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KR100551096B1 - 신규한 와이-폴리에틸렌글리콜 유도체 및 그의 제조방법 - Google Patents

신규한 와이-폴리에틸렌글리콜 유도체 및 그의 제조방법 Download PDF

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KR100551096B1
KR100551096B1 KR1020030055102A KR20030055102A KR100551096B1 KR 100551096 B1 KR100551096 B1 KR 100551096B1 KR 1020030055102 A KR1020030055102 A KR 1020030055102A KR 20030055102 A KR20030055102 A KR 20030055102A KR 100551096 B1 KR100551096 B1 KR 100551096B1
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김인경
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선바이오(주)
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Abstract

본 발명은 신규한 생체고분자인 Y-PEG(세 개의 결합부위를 지닌 핵분자를 중심으로 두 개의 결합부위에는 PEG를 부착하며 나머지 하나의 결합부위에는 반응기를 부착하는 Y자 형태의 화합물) 유도체 및 그의 합성방법에 관한 것으로, 상세하게는 생체친화성이 높은 PEG의 성질을 가짐과 동시에 목표물에 공유결합할 수 있는 반응기를 가짐으로써, 그 용도로서 다당류, 단백질, 효소, 당단백질, 항체, 세포 등의 생명공학 제품이나 화학의약품 등의 특정 부위에 선택적으로 공유결합 함으로서 최종제품의 약리작용을 향상시키고 독성을 감소시키는 등 치료제 또는 의료기기로서 유용성이 높다.
폴리에틸렌글리콜, 생체고분자, 공유결합

Description

신규한 와이-폴리에틸렌글리콜 유도체 및 그의 제조방법{Novel Y-PEG Derivatives and the preparation method thereof}
본 발명은 신규한 생체고분자인 Y-PEG(세 개의 결합부위를 지닌 핵분자를 중심으로 두 개의 결합부위에는 PEG를 부착하며 나머지 하나의 결합부위에는 반응기를 부착하는 Y자 형태의 화합물) 유도체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 생체친화성이 높은 PEG의 성질을 가짐과 동시에 목표물에 공유결합할 수 있는 반응기를 가짐으로써, 그 용도로서 다당류, 단백질, 효소, 당단백질, 항체, 세포 등의 생명공학 제품이나 화학의약품 등의 특정 부위에 선택적으로 공유결합 함으로서 최종제품의 약리작용을 향상시키고 독성을 감소시키는 등 치료제 또는 의료기기로서 유용성이 높다.
일반적으로 유기용매 및 물에 잘 녹는 양친매성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(이하 'PEG'라 함)은 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)로도 잘 알려져 있으며, 수용성이 극히 낮은 물질이라도 PEG와 결합하게 되면 수용성을 가지게 된다. 또한 PEG는 인체내 면역 반응성이 거의 없고 무독성이라는 장점이 있어, 생명공학 치료제의 분자나 표면에 대한 화학적 결합은 약학적으로 매우 유용하며, 결과적으로 인체내 주사제 등으로 다수 사용되고 있다. PEG의 가장 일반적인 형태는 양쪽 끝부분에 히드록실(hydroxyl)기를 갖는 선형 고분자로서, 그 구조식은 HO-(CH2CH2O)n-H로 표현되며 간단히 HO-PEG-OH로도 나타낼 수 있는데, 여기서 PEG-는 (CH2CH2O)로서, 말단의 반응기가 없는 고분자 골격을 의미한다. 또 다른 형태의 PEG로는 메톡시(methoxy, CH3O-)기를 한쪽 말단에 포함하고 나머지 한쪽 말단에는 히드록실기를 갖는 메톡시-PEG-OH(이하 'mPEG'라 함)가 일반적으로 사용되고 있다. 그 구조식은 CH3O-(CH2CH2O)n-H로 표현된다.
생체 활성을 갖는 여러 가지 효소, 단백질 또는 기타 폴리펩티드 등은 오래 전부터 화학적, 유전학적 방법으로 합성, 개발되어 왔다. 그러나 이러한 화합물들은 생체 내 면역거부반응이 일어나거나 장기독성을 유발하는 등의 단점이 있으며, 또한 체내 반감기가 매우 짧아 그 효능이 떨어지거나 물에 불용성인 경우 치료제재로 사용할 수 없는 등 여러 가지 한계점이 있다.
이러한 한계점을 극복하기 위해 폴리펩티드에 PEG를 결합시켜 그 폴리펩티드의 주변에 친수성 PEG 구름을 형성시키고자 하는 시도가 있었으며, 이처럼 인체 친화적인 PEG와 결합된 생명공학 제품은 친수성이외에도 구조적 안정성도 가지게 되어 다양한 신약 개발 제재로 응용될 수 있다. 특히 체내에서 사용될 경우, 거대한 PEG 구름은 폴리펩티드의 다른 활성 부위에 부가적인 화학적 반응이 일어나지 않도록 보호해주며 또한 체내의 단백질분해효소에 의해 분해되는 것을 방지하여, 결과 적으로 빨리 생리활성을 잃거나 또는 신장으로 빠르게 여과되는 등의 다양한 부정적인 효과들을 감소시킨다. 또한 폴리펩티드 주변을 둘러싼 PEG 구름은 체내 면역반응을 감소시키고 다른 체내 기관에 독성으로 작용하는 효과를 현저히 감소시킨다.
그러나 이러한 장점에도 불구하고 부수적인 문제들이 발생하였으며, 이 문제들은 PEG와 폴리펩티드의 연결이 어렵다는 점에서 발생되었다. 양반응성 (bifunctional) 또는 다반응성(multi-functional) 고분자 유도체는 단백질들끼리 서로 교차연결시켜 오히려 수용액상에서의 용해도를 감소시켰고 혈관을 통한 순환에 부적합하였다. 폴리펩티드나 단백질의 일반적인 아미노산에 PEG를 연결시키고자 하는 가장 고전적인 방법으로는 숙신이미드 활성 그룹을 가진 mPEG-숙신이미딜 숙신네이트(mPEG-succinimidyl succinate, 이하 "PEG-SS"라 한다)가 사용되었다. 폴리펩티드 또는 단백질과 PEG가 에스터(ester) 결합으로 연결되면 체내에서 단백질 가수분해 효소에 의해 쉽게 분해되는 것으로 보고되었으며, 약한 염기성 조건에서도 단백질로부터 분리되어 mPEG-숙신 산(mPEG-succinic acid)으로 남게 되는데 이것은 체내 다른 기관에 대하여 독성을 가질 수 있다고 알려져 있다(US patent 5,932,462).
위와 같은 단점을 극복하기 위한 노력으로 단백질 또는 폴리펩티드 및 PEG와의 연결부위에 단백질가수분해 효소들의 접근을 입체적으로 방해하는 새로운 형태의 PEG가 개발되었다. 미국 특허 제 5,643,575 및 미국 특허 제 5,919,455호에 기재된 가지상의 PEG 고분자(Branched PEG polymer)는 이러한 형태의 PEG의 대표적인 예이다. 상기 가지상의 PEG 고분자는 라이신 등의 핵분자를 중심으로 두 개의 PEG 분자가 연결된 형태로서, 이것은 우산형태의 구조를 가지기 때문에 선형 구조의 단일 PEG에 비해 입체적 부피효과가 현저하게 증가하여 단백질 분해 효소의 접근을 방해하는 효과를 가져오므로 앞서 기술한 단점들을 극복할 수 있는 것으로 알려져 있다(Bioconjugate Chem. 12, pp62-70, 2001; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 12, pp177-180, 2002).
이와 비슷한 형태로 미국 특허 제 6,251,382호에는 여러 개의 결합가능부위를 가진 핵분자에 약물 전구체를 연결한 후 PEG를 도입한 화합물을 개시하였다. 이것은 하나의 분자에 생체 활성을 가진 약물 전구체를 여러 개 도입함으로써 약물전달 효과를 높일 수 있는 장점을 가지며, 또한 기존에 알려져 있는 멀티-암(multi-arm) PEG에 약물 전구체를 연결한 화합물에 비하여 인체내 유동성이나 약물 전구체의 손실을 줄일 수 있는 등의 이점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또 다른 예로 미국 특허 제5,932,462호에 개시된 멀티-암(multi-armed), 단일반응성의 고분자(monofunctional polymer)도 이와 유사한 형태를 가지고 있다. 이 화합물은 핵분자를 기반으로 하였으며, 핵분자로서는 세 개의 부착가능부위를 지닌 라이신(lysine)을 채택하였다. 이 세 개의 부착가능부위는 두개의 아민(amine)기와 하나의 산(acid)기이며, 여기에서 두 개의 아민기에는 PEG를 부착하고 연이어 반대편의 한 개 산기에는 숙신이미딜기 등의 반응기를 부착시켜 단백질 또는 폴리펩티드 등의 목표물질과 공유결합을 일으킬 수 있는 새로운 구조의 폴리머를 개발하였다. 이의 임상적 응용으로서 라이신을 핵분자로 갖는 PEG 유도체와 인터페론-α(알 파)가 결합된 형태로 페가시스(PegaSys)라는 이름의 C형 간염치료제로 시장에 나와 있으며 기존의 인터페론-α(알파)와 비교하여 체내 잔류시간이 길고 항바이러스성이 향상되는 등 뛰어난 임상효과를 보여주는 것으로 나타났다(J. Control. Rel. 72, pp217-224, 2001).
본 발명에서는 새로운 형태의 다중암, 단일반응성의 고분자(monofunctional polymer)를 개발하기 위하여 일반적인 아미노산, 바람직하게는 아스파르트산 (aspartic acid) 또는 글루타민 산(glutamic acid)을 핵분자로 채택하여 이 핵이 가지는 두개의 산기에 PEG를 부착하고 연이어 반대편 한 개의 아민기에 활성기를 부착하는 새로운 형태의 Y-PEG을 합성하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 기존의 PEG 부착형태와는 다른 두 개의 산기에 PEG를 부착하고 한 개의 아민기에 반응기를 부착하는 새로운 형태로, 아민기로서 화학구조식이 시작되는 말레이미드(maleimide)기, 니트로페닐 카보네이트(nitrophenyl carbonate)기, 이소시아네이트(isocyanate)기 등의 반응기의 합성에 절대적으로 유리함을 특징으로 하는 신규한 구조의 Y-PEG 유도체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세 개의 결합부위를 가진 핵분자(core)를 기반으로 하여, 두 개의 산기에는 PEG를 부착하고 나머지 한 개의 아민기에는 반응기를 부착하는 Y자 형태의 Y-PEG 유도체를 제공한다.
상기 핵분자는 아스파르트 산(aspartic acid) 또는 글루타민 산(glutamic acid)인 Y자 형태의 Y-PEG 유도체를 제공한다.
또한, 반응기는 말레이미드(maleimide), 파라-니트로페닐 카보네이트(p-nitrophenyl carbonate), 이소시아네이트(isocyanate)인 Y자 형태의 Y-PEG 유도체를 제공한다.
상세하게는, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅰ)의 화학구조를 갖는 L-아스파르틱(Aspartic)-Y-PEG 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00001
(Ⅰ)
또한, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅱ)의 화학구조를 갖는 L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00002
(Ⅱ)
또한, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅲ)의 화학구조 를 갖는 L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00003
(Ⅲ)
또한, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅳ)의 화학구조를 갖는 L-아스파르틱-Y-PEG-이소시아네이트 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00004
(Ⅳ)
또한, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅴ)의 화학구조를 갖는 L-글루타믹(Glutamic)-Y-PEG 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00005
(Ⅴ)
또한, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅵ)의 화학구조를 갖는 L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00006
(Ⅵ)
또한, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅶ)의 화학구조를 갖는 L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00007
(Ⅶ)
또한, 본 발명은 신규한 생체적합성 고분자인 하기 일반식 (Ⅷ)의 화학구조를 갖는 L-글루타믹-Y-PEG-이소시아네이트 화합물을 제공한다.
Figure 112003029394318-pat00008
(Ⅷ)
또한, 본 발명은 생체적합성 고분자인 상기 일반식(Ⅰ)의 L-아스파르틱-Y-PEG 화합물을 제조하는 방법에 있어서, N-Boc-L-아스파르트 산(Aspartic acid)에 mPEG-아민을 1-[3-(디메틸아미노)프로필-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(1- [3-(dimethylamino)propyl-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)로 처리하여 유기용매 하에 반응시켜 두개의 mPEG을 연결시킨 후, 이 유도체를 탈보호화 반응화제(deprotection)로 처리함으로써 보호기(Boc)를 제거하여 상기 일반식(Ⅰ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식(Ⅱ)의 L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)에 말레산 무수물(maleic anhydride) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(pentafluoro phenyl trifluoroacetate)와 같은 반응화제를 유기용매 존재 하에 반응시킴으로써 상기 일반식(Ⅱ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식(Ⅲ)의 L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)에 파라-니트로페닐 클로로포메이트(p-nitrophenyl chloroformate)와 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재 하에 반응시킴으로써 상기 일반식(Ⅲ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식(Ⅳ)의 L-아스파르틱-Y-PEG-이소시아네이트 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)에 트라이포스겐 (triphosgene)과 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재 하에 반응시킴으로써 상 기 일반식(Ⅳ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체적합성 고분자인 상기 일반식(Ⅴ)의 L-글루타믹-Y-PEG화합물을 제조하는 방법에 있어서, N-Boc-L-글루타민 산(Glutamic acid)에 mPEG-아민을 EDC로 처리하여 유기용매 하에 반응시키고 이 유도체를 탈보호화 반응화제로 처리함으로써 보호기(Boc)를 제거하여 상기 일반식(Ⅴ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식(Ⅵ)의 L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 일반식(Ⅴ)에 말레산 무수물(maleic anhydride) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(pentafluoro phenyl trifluoroacetate)와 같은 반응화제를 유기용매 존재하에 반응시킴으로써 상기 일반식(Ⅵ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식(Ⅶ)의 L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 일반식(Ⅴ)에 파라-니트로페닐 클로로포메이트(p-nitrophenyl chloroformate)와 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재하에 반응시킴으로써 상기 일반식(Ⅶ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식(Ⅷ)의 L-글루타믹-Y-PEG-이소시아네이트 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 일반식(Ⅴ)에 트라이포스겐 (triphosgene)과 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재하에 반응시킴으로써 상기 일반식(Ⅷ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명의 제조방법을 구체적으로 기재한다.
본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여, 예를 들어, 하기의 반응식 1 내지 8에 도시 된 방법에 의하여 생체적합성 고분자인 일반식(Ⅰ) 내지 일반식(VIII)을 제조할 수 있으며, 하기 반응식들은 본 발명을 설명하기 위해 도시한 것이지, 본 발명의 범위를 제한하거나 한정하고자 함이 아니다.
예를 들어, 본 발명의 일반식(Ⅰ)의 L-아스파르틱-Y-PEG는 하기 반응식 1에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00009
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 N-Boc-L-아스파르트 산(I-b)에 반응화제로 mPEG-아민(mPEG-NH2), EDC 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)과 같은 커플링 시약(coupling reagent)를 넣고 DMF(Dimethylformamide)을 유기용매로 사용하여 N-Boc-L-아스파르틱-Y-PEG을 제조하는 1단계, 이 합성된 화합물(Ⅰ-a)에 탈보호화 반응화제를 메탄올을 유기용매로 사용하여 L-아스파르틱-Y-PEG를 얻는 제 2단계의 합성방법을 포함하는 제조 방법을 제공한다.
이와 같은 방법으로 얻은 혼합물은 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography) 또는 크기배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography)를 이용하여 분리 정제한다.
본 발명의 일반식 (Ⅱ)의 L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드 화합물은 하기 반응식 2에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00010
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 L-아스파르틱-Y-PEG(Ⅰ)에 반응화제로 말레산 무수물(maleic anhydride)을 사용하고 유기용매로 N,N-디메틸아세트아미드(DMAC, N,N-dimethylacetamide) 및 N-사이클로헥실피롤리디논(CHP, N-cyclopyrolidinone)의 혼합용매를 사용하여 L-아스파르트 산-Y-PEG-말레아민 산(maleamic acid) 화합물(Ⅱ-a)을 얻는 제 1단계, 이 합성된 화합물(Ⅱ-a)에 반응화제로서 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(pentafluorophenyl trifluoro acetate) 등과 같은 반응화제를 첨가하고 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)와 같은 염기촉매 하에서 디클로메탄과 DMF의 혼합용매를 사용하여, 본 발명의 L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드 유도체(Ⅱ)를 얻는 제 2단계의 합성방법을 포함하는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일반식 (III)의 L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 화합물은 하기 반응식 3에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00011
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 L-아스파르틱-Y-PEG(Ⅰ)에 반응화제로 파라-니트로페닐 클로로포메이트(p-nitrophenyl chloroformate)를 사용하 고 TEA(triethylamine)와 같은 염기촉매 하에서 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하여 L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 (III)를 얻는 합성방법을 포함하는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일반식(Ⅳ)의 L-아스파르틱-PEG-이소시아네이트 화합물은 하기 반응식 4에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00012
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 L-아스파르틱-Y-PEG(Ⅰ)에 반응화제로 트라이포스겐을 사용하고 TEA와 같은 염기촉매 하에서 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하여 L-아스파르틱-Y-PEG-이소시아네이트 (IV)를 얻는 합성방법을 포함하는 제조방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 일반식(V)의 L-글루타믹-Y-PEG는 하기 반응식 5에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00013
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 N-Boc-L-글루타민 산(V-b)에 반응화제로 mPEG-아민, EDC 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)와 같은 커플링 시약를 넣고 DMF을 유기용매로 사용하여 N-Boc-L-글루타믹-Y-PEG을 제조하는 1단계, 이 합성된 화합물(V-a)에 탈보호화 반응화제를 메탄올을 유기용매로 사용하여 L-글루타믹-Y-PEG (V)를 얻는 제 2단계의 합성방법을 포함하는 제조 방법을 제공한다.
이와 같은 방법으로 얻은 혼합물은 이온교환 크로마토그래피 또는 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제한다.
본 발명의 일반식 (VI)의 L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드 화합물은 하기 반응식 6에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00014
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 L-글루타믹-Y-PEG (V)에 반응화제로 말레산 무수물(maleic anhydride)을 사용하고 유기용매로 N,N-디메틸아세트아미드 및 N-사이클로헥실피롤리디논의 혼합용매를 사용하여 L-글루타민 산-Y-PEG-말레아민 산(VI-a)를 얻는 제 1단계, 이 합성된 화합물(VI-a)에 반응화제로서 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 등과 같은 반응화제를 첨가하고 DIEA와 같은 염기촉매 하에서 디클로메탄 및 DMF의 혼합용매를 사용하여 본 발명의 L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드 유도체(VI)를 얻는 제 2단계의 합성방법을 포함하는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일반식 (VII)의 L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 화합물은 하기 반응식 7에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00015
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 L-글루타믹-Y-PEG (V)에 반응화제로 파라-니트로페닐 클로로포메이트를 사용하고 TEA와 같은 염기촉매 하에서 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하여 L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 (VII)를 얻는 합성방법을 포함하는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일반식 (VIII)의 L-글루타믹-Y-PEG-이소시아네이트 화합물은 하기 반응식 8에 기재된 바와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112003029394318-pat00016
상기의 반응식에 기재된 바와 같이, 본 발명은 L-글루타믹-Y-PEG (V)에 반응화제로 트라이포스겐을 사용하고 TEA와 같은 염기촉매 하에서 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하여 L-글루타믹-Y-PEG-이소시아네이트 (VIII)를 얻는 합성방법 을 포함하는 제조방법을 제공한다.
상기한 본 발명의 제조방법으로 제조될 수 있는 중합체는 에틸렌 글리콜을 기본으로 하는 Y-PEG로서 그 분자량이 100내지 1,000,000 좀더 바람직하게는 약 1000 내지 100,000 달톤(Dalton)인 중합체를 포함한다.
본 발명의 화합물 중, 말레이미드로 유도체화 된 일반식(Ⅱ) 화합물 및 일반식 (Ⅵ) 화합물은 목표물 단백질의 아미노산 배열 중 시스테인(cysteine) 부위와 선택적 공유결합을 형성하는 특징을 가지며 이러한 성질을 이용한 항체의 자유 시스테인(free cystein)과의 결합, 다당류의 특정 도메인과의 선택적 결합, 기타 설프하이드릴(sulfhydryl)기를 포함하는 화합물과의 결합 등에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 니트로페닐 카보네이트(nitrophenyl carbonate)로 유도체화 된 일반식 (Ⅲ) 화합물 및 일반식 (Ⅶ) 화합물, 그리고 이소시아네이트(isocyanate)로 유도체화 된 일반식(Ⅳ) 화합물 및 일반식 (Ⅷ) 화합물은 단백질의 N-말단기와의 결합, 다당류의 특정 도메인과의 결합 등 목표물의 선택적 부위와의 결합, 또는 반응 조건에 따라 기타 아민(amine)기, 히드록실(hydroxyl)기, 알데히드(aldehyde)기, 카르복실(carboxyl)기 등을 포함하는 목표물과의 비선택적 결합 등에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 하기의 실시예에 의해 제한되지는 않는다.
실시예 1. L-아스파르틱-Y-PEG(L-Aspartic-Y-PEG)의 제조
단계 1-1. N-Boc-L-아스파르틱-Y-PEG(N-Boc-L-Aspartic-Y-PEG)의 제조
출발물질로 메톡시 폴리에틸렌글리콜-아민(mPEG-amine) (0.75mM, MW=20,000) 15g 및 N-(3급-부톡시카르보닐)-L-아스파르트 산(N-(tert- butoxycarbonyl)-L-aspartic acid, 0.375M) 84mg를 DMF 100ml에 녹인 후, EDC(0.0075M) 1.43g 및 1-히드로벤조트리아졸(HOBt, 0.0075M) 1.15g를 각각 첨가하여 실온에서 4일 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후, 반응 혼합물을 에틸에테르로 침전시켜 여과, 건조하여 하기 물성치를 갖는 고체상태의 N-Boc-L-아스파르틱-Y-PEG 화합물 14g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 4.25 ppm (t, 1H, mPEG-NHCOCH2 CH), 3.65 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3), 2.03 ppm (t, 2H, mPEG-NHCOCH 2CH), 1.45 ppm (s, 9H, NHCOOC(CH 3 ))
단계 1-2. L-아스파르틱-Y-PEG(L-Aspartic-Y-PEG)의 제조
둥근바닥 플라스크에 메탄올 10ml를 넣고, 0℃로 냉각한 다음 아세틸 클로라이드 30ml를 천천히 가하여 30분간 교반한 후, 메탄올 30ml에 실시예 1-1 단계에서 얻은 N-Boc-L-아스파르틱-Y-PEG(0.35mM) 14g을 희석한 용액을 천천히 가하여 30분간 교반 한 다음, 상온에서 2시간 동안 다시 교반하였다. 반응이 끝난 후, 반응 혼 합물을 메틸렌 클로라이드로 추출하여 유기층을 무수 황산마그네슘(MgSO4)으로 건조하고 감압 농축하였다. 농축물을 에틸에테르로 침전시키고, 걸러낸 고체는 건조하여 아스파라긴산(L-aspartic acid)을 핵분자(core)로 하여 하기 물성치를 갖는 L-아스파르틱-Y-PEG 화합물 13.5g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 3.65 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3)
실시예 2. L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드의 제조
단계 2-1. L-아스파르틱-Y-PEG-말레아민 산(L-Aspartic-Y-PEG-maleamic acid)의 제조
질소 풍선하에서 실시예 1에서 얻은 L-아스파르틱-Y-PEG (0.11mM, MW=40000) 4.5g를 N,N-디메틸아세트아미드(DMAC, 4ml/gPEG) 18ml 및 N-시클로헥실 피롤리돈 (CHP, 1ml/DMAC 5ml) 3.6ml 용매에 녹인 후, 말레산 무수물(maleic anhydride, 1.1mM) 0.1g을 적가하였다. 수분정량기(Dean-Stark trap set)를 설치하고 공존용매(cosolvent)로서 톨루엔을 사용하여, 80℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후, 반응 혼합물을 에틸에테르로 침전시켜 여과한 다음 고체상태의 L-아스파르틱-Y-PEG-말레아민 산 화합물 4g을 수득하였다.
단계 2-2. L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드(L-Aspartic-Y-PEG-maleimide)의 제조
상기 실시예 2-1 단계에서 얻은 L-아스파르틱-Y-PEG-말레아민 산(maleamic acid, 0.1mM) 4g을 메틸렌 클로라이드 및 DMF에 녹인 후, 0℃에서 DIEA 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트를 가하여 55℃에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류하여 디에틸에테르를 가하여 침전을 유도하고, 침전화합물을 감압 여과하였다. 여과물을 메틸렌 클로라이드 1L에 녹인 다음 활성탄(activated charcoal)을 넣고 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드(celite pad)에 여과하여 활성탄을 제거하고 용매는 증류하여 제거한 후, 디에틸에테르를 가하여 침전을 유도하였다. 침전화합물은 감압 여과하여 하기 물성치를 갖는 L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드 화합물 3.5g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.37 ppm (s, 2H, 말레이미드), 3.65 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3)
실시예 3. L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트(L-Aspartic-Y-PEG-nitro phenyl carbonate)의 제조
출발물질로 상기 실시예 1에서 얻은 L-아스파르틱-Y-PEG (0.11mM) 4.5g을 메틸렌 클로라이드에 녹이고 트리에틸아민(0.44mM) 0.044g을 0℃에서 천천히 적가한 후, p-니트로페닐 클로로포메이트(0.44mM) 0.088g을 적가하여 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 감압 증류하여 용매를 제거하고 글래스 필터를 이용하여 여과하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도한 다음, 감압 여과하여 하기 물성치를 갖는 L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 화합물 3.5g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.29 ppm (d, 2H, aromatic), 7.40 ppm (d, 2H, aromatic), 4.45 ppm (t, 1H, mPEG-NHCOCH2 CH), 3.64 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3), 2.04 ppm (t, 2H, mPEG-NHCOCH 2CH)
실시예 4. L-아스파르틱-Y-PEG-이소시아네이트(L-Aspartic-Y-PEG-iso cyanate)의 제조
출발물질로 상기 실시예 1에서 얻은 L-아스파르틱-Y-PEG(0.11mM) 4.5g을 진공감압하여 건조한 후, 증류로 정제한 무수 메틸렌 클로라이드에 녹였다. 질소 가스하에 트리에틸아민(1.76mM) 0.176g을 가하여 30분간 교반한 다음, 트라이포스겐 (1.32mM) 0.39g을 가하여 다시 3시간 이상 환류, 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 식힌 후, 질소 가스를 15분 이상 넣어주면서 남아있는 포스겐 가스를 제거하였다. 반응혼합물을 감압 여과하여 트리에틸아민염을 제거하고 다시 감압 증류하여 용매를 농축한 다음, 디에틸에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 감압 여과를 수행하여 하기 물성치를 갖는 L-아스파르틱-Y-PEG-이소시아네이트 화합물을 3.5g 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 3.64 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.40 ppm (t, 2H, -CH2-이소시아네이트), 3.37 ppm (s, 6H, OCH3)
실시예 5. L-글루타믹-Y-PEG의 제조
5-1. N-Boc-L-글루타믹-Y-PEG(N-Boc-L- Glutamic-Y-PEG)의 제조
출발물질로 메톡시 폴리에틸렌글리콜(mPEG-amine, 0.7mM, mw=20,000) 14g 및 N-(3급-부톡시카르보닐)-L-글루타민 산(N-(tert-butoxycarbonyl)-L-glutamic acid, 0.35mM) 86mg를 DMF 100ml에 녹인 후, EDC(0.007M) 1.34g 및 1-히드록시벤조트리아졸(0.007M) 1.06g를 각각 가하여 실온에서 4일 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후, 반응 혼합물을 에틸에테르로 침전시켜 걸러낸 다음 건조하여, 하기 물성치를 갖는 고체상태의 N-Boc-L-글루타믹-Y-PEG 화합물 13g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 4.31 ppm(t, 1H, mPEG-NHCOCH2 CH), 3.64 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3), 2.04 ppm(d, 4H, mPEG-NHCOCH 2 CH 2 CH), 1.43 ppm (s, 9H, NHCOOC(CH 3 ))
5-2. L-글루타믹-Y-PEG(L-Glutamic-Y-PEG)의 제조
둥근바닥 플라스크에 메탄올 30ml를 넣고 0℃로 냉각한 다음 아세틸 클로라이드 30ml를 천천히 가하여 30분간 교반한 후, 메탄올 30ml에 실시예 5-1 단계에서 얻은 N-Boc-L-글루타믹-Y-PEG(0.325mM) 13g을 희석한 용액을 천천히 가하여 30분간 교반한 후, 상온에서 2시간 동안 다시 교반하였다. 반응이 끝난 후, 반응 혼합물을 메틸렌클로라이드로 추출하여 유기층을 무수 황산마그네슘(MgSO4)으로 건조하고 감압 농축하였다. 농축물을 에틸에테르로 침전시키고, 걸러낸 고체를 건조하여 글루타민 산(L-Glutamic acid)을 핵분자(core)로 하는 L-글루타믹-Y-PEG 화합물을 12.5g 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) : 3.64 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3)
실시예 6. L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드의 제조
단계 6-1. L-글루타믹-Y-PEG-말레아민 산(L-glutamic-Y-PEG-maleamic acid)의 제조
질소 풍선하에서 상기 실시예 5에서 얻은 L-글루타믹-Y-PEG(0.11mM, mw=40000) 4.5g를 N,N-디메틸아세트아미드(4ml/PEG g) 18ml 및 N-시클로헥실 피롤리돈(1ml/DMAC 5ml) 3.6ml 용매에 녹인 후, 말레산 무수물( 1.1mM) 0.1g를 가하였다. 수분정량기(Dean-Stark trap set)를 설치하고 공존용매로서 톨루엔을 사용하여, 80℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후, 반응 혼합물을 에틸에테르로 침전시켜 걸러내어 고체상태의 L-글루타믹-Y-PEG-말레아민 산 화합물 4g을 수득하였다.
단계 6-2. L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드(L-glutamic-Y-PEG-maleimide)의 제조
상기 실시예 6-1 단계에서 얻은 L-글루타믹-Y-PEG-말레아민 산(0.1mM) 4g을 메틸렌 클로라이드 및 DMF에 녹이고, 0℃에서 DIEA 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트를 가하여, 55℃에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류하여 디에틸에테르를 가하여 침전을 유도하고, 침전화합물은 감압 여과하였다. 여과물을 메틸렌 클로라이드 1L에 녹인 다음 활성탄을 넣고 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드(celite pad)에 여과하여 활성탄을 제거하고 용매는 증류하여 제거한 후, 디에틸에테르를 가하여 침전을 유도하였다. 침전화합물은 감압 여과하여 하기 물성치를 갖는 L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드 화합물 3.5g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.37 ppm (s, 2H, 말레이미드), 3.64 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3)
실시예 7. L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트(L-Glutamic-Y-PEG-nitro phenyl carbonate)의 제조
출발물질로 상기 실시예 5에서 얻은 L-글루타믹-Y-PEG (0.1mM) 4g을 메틸렌 클로라이드에 녹인 후, 트리에틸아민(0.4mM) 0.04g을 0℃에서 천천히 적가한 다음, p-니트로페닐 클로로포메이트(0.4mM) 0.08g를 가하여, 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 감압 증류하여 용매를 제거하고 글래스 필터를 이용하여 여과하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 가하여 침전을 유도한 다음, 감압 여과하여 하기 물성치를 갖는 L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 화합물 3.5g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.29 ppm (d, 2H, aromatic), 7.40 ppm (d, 2H, aromatic), 4.45 ppm (t, 1H, mPEG-NHCOCH2CH2 CH), 3.64 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.38 ppm (s, 6H, OCH3), 2.04 ppm (d, 4H, mPEG-NHCOCH 2 CH 2 CH)
실시예 8. L-글루타믹-Y-PEG-이소시아네이트(L-Glutamic-Y-PEG-isocyanate)의 제조
출발물질로 상기 실시예 5에서 얻은 L-글루타민 산-Y-PEG(0.1mM) 4g을 진공감압하여 건조한 후, 증류로 정제한 무수 메틸렌 클로라이드에 녹였다. 질소 가스하에 트리에틸아민(1.6mM) 0.16g을 적가하여 30분간 교반한 다음, 트라이포스겐 (1.2mM) 0.35g을 가하여 다시 3시간 이상 환류, 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 식힌 후 질소 가스를 15분 이상 넣어주면서 남아있는 포스겐 가스를 제거하였다. 반응혼합물을 감압 여과하여 트리에틸아민염을 제거하고 다시 감압 증류하여 용매를 농축한 다음, 디에틸에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 감압 여과를 수행하여 하기 물성치를 갖는 L-글루타믹-Y-PEG-이소시아네이트 화합물 3.5g을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) δ: 3.64 ppm (s, 3636H, PEG backbone, -OCH2-), 3.40 ppm (t, 2H, -CH2-이소시아네이트), 3.37 ppm (s, 6H, OCH3)
이상에서 살펴본 본 바와 같이, 본 발명에 따라 다당류, 단백질, 항체 등의 생명공학 제품이나 화학의약품 등의 특정 부위나 도메인에 선택적으로 결합할 수 있는 신규한 Y-PEG 유도체 및 그의 제조방법을 제공하여 고수율, 고순도의 제품을 생산하는 것이다.

Claims (17)

  1. 세 개의 결합부위를 가진 핵분자(core)를 기반으로 하여, 두 개의 산기에는 PEG를 부착하고 나머지 한 개의 아민기에는 반응기를 부착하는 Y자 형태의 Y-PEG 유도체.
  2. 제 1항에 있어서, 핵분자는 아스파르트 산(aspartic acid) 또는 글루타민 산(glutamic acid)인 Y자 형태의 Y-PEG 유도체.
  3. 제 1항에 있어서, 반응기는 말레이미드(maleimide), 파라-니트로페닐 카보네이트(p-nitrophenyl carbonate), 이소시아네이트(isocyanate)인 Y자 형태의 Y-PEG 유도체.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서 화합물은;
    L-아스파르틱-Y-PEG, L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드, L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트, L-아스파르틱-Y-PEG-이소시아네이트, L-글루타믹-Y-PEG, L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드, L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트, L-글루타 믹-Y-PEG-이소시아네이트에서 선택된 것임을 특징으로 하는 Y자 형태의 Y-PEG 유도체.
  5. 하기 일반식(Ⅰ)의 L-아스파르틱(Aspartic)-Y-PEG 화합물을 제조하는 방법에 있어서, N-Boc-L-아스파르트 산(Aspartic acid)에 mPEG-아민을 1-[3-(디메틸아미노)프로필-3-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(1-[3-(di methylamino)propyl- 3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)로 처리하여 유기용매 하에 반응시켜 두개의 mPEG을 연결시킨 후, 이 유도체를 탈보호화 반응화제(deprotection)로 처리함으로써 보호기(Boc)를 제거하여 일반식(Ⅰ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00017
    (Ⅰ)
  6. 하기 일반식(Ⅱ)의 L-아스파르틱-Y-PEG-말레이미드 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 제 5항의 일반식(Ⅰ)에 말레산 무수물(maleic anhydride) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(pentafluoro phenyl trifluoroacetate)와 같은 반응화제를 유기용매 존재 하에 반응시킴으로써 일반식(Ⅱ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00018
    (Ⅱ)
  7. 하기 일반식(Ⅲ)의 L-아스파르틱-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 제 5항의 일반식(Ⅰ)에 파라-니트로페닐 클로로포메이트(p-nitrophenyl chloroformate)와 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재 하에 반응시킴으로써 일반식(Ⅲ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00019
    (Ⅲ)
  8. 하기 일반식(Ⅳ)의 L-아스파르틱-Y-PEG-이소시아네이트 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 제 5항의 일반식(Ⅰ)에 트라이포스겐(triphosgene)과 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재 하에 반응시킴으로써 일반식(Ⅳ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00020
    (Ⅳ)
  9. 하기 일반식(Ⅴ)의 L-글루타믹-Y-PEG화합물을 제조하는 방법에 있어서, N-Boc-L-글루타민 산(Glutamic acid)에 mPEG-아민을 EDC로 처리하여 유기용매 하에 반응시키고 이 유도체를 탈보호화 반응화제로 처리함으로써 보호기(Boc)를 제거하여 일반식(Ⅴ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00021
    (Ⅴ)
  10. 하기 일반식(Ⅵ)의 L-글루타믹-Y-PEG-말레이미드 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 제 9항의 일반식(Ⅴ)에 말레산 무수물(maleic anhydride) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(pentafluoro phenyl trifluoroacetate)와 같은 반응화제를 유기용매 존재하에 반응시킴으로써 일반식(Ⅵ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00022
    (Ⅵ)
  11. 하기 일반식(Ⅶ)의 L-글루타믹-Y-PEG-니트로페닐 카보네이트 중합체 화합물 을 제조하는 방법에 있어서, 제 9항의 일반식(Ⅴ)에 파라-니트로페닐 클로로포메이트(p-nitrophenyl chloroformate)와 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재하에 반응시킴으로써 일반식(Ⅶ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00023
    (Ⅶ)
  12. 하기 일반식(Ⅷ)의 L-글루타믹-Y-PEG-이소시아네이트 중합체 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 제 9항의 일반식(Ⅴ)에 트라이포스겐(triphosgene)과 같은 반응화제를 염기 및 유기용매 존재하에 반응시킴으로써 일반식(Ⅷ) 중합체 화합물을 제조함을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112003029394318-pat00024
    (Ⅷ)
  13. 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 반응화제는 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트, 파라-니트로페닐 클로로포메이트, 트라이포스겐 또는 탈보호화제로부터 선택된 단독 또는 2종이상의 혼합물임을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 염기는 TEA 또는 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)로부터 선택된 단독 또는 2종이상의 혼합물임을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 유기용매는 디클로로메탄, 메틸렌 클로라이드 또는 DMF(Dimethylformamide)로부터 선택된 단독 또는 2종이상의 혼합물임을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식 (Ⅰ) 내지 일반식 (Ⅷ)의 Y-PEG 중합체는 분자량이 100내지 1,000,000달톤(Dalton)인 제조방법.
  17. 제 16항에 있어서, 일반식 (Ⅰ) 내지 일반식 (Ⅷ)의 Y-PEG 중합체는 분자량이 1000 내지 100,000 달톤(Dalton)인 제조방법.
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