨가하는 단계; 및

(c) PCR 반응을 수행하는 단계;을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
제 8 항에 있어서,

상기 (c)단계에서, 상기 PCR 반응은 상기 전극의 표면에서 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.
제 8 항에 있어서,

상기 제2 프라이머는 티올로 개질된 올리고뉴클레이오티드에 금 나노입자가 표지된 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.
(a) 증폭반응 챔버에 마련된 전극의 표면에 제1 및 제2 프라이머로 구성되는 PCR 프라이머 세트 중 제1 프라이머를 고정화하는 단계;

(b) 상기 증폭반응 챔버 내에 상기 PCR 프라이머 세트 중 나노입자가 표지된 제2 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 첨가하는 단계;

(c) PCR 반응을 수행하는 단계; 및

(d) 상기 PCR 반응에 의하여 상기 전극의 표면에 생성된 PCR 증폭산물의 농도를 전기화학적 방법으로 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭산물의 농도를 측정하는 방법.
제 11 항에 있어서,

상기 전기화학적인 검출방법은 전압전류법, 전위차법, 전류법 또는 임피던스 측정법인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭산물의 농도를 측정하는 방법.
제 11 항에 있어서,

상기 제2 프라이머는 티올로 개질된 올리고뉴클레이오티드에 금 나노입자가 표지된 것을 특징으로 하는 PCR 증폭산물의 농도를 측정하는 방법.