KR100544831B1 - 발아된 검은콩 및 검은쌀 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발아된 검은콩 및 검은쌀을 효소분해하여 제조된 펩타이드를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 화장료 조성물은 발아된 검은콩 및 검은쌀을 단백질 분해효소로 가수분해하여 제조된 펩타이드 혼합물을 함유함으로서 기존의 피부개선 성분을 함유하는 화장료에 비해 피부내 섬유아세포의 증식과 콜라겐 합성촉진, 피부주름 개선효과, 항노화효과, 미백효과가 향상되었다.

발아, 펩타이드, 검은 콩, 검은 쌀, 효소분해, 화장료

Description

발아된 검은콩 및 검은쌀 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물을 함유하는 화장료 조성물{COMPOSITIONS OF THE COSMETIC PRODUCT CONTAINING THE GERMINATED BLACK BEAN AND/OR BLACK RICE PEPTIDES MIXTURE THAT PREPARED BY ENZYMATIC HYDROLYSIS}

본 발명은 발아된 검은콩 및 검은쌀을 효소분해 하여 제조된 펩타이드를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 화장료 조성물은 발아된 검은콩 및 검은쌀을 효소분해하여 제조된 펩타이드를 함유함으로서 기존의 피부개선 성분을 함유하는 화장료에 비해 효과가 향상되었으며, 발아된 검은콩 및 검은쌀 효소분해 펩타이드를 화장료에 0.001-10중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

표피, 진피, 피하지방으로 구성되어 있는 피부는 보호기능과 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 역할을 담당하고 있는 아주 중요한 기관이다. 그러나 나이가 들면서 피부는 그 기능이 급격하게 저하된다. 노화에 따른 피부의 생리적 변화로는 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지는 현상, 진피의 콜라겐과 같은 세포외 기질의 분해로 인한 피부탄력 감소 및 주름이 형성되고 피부의 수분함량이 떨어지고 피부가 건조해지는 현상 등이 있다.

이러한 현상 중 생체 내 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)의 발현은 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름을 형성시켜 노화의 주된 원인이 된다.

또한, 자외선량의 증가와 대기오염 및 현대인의 과도한 피로와 스트레스 등으로 인해 생성되는 반응성이 높은 활성산소와 자유라디칼은 생체성분(단백질, 핵산, 세포막 지질 등)을 산화시키거나 변성시켜 노화의 원인이 된다.

자외선에 노출되는 부위인 피부에 자외선이 가져오는 또 다른 문제의 하나는 멜라닌 과다 생산을 들 수 있다. 이러한 멜라닌의 과도한 생성은 주로 피부의 색깔에 영향을 주어 과도한 색소침착 및 기미, 주근깨 등을 유발한다.

따라서 피부노화에 따라 일어나는 세포외기질 분해로 인한 주름형성, 피부 탄력감소, 활성산소와 자유라디칼로 인한 생체성분 산화 또는 변성, 건조 등과 자외선에 의한 멜라닌의 과도한 생산은 화장품 분야에서 피부 보호 및 미용 차원의 중요한 과제로 이러한 노화의 원인을 차단하는 우수한 화장품 소재의 개발은 가장 많이 연구되고 있는 영역 중 하나이다.

이러한 화장품 소재의 연구영역에서 최근 주목받고 있는 소재 중 하나로서 펩타이드를 들 수 있다.

펩타이드는 펩타이드 결합으로 이루어진 아미노산 중합체의 총칭으로 협의로는 중합도 100 이상을 단백질, 100이하를 펩타이드라고 분류한다.

이러한 펩타이드는 혈압강하작용, 항산화 작용, 지질대사 촉진작용, 면역증 강작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 알코올 흡수 저해작용, 철 및 칼슘흡수 촉진작용, 피부의 주름 생성 억제작용 및 각종 생체 내 제어 및 정보 전달에 중요한 역할을 담당하여, 호르몬, 세포증식, 혈압조절, 신경전달, 항생작용 등을 가지며 생체내 조절 작용의 90% 정도에 조절 요인들로 작용하고 있어, 식품, 화장품 및 의약품 분야 등의 신소재로서 주목받고 있다.

종래에 천연물에서 이러한 펩타이드를 제조하는 방법은 천연물 또는 천연물에서 단백질을 추출하여, 단백질 분해효소만을 이용하여 분해하거나, 산 또는 알칼리 분해하여 얻었다. 종래의 분해방법 중 산 또는 알칼리에 의한 방법은 발암을 일으키는 염소화합물이 발생하는 것이 알려져 있으며, 단백질 분해물의 중합도를 제어하기가 곤란하다. 또한 최종적으로는 산 또는 알칼리를 중화하는 과정이 필요하여, 염이 함유되지 않은 펩타이드를 얻기 위해서는 탈염공정이 필수적이다. 또한 단백질 분해효소만을 이용하여 분해하여 펩타이드를 제조하는 경우 식물종자에 포함된 단백질을 충분히 분해하기 어려우며, 이러한 목적을 달성하기 위해서는 다량의 단백질 분해효소를 사용하여야 하는데, 단백질 분해효소는 고가인 경우가 많아 제조단가 상승의 원인이 되는 실정이었다.

식물의 종자는 발아 과정에서 다양한 생명활성을 나타내는데, 우선, 발아과정과 이후의 생명활동에 영양을 공급하기 위해 식물 종자에 포함된 단백질을 포함한 각종 영양성분의 분해가 시작되며, 각종 효소를 포함한 신규 단백질, 펩타이드, 아미노산 및 비타민 등이 다량 생성된다. 이러한 발아 식물종자를 이용한 예로는 맥아를 들 수 있는데, 맥아는 발아과정에서 아밀라아제가 다량 생성되고 비타민B1 이 활성화되어 맥주의 제조 등과 한방에서는 위장과 비장을 튼튼하게 하고 소화를 잘되게 하는 약재로 이용되었다. 이외에도 발아 식물 종자에는 발아 전에 없던 성분이 다량으로 증가하는 것을 확인할 수 있는데, 현미를 싹 틔운 발아현미성분에는 감마오리자놀, 비타민, 아미노산, 지방산, 식이섬유 등이 증가하며 특히, 감마 오리자놀의 경우, 발아의 과정에서 현미 100g 당 295mg이나 생성되는 것으로 보고되고 있다. 이와 같이 발아된 식물의 종자는 발아과정 중에 새로이 다양한 생리활성 물질을 생성할 뿐만 아니라, 발아과정 중에 생성된 새로운 단백질의 분해된 펩타이드 및 발아과정에서 생성된 다양한 펩타이드 및 아미노산을 함유하고 있다.

검은쌀은 중국 남부 지방인 광동과 운남지방에 자생하는 것을 인간이 2000년 전에 재배한 기록이 있다 하며, 중국의 한무제시대에 황실에 진상되었다고 한다. 본초강목(本草疆目)에 의하면 검은쌀은 위를 단단히 하고 음기를 활성화시키고 신장을 보호하며, 간을 이완시키고, 눈을 밝게 하고, 혈액순환을 활성화한다고 하며, 머리 어지러움, 빈혈, 백발 예방 및 치료. 눈병, 다뇨증, 변비증, 심혈관 등 질병에 뚜렷한 효과가 있다고 하여 중국에서는 예로부터 다양하게 이용되어 왔다.

검은쌀은 백미보다 단백질과 지방, 비타민 B1, B2, E, 무기질, 인, 철, 칼슘이 풍부하여 아미노산이 많고, 특히 라이신(Lysine)이 백미보다 훨씬 많이 함유되어 있고 또한, 셀레늄(Se)의 함량이 높아 암의 예방에도 효과가 있다고 보고되고 있다.

이러한 성분 중에서도 특히 주목할 만한 활성물질 중 하나는 색소성분의 일종인 안토시아닌(anthocyanin)이다. 검은쌀의 안토시아닌은 항암작용이 있음이 보 고되었다.

검은콩은 종자의 껍질색깔이 검정색이고 속(자엽)이 녹색으로 알이 굵은 콩을 말하며 일부지방에선 속 푸르테콩, 속청 또는 서리를 맞으면서 익어간다고 하여 서리태라고 한다. 이러한 검은콩의 껍질에는 검은색을 내는 색소가 있으며, 이 검은색 색소때문에 일반 대두와는 다른 약효를 발휘한다. 한방에서 검은콩은 생명에너지를 증가시켜 원기를 내는 식품으로 알려져 있다. 특히 신장의 기능을 향상시키고, 강력한 해독작용을 가지고 있다 하여 예로부터 다양하게 이용되어 왔다.

이외에도, 검은콩에는 염증을 가라앉혀 주는 소염 성분이 다량 함유되어 있으며, 검은콩에 많이 함유된 아르기닌(Arginine)은 모발성장을 촉진시켜주는 산화질소(Nitric Oxide)의 대사 전구물질로서 항안드로겐 복용으로 오는 성기능 부작용을 막아주며, 모발의 성장에 필수성분인 시스테인(Cysteine)은 탈모방지용으로 효과가 있음이 밝혀졌다. 또한 검은쌀과 같이 안토시아닌이 풍부하다.

하지만, 상기 검은쌀을 화장품에 응용한 예는 전무한 실정이며 또한 이를 펩타이드 소재로 개발한 경우도 없는 실정이다. 따라서 검은쌀을 펩타이드 제조의 소재로 이용할 경우 종래 화장품 소재와는 달리 펩타이드 소재의 우수한 기능성에 검은쌀에 포함된 생리활성기능을 부가하여 우수한 화장품 소재의 개발이 가능하다.

또한, 검은콩의 경우에도 검은콩을 추출물 형태로 개발하여 화장품에 응용한 예(특허 0281011호)가 있지만, 펩타이드 소재로 개발한 경우는 없다. 추출물 형태로 화장품에 응용한 경우에도 단순한 추출물의 형태에 제한되어 있으며, 이로 인해 짙은 색상으로 인한 화장품 응용시 외관이 미려하지 못한 단점과 콩 특유의 비린 특이취 등으로 인해 상품성이 저하되는 문제점이 있었다. 또한, 다량의 오일성분과 고분자 단백질 함유 등으로 인한 원료의 불안정성, 미생물 오염에 대한 취약성을 나타내었으며, 거대분자 함유로 인해 피부친화성 및 투과가 어려운 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명과 같이 발아된 검은콩 및 검은쌀을 효소분해하여 제조된 펩타이드를 화장품 소재로 이용할 경우에는 기존 추출물의 기능과 펩타이드 소재의 우수한 기능성을 함께 가지며, 기존 추출물의 단점을 극복할 수 있으며, 발아로 인해 저분자 펩타이드의 함량이 높은 검은콩 및 검은쌀 펩타이드라는 장점과 함께 발아과정 중에 새로운 단백질이 생성되어 발아 이전과는 상이한 펩타이드가 포함되므로 발아과정에서 생성된 펩타이드 및 아미노산을 이용할 수 있다는 장점을 가진다. 또한 부가적으로 발아과정 중에 생성되는 생리활성 물질을 포함시킬 수 있어 이를 화장료에 첨가할 경우 종래의 화장료보다 우수한 화장료를 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 검은콩 및 검은쌀을 발아시키고 이를 단백질분해효소로 가수분해시킴으로써 펩타이드 혼합물을 제조하여 이를 함유하는 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 발아된 검은콩 및 검은쌀을 효소분해하여 제조된 펩타이드 혼합물을 함유함으로서 기존의 피부개선 성분을 함유하는 화장료에 비해 효과가 향상되었으며, 발아된 검은콩 및 검은쌀을 효소분해 펩타이드를 화장료에 0.001-10중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 발아된 검은쌀을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물, 발아된 검은콩을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 제형인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 발아된 검은쌀을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물, 발아된 검은콩을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물 중의 1종 이상을 화장료의 총 중량에 대하여 0.001-10 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 구성을 좀더 상세하게 설명하면, 본 발명의 발아된 검은콩 또는 검은쌀 효소분해 펩타이드 혼합물은 화장료의 중량에 0.001-10중량%, 바람직하게는 0.01-5중량%를 함유한다. 발아된 검은콩 또는 검은쌀 효소분해 펩타이드 혼합물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우는 성분의 효능을 거의 나타내지 못하며, 10중량% 이상인 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증대치가 미미하고, 조성물 색상이 바람직하지 못하며, 변성될 가능성이 높아진다.

또한 본 발명의 발아된 검은콩 및 검은쌀 효소분해한 펩타이드 혼합물을 함유하는 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없는데, 예를 들면, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 등의 제형을 가질 수 있다. 그리고, 각제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 발아 검은콩 및 검은쌀 펩타이드 외의 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명에 사용되는 발아 검은콩 및 검은쌀 효소분해 펩타이드 혼합물은 발아된 검은쌀, 검은콩 등의 식물종자에 단백질 분해효소를 이용, 분해하여 제조된 펩타이드이며, 우수한 보습효과와 피부 내 섬유아세포의 증식과 콜라겐 합성을 촉진하여 피부주름 개선효과를 부여하는 기능 및 피부 내의 멜라닌 생산을 저해하여 미백효과를 가지고 있다.

이하에서 실시예들을 들어 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예의 기재에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

도정하지 않은 검은쌀은 수세하여 불순물을 제거하고 적절한 농도의 소금물에 담궈 가라앉는 종자만을 골라 실온에서 충분한 양의 물에 48시간 침지한 후 수세하고, 바닥에 깨끗한 면포를 충분한 두께로 깐 철망 위에 고르게 깔고 위에 다시 깨끗한 면포를 덮어두고 25℃, 빛이 차단된 상태에서 약 4㎜ 발아될 때까지 6시간 간격으로 충분한 양의 물로 면포를 적셔 주어 발아시켰다.

상기와 같이 발아된 검은쌀을 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 검은쌀 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 검은쌀 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액 을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.

상기의 발아 검은쌀 분산액에 파파인(Papain, EC 3.4.22.2, Fluka, USA)을 마쇄 발아 검은쌀 중량의 0.2% 첨가하고 40℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.

이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 하기 실시예 및 실험예에서 사용하였다.

[실시예 2]

수세하여 불순물을 제거한 검은콩은 알이 굵고 흠집이 없는 종자를 골라 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 바닥에 깨끗한 면포를 충분한 두께로 깐 철망 위에 고르게 깔고 위에 다시 깨끗한 면포를 덮어두고 30℃, 빛이 차단된 상태에서 약 7㎜ 발아될 때까지 6시간 간격으로 충분한 양의 물로 면포를 적셔 주어 발아시켰다.

상기와 같이 발아된 검은콩을 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 검은콩 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산시킨 후 여과하고 마쇄된 발아 검은콩을 회수하여 실온에서 건조시켜 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄 발아 검은콩에 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산시키고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 검은콩 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 9.0으로 조절하였다.

상기 발아 검은콩 분산액에 파파인(Papain, EC 3.4.22.2, Fluka, USA)을 마쇄 검은콩 중량의 0.1% 첨가하고 40℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.

이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 하기 실시예 및 실험예에서 사용하였다.

[실시예 3]

실시예 1와 같이 선별한 검은쌀은 수세하여 불순물을 제거하고 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 충분히 마쇄한 후 마쇄된 검은쌀 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 검은쌀 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.

상기 검은쌀 분산액에 파파인(Papain, EC 3.4.22.2, Fluka, USA)을 마쇄 검은쌀 중량의 0.2% 첨가하고 40℃에서 5시간 동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩 타이드로 용해하였다.

이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 검은쌀 효소분해 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 하기 실시예 및 실험예에서 사용하였다.

[실시예 4]

실시예 2와 같이 선별한 검은콩은 수세하여 불순물을 제거하고 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 충분히 마쇄한 후 마쇄된 검은콩 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산한 후 여과하고 마쇄된 검은콩을 회수하여 실온에서 건조하여 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄된 검은콩에 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 검은콩 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.

상기 검은콩 분산액에 파파인(Papain, EC 3.4.22.2, Fluka, USA)을 마쇄 검은콩 중량의 0.1% 첨가하고 40℃에서 5시간 동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.

이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 하기 실시예 및 실험예에서 사용하였다.

[실시예 5 내지 7 및 비교예 1 내지 3]

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 제조하여 실시예 3 및 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료 및 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다. 실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 1에 나타낸 바와 같다. 우선 표 1에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림을 제조한다.

표의 단위: 중량%

[실시예 8 내지 10 및 비교예 4 내지 6]

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 제조하여 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드를 함유한 화장료 및 비교예 4와 비교실험을 행하여 평가하였다. 실험에 사용된 화장료는 젤형태이고, 그 조성은 표 2에 나타낸 바와 같다. 젤 베이스의 혼합물을 호모믹서기에서 교반, 강력, 탈기, 냉각시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 젤을 제조한다.

표의 단위: 중량%

[실시예 8 내지 10 및 비교예 4 내지 6]

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 제조하여 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료 및 비교예 4와 비교실험을 행하여 평가하였다. 실험에 사용된 화장료는 젤형태이고, 그 조성은 표 2에 나타낸 바와 같다. 젤 베이스의 혼합물을 호모믹서기에서 교반, 강력, 탈기, 냉각시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 젤을 제조한다.

[실시예 11 내지 13 및 비교예 7 내지 9]

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 제조하여 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료 및 비교예 4와 비교실험을 행하여 평가하였다. 실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 3에 나타낸 바와 같다. 우선 표 3에 기록되어 있는 조성을 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림을 제조한다.

표의 단위: 중량%

[실시예 14 내지 16 및 비교예 10 내지 12]

본 실시예는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 함유한 화장료를 제조하였다. 실험에 사용된 화장료는 유액형태이고, 그 조성은 표 4에 나타낸 바와 같다. 우선 표 4에 기록되어 있는 조성을 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 유액을 제조한다.

표의 단위: 중량%

[시험예 1] 항산화 효과 측정

크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성하는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다.

이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitroblue tetrazolium;NBT)과 반응 하여 이것에 의해 생성하는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소량을 측정한다.

사용한 시약으로서는

1) 0.05M(50mM) Na₂CO₃완충액(MW=105.99) : 탄산나트륨 5.25g(50mM)을 정제수에 용해한 용액과 50mM NaHCO₃(MW=84.01) 용액을 혼합하여 pH 10.2로 한다.

2) 3mM 크산틴(xanthine)용액 : 크산틴(MW=152.11) 45.6mg을 물에 용해하여 10ml로 한다.

3) 3mM EDTA용액 : 에틸렌디아민4초산나트륨(MW=60.1)을 증류수에 용해하여 3mM로 한다.

4) 0.15% BSA용액 : BSA(Fraction V, powder, Sigma) 15mg을 증류수에 용해하여 10ml로 한다.

5) 0.75mM NBT용액 : 니트로블루 테트라졸리움(Nitroblue tetrazolium)(MW=817.65) 61.32mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

6) 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase) 용액 : 크산틴 옥시다아제(Boehringer)를 증류수로 약 100배로 희석하고 측정조작에서 공시험의 흡광도가 0.2∼0.23의 범위에 들도록 한다. 다시말해 흡광도의변화가 A560=0.3/20분이 되게 정제수로 희석한다.

7) 6mM CuCl₂ 용액 :염화구리(CuCl₂-2H₂O, MW=134.45)를 102.29mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

가. 0.05M Na₂CO₃ -------------- 2.4ml

나. 3mM 크산틴 용액 ------ 0.1ml

다. 3mM EDTA용액 ------ 0.1ml

라. BSA용액 ------------- 0.1ml

마. 0.72mM NBT용액 ----- 0.1ml

바. 크산틴 옥시다아제 용액 --- 0.1ml

사. 6mM CuCl₂ 용액 --------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후에 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과산출은 다음의 수학식 1에 의하여 계산하였다.

억제율(%) =〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소반응후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

시험에 사용한 시료는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아된 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 0.2% 수용액과 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 0.2% 수용액을 가지고 비교하여 실험한 것의 결과값이다. 그 결과를 표 5에 나타내었다. 표5에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 2의 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드 및 발아 검은콩 효소분해 펩타이드 수용액은 실시예 3 내지 4의 검은쌀 효소분해 펩타이드 수용액 및 검은콩 효소분해 펩타이드에 비해 활성산소 제거효과가 우수함을 알 수 있다.

[시험예 2] 세포 활성 효과 측정 (MTT assay)

세포주는 마우스 유래 섬유아세포인 Hs-68 사용하였으며 12웰 플레이트(well plate)에 웰당 2 x 10⁵cell 수로 세포를 분주하고 24시간 배양하였다. 각 시료를 세 포독성을 일으키지 않는 농도로 처리하고 시료를 처리한 후 24시간이 지나면 배지를 제거하고 각 웰당 500ul 새 배지와 60ul MTT용액을 넣은 후 2시간 동안 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포를 용해시키고 각각을 100ul씩 96웰 플레이트에 옮긴다. ELISA 판독기로 565nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군은 시료를 첨가하지 않는다는 것을 제외하고 상기와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정하고, 세포의 증식율은 대조군의 세포증식율을 100으로한 비교 백분율로 나타내었다. 시험에 사용한 시료는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아된 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 0.2% 수용액과 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 추출물 0.2% 수용액을 가지고 비교하여 실험한 것의 결과값이다. 그 결과를 표 6에 나타내었다. 표6에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 2의 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드 및 발아 검은콩 효소분해 펩타이드 수용액은 실시예 3 내지 4의 검은쌀 효소분해 펩타이드 수용액 및 검은콩 효소분해 펩타이드에 비해 마우스 유래 섬유아세포인 Hs-68에 대한 세포증식 효과가 우수함을 알 수 있다.

[시험예 3] 콜라겐 생성 촉진 효과 측정

실험에 사용한 세포주는 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF)를 사용하였으며, 시료를 첨가 후 세포외 기질(extracellular matrix)의 주요성분인 콜라겐의 농도를 측정하기 위해서 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 실시하였다. 시료가 첨가된 배지(serum free)로 교환하고 12시간 배양한 다음 PBS-T(0.02% tween-20 in PBS)로 HDF를 3회 세척하였다. 3% 포름알데히드(formaldehyde)로 세포를 20분간 고정화한 다음 5% 탈지유(skim milk)를 1시간 처리하여 블로킹(blocking)하였다. 1차항체(Primary antibody)인 단일클론 항콜라겐 타입Ⅰ 항체(monoclonal anti-collagen type I antybody)를 37 , 5% CO₂에서 40분간 반응시켰다. PBS-T로 3회 세척 후, 2차항체(secondary antibody)인 항-마우스 IgG항체(anti-mouse IgG antibody) 를 PBS-T 에 1/1,000로 희석하여 다시 40분 정도 반응시킨 후, PBS-T로 5회 세척하여 준다. 기질인 알칼린 포스파타아제 기질 용액(alkaline phosphatase substrate solution)(1mg/ml -nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군은 시료를 첨가하지 않는다는 것을 제외하고 상기에서와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정하며, 콜라겐 생성 촉진효과는 대조군의 콜라겐양을 100으로 한 비교 백분율로 나타내었다.

시험에 사용한 시료는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아된 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 0.2% 수용액과 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 추출물 0.2% 수용액을 가지고 비교하여 실험하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

표7에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 2의 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드 및 발아 검은콩 효소분해 펩타이드 수용액은 실시예 3 내지 4의 검은쌀 효소분해 펩타이드 수용액 및 검은콩 효소분해 펩타이드에 비해 인간 섬유아세포에 대한 콜라겐 생산 촉진 효과가 우수함을 알 수 있다.

[시험예 4] 티로시나제를 이용한 티로시나제 억제효과 측정시험

본 시험예의 시험은 실시예에서 수득한 시료의 미백효과를 확인하기 위해피부 내 멜라닌 생합성 과정의 조절 인자인 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 통해 미백효과를 판단하는 시험이다.

티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성과정의 조절인자로 작용하는 효소로서, 본 시험예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomeranz S.H., J. Biochem., 24, 167-168, 1966)을 응용해 미백효과를 판정하였다.

시료 15ul를 96웰 플레이트에 가하고 50mM 인산완충액(pH 6.5) 150ul, 1.5mM L-티로신 용액 25ul를 가한 후, 버섯 티로시나제(1,500 units/ml, Sigma사) 10ul를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)(ELx800, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 다음 수학식 2에 의하여 계산하였으며, IC50값은 티로시나제 효소활성을 50% 저해하는 시료의 농도이다.

저해율(%)=[(D-C)-(B-A)/(D-C)]×100

A : 시료를 가한 웰(well)의 반응 전 흡광도

B : 시료를 가한 웰의 반응 후 흡광도

C : 시료를 가하지 않은 웰의 반응 전 흡광도

D : 시료를 가하지 않은 웰의 반응 후 흡광도

시험에 사용한 시료는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아된 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물 0.2% 수용액과 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 추출물 혼합물 0.2% 수용액을 가지고 비교하여 실험하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다. 표8에 나타난 바와 같이, 실시예 3 내지 4의 검은쌀 효소분해 펩타이드 수용액 및 검은콩 효소분해 펩타이드의 경우, 티로시나제에 대한 저해효과를 확인할 수 없었던 것에 비해 실시예 1 내지 2의 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드 및 발아 검은콩 효소분해 펩타이드 수용액은 티로시나제에 대한 우수한 저해효과를 가지는 것으로 나타났다.

[시험예 5] 멜라닌형성세포 자극 호르몬(MSH)을 이용한 멜라닌형성세포의 멜라닌 합성 저해 실험

본 시험예의 시험은 실시예의 시료의 미백효과를 확인하기 위해 멜라닌형성세포에 대한 멜라닌 합성 저해효과를 확인하는 실험이다. 시험에 사용된 세포주는 A375SM 멜라닌 형성세포로서 사람에서 유래한 세포주이며 정상적인 조건에서는 멜라닌을 분비하지 않다가 멜라닌형성세포의 세포막 수용체와 결합하여 세포내로 멜라닌 합성 신호를 전달하는 싸이토카인인 멜라닌형성세포 자극호르몬을 처리하면 멜라닌을 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 α-MSH와 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드와 발아 검은콩 효소분해 펩타이드를 처리하여 멜라닌 흑색색소의 합성정도를 비교, 평가하였다. 본 시험예에서 사용된 A375SM 멜라닌 형성세포는 KCLB(Korea Cell Line Bank, 기탁번호:80004)로부터 분양받아 사용하였다.

A375SM 멜라닌형성세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 α-MSH(Sigma사) 200nM과 시료를 동시에 처리하여 48시간동안 배양하였다. 48시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다 음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res., 40,3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 세포 펠렛(Cell pellet)을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 인산나트륨 완충액, pH6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1ml을 가하여 5분간 진탕하여 세포를 파쇄하였다. 3000rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 세포 파쇄액에 10% DMSO를 첨가한 1N 수산화나트륨 용액을 가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로플레이트 판독기(ELx800,USA)로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정하여 합성된 멜라닌을 정량한 다음 시료의 멜라닌 합성 저해율을 측정하였다.

A375SM 멜라닌형성세포의 멜라닌 합성 저해율(%)dms 다음 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC50값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 시료의 농도이다.

저해율(%)=[(A-B)/A]×100

A : α-MSH만 첨가한 웰의 멜라닌 양

B : 시료와 α-MSH를 동시에 가한 웰의 멜라닌 양

시험에 사용한 시료는 실시예 1 내지 2에서 수득한 발아된 검은쌀 및 검은콩 효소분해 펩타이드 0.2% 수용액과 실시예 3 내지 4에서 수득한 검은쌀 및 검은콩 추출물 0.2% 수용액을 가지고 비교하여 실험하였으며, 그 결과를 표 9에 나타내었다. 표9에 나타난 바와 같이, 실시예 3 내지 4의 검은쌀 효소분해 펩타이드 수용액 및 검은콩 효소분해 펩타이드의 경우, 멜라닌형성세포에 대한 멜라닌 합성 저해효과를 확인할 수 없었던 것에 비해 실시예 1 내지 2의 발아 검은쌀 효소분해 펩타이 드 및 발아 검은콩 효소분해 펩타이드 수용액은 멜라닌형성세포에 대해 우수한 멜라닌 합성 저해효과를 가지는 것으로 나타났다.

[시험예 6] 피부 잔주름 개선 효과와 피부미용효과 측정

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽부위에는 실시예 5 내지 7 및 비교예 2 내지 3에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 3개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 잔주름 완화 효과는 제품 사용 전과 3개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태와 색차계를 이용하여 피부색 개선 정도를 비교하였다.

표 10은 실시예 5 내지 7 및 비교예 2 내지 3에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 얼굴 오른쪽부위 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름 감소 정도를 비교예 1의 크림을 사용한 실험자의 얼굴 왼쪽부위와 비교한 것이다. 표 10에서 나타난 바와 같이 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드 혼합물 및 발아 검은콩 효소분해 펩타이들 드 혼합물을 첨가한 실시예 5 내지 7의 크림의 경우는 크림 베이스만을 처리한 비교예 1과 검은쌀 효소분해 펩타이드를 첨가한 비교예 2, 검은콩 효소분해 펩타이드를 첨가한 비교예 3에 비해 도포한 실험자의 안면 눈 주위 피부에서 피부 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

[시험예 7] 피부 보습효과 측정

보습효과의 측정은 코르네오메타(Corneometer) CM825를 이용한 커패시턴스 측정법을 사용하고, 20∼30대 여성 20명을 대상으로 하여, 시험 시작 직전에 전박 굴측면을 항온항습실(22℃, 상대습도 40~60%)에서 20분동안 적응하게 하여 피부의 수분 자체를 일정하게 유지시켰다. 그 다음, 코르네오메타 CM825을 사용하여 각 시료 도포부위의 초기 수분 보유량을 측정한 후, 시료를 도포하였다. 시료의 도포는, 2.0 mg/cm²를 전박 굴측면에 따른 오차를 최소화하기 위하여 피검자마다 도포하는 시료의 위치를 달리하면서 도포하였다. 도포 10분, 30분, 50분, 90분, 120분에서 시간별로 피부 수분량을 1차 측정하고, 2시간 후에 다시 피부 수분량을 측정하였다. 실시예각 측정부위를 3번 반복 측정하고 그 평균값으로 하기 수학식 4에 따라 피부 수분량을 계산한다. 시험에 사용한 시료는 8 내지 10에서 수득한 젤을 비교예 4 내지 6에서 제조한 젤과 비교하여 그 결과를 표 11에 나타내었다.

Tdi : 시료도포부위의 n번째 측정값

Tdo :시료도포부위의 도포전 측정값(시험부위 초기 수분량)

NTdi :시료를 도포하지 않은 부위의 n번째 측정값

NTdo : 시료를 도포하지 않은 부위의 도포전 측정값(대조부위 초기 수분량)

표 11은 실시예 8 내지 10 및 비교예 4 내지 5에서 제조된 젤을 도포한 실험자 전박 굴측면의 도포 후 시간경과에 따른 피부수분량을 측정한 결과이다. 표 11에서 나타난 바와 같이 발아 검은쌀 효소분해 펩타이드 혼합물 및 발아 검은콩 효소분해 펩타이드 혼합물을 첨가한 실시예 8 내지 10의 크림의 경우는 젤 베이스만을 처리한 비교예 4와 검은쌀 효소분해 펩타이드를 첨가한 비교예 5, 검은콩 효소분해 펩타이드를 첨가한 비교예 6에 비해 도포한 실험자 전박 굴측면의 도포 후 시간 경과에 따른 피부수분 감소정도가 적어, 시간경과에 따른 피부수분 유지 효과가 우수함을 알 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물은 발아된 검은쌀 및 검은콩을 효소분해하여 제조된 펩타이드 혼합물을 함유함으로서 보습효과와 피부내 섬유아세포의 증식과 콜라겐 합성을 촉진하고 피부주름 개선효과를 부여하는 항노화 효과 및 피부 내의 멜라닌 생산을 저해하여 미백효과를 제공할 수 있다.

Claims (3)

1. 발아된 검은쌀을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물, 발아된 검은콩을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 제형인 것을 특징으로 하는, 발아된 검은쌀을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물, 발아된 검은콩을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 발아된 검은쌀을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물, 발아된 검은콩을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물 중의 1종 이상은 화장료의 총 중량에 대하여 0.001-10 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는, 발아된 검은쌀을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물, 발아된 검은콩을 단백질분해효소로 가수분해한 펩타이드 혼합물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.