[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR100479767B1 - DNA amplification monitoring by fluorescence - Google Patents

DNA amplification monitoring by fluorescence Download PDF

Info

Publication number
KR100479767B1
KR100479767B1 KR10-1998-0709729A KR19980709729A KR100479767B1 KR 100479767 B1 KR100479767 B1 KR 100479767B1 KR 19980709729 A KR19980709729 A KR 19980709729A KR 100479767 B1 KR100479767 B1 KR 100479767B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fluorescence
temperature
sample
pcr
amplification
Prior art date
Application number
KR10-1998-0709729A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20000016161A (en
Inventor
칼 티. 위터
커크 엠. 리리
랜디 피. 라스센
데이비드 알. 힐야드
Original Assignee
유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 filed Critical 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Priority to KR10-1998-0709729A priority Critical patent/KR100479767B1/en
Publication of KR20000016161A publication Critical patent/KR20000016161A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR100479767B1 publication Critical patent/KR100479767B1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5082—Test tubes per se
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B01L2300/0838—Capillaries
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1838—Means for temperature control using fluid heat transfer medium
    • B01L2300/1844—Means for temperature control using fluid heat transfer medium using fans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/0303—Optical path conditioning in cuvettes, e.g. windows; adapted optical elements or systems; path modifying or adjustment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/07—Centrifugal type cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/025—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having a carousel or turntable for reaction cells or cuvettes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

열 싸이클링 방법 및 장치가 발표된다. 이 장치는 DNA 폴리메라제 연쇄반응과 같은 여러 생물학적 절차를 수행하는데 필요한 온도범위에 대해서 신속하고 정확하게 온도가 조절될 수 있는 샘플챔버를 포함한다. 생물학적 샘플은 유리 마이크로 모세관 튜브에 충진되고 이후에 샘플 챔버 내부에 위치된다. 프로그램가능한 제어기는 샘플 챔버 내부의 샘플 온도를 조절한다. DNA 증폭의 모니터링은 싸이클당 한 번 또는 싸이클당 여러번 형광에 의해 모니터링 된다. 본 발명은 DNA 정량화에 강력한 도구인 PCR 형광 모니터링 방법을 제공한다.Thermal cycling methods and apparatus are disclosed. The device includes a sample chamber that can be quickly and accurately temperature controlled over the temperature range needed to perform various biological procedures such as DNA polymerase chain reaction. The biological sample is filled in a glass micro capillary tube and then placed inside the sample chamber. The programmable controller regulates the sample temperature inside the sample chamber. Monitoring of DNA amplification is monitored by fluorescence once per cycle or several times per cycle. The present invention provides a PCR fluorescence monitoring method that is a powerful tool for DNA quantification.

Description

형광에 의한 ＤＮＡ 증폭 모니터링 방법 및 시스템Method and system for monitoring DNA amplification by fluorescence

본 발명은 반응의 진행을 모니터링하면서 PCR 샘플을 신속히 제어하는 장치에 관계한다. 특히 본 발명은 반응을 모니터링하면서 신속한 PCR이 수행될 수 있게 하는 열 싸이클링 장치에 관계한다.The present invention relates to an apparatus for rapidly controlling PCR samples while monitoring the progress of a reaction. In particular, the present invention relates to a thermal cycling device that allows rapid PCR to be performed while monitoring the reaction.

다양한 산업, 기술 및 연구 분야에서 비교적 적은 샘플을 신뢰성 있고 재현성 있게 열 싸이클링을 받게할 필요가 있다. 샘플을 반복된 열 싸이클을 받게할 필요성은 특히 생물공학 분야에서 절실하다. 생물공학 분야에서 짧은 기간에 걸쳐서 작은 샘플을 반복적으로 가열 및 냉각할 필요가 자주 발생한다. 정기적으로 수행되는 이러한 생물학적 과정은 주기적 DNA 증폭이다.In a variety of industries, technologies and research areas, relatively few samples need to be subjected to thermal cycling reliably and reproducibly. The need for samples to undergo repeated heat cycles is particularly urgent in the field of biotechnology. In the field of biotechnology, it is often necessary to repeatedly heat and cool small samples over a short period of time. This biological process that is performed regularly is periodic DNA amplification.

열안정성 DNA 폴리메라제를 사용하는 주기적 DNA 증폭은 "폴리메라제 체인 반응"이라고 널리 알려진 프라이머 특이성 DNA의 자동 증폭을 허용한다. 이러한 과정의 자동화는 통상 복수의 용기에 담긴 반응 혼합물의 조절되고 정확한 열 싸이클링을 필요로 한다. 과거에 선호되는 용기는 플라스틱 마이크로 튜브였다.Periodic DNA amplification using thermostable DNA polymerases allows for automatic amplification of primer specific DNA, well known as the "polymerase chain reaction." Automation of this process usually requires controlled and accurate thermal cycling of the reaction mixture in a plurality of vessels. In the past, the preferred container was a plastic micro tube.

시간에 대한 필요한 온도구배를 통해서 마이크로 튜브에서 샘플의 열 싸이클링을 하기 위해서 과거에는 프로그램가능한 금속 열 블럭이 사용되었다. 그러나, 짧은 기간에 걸쳐서 넓은 온도 범위에서 열블럭의 온도를 신속하고 정확하게 조절할 수 없으므로 폴리머아제 체인 반응을 수행할 때 열 제어 시스템으로서 열블럭 형태의 장치가 바람직하지 않게 되었다.Programmable metal thermal blocks have been used in the past to thermally cycle samples in microtubes through the required temperature gradient over time. However, since it is not possible to quickly and accurately control the temperature of the heat block over a wide temperature range over a short period of time, the device in the form of a heat block as a thermal control system when carrying out the polymerase chain reaction has become undesirable.

게다가, 일반적으로 사용된 마이크로 튜브는 단점이 있다. 마이크로 튜브 재료, 이의 벽두께, 및 마이크로 튜브의 모양은 그속에 담긴 샘플의 신속한 가열 및 냉각에 장애가 된다. 마이크로 튜브의 벽두께 및 플라스틱 재료는 담긴 샘플과 주변 매체간에 절연체로서 작용하여 열에너지 전달을 방해한다. 또한 마이크로튜브의 모양은 열에너지 전달에 어떠한 매체가 사용되는지에 관계없이 작은 표면적을 제시한다. 당해 분야에서 최적이 아닌 모양을 가진 마이크로 튜브의 계속된 사용은 개선된 열전달(일정한 부피의 샘플에 대해서 샘플용기의 표면적을 증가시킴으로써 가능한)의 장점이 여태까지 인식되지 않았음을 표시한다.In addition, generally used microtubes have disadvantages. The micro tube material, its wall thickness, and the shape of the micro tube impede the rapid heating and cooling of the sample contained therein. The wall thickness of the microtubes and the plastic material act as an insulator between the contained sample and the surrounding medium, hindering heat energy transfer. The shape of the microtubes also presents a small surface area, regardless of what medium is used for thermal energy transfer. Continued use of microtubes with non-optimal shapes in the art indicates that the benefits of improved heat transfer (possibly by increasing the surface area of the sample container for a constant volume of sample) have not been recognized to date.

게다가, 유체식 전환(또는 기계적 전달)을 하는 수조를 사용하는 장치가 폴리메라제 연쇄반응을 위한 열적 순환기로 사용된다. 수조는 반응에 필요한 시간대 온도 구배를 통해 폴리메라제 연쇄 반응 혼합물을 싸이클링시키는데 사용되었지만 물의 높은 열질량과 플라스틱 마이크로 튜브의 낮은 열 전도성은 장치의 성능 및 반응의 수율을 크게 제한시켰다.In addition, a device using a water bath with fluidic conversion (or mechanical transfer) is used as the thermal cycler for the polymerase chain reaction. The bath was used to cycle the polymerase chain reaction mixture through the time zone temperature gradient required for the reaction, but the high thermal mass of water and the low thermal conductivity of the plastic microtubes greatly limited the performance of the device and the yield of the reaction.

수조를 사용한 장치는 성능에 있어서 제한적이다. 그 이유는 물의 열질량이 달성될 수 있는 시간에 대한 최대 온도 그래디언트를 크게 한정시키기 때문이다. 또한, 수조 장치는 크기, 물전달 호스의 수, 및 외부 온도 조절 장치로 인하여 매우 복잡하다. 게다가, 수조 장치의 누수를 탐지할 목적으로 피팅의 주기적인 보수 및 조사는 귀찮고 시간 소모적이다. 마지막으로, 샘플 튜브내 온도를 필요한 정확도로 제어하는 것이 수조장치로는 곤란하다.Apparatus using a water bath is limited in performance. This is because the thermal mass of water greatly limits the maximum temperature gradient over time. In addition, the bath apparatus is very complicated due to the size, the number of water transfer hoses, and the external thermostat. In addition, periodic maintenance and inspection of the fittings for the purpose of detecting leaks in the bath apparatus are cumbersome and time consuming. Finally, it is difficult for a bath apparatus to control the temperature in the sample tube to the required accuracy.

미국특허 3,616,264(Ray)는 생물학적 샘플을 일정한 온도로 가열 또는 냉각시키기 위해서 공기를 순환시키는 장치를 보여준다. Ray의 장치가 에어 챔버내의 온도를 일정하게 유지시키는데 다소 효과적이지만 폴리메라제 연쇄반응과 같은 생물학적 과정에 필요로 하는 시간대 온도 프로파일에 따라 주기적 방식으로 온도를 신속히 조절할 필요성에 대해서 강조하지 않는다.US 3,616, 264 to Ray shows a device for circulating air to heat or cool a biological sample to a constant temperature. Although Ray's device is somewhat effective at keeping the temperature in the air chamber constant, it does not emphasize the need to quickly adjust the temperature in a periodic manner depending on the time zone temperature profile required for biological processes such as polymerase chain reactions.

미국특허 4,420,679(Howe) 및 4,286,456(Sisti)는 가스 크로마토그래피 오븐을 발표한다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 가스 크로마토그래피 과정을 수행하는데 적합하지만 이전에 언급된 장치에 의해 제공되는 것보다 빠른 열적 싸이클링을 제공하지 못한다. 신속한 열적 순환은 많은 과정을 수행하는데 유용하다. Howe 및 Sisti 특허에서 발표된 장치는 이러한 반응을 빠르고 효과적으로 수행하는데는 부적합하다.US Pat. Nos. 4,420,679 (Howe) and 4,286,456 (Sisti) disclose gas chromatography ovens. The devices disclosed in the Howe and Sisti patents are suitable for performing gas chromatography processes but do not provide faster thermal cycling than those provided by the previously mentioned devices. Rapid thermal cycling is useful for carrying out many processes. The devices presented in the Howe and Sisti patents are not suitable for performing this reaction quickly and effectively.

특히, 폴리메라제 연쇄반응(PCR)은 분자생물학의 기본이며 임상 실험실에서 중요한 분자공학 기술이다. 이의 유용성 및 대중성에도 불구하고 PCR에 대한 현재의 지식은 그다지 진보하지 못했다. 증폭은 시행착오에 의해 최적화되어야 하며 프로토콜은 맹목적이었다. 당해분야에서 PCR에 대한 제한된 이해는 당해분야의 숙련된 자가 이해없이 강력한 기술을 활용하는데 얼마나 만족하는가에 대한 좋은 예이다.In particular, polymerase chain reaction (PCR) is the basis of molecular biology and an important molecular engineering technique in clinical laboratories. Despite its usefulness and popularity, current knowledge of PCR has not progressed much. Amplification must be optimized by trial and error and the protocol is blind. A limited understanding of PCR in the art is a good example of how satisfied are those who utilize powerful techniques without self-understanding by those skilled in the art.

PCR을 샘플의 온도 순환을 필요로 한다. 공지기술이 온도 순환을 느리게 시킬 뿐만 아니라 PCR의 기본 원리를 무시하며 PCR을 더욱 유용하게 하는데 사용될 수 있는 기본원리를 무시한다. 따라서, PCR을 빠르게 수행하며 일어나는 반응을 분석하는 장치 및 방법을 제공한다면, 특히 이러한 반응이 실시간으로 분석된다면 당해분야에서 큰 진보일 것이다.PCR requires temperature cycling of the sample. Known techniques not only slow temperature cycling but also ignore the basic principles of PCR and ignore basic principles that can be used to make PCR more useful. Thus, providing a device and method for analyzing reactions occurring while performing PCR rapidly would be a major advance in the art, particularly if such reactions were analyzed in real time.

도 1 은 본 발명의 개념에 따라 순환적 DNA 증폭에 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 열적 싸이클링 장치의 사시도이다.1 is a perspective view of a thermal cycling device of a biological sample that can be used for cyclic DNA amplification in accordance with the inventive concepts.

도 2 는 도 1 장치의 유체 챔버부위의 측면도이다.FIG. 2 is a side view of the fluid chamber portion of the device of FIG. 1. FIG.

도 3 은 도 1 에 도시된 장치의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.3 is an internal plan view of the fluid chamber portion of the apparatus shown in FIG.

도 4 는 본 발명의 또다른 구체예의 유체 챔버부위의 내부 평면도이다.4 is an interior plan view of a fluid chamber portion of another embodiment of the present invention.

도 5 는 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용하여 폴리메라제 연쇄반응에 대한 최적화된 시간대 온도 프로파일을 보여준다.5 shows an optimized time zone temperature profile for polymerase chain reaction using the thermal cycling device of the present invention.

도 6 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 어닐링 시간이 PCR 특이성 및 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.6 is a graph showing the effect of annealing time on PCR specificity and yield when using the thermal cycling device of the present invention.

도 7 은 본 발명의 열적 싸이클링 장치를 사용할 때 변성 시간이 PCR 수율에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.7 is a graph showing the effect of denaturation time on the PCR yield when using the thermal cycling device of the present invention.

도 8a 및 8b 는 본 발명의 또다른 구체예의 사시도와 단면도를 보여준다.8A and 8B show a perspective view and a cross sectional view of another embodiment of the present invention.

도 8c 는 도 8a 및 8b 에 도시된 구체예에서 생물학적 샘플을 담는 모세관 튜브와 열발생요소의 관계를 나타내는 다이아그램이다.FIG. 8C is a diagram showing the relationship between the capillary tube and the heat generating element in the embodiment shown in FIGS. 8A and 8B.

도 9a 는 4개의 상이한 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물(A-D)을 보여준다.9A shows the results of four different temperature / time profiles (A-D) and the amplification product (A-D) after 30 cycles.

도 9b 는 본 발명에 의해 사용된 또다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.9B shows another cycle of temperature / time profile used by the present invention.

도 9c-g 는 본 발명에서 사용되는 다른 온도/시간 프로파일의 싸이클을 보여준다.9C-G show cycles of different temperature / time profiles used in the present invention.

도 10 은 본 발명에 따른 온도 기울기 제어회로의 블록선도이다.10 is a block diagram of a temperature gradient control circuit according to the present invention.

도 11 은 본 발명에 따라서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러의 개략도이다.11 is a schematic of a rapid temperature cycler for fluorescence detection in accordance with the present invention.

도 11a 는 도 11 의 장치의 작동을 보여주는 시간대 온도 차트이다.11A is a time zone temperature chart showing operation of the device of FIG. 11.

도 12 는 3차원 플롯으로도 도시된 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광을 2차원 플롯으로 보여주는 차트이다.FIG. 12 is a chart showing time zone temperature, time zone fluorescence, and temperature zone fluorescence shown in three-dimensional plots as two-dimensional plots.

도 13 은 인간 β-글로블린 유전자의 536 베이스 쌍 조각에 대한 온도대 형광 투영도이다.FIG. 13 is a temperature band fluorescence projection of 536 base pair fragments of the human β-globulin gene. FIG.

도 14 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광대 싸이클 횟수 플롯이다.14 is a plot of the number of fluorescence cycle cycles obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 15 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 형광비대 싸이클 횟수 플롯이다.15 is a plot of the number of fluorescence hypertrophy cycles obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 16 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.16 is a plot of temperature versus fluorescence ratio obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 16a 는 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 싸이클횟수대 형광비 플롯이다.16A is a cycle count versus fluorescence ratio plot obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 17 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 온도대 형광비 플롯이다.17 is a plot of temperature versus fluorescence ratio obtained in accordance with another aspect of the present invention.

도 18 은 본 발명의 또다른 측면에 따라 획득된 수많은 초기 템플레이트 복제물에 대한 싸이클 횟수대 형광 플롯이다.18 is a cycle count versus fluorescence plot for a number of initial template replicas obtained according to another aspect of the present invention.

도 19a-d 는 본 발명에 따라서 PCR 생성물의 서열 특이성 탐지를 제공하기 위한 2개의 선호되는 배열을 보여준다.19A-D show two preferred arrangements for providing sequence specificity detection of PCR products in accordance with the present invention.

도 20 은 본 발명에 따라서 획득된 이중-라벨링된 가수분해 프로브를 써서 모니터링된 DNA 증폭에 대한 싸이클 횟수대 형광비(형광제/로오다민) 플롯이다.FIG. 20 is a plot of the cycle number versus fluorescence (fluorescent / rhoodamine) versus DNA amplification monitored using the double-labeled hydrolysis probe obtained according to the present invention.

도 21a-d 는 dsDNA 염료 SYBR Green I(A), 이중라벨링된 형광제/로오다민 가수분해 프로브(B), 및 Cy5-라벨링된 프라이머를 갖는 형광제-라벨링된 교합 프로브(c)를 포함하여 PCR에 대한 3개의 형광 모니터링 방법을 비교하는 것으로서, 도 21d 는 도 21a-c 에 도시된 3개의 모니터링 기술의 분산 계수를 보여준다.Figures 21A-D include dsDNA dye SYBR Green I (A), dual labeled fluorescent / rhoodamine hydrolysis probes (B), and fluorescent agent-labeled occlusal probes (c) with Cy5-labeled primers. As a comparison of the three fluorescence monitoring methods for PCR, FIG. 21D shows the variance coefficients of the three monitoring techniques shown in FIGS. 21A-C.

도 22 는 PCR 형광곡선의 정량화를 위한 내삽방법의 적용을 보여주는 플롯이다.22 is a plot showing the application of the interpolation method for the quantification of PCR fluorescence curves.

도 23a 는 더 많은 프로브가 가수분해될 때 온도에 따른 형광비의 선형 변화와 형광의 증가를 보여주는 플롯이다.23A is a plot showing the linear change in fluorescence ratio and increase in fluorescence with temperature as more probes are hydrolyzed.

도 23b 는 교합 프로브로 부터 형광비가 온도에 따라 급변함을 보여주는 플롯이다.23B is a plot showing that the fluorescence ratio from the occlusion probe changes rapidly with temperature.

도 24 는 본 발명에 따라서 PCR동안 생성물쇄 상태의 온도 종속성을 보여주는 플롯이다.24 is a plot showing temperature dependence of product chain state during PCR in accordance with the present invention.

도 24a 는 SYBR Green I 사용시 PCR의 형광대 온도 플롯이다.24A is a fluorescence band temperature plot of PCR when using SYBR Green I.

도 25 는 본 발명에 따라서 생성물 용융 곡선의 최초성분과 경쟁 성분을 보여주는 플롯이다.25 is a plot showing the original and competitive components of the product melt curve in accordance with the present invention.

도 26 은 본 발명에 따라서 PCR생성물의 다양한 농도에서 생성물 재어닐링 속도에 대한 플롯이다.26 is a plot of product reanneal rate at various concentrations of PCR products in accordance with the present invention.

도 27 은 속도상수의 초기 결정을 보여주는 플롯이다.27 is a plot showing initial determination of velocity constants.

도 28 은 평형 PCR 패러다임과 동적 PCR 패러다임을 보여주는 그래프이다.28 is a graph showing the equilibrium PCR paradigm and the dynamic PCR paradigm.

도 29 는 루틴 증폭의 선형 부위의 로그에서 10배의 동적 범위에 대한 모니터링이 수행됨을 보여준다.29 shows that monitoring is performed for a 10-fold dynamic range in the logarithm of the linear region of routine amplification.

도 30 은 단일 샘플의 연속 모니터링을 위해 구성된 본 발명의 구체예를 보여준다.30 shows an embodiment of the invention configured for continuous monitoring of a single sample.

도 31 은 PCR샘플의 연속 모니터링을 위해서 본 발명에 따른 또다른 구체예의 광학적 배치를 보여준다.Figure 31 shows the optical arrangement of another embodiment according to the present invention for the continuous monitoring of PCR samples.

도 32 는 모세관 샘플튜브의 측부보다 팁을 보여줌으로써 광 파이핑의 효과를 보여주는 차트이다.32 is a chart showing the effect of light piping by showing the tip rather than the side of the capillary sample tube.

도 33 은 모세관 샘플튜브를 사용할 때 관찰되는 편광이 활성화 비임에 대한 튜브의 위치선정에 달려있음을 보여주는 차트이다.33 is a chart showing that the polarization observed when using capillary sample tubes depends on the positioning of the tubes relative to the activation beam.

도 34 는 본 발명에 따라서 하나의 편광 프로브 사용시 수득되는 결과를 보여준다.34 shows the results obtained when using one polarizing probe according to the present invention.

도 35 는 형광제와 로오다민 라벨 사이에 5개의 베이스를 갖는 프로브로 부터 나오는 형광 PCR 결과이다.FIG. 35 shows fluorescence PCR results from probes with five bases between the fluorescent and rhodaramine labels.

도 36 은 프로브 농도가 민감성에 미치는 효과를 보여준다.36 shows the effect of probe concentration on sensitivity.

도 37 은 본 발명에 따라서 가수분해 프로브의 공명에너지 전달에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 싸이클 횟수 플롯이다.37 is a plot of the number of fluorescence hypertrophy cycles in PCR monitored by resonance energy transfer of hydrolysis probes in accordance with the present invention.

도 38 은 본 발명에 따라서 이중 라벨링된 형광제/Cy5 프로브의 공명에너지 전달에 의해 모니터링된 형광대 방출 파장 플롯이다.FIG. 38 is a fluorescence band emission wavelength plot monitored by resonance energy transfer of dual labeled fluorescent agent / Cy5 probes in accordance with the present invention. FIG.

도 39 는 교합 프로브의 공명에너지 전달에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 싸이클 횟수를 보여주는 플롯이다.39 is a plot showing the number of fluorescence hypertrophy cycles in PCR monitored by resonance energy transfer of occlusion probes.

도 40 은 인접한 교합 프로브에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 온도 플롯이다.40 is a fluorescence hypertrophy temperature plot in PCR monitored by adjacent occlusion probes.

도 41 은 가수분해 프로브에 의해 모니터링된 PCR에서 형광비대 온도 플롯이다.41 is a fluorescence hypertrophy temperature plot in PCR monitored by hydrolysis probes.

도 42a 는 온도와 형광간의 반비례 관계를 보여주는 형광대 시간 플롯이다.42A is a fluorescence band time plot showing an inverse relationship between temperature and fluorescence.

도 42b 는 온도와 형광간의 반비례 관계를 보여주는 온도대 시간 플롯이다.42B is a temperature versus time plot showing the inverse relationship between temperature and fluorescence.

도 43 은 PCR 생성물의 겉보기 Tm이 가열속도에 종속됨을 보여주는 형광대 온도 플롯이다.43 is a fluorescence band temperature plot showing that the apparent T m of a PCR product is dependent on heating rate.

도 44 는 PCR 생성물의 Tm이 dsDNA 염료농도에 종속됨을 보여주는 온도대 상대 형광 플롯이다.FIG. 44 is a temperature versus relative fluorescence plot showing that T m of PCR products is dependent on dsDNA dye concentration.

도 45 는 Tm이 2℃ 차이가 나는 두 개의 정제된 PCR 생성물이 혼합될 때 수득되는 용융곡선을 보여주는 온도대 형광 플롯이다.FIG. 45 is a temperature band fluorescence plot showing the melting curve obtained when two purified PCR products with a T m difference of 2 ° C. are mixed.

도 46 은 각 PCR의 상대적 양이 정량될 수 있는 방법을 보여주는 플롯이다.46 is a plot showing how the relative amounts of each PCR can be quantified.

도 47 은 모세관 샘플튜브의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러의 개략도이다.47 is a schematic of a rapid temperature cycler with fluorescence detection at the tip of a capillary sample tube.

도 47a-d 는 샘플이 충진되는 복합 플라스틱/유리 용기를 보여준다.47A-D show composite plastic / glass containers filled with samples.

도 48 은 형광 교합 모니터링에 유용한 시간대 온도 세그멘트를 보여준다.48 shows time zone temperature segments useful for fluorescence occlusion monitoring.

도 49 는 용융 피크로서 표시된 용융 곡선 정보를 보여준다.49 shows melt curve information indicated as melt peaks.

도 50 은 각 반응 싸이클동안 쇄의 상태를 모니터링할 수 있도록 PCR동안 온도의 함수로서 dsDNA 특이성 염료에서 나오는 형광의 플롯이다.FIG. 50 is a plot of the fluorescence coming from dsDNA specific dyes as a function of temperature during PCR so that the state of the chain can be monitored during each reaction cycle.

도 51 은 용융곡선 획득싸이클 플롯이다.51 is a melt curve acquisition cycle plot.

도 52a 는 PCR 생성물 용융곡선의 절대위치를 보여준다.52A shows the absolute position of the PCR product melt curve.

도 52b 는 변성온도를 통한 신속한 온도전이가 용융곡선을 더 높은 겉보기 Tm으로 이동시킴을 보여주는 플롯이다.52B is a plot showing that rapid temperature transition through denaturation temperature shifts the melting curve to higher apparent T m .

도 53 은 3개의 정제된 PCR 생성물의 용융곡선이다.53 is a melt curve of three purified PCR products.

도 54 는 정제된 PCR 생성물이 혼합될 때 나오는 겹치는 용융곡선을 보여준다.54 shows overlapping melting curves as the purified PCR products are mixed.

도 55 는 2℃미만으로 Tm이 차이가 나는 반응 생성물 혼합물을 별도의 피크로 분해할 수 있음을 보여주는 용융 피크로 전환후 결과를 보여준다.FIG. 55 shows the results after conversion to a melt peak showing that the reaction product mixture with a T m difference of less than 2 ° C. can be broken down into separate peaks.

도 56 은 프라이머 다이머와 같은 비특이성 생성물로 부터 목적 생성물을 구별시키는데 사용되는 용융곡선 분석 플롯이다.FIG. 56 is a melt curve analysis plot used to distinguish a desired product from a nonspecific product, such as a primer dimer.

도 57 은 초기 템플레이트 농도에서 변하는 일련의 반응동안 생성물의 폴리메라제 확장후 각 싸이클마다 획득된 상대 형광을 보여주는 플롯이다.57 is a plot showing the relative fluorescence obtained for each cycle after polymerase expansion of the product during a series of reactions varying at the initial template concentration.

도 58 은 여러 샘플에 대해 획득된 용융 피크 플롯이다.58 is a melt peak plot obtained for several samples.

도 59 는 보정된 플롯을 제공하기 위해서 적당한 비율이 곱해진 도 57 데이타에 대한 플롯이다.FIG. 59 is a plot of FIG. 57 data multiplied by an appropriate ratio to provide a corrected plot. FIG.

도 60 은 도 58 의 결과가 전기영동 결과와 상관함을 보여준다.FIG. 60 shows that the results of FIG. 58 correlate with the electrophoretic results.

도 61 은 존재하는 다양한 생성물의 상대적 양을 추정하기 위해 도 56 에 도시된 용융 곡선이 생성물 피크로 분해될 수 있음을 보여준다.FIG. 61 shows that the melt curve shown in FIG. 56 can be broken down to product peaks to estimate the relative amounts of various products present.

* 부호 설명* Code Description

10 ... 열적 싸이클링 장치 11 ... 챔버10 ... thermal cycling device 11 ... chamber

12 ... 제어기 13 ... 하우징12 ... controller 13 ... housing

14 ... 통기 도어 15 ... 하우징14 ... vent door 15 ... housing

16 ... 송풍기 장착 보오드 17 ... 솔레노이드 플랫포옴16 ... blower-mounted board 17 ... solenoid platform

18 ... 솔레노이드 19 ... 솔레노이드 전기자18 ... solenoid 19 ... solenoid armature

20 ... 로드 21 ... 상부단부20 ... Rod 21 ... Upper end

22 ... 스프링 23 ... 지지 포스트22 ... spring 23 ... support post

24 ... 전송 케이블 25 ... 입력키24 ... transmission cable 25 ... input key

26 ... 디스플레이 27 ... 샘플구획26 ... Display 27 ... Sample Section

28 ... 송풍기 29 ... 가열구획28 ... blower 29 ... heating compartment

30 ... 반응구획 31 ... 가열코일30 ... Reaction compartment 31 ... Heating coil

32 ... 배플 33 ... 배플32 ... baffles 33 ... baffles

34 ... 유체 복귀 구획 35 ... 열전쌍 센서34 ... fluid return compartment 35 ... thermocouple sensor

36 ... 입구 37 ... 출구36 ... entrance 37 ... exit

39 ... 가열구획 100 ... 장치39 ... Heating compartment 100 ... Unit

102 ... 하우징 104 ... 피트102 ... housing 104 ... feet

106 ... 브라켓 108 ... 모세관 튜브106 ... Bracket 108 ... Capillary Tube

110 ... 발포물 112 ... 램프110 ... foam 112 ... lamp

112A ... 램프 소켓 112B ... 지지부112 A ... lamp socket 112 B ... support

114 ... 하우징 입구 116 ... 팬114 ... housing opening 116 ... fan

118 ... 모터 122 ... 모터 샤프트118 ... motor 122 ... motor shaft

124 ... 패들 126 ... 챔버입구124 ... paddles 126 ... chamber inlet

128 ... 통기도어 129 ... 힌리128 ... Breathing Door 129 ... Hinri

130 ... 하우징 입구 132 ... 솔레노이드130 ... housing opening 132 ... solenoid

136 ... 경로 200 ... 열전쌍136 ... path 200 ... thermocouple

206 ... 집적회로 212 ... 회로206 ... integrated circuits 212 ... circuits

214 ...전위차계 218 ... 연산 증폭기214 ... potentiometer 218 ... op amp

222 ... 회로 224, 226 ... 디지탈 아날로그 전환기222 ... circuits 224, 226 ... digital analog converter

230 ... 전위차계 236, 238, 244 ... 저상230 ... potentiometers 236, 238, 244 ... low phase

240 ... 합산회로 242, 246 ... 연산증폭기240 ... summing circuit 242, 246 ... operational amplifier

248 ... 트랜지스터 250 ... 공급원248 ... Transistor 250 ... Source

252, 256 ... 저장 254 ... 회로252, 256 ... storage 254 ... circuit

260 ... AC 전류원 262 ... 램프260 ... AC current source 262 ... Lamp

300 ... 온도싸이클너 302 ... 고온 공기원300 ... temperature cycler 302 ... hot air source

304 ... 저온공기원 306, 308 ... 나일론 튜브304 ... low temperature air source 306, 308 ... nylon tube

310 ... 샘플챔버 312 ... 통기구310 ... Sample chamber 312 ... Vent

314 ... 배출팬 316 ... 열전쌍314 ... drain pan 316 ... thermocouple

318 ... 샘플챔버팬 320 ... 모세관 튜브318 ... sample chamber pan 320 ... capillary tube

322... 카루셀 324 ... 스테핑 모터322 ... Carousel 324 ... Stepping Motor

326 ... 구동 모듈 328 ... 형광 활성화 소스326 ... drive module 328 ... fluorescence activated source

332 ... 유리 334 ... 혼채332 ... Glass 334 ... Mixed

336, 340 ... 평철 렌즈 338 ... 간섭 필터336, 340 ... flat iron lens 338 ... interference filter

342, 344 ... 실리카 윈도우 348 ... 필터342, 344 ... Silica Windows 348 ... Filters

350 ... 셔터 352 ... 셔터제어부350 ... shutter 352 ... shutter control unit

354 ... 비구면렌즈 356, 358 ... 필터354 ... Aspherical lenses 356, 358 ... Filters

360A, 360B 평철렌즈 362A, 362 B ...광 배증관360A, 360B Flat Iron Lens 362A, 362 B ...

364 ... 제어모듈 366A, 366B ... PMT 셔터364 ... control module 366A, 366B ... PMT shutter

본 발명의 목적은 생물학적 샘플의 온도를 정확히 조절하는 장치를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an apparatus for precisely controlling the temperature of a biological sample.

예정된 시간 대 온도 프로파일에 따라서 생물학적 샘플의 온도를 빠르고 정확하게 변화시키는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a thermocycling device that changes the temperature of a biological sample quickly and accurately in accordance with a predetermined time versus temperature profile.

다양한 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 적합한 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a device suitable for rapid thermal cycling of various biological samples.

매우 짧은 기간에 걸쳐 샘플이 큰 온도 그래디언트를 받게 할 수 있는 낮은 열량의 열전달 매체를 가지는 열순환 장치를 제공하는 것도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a thermocycling device having a low calorific heat transfer medium capable of subjecting a sample to a large temperature gradient over a very short period of time.

열전달 매체로서 공기를 사용하여 생물학적 샘플이 신속한 열 순환을 받게 하는 장치 제공도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide an apparatus for allowing a biological sample to undergo rapid thermal circulation using air as the heat transfer medium.

내부 히터를 사용하여 유체 챔버에 위치된 샘플을 가열하고 열순환에서 적절한 시기에 샘플을 냉각시키기 위해서 주변 유체를 챔버에 이동시켜 샘플을 냉각하는 열순환 장치 제공도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a thermocycling device that uses an internal heater to heat a sample located in the fluid chamber and to transfer the surrounding fluid to the chamber to cool the sample in order to cool the sample at a suitable time in the thermocycle.

PCR을 빠르게 수행하며 반응을 동시에 모니터링하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.It is another object of the present invention to provide a system and method for rapidly performing a PCR and simultaneously monitoring a reaction.

PCR을 빠르게 수행하며 반응을 연속으로 모니터링하고 반응이 진행되는 동안 반응 매개변수를 조절하는 시스템 및 방법 제공도 본 발명의 목적이다.It is also an object of the present invention to provide a system and method for rapidly performing PCR, continuously monitoring the reaction, and adjusting the reaction parameters during the reaction.

본 발명은 수많은 절차 또는 공정을 수행하기 위해서 생물학적 샘플을 빠르게 열순환시키는데 특히 적합한 장치이다. 선호되는 예에서 장치는 생물학적 샘플 유지수단을 포함한다. 생물학적 샘플 유지수단 또는 샘플 챔버에는 열에너지 유지를 위한 절연수단과 샘플챔버 내부를 가열하는 수단이 제공된다. 특히 고출력 백열등이 샘플 챔버 내부를 가열하는 수단으로 기능을 한다. 열 절연체는 샘플 챔버 내부에 라이닝 되어서 샘플 챔버내에서 램프에 의해 발생되는 열을 유지하고 절연 수단으로서 작용한다.The present invention is a particularly suitable device for rapid thermal cycling of biological samples to perform a number of procedures or processes. In a preferred example, the device comprises biological sample holding means. The biological sample holding means or sample chamber is provided with insulating means for maintaining thermal energy and a means for heating the inside of the sample chamber. In particular, high power incandescent lamps function as a means of heating the inside of the sample chamber. The thermal insulator is lined inside the sample chamber to maintain the heat generated by the lamp in the sample chamber and to act as an insulating means.

샘플 챔버를 신속히 냉각하기 위해서, 장치는 공기를 샘플챔버에 강제 주입하는 수단과 샘플챔버에 주입된 공기를 분산시키는 수단을 포함한다. 고속팬이 공기를 샘플챔버에 주입하며 회전 패들이 공기를 챔버에 분산시키는 작용을 한다. 통기 수단은 샘플 챔버로 부터 공기를 빼내서 불필요한 열을 제거하는 수단이다. 본 발명은 샘플의 가열 및 냉각이 신속하고 균일하게 이루어질 수 있도록 한다.To rapidly cool the sample chamber, the apparatus includes means for forcing air into the sample chamber and means for dispersing the air injected into the sample chamber. The high speed fan injects air into the sample chamber and the rotary paddle serves to distribute the air into the chamber. The venting means is a means for removing unnecessary heat by bleeding air from the sample chamber. The present invention allows the heating and cooling of the sample to be done quickly and uniformly.

본 발명의 장치는 필요한 온도대 시간 프로파일을 통해서 장치를 작동시키는 제어수단을 포함한다. 본 발명은 자동화된 폴리메라제 연쇄반응을 수행하는데 특히 적합하다.The apparatus of the present invention includes control means for operating the apparatus through the required temperature versus time profile. The present invention is particularly suitable for carrying out the automated polymerase chain reaction.

본 발명의 또다른 구체예는 폐쇄 루우프 고온유체 구획과 반응 구획을 포함한다. 반응 구획은 고온 유체 구획내에 위치되며 폴리메라제 연쇄반응 혼합물을 포함할 수 있는 모세관 튜브에 샘플의 삽입을 허용하기 위해 통기 도어를 통해 접근될 수 있다. 가열 코일 역시 이 구획에 위치되며 반응 구획에 인접한 위치에서 이 구획에 위치된 열전쌍 센서를 통해서 프로그램가능한 공정 제어기에 의해 조절된다.Another embodiment of the invention includes a closed loop hot fluid compartment and a reaction compartment. The reaction compartment is located within the hot fluid compartment and can be accessed through a vent door to allow insertion of the sample into a capillary tube, which may comprise a polymerase chain reaction mixture. The heating coil is also located in this compartment and controlled by a programmable process controller via a thermocouple sensor located in this compartment at a location adjacent to the reaction compartment.

가열코일은 반응구획 상류에 위치되며 송풍기 유닛에 의해 가열 코일을 가로질러 송풍된 유체가 반응 구획을 통해 폐쇄된 루우프 방식으로 송풍기 유체의 유입부에 통과하도록 팬이 가열 코일 상류에 위치된다. 가열된 유체가 반응 구획을 통과하기 이전에 가열된 유체의 균질 혼합을 위해서 가열코일과 반응구획사이에 배플이 위치될 수 있다.The heating coil is located upstream of the reaction compartment and the fan is positioned upstream of the heating coil such that the fluid blown across the heating coil by the blower unit passes through the inlet of the blower fluid in a closed loop manner through the reaction compartment. A baffle may be placed between the heating coil and the reaction compartment for homogeneous mixing of the heated fluid before the heated fluid passes through the reaction compartment.

혹은, 팬은 가열 코일 하류, 반응 구획 앞에 위치될 수 있다. 이 경우에 팬의 날개는 가열된 유체를 혼합하는 배플로 작용한다. 예정된 열순환에서 올바른 시간에 제어기는 유체를 구획으로 부터 통기시키는 통기 도어를 개방시키는 솔레노이드를 활성화 시켜서 차가운 유체가 유입되어 샘플을 냉각시킨다.Alternatively, the fan may be located downstream of the heating coil, before the reaction compartment. In this case the blades of the fan act as baffles to mix the heated fluid. At the correct time in the scheduled heat cycle, the controller activates the solenoid, which opens the vent door to vent the fluid from the compartment, to allow cold fluid to enter and cool the sample.

본 발명의 제어기는 챔버와 샘플구획내에 위치된 샘플이 폴리메라제 연쇄반응에서 변성, 어닐링 및 신장단계에 해당하는 예정된 온도 싸이클을 받게 한다. 사용시, 본 발명의 장치는 시간 및 온도 측면에서 변성, 어닐링 및 신장단계의 신속한 최적화와 각 단계에서 온도간의 짧아진 기간(램프타임)을 허용한다.The controller of the present invention allows a sample located in the chamber and the sample compartment to undergo a predetermined temperature cycle corresponding to the denaturing, annealing and stretching steps in the polymerase chain reaction. In use, the apparatus of the present invention allows for rapid optimization of the denaturing, annealing and stretching steps in terms of time and temperature and a shorter period of time (lamp time) between temperatures in each step.

본 발명은 특이성 및 수율을 크게 증가시키면서 공지 기술의 열 순환 장치에 비해서 폴리메라제 연쇄반응의 완결에 필요한 총시간을 단축시킨다.The present invention shortens the total time required to complete the polymerase chain reaction as compared to the thermal cycling apparatus of the known art while greatly increasing the specificity and yield.

본 발명의 또다른 측면에 따르면 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링 장치 및 방법을 제공한다. 선호되는 구체예에서 다양한 형광 기술에 의해서 DNA 증폭을 연속 모니터링 하기 위해서 신속한 온도 순환을 제공하는 구조와 광학적 성분이 조합된다. 유리 모세관 샘플 튜브와 복합 플라스틱/유리샘플 튜브가 공기로 부터 신속한 열전달(15분 미만에서 30싸이클)과 반응의 동시적 광학모니터링을 허용한다. 회전체상의 단일 샘플 또는 다중샘플로 부터 형광이 연속으로 수득되며 모든 샘플은 동시에 신속한 열순환을 받는다.According to another aspect of the present invention, there is provided an apparatus and method for continuous fluorescence monitoring of DNA amplification. In preferred embodiments, the structure and optical components are combined to provide rapid temperature cycling for continuous monitoring of DNA amplification by various fluorescence techniques. Glass capillary sample tubes and composite plastic / glass sample tubes allow for rapid heat transfer from air (30 cycles in less than 15 minutes) and simultaneous optical monitoring of the reaction. Fluorescence is obtained continuously from a single sample or multiple samples on the rotor and all samples are subjected to rapid thermal cycling at the same time.

본 발명의 또다른 측면에 따르면 DNA 증폭동안 형광이 다음에 의해서 모니터링된다: 1) 이중쇄-특이성 염료 SYBR Green I, 2) 이중-라벨링된 하이브리다이제이션 프로브의 엑소누클레아제 절단후 로오다민에 의한 형광제 퀀칭의 감소, 3) 인접한 하이브리다이제이션 프로브에 의해 Cy5로의 형광제의 공명에너지 전달. 싸이클마다 수득된 형광 데이타는 형광 특이성 및 증폭 효율이 알려진다면 초기 템플레이트 복사 횟수의 정량화를 가능하게 한다.According to another aspect of the invention the fluorescence during DNA amplification is monitored by: 1) double-chain-specific dye SYBR Green I, 2) exogenous cleavage of rhodanamine after exonuclease cleavage of the double-labeled hybridization probe Reduction in quenching of fluorescein, 3) resonance energy transfer of fluorescein to Cy5 by adjacent hybridization probes. The fluorescence data obtained per cycle allows for the quantification of initial template copy times if fluorescence specificity and amplification efficiency are known.

게다가, 싸이클마다 형광을 측정하는 것에 비해서 본 발명의 구체예에서 각 싸이클마다 온도, 시간 및 형광을 연속으로 모니터링 하여서 3차원 나선을 생성한다. 3차원 나선은 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광 플롯이 될 수 있다. 하이브리다이제이션 프로브의 온도대 형광 플롯은 엑소누클레아제 절단의 축적되는 비가역 신호와 인접한 프로브의 온도 종속 가역 하이브리다이제이션을 구별한다. 2중쇄 염료를 사용하여 생성물 변성, 재어닐링 및 확장이 각 싸이클내에서 뒤따를 수 있다.In addition, three-dimensional spirals are generated by continuously monitoring temperature, time, and fluorescence for each cycle in an embodiment of the invention as compared to measuring fluorescence per cycle. The three-dimensional helix can be time zone temperature, time zone fluorescence, and temperature zone fluorescence plots. The temperature band fluorescence plot of the hybridization probe distinguishes the accumulated irreversible signal of exonuclease cleavage from the temperature dependent reversible hybridization of the adjacent probe. Product denaturation, reannealing and expansion can be followed within each cycle using a double chain dye.

본 발명은 PCR의 형광 모니터링이 DNA 정량화에 강력한 도구임을 제공한다. dsDNA를 사용한 순환적 모니터링은 고유한 프로브를 필요치 않아서 큰 동적 범위에서 정량화가 가능하다. 서열 특이성 형광 프로브는 향상된 특이성을 제공하므로 매우 적은 수의 템플레이트 복사를 정량하는데 사용될 수 있다. PCR에서 유용한 적어도 두가지 부류의 서열 특이성 형광 올리고누클레오타이드 프로브가 있다. 신호 발생 메카니즘은 이들을 가수분해 프로브 또는 교합 프로브로 분리한다. 각 싸이클에서 형광을 모니터링 함으로써 어느 프로브 시스템이나 정량에 사용될 수 있다. 형광의 연속 모니터링은 온도 싸이클링 동안 용융 곡선과 생성물 어닐링 곡선을 얻을 수 있게 한다.The present invention provides that fluorescence monitoring of PCR is a powerful tool for DNA quantification. Cyclic monitoring with dsDNA does not require a unique probe, allowing quantification over a large dynamic range. Sequence specificity fluorescent probes provide improved specificity and can therefore be used to quantify very few template copies. There are at least two classes of sequence specific fluorescent oligonucleotide probes useful in PCR. Signal generation mechanisms separate them into hydrolysis or occlusion probes. By monitoring the fluorescence in each cycle, any probe system can be used for quantification. Continuous monitoring of fluorescence makes it possible to obtain melt curves and product annealing curves during temperature cycling.

본 발명의 또다른 측면에 따르면 형광 모니터링 광학 성분이 신속한 열 순환기와 조합되어서 2중쇄 특이성 염료의 형광 모니터링에 의해 PCR동안 DNA 용융 곡선 습득에 사용된다. 생성물의 해리온도를 통해 열순환기가 가열될 때 온도의 함수로서 형광을 플로팅하면 DNA 용융 곡선이 획득된다. DNA 용융곡선의 모양과 위치는 GC/AT 비율, 길이 및 서열의 함수이며 용융온도에서 2℃ 미만으로 분리된 증폭 생성물을 구별하는데 사용될 수 있다. 필요한 생성물은 프라이머 다이머를 포함한 원치않은 생성물과 구별될 수 있다. 용융곡선의 분석은 정량적인 PCR의 동적범위를 연장시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 15분 미만, 특히 10분 미만에서 증폭 및 정량 분석으로 신속한 싸이클 PCR 방법 및 장치를 제공한다.According to another aspect of the present invention, a fluorescence monitoring optical component is used for acquiring DNA melting curves during PCR by fluorescence monitoring of double chain specific dyes in combination with rapid thermal cyclers. The DNA melting curve is obtained by plotting fluorescence as a function of temperature when the thermocycler is heated through the dissociation temperature of the product. The shape and location of the DNA melt curve is a function of the GC / AT ratio, length and sequence and can be used to distinguish amplification products separated below 2 ° C. at the melting temperature. The required product can be distinguished from unwanted products including primer dimers. Analysis of the melt curve can be used to extend the dynamic range of quantitative PCR. The present invention provides rapid cycle PCR methods and apparatus with amplification and quantitation in less than 15 minutes, in particular less than 10 minutes.

본 발명은 목표 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭의 실시간 모니터링 방법, DNA 서열 다형성, 이형 접합성 또는 돌연변이를 위해 생물학적 샘플의 목표 DNA 서열을 분석하는 방법을 제공한다. 이 방법은 목표 서열의 인접 지역까지 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 존재하에서 폴리메라제 연쇄반응에 의해 목표 서열을 증폭하고, 도너 형광단에 의해 흡수되는 파장의 빛으로 샘플을 활성화시키고, 샘플에서 나오는 형광방출을 탐지하는 단계를 포함한다. 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 프로브는 두 개의 프로브를 목표 서열의 교합시 도너와 받게 형광이 0 내지 25개의 누클레오타이드내에 있도록 형광 에너지 전달쌍이 도너 형광단으로 라벨링된다. 폴리메라제 연쇄 반응은 생물학적 샘플에 목표 핵산 서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 첨가하고 변성온도와 신장온도사이에서 생물학적 샘플을 열순환시키는 단계를 포함한다. 또다른 구체예에서 샘플에서 나오는 형광이 샘플온도의 함수로서 모니터링된다. 또다른 구체예에서, 도너 형광단은 형광제이다. 형광제와 함께 사용하기에 적합한 받게 형광단은 Cy5이다.The present invention provides a method for real-time monitoring of polymerase chain reaction amplification of a target DNA sequence, a method for analyzing a target DNA sequence of a biological sample for DNA sequence polymorphism, heterozygous or mutation. This method amplifies the target sequence by polymerase chain reaction in the presence of two nucleic acid probes that occupy adjacent regions of the target sequence, activates the sample with light of wavelengths absorbed by the donor fluorophore, and exits the sample. Detecting fluorescence emission. One of the probes is labeled with a recipient fluorophore and the other probe is labeled with a donor fluorophore such that the donor and the receiving fluorescence are within 0-25 nucleotides of the donor upon occlusion of the target sequence. The polymerase chain reaction involves adding primers and thermostable polymerases for target nucleic acid sequences to the biological sample and thermocycling the biological sample between denaturation and extension temperatures. In another embodiment the fluorescence from the sample is monitored as a function of sample temperature. In another embodiment, the donor fluorophore is a fluorescent agent. A recipient fluorophore suitable for use with a fluorescent agent is Cy5.

본 발명의 또다른 구체예로서 생물학적 샘플의 목표 핵산 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭의 실시간 모니터링 방법이 제공된다. 이 방법은 DNA 서열 다형성, 이형 접합성 및 돌연변이를 위해 생물학적 샘플의 목표 DNA 서열을 분석하는데 유용하다. 이 방법은 다음 단계를 포함한다:In another embodiment of the present invention, a method for real-time monitoring of polymerase chain reaction amplification of a target nucleic acid sequence of a biological sample is provided. This method is useful for analyzing target DNA sequences of biological samples for DNA sequence polymorphism, heterozygosity, and mutation. This method involves the following steps:

(a) 생물학적 샘플에 유효량의 2 핵산 프라이머와 핵산 프로브를 첨가하고, 상기 프라이머와 핵산중 하나는 받게 형광단과 도너 형광단을 포함하는 형광에너지 전달쌍으로 라벨링되고, 라벨링된 프로브는 라벨링된 프라이머 0 내지 25 누클레오타이드내에서 목표 핵산 서열의 증폭된 복제까지 교합되고; (a) adding an effective amount of two nucleic acid primers and a nucleic acid probe to a biological sample, one of the primers and the nucleic acid being labeled with a fluorescent energy transfer pair comprising a fluorophore and a donor fluorophore, wherein the labeled probe is labeled primer 0 Occupy from 25 to 25 nucleotides up to amplified replication of the target nucleic acid sequence;

(b) 폴리메라제 연쇄반응에 의해 목표 핵산서열을 증폭하고, 상기 폴리메라제 연쇄반응은 목표 핵산 서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 첨가하고 변성온도와 신장 온도 사이에서 생물학적 샘플을 열순환시키는 단계를 포함하고;(b) amplifying the target nucleic acid sequence by polymerase chain reaction, wherein the polymerase chain reaction adds a primer and a thermostable polymerase for the target nucleic acid sequence and opens the biological sample between denaturation temperature and extension temperature. Circulating;

(c) 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 생물학적 샘플에 조사하고 샘플의 형광 방출을 탐지하는 단계.(c) irradiating the biological sample with light of a selected wavelength absorbed by the donor fluorophore and detecting the fluorescence emission of the sample.

이 방법은 샘플의 온도 종속 형광 모니터링 단계를 더욱 포함할 수 있다.The method may further comprise the step of monitoring the temperature dependent fluorescence of the sample.

생물학적 샘플의 온도 종속 형광에 관련된 데이타는 열순환 조건 조절의 기초로 사용되어서 반응의 특이성 또는 수율을 최적화 할 수 있다. 따라서 생물학적 샘플의 목표 핵산 서열 증폭을 위한 개선된 방법은 다음 단계를 포함한다:Data relating to temperature dependent fluorescence of biological samples can be used as a basis for thermocycling condition control to optimize the specificity or yield of the reaction. Thus, an improved method for amplifying a target nucleic acid sequence of a biological sample includes the following steps:

(a) 생물학적 샘플에 목표 서열의 인접지역까지 교합하는 2개의 핵산 프로브의 유효량을 첨가하고, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 하나는 두 개의 프로브와 목표 서열의 교합시 도너 및 받게 형광단이 0 내지 25 누클레오타이드내에 있도록 형광 공명에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링되고; (a) Add an effective amount of two nucleic acid probes to the biological sample up to the contiguous region of the target sequence, one of which is labeled with a recipient fluorophore and the other a donor and recipient for the engagement of the two probes with the target sequence Labeled with donor fluorophore of fluorescence resonance energy transfer pair such that the fluorophore is within 0 to 25 nucleotides;

(b) 예정된 시간 및 온도를 사용하여 생물학적 샘플이 열 싸이클링을 받게 하는 단계를 포함하는 폴리메라제 연쇄반응을 사용하여 목표 핵산 서열을 증폭하고;(b) amplifying the target nucleic acid sequence using a polymerase chain reaction comprising subjecting the biological sample to thermal cycling using a predetermined time and temperature;

(c) 폴리메라제 연쇄반응동안 상기 받게 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 생물학적 샘플에 조사하고;(c) irradiating the biological sample with light of a selected wavelength absorbed by the recipient fluorophore during the polymerase chain reaction;

(d) 상기 샘플에서 나오는 형광 방출을 모니터링하고;(d) monitoring fluorescence emission from the sample;

(e) 단계(d)에서 발생된 데이타에 따라서 온도 및 시간을 조절하여 수율 또는 특이성을 최적화하는 단계.(e) adjusting temperature and time according to the data generated in step (d) to optimize yield or specificity.

폴리메라제 연쇄반응의 상태를 표시하는 형광신호의 소스로서 형광 공명 에너지 전달쌍을 사용하는 본 발명의 방법에서 공명 에너지 전달쌍이 도너로서 형광제와 받게로서 Cy5를 포함하는 경우에 양호한 결과가 수득된다. 이 방법은 최대 온도에서 최소의 유지시간으로 고온 램프 속도에서 광학적으로 투명한 모세관 튜브에서 생물학적 샘플이 열 싸이클링을 받게 하도록 설계된 장치에서 이득이 되게 수행되며 샘플 형광이 모세관 튜브의 단부를 통해 탐지됨을 특징으로 한다.Good results are obtained when the resonance energy transfer pair comprises the fluorescent agent and donor Cy5 as donor in the method of the present invention using a fluorescence resonance energy transfer pair as a source of fluorescence signal indicating the state of the polymerase chain reaction. . This method is performed in a device designed to allow a biological sample to undergo thermal cycling in an optically transparent capillary tube at a high temperature ramp rate with minimal hold time at maximum temperature, and sample fluorescence is detected through the end of the capillary tube. do.

본 발명은 샘플의 형광을 모니터링하는 장치를 제공한다. 이 장치는 다음을 포함한다.The present invention provides an apparatus for monitoring the fluorescence of a sample. This device includes:

챔버;chamber;

높은 부피대 표면적을 가지며 광학적으로 투명한 재료를 포함하는 모세관 튜브;Capillary tubes having a high volumetric surface area and comprising an optically transparent material;

모세관 튜브 유지기;Capillary tube retainers;

상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브 단부를 통해 모세관 튜브를 조사하는 광원;A light source mounted to the chamber and irradiating the capillary tube through the capillary tube end;

상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 모세관 튜브로 부터 나오는 형광을 측정하는 광 탐지기.And a photo detector mounted to the chamber for measuring fluorescence coming from the capillary tube through the end of the capillary tube.

장치의 구체예에서 모세관 튜브 유지기는 복수의 모세관 튜브를 유지하는 목마 형태이다. 목마는 상기 챔버에 회전가능하게 장착되며 본 장치는 목마를 회전시키는 스테핑 모터; 상기 목마를 상기 모터에 결합시키는 수단을 더욱 포함한다. 또다른 구체예에서 장치에 히터와 팬이 제공되며 팬은 챔버와 공기를 교환할 수 있다. 히터와 팬은 프로그램가능한 제어기에 의해 조절되어서 챔버의 온도를 신속히 순환시킨다.In an embodiment of the device the capillary tube retainer is in the form of a horse that holds a plurality of capillary tubes. A horse is rotatably mounted in the chamber and the device comprises a stepping motor for rotating the horse; And means for coupling the horse to the motor. In another embodiment, the apparatus is provided with a heater and a fan, which fan can exchange air with the chamber. The heater and fan are controlled by a programmable controller to quickly cycle the temperature of the chamber.

또한, 본 발명은 다음을 포함하는 PCR 반응 수행 장치에도 관계한다:The invention also relates to an apparatus for performing PCR reactions comprising:

챔버;chamber;

상기 장치에 장착되며 챔버와 공기를 교환하는 히터와 팬;A heater and a fan mounted to the apparatus and exchanging air with the chamber;

복수의 모세관 튜브를 유지하며 상기 챔버에 회전가능하게 장착되는 목마, 상기 모세관 튜브는 광학적으로 투명한 재료를 포함한다;A horse holding a plurality of capillary tubes rotatably mounted in said chamber, said capillary tubes comprising an optically transparent material;

상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 적어도 하나의 모세관 튜브를 조사하는 광원;A light source mounted to the chamber for irradiating at least one capillary tube through an end of the capillary tube;

상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 적어도 하나의 모세관 튜브에서 나오는 형광을 측정하는 광 탐지기.And a photo detector mounted to the chamber for measuring fluorescence exiting at least one capillary tube through an end of the capillary tube.

또한, 형광단을 포함하는 샘플에서 형광의 습득효율과 탐지효율을 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 형광 방출의 습득 및 모니터링을 최적화시키기 위해서 완전 내부 반사를 사용한다. 이 방법은 광학적으로 투명한 재료로된 모세관 튜브에 샘플을 넣고 모세관 단부를 통해 샘플에서 나오는 형광을 탐지하는 단계를 포함한다. 모세관 튜브의 부피에 대한 표면적의 비는 4㎜-1 이상이다. 형광이 샘플의 형광단 ― 조사에 의해 유도되는 경우에 이 방법은 특히 탐지된 형광의 광학경로를 따라 모세관의 단부를 통해 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함한다.In addition, a method of increasing the acquisition efficiency and detection efficiency of fluorescence in a sample comprising a fluorophore is provided. This method uses full internal reflection to optimize the acquisition and monitoring of fluorescence emission. The method includes placing a sample in a capillary tube of optically transparent material and detecting fluorescence exiting the sample through the capillary end. The ratio of surface area to volume of the capillary tube is at least 4 mm −1 . In the case where fluorescence is induced by fluorophore—irradiation of the sample, the method further comprises irradiating the sample through the end of the capillary, especially along the optical path of the detected fluorescence.

선호되는 구체예에서, 생물학적 샘플의 형광은 온도 종속적이며 이 방법은 샘플의 온도종속 형광을 모니터링하기 위해서 형광탐지동안 생물학적 샘플을 가열 또는 냉각하는 단계를 더욱 포함한다. 샘플은 형광 에너지 전달쌍을 포함할 수 있고 형광 에너지 전달쌍중 적어도 하나의 형광단의 형광이 탐지된다. 한 구체예에서, 샘플은 핵산 프로브를 포함하는 핵산이다. 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링되고 다른 프로브는 형광 에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링된다. 탐지된 형광은 도너 형광단 또는 받게 형광단에서 나오는 형광이다.In a preferred embodiment, the fluorescence of the biological sample is temperature dependent and the method further comprises heating or cooling the biological sample during fluorescence detection to monitor the temperature dependent fluorescence of the sample. The sample may comprise a fluorescence energy transfer pair and fluorescence of at least one fluorophore of the fluorescence energy transfer pairs is detected. In one embodiment, the sample is a nucleic acid comprising a nucleic acid probe. One of the probes is labeled with the recipient fluorophore and the other probe is labeled with the donor fluorophore of the fluorescent energy transfer pair. The fluorescence detected is the fluorescence coming from the donor fluorophore or the receiving fluorophore.

본 발명의 또다른 측면은 샘플 취급 시스템이다. 이 시스템은 샘플 운반 포트를 가지는 모세관 튜브와 상기 모세관 튜브를 충진하는 퍼넬 캡을 포함한다. 모세관 튜브는 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 부피에 대한 표면적의 비는 4㎜-1 이상이다. 퍼넬 캡은 샘플 수신 구멍, 샘플 전달 구멍, 퍼넬캡의 샘플 전달구멍과 모세관 튜브의 샘플전달구멍이 일직선이 되도록 모세관 튜브의 샘플 전달 구멍과 착탈식으로 맞물리는 수단을 포함한다. 또한 샘플 취급 시스템은 퍼넬캡의 샘플 수신 포트와 마찰식으로 맞물리는 플러그를 포함한다.Another aspect of the invention is a sample handling system. The system includes a capillary tube having a sample delivery port and a funnel cap filling the capillary tube. The capillary tube consists of an optically transparent material and the ratio of surface area to volume is at least 4 mm −1 . The funnel cap includes means for detachably engaging the sample delivery hole of the capillary tube such that the sample receiving hole, the sample delivery hole, the sample delivery hole of the funnel cap and the sample delivery hole of the capillary tube are aligned. The sample handling system also includes a plug that frictionally engages the sample receiving port of the funnel cap.

본 발명의 또다른 구체예는 다음을 포함하며 실시간으로 PCR을 모니터링하는 시스템이다:Another embodiment of the invention is a system for monitoring PCR in real time, including:

챔버;chamber;

챔버와 공기가 교환되게 상기 장치에 장착되는 히터 및 팬과 예정된 초기 온도 및 시간에 따라서 챔버내 온도를 순환시키는 제어기;A controller for circulating the temperature in the chamber according to a predetermined initial temperature and time and a heater and a fan mounted to the apparatus to exchange air with the chamber;

복수의 모세관 샘플 튜브를 유지하며 상기 챔버에 회전가능하게 장착되는 목마, 상기 모세관 튜브는 광학적으로 투명한 재료로 구성되며 신속한 열전달을 위해 높은 부피대 표면적비를 가지며;A horse holding a plurality of capillary sample tubes rotatably mounted in said chamber, said capillary tubes being composed of an optically transparent material and having a high volume to surface area ratio for rapid heat transfer;

상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 적어도 하나의 모세관 튜브를 조사하는 광원;A light source mounted to the chamber for irradiating at least one capillary tube through an end of the capillary tube;

상기 챔버에 장착되며 모세관 튜브의 단부를 통해 모세관 튜브로 부터 나오는 형광을 측정하는 광 탐지기;A photo detector mounted to the chamber and measuring fluorescence coming from the capillary tube through an end of the capillary tube;

탐지된 형광에 기초하여 반응의 상태를 표시하는 수단.Means for indicating the status of the reaction based on the detected fluorescence.

선호되는 구체예에서 시스템은 하나 이상의 반응 매개변수가 실시간으로 조절되도록 제어기를 조절하는 수단을 더욱 포함한다. 모세관 샘플 튜브는 0.02 내지 1.0㎜의 내경을 가질 수 있다. 또다른 구체예에서 장치는 모세관 샘플 튜브의 단부를 통해 조명 및 형광 탐지를 위해 상기 목마에 의해 고정된 모세관 튜브를 위치시키도록 목마를 회전시키는 스테핑 모터를 더욱 포함한다.In a preferred embodiment the system further comprises means for adjusting the controller such that one or more reaction parameters are adjusted in real time. The capillary sample tube may have an inner diameter of 0.02 to 1.0 mm. In another embodiment the device further comprises a stepping motor for rotating the horse to position the capillary tube fixed by the horse for illumination and fluorescence detection through the end of the capillary sample tube.

도 1 에서 열적 싸이클링 장치(10)는 통기도어(14)를 통해 순환되며 샘플을 수용하는 폐쇄루우프 유체(특히 공기)챔버(11)를 포함한다. 폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 복수의 구획을 포함한다. 장치(10)는 입력키(25) 및 디스플레이(26)를 수단으로 프로그램될 수 있는 제어기(12)를 포함하여서 예정된 기간에 걸쳐서 일련의 온도를 통해 챔버(11)가 싸이클링 받을 수 있다. 챔버(11)의 열적 싸이클링은 여러 절차를 수행하는데 사용되며 특히 샘플 함유 반응 혼합물로 부터 프라이머 특이성 DNA의 증폭에 적합하다.The thermal cycling device 10 in FIG. 1 comprises a closed loop fluid (particularly air) chamber 11 which is circulated through the ventilator 14 and contains a sample. The closed loop fluid chamber 11 includes a plurality of compartments. The device 10 can include a controller 12 that can be programmed by means of an input key 25 and a display 26 so that the chamber 11 can be cycled through a series of temperatures over a predetermined period of time. Thermal cycling of chamber 11 is used to perform several procedures and is particularly suitable for amplification of primer specific DNA from sample containing reaction mixtures.

폐쇄 루우프 유체 챔버(11)는 박스형태로 하우징(13)에 의해 에워싸인다. 필요하다면 송풍기 장착 보오드(16)가 챔버(11)의 직사각형 섹션을 구획하고 거기에 실린더형 하부 하우징(15)을 지탱 및 고정하도록 위치될 수 있다. 혹은, 송풍기(28)의 팬이 챔버 하우징(13)내에 일체로 수용될 수 있다.The closed loop fluid chamber 11 is surrounded by the housing 13 in the form of a box. If necessary, a blower mounted board 16 may be positioned to partition the rectangular section of the chamber 11 and to support and secure the cylindrical lower housing 15 therein. Alternatively, the fan of the blower 28 may be integrally housed in the chamber housing 13.

송풍기 하우징(15)의 내부는 날개와 샤프트를 포함한다. 송풍기 모터(도시안된)는 송풍기 하우징(15) 외부, 챔버(11) 외부에 위치된다. 이러한 구성에서 날개와 샤프트는 챔버(11)내에서 순환하는 고온 유체에 노출되는 송풍기의 부분이다. 모터에 온도변화를 주며 가열 및 냉각을 겪는 챔버에 모터의 열량을 첨가시키는 챔버내 모터 장착은 단점이 된다. 챔버(11)에서 유체에 노출된 열량의 감소는 예정된 시간대 온도 프로파일을 샘플이 받게하는 기능에 있어서 장치(10)의 전체 성능에 중요하다.The interior of the blower housing 15 includes a wing and a shaft. The blower motor (not shown) is located outside the blower housing 15 and outside the chamber 11. In this configuration the vanes and shafts are part of the blower that is exposed to the hot fluid circulating in the chamber 11. Mounting a motor in a chamber that changes the temperature of the motor and adds the heat of the motor to the chamber undergoing heating and cooling is a disadvantage. The reduction in the amount of heat exposed to the fluid in the chamber 11 is important for the overall performance of the device 10 in its ability to receive a predetermined time zone temperature profile.

송풍기(28)는 낮은 열량의 프로펠러형 팬 또는 다람쥐장 형태의 팬을 사용하는 "인 라인"형 송풍기이며 팬은 분당 75세제곱피트의 최소 용량을 가진다.Blower 28 is an "in-line" blower that uses a low calorie propeller fan or squirrel field fan and the fan has a minimum capacity of 75 cubic feet per minute.

솔레노이드 플랫포옴(17)은 솔레노이드(18)를 고정시킨다. 솔레노이드 전기자(19)는 통기 도어(14)에 부착되며 통기 도어(14) 상하 지점에서 하우징(13)에 회전가능하게 부착되는 로드(20)의 상부단부에 부착된다. 그러므로 로드(20)는 통기 도어(14)를 로드의 종축 주위로 하우징(13)에 대해서 자유 회전시킬 수 있다.Solenoid platform 17 secures solenoid 18. The solenoid armature 19 is attached to the vent door 14 and attached to the upper end of the rod 20 which is rotatably attached to the housing 13 at the upper and lower points of the vent door 14. The rod 20 can therefore freely rotate the vent door 14 about the housing 13 about the longitudinal axis of the rod.

스프링(22)은 지지 포스트(23)에 의해서 한 단부에서 하우징(13)에 부착된다. 스프링(22)의 반대단부는 솔레노이드 전기자(19) 부착부에 인접한 로드(20)의 상부단부(21)에 부착된다. 스프링(22)은 두 부착점 사이에서 인장된다. 그러므로 스프링(22)은 지지포스트(23)쪽으로 상부 단부(21)를 당겨서 통기 도어(14)를 폐쇄 위치로 회전시킨다. 솔레노이드(18)가 활성화될 때 전기자(19)는 로드(20)의 상부단부(21)를 스프링(22) 당김 방향과 반대인 솔레노이드(18) 방향으로 당겨서 통기 도어(14)를 개방시킨다.The spring 22 is attached to the housing 13 at one end by a support post 23. The opposite end of the spring 22 is attached to the upper end 21 of the rod 20 adjacent the solenoid armature 19 attachment. The spring 22 is tensioned between two attachment points. The spring 22 thus rotates the vent door 14 to the closed position by pulling the upper end 21 towards the support post 23. When the solenoid 18 is activated, the armature 19 opens the vent door 14 by pulling the upper end 21 of the rod 20 in the direction of the solenoid 18 opposite to the spring 22 pulling direction.

제어기(12)는 전송 케이블(24)에 의해 챔버(11)에 전기적으로 부착된다. 케이블(24)은 송풍기 모터(도시안된)와 가열코일(31)에 전력을 공급하기도 한다. 게다가, 제어기(12)는 온도 데이타에 해당하는 신호를 수신하는 열전쌍 센서(35)와 솔레노이드 전기자를 활성화시키는 솔레노이드(18)에 연결된다.The controller 12 is electrically attached to the chamber 11 by a transmission cable 24. The cable 24 also supplies power to the blower motor (not shown) and the heating coil 31. In addition, the controller 12 is connected to a thermocouple sensor 35 for receiving a signal corresponding to temperature data and a solenoid 18 for activating the solenoid armature.

제어기(12)는 챔버(11)내에서 시간의 함수로서 예정된 온도를 달성하도록 가열코일(31), 통기도어(14), 및 송풍기를 조절하도록 프로그램되며 예정된 기간과 챔버온도에서 솔레노이드를 구동하는 릴레이 출력을 활성화시키도록 프로그램될 수 있는 공지형태의 온도 제어기일 수 있다. 도 1-3 의 구체예에서 사용하는 온도 제어기(12)는 Omega Engineering Inc.(Stanford, Connecticut)로 부터 모델번호 CN8600 프로세스 컨트롤러로 구매가능한 Partlow MIC-6000 비율 온도 제어기이다.The controller 12 is programmed to regulate the heating coil 31, the ventilator 14, and the blower to achieve a predetermined temperature as a function of time in the chamber 11 and to relay the solenoid at the predetermined time and chamber temperature. It may be a known temperature controller that can be programmed to activate the output. The temperature controller 12 used in the embodiments of FIGS. 1-3 is a Partlow MIC-6000 ratio temperature controller available as model number CN8600 process controller from Omega Engineering Inc. (Stanford, Connecticut).

도 2 및 도 3 에서, 챔버(11)의 내부는 4개의 주요 구획으로 나뉘어진다. 송풍기 구획(28)은 송풍기 하우징(15) 및 송풍기 장착판(16)으로 구성된다. 송풍기 구획(28) 전체는 팬과 샤프트로 채워진다. 송풍기는 공지된 디자인을 가진다. 송풍기 구획(26)에 위치된 팬은 유체를 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)안으로 들여보내고 출구(37)를 통해 유체를 내보낸다.2 and 3, the interior of the chamber 11 is divided into four main compartments. The blower section 28 consists of a blower housing 15 and a blower mounting plate 16. The entire blower section 28 is filled with a fan and a shaft. The blower has a known design. A fan located in blower compartment 26 introduces fluid through inlet 36 into blower compartment 28 and delivers fluid through outlet 37.

유체는 송풍기에 의해 분당 75세제곱 피트 이상의 속도로 흐를 수 있다. 그러나, 본 발명에서 중요한 점은 챔버(11)에 위치된 유체가 송풍기의 팬과 구동 샤프트 부분만을 접촉하며 송풍기 모터 자체는 송풍기 하우징(15)밖에 위치되어서 챔버(11)의 유체와의 접촉이 방지된다는 것이다. 싸이클링 과정동안 가열 또는 냉각되어야 하는 재료의 열량을 최소화하기 위해서 챔버(11) 내부에서 유체와 접촉하는 재료를 최소화 하는 것이 본 발명의 작동속도에 중요하다. 유체에 의해서 가열 또는 냉각되어야 하는 열량을 최소화 함으로써 챔버(11) 내용물을 균일한 온도가 되게 하는데 필요한 응답시간이 크게 단축된다.The fluid can be flowed by the blower at a speed of at least 75 cubic feet per minute. However, it is important in the present invention that the fluid located in the chamber 11 contacts only the fan and drive shaft portion of the blower and the blower motor itself is located outside the blower housing 15 to prevent contact with the fluid in the chamber 11. It is. It is important to the operating speed of the present invention to minimize the material in contact with the fluid inside the chamber 11 to minimize the amount of heat of the material that must be heated or cooled during the cycling process. By minimizing the amount of heat that must be heated or cooled by the fluid, the response time required to bring the contents of the chamber 11 to a uniform temperature is greatly shortened.

출구(37)를 통해 송풍기 구획(28)을 빠져나가는 유체는 가열구획(29)에 들어온다. 가열구획(29)으로 들어온 유체는 가열 코일(31)을 통과한다. 가열 코일(31)이 가열구획(29)에 들어오는 유체보다 뜨거워진다면 유체는 이 구획을 통과할 때 가열된다. 가열코일은 마이크로서포트 주위에 감긴 1000와트(125VAC) 니크롬선 코일이다. 그러나 챔버에 존재하는 유체의 가열에 적합한 모든 가열 유닛이 사용될 수 있다. 도 1-3 의 가열코일은 Johnstone Supply (Portland, Oregon)에 의해 제조된다.Fluid exiting blower section 28 through outlet 37 enters heating compartment 29. The fluid entering the heating compartment 29 passes through the heating coil 31. If the heating coil 31 is hotter than the fluid entering the heating compartment 29, the fluid is heated as it passes through this compartment. The heating coil is a 1000 watt (125 VAC) nichrome wire coil wound around the micro support. However, any heating unit suitable for heating the fluid present in the chamber can be used. The heating coils of FIGS. 1-3 are manufactured by Johnstone Supply (Portland, Oregon).

가열코일은 제어기(12)에 포함된 출력 릴레이에 의해 활성화된다. 선호되는 릴레이는 Omega Engineering Inc. (Stanford, Connecticut)에 의해 모델번호 Omega SSR 240 D25로 제조되는 25A, 125VAC 고체상태 릴레이이다.The heating coil is activated by an output relay included in the controller 12. Preferred relays are Omega Engineering Inc. A 25A, 125VAC solid state relay manufactured by Model Number Omega SSR 240 D25 by Stanford, Connecticut.

가열구획(29)을 통과하는 유체는 반응구획(30)에 통과하기 전에 배플(32, 33)에 충돌한다. 배플(32, 33)은 층흐름 유체를 파괴하여 교란을 일으켜서 균질온도에서 반응구획(30)에 도달하도록 유체를 효과적으로 혼합한다.Fluid passing through the heating compartment 29 impinges on the baffles 32 and 33 before passing through the reaction compartment 30. The baffles 32 and 33 destroy the laminar fluid and cause disturbances to effectively mix the fluid to reach the reaction compartment 30 at a homogeneous temperature.

열전쌍 센서(35)는 반응구획(30)에서 유체온도에 대응하는 전기적 입력신호를 제어기(12)에 제공한다. 열 싸이클링 장치(10)의 작동동안 온도 모니터링은 30-게이지 철-콘스탄탄 "J-형" 열전쌍으로 이루어진다. 제어기는 이 정보를 사용하여 프로그램된 시간대 온도 프로파일에 따라 가열 코일(31)을 제어하고 솔레노이드(18)를 활성화시킨다.The thermocouple sensor 35 provides the controller 12 with an electrical input signal corresponding to the fluid temperature in the reaction compartment 30. Temperature monitoring during operation of the thermal cycling device 10 consists of a 30-gauge iron-constantan "J-type" thermocouple. The controller uses this information to control the heating coil 31 and to activate the solenoid 18 according to the programmed time zone temperature profile.

반응구획(30)으로 부터 복귀 공기 구획(34)으로 통과하는 유체는 샘플 구획(27)(점선으로 도시된)을 통과한다.Fluid passing from reaction compartment 30 to return air compartment 34 passes through sample compartment 27 (shown in dashed lines).

유체 복귀 구획(34)은 샘플구획(27)에 위치된 샘플로의 열전달 때문에 약간 냉각된다. 유체 복귀 구획(34)의 유체는 입구(36)를 통해 송풍기 구획(28)으로 흐르고 팬의 작용에 의해 출구(37)를 통해 가열구획(39)으로 흐른다. 따라서, 통기 도어(14)가 폐쇄될 때 유체챔버(11)는 각 구획을 통해 폐쇄된 루우프 경로를 따라 유체를 연속으로 재순환시켜서 내용물이 균일한 온도가 되게 하는 폐쇄된 루우프 유체 챔버이다. 공기 챔버(11)에서 공기의 연속 순환은 샘플구획(27)내 샘플이 가능한 빨리 예정된 온도가 되게 하며 이 온도로 유지될 수 있게 한다.The fluid return section 34 is slightly cooled due to heat transfer to the sample located in the sample compartment 27. Fluid in the fluid return section 34 flows through the inlet 36 to the blower section 28 and through the outlet 37 to the heating compartment 39 by the action of a fan. Thus, when the vent door 14 is closed, the fluid chamber 11 is a closed loop fluid chamber that continuously recycles the fluid along the closed loop path through each compartment to bring the contents to a uniform temperature. Continuous circulation of air in the air chamber 11 allows the sample in the sample compartment 27 to be brought to a predetermined temperature as quickly as possible and maintained at this temperature.

장치(10)가 반응구획(27)에 위치된 재료를 주변유체(공기)온도 이상의 온도로 가능한 빨리 가열해서 냉각시키는데 사용될 때 제어기(12)는 통기 도어(14)를 개방시켜 많은 양의 주변유체를 가열된 유체가 탈출하는 동안 구획(11)에서 범람시키도록 솔레노이드(18)를 작동시키도록 프로그램될 수 있다.When the device 10 is used to heat and cool the material located in the reaction compartment 27 to a temperature above the ambient fluid (air) temperature as quickly as possible, the controller 12 opens the vent door 14 to open a large amount of ambient fluid. The solenoid 18 can be programmed to flood the compartment 11 during the escape of the heated fluid.

통기도어(14)를 개방시켜 송풍기를 연속으로 활성화시키는 동안 가열 코일(31)을 활성제거하면 주변유체가 복귀 구획(34) 및 송풍기 구획(28)으로 흐른다. 송풍기는 주변유체를 가열구획(29)으로 흐르게 하고 코일(31)에 의해 가열됨이 없이 반응구획(30)으로 직접 통과시킨다. 주변유체는 이후에 샘플구획(27)을 통과하고 통기 도어(14)를 통해 챔버(11) 밖으로 탈출한다. 챔버(11)에 위치된 재료의 최소의 열량과 송풍기 팬의 작용으로 인하여 많은 양의 주변유체가 샘플구획(27)을 통과하고 챔버(11) 밖으로 나온다. 따라서, 반응 구획(27)에 위치된 샘플 또는 재료의 신속한 냉각이 이루어진다.Deactivation of the heating coil 31 during opening of the ventilator 14 to continuously activate the blower causes the surrounding fluid to flow into the return compartment 34 and the blower compartment 28. The blower causes the surrounding fluid to flow into the heating compartment 29 and passes directly to the reaction compartment 30 without being heated by the coil 31. The peripheral fluid then passes through the sample compartment 27 and escapes out of the chamber 11 through the vent door 14. Due to the minimum amount of heat of the material located in the chamber 11 and the action of the blower fan, a large amount of surrounding fluid passes through the sample compartment 27 and exits the chamber 11. Thus, rapid cooling of the sample or material located in the reaction compartment 27 is achieved.

샘플구획(27)은 샘플을 담은 길쭉한 중공 유리 튜브와 같은 복수의 샘플이 이격된 방향에 쉽게 위치되도록 하는 크기를 가져서 유체가 각 샘플 주위에 균일하게 통과할 수 있다. 필요하다면 샘플구획(27)은 균일한 간격으로 복수의 샘플을 수용하여서 샘플챔버(27)에 샘플충진을 단순화시키도록 구성된 랙 또는 바스켓의 삽입을 허용하는 크기와 모양을 가질 수 있다.The sample compartment 27 is sized such that a plurality of samples, such as elongated hollow glass tubes containing samples, are easily located in the spaced apart direction so that fluid can pass evenly around each sample. If desired, the sample compartment 27 may be sized and shaped to accommodate insertion of a plurality of samples at uniform intervals to allow the insertion of racks or baskets configured to simplify sample filling in the sample chamber 27.

샘플구획(27)으로의 접근은 통기도어(14)를 개방위치까지 회전시켜 이루어진다. 통기도어(14)가 폐쇄위치로 부터 90도만큼 회전된다면 샘플구획(27)에 쉽게 접근할 수 있다. 또한, 폐쇄위치로 부터 통기도어(14)의 90도 회전은 복귀유체 구획(34)을 반응 구획(30)으로 부터 폐쇄시킨다. 따라서 본 발명의 장치(10)가 "냉각"모드에 있을 때 주변유체가 복귀유체구획(34)으로 직접 들어오고 폐쇄 루우프 유체 흐름 경로와 동일한 경로를 따라 송풍기 구획(28), 가열구획(29), 반응구획(30) 및 샘플구획(28)으로 흐른다. 이후에 유체는 공기챔버(11) 밖으로 나와 샘플구획(27)과 복귀 유체 구획(34) 사이에 통기도어(14)의 위치 선정에 의해 공기 복귀 구획(34)으로 복귀하는 것을 방지한다.Access to the sample compartment 27 is made by rotating the ventilator 14 to the open position. If the ventilator 14 is rotated 90 degrees from the closed position, the sample compartment 27 can be easily accessed. In addition, a 90 degree rotation of the ventilator 14 from the closed position closes the return fluid compartment 34 from the reaction compartment 30. Thus, when the apparatus 10 of the present invention is in the "cooling" mode, the peripheral fluid directly enters the return fluid compartment 34 and follows the same path as the closed loop fluid flow path, the blower compartment 28 and the heating compartment 29. , Flows into the reaction compartment 30 and the sample compartment 28. The fluid then exits the air chamber 11 and prevents return to the air return section 34 by positioning the ventilator 14 between the sample compartment 27 and the return fluid section 34.

따라서, 통기도어(14)는 주변유체를 챔버(11)에 들어오게 할뿐만 아니라 챔버(11)를 통해 유체가 루우프 형태로 재순환 하는 것을 방지할 수 있다. 대신에, 유체는 샘플구획(27)을 통과하고 이후에 챔버(11) 밖으로 나와서 샘플 내용물과 챔버(11)의 신속한 냉각을 돕는다.Thus, the ventilator 14 may not only allow the surrounding fluid to enter the chamber 11 but also prevent the fluid from being recycled to the loop through the chamber 11. Instead, the fluid passes through the sample compartment 27 and then exits the chamber 11 to aid in rapid cooling of the sample contents and the chamber 11.

본 발명의 장치(10)가 순환적 DNA 증폭에 사용될 때 시간대 온도 프로파일을 통한 반복적 순환이 필요하다. PCR동안 반응 혼합물 함유 샘플은 증폭과정의 변성, 어닐링 및 신장 단계에 대응하는 시간대 온도 프로파일을 통해 약 30회 순환되어야 한다.When the device 10 of the present invention is used for cyclic DNA amplification, iterative circulation through a time zone temperature profile is required. During PCR, the sample containing the reaction mixture should be cycled about 30 times through a time zone temperature profile corresponding to the denaturation, annealing and stretching steps of the amplification process.

본 발명의 장치(10)는 낮은 열량으로 인하여 공지기술에 비해서 단축된 시간대 온도 프로파일을 통해서 샘플을 싸이클링 받게할 수 있다. 도 1-3 구체예의 DNA 증폭응용은 30-60초후에 시간대 온도 프로파일 싸이클을 통과한다(도 5). 공지기술 사용시 동일한 싸이클은 5-10배 더 오래 걸린다. 이러한 낮은 싸이클 시간은 공지기술의 싸이클링에 비해서 PCR의 수율 및 특이성을 증가시켰다.The device 10 of the present invention is able to cycle the sample through a shorter time zone temperature profile compared to the known art due to the low calories. The DNA amplification application of the Figures 1-3 embodiment passes through a time zone temperature profile cycle after 30-60 seconds (Figure 5). The same cycle takes 5-10 times longer with the known art. This low cycle time increased the yield and specificity of PCR as compared to the cycling of the prior art.

실시예 1Example 1

폴리메라제 연쇄반응이 50ng DNA 템플레이트, 0.5㎃ 데옥시누클레오타이드, 500nM 올리고누클레오타이드 프라이머가 50mM Tris-HCl(25℃에서 pH 8.5), 3.0mM 염화마그네슘, 20mM HCl 및 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민으로 구성된 반응 버퍼에 들어있는 10㎕ 부피에서 수행된다. 내열성 폴리메라제 (Tag 폴리메라제 0/4 유닛 － Stratagene)가 첨가되고 샘플이 8㎝ 길이의 얇은 벽 모세관 튜브(Kimble, Kimax 46485-1)에 담기고 튜브의 양 단부에 공기방울이 존재하도록 단부가 실험실 가스버너로 융합된다.Polymerase Chain Reaction with 50ng DNA Template, 0.5kO Deoxynucleotide, 500nM Oligonucleotide Primer with 50mM Tris-HCl (pH 8.5 at 25 ° C), 3.0mM Magnesium Chloride, 20mM HCl and 500µg / ml Bovine This is done in a 10 μl volume contained in the reaction buffer consisting of serum albumin. Heat-resistant polymerase (Tag polymerase 0/4 unit-Stratagene) is added and the sample is immersed in an 8 cm long thin wall capillary tube (Kimble, Kimax 46485-1) and ends with air bubbles at both ends of the tube. Is fused to a laboratory gas burner.

이후에 모세관 튜브는 1㎜ 두께의 "사전 펀칭된 보오드"로 구성된 홀더(Radio Shack에 의해 제조)에 수직으로 놓인다. 혼합물은 도 5 의 시간대 온도 프로파일에 표시된 시간동안 30회 변성(90-92℃), 어닐링(50-55℃), 및 신장(72-75℃)된다. 10㎕ 탈이온수에 놓이고 열전쌍 모니터(BAT-12, Sensortek)에 연결된 소형 열전쌍(IT-23, Sensortek, Clifton, NJ)을 써서 모세관 튜브의 온도 모니터링이 수행된다. 증폭 생성물은 1.5% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분별된다. 양호한 결과가 수득되었다.The capillary tube is then placed perpendicular to a holder (manufactured by Radio Shack) consisting of a 1 mm thick "pre-punched board". The mixture is denatured (90-92 ° C.), annealed (50-55 ° C.), and stretched (72-75 ° C.) 30 times for the time indicated in the time zone temperature profile of FIG. 5. Temperature monitoring of capillary tubes is performed using a small thermocouple (IT-23, Sensortek, Clifton, NJ) placed in 10 μl deionized water and connected to a thermocouple monitor (BAT-12, Sensortek). Amplification products are fractionated by electrophoresis on 1.5% agarose gel. Good results were obtained.

본 발명의 장치(10)가 열전달 매체로서 물대신에 공기를 순환시키기 때문에 빠르게 데워질 수 있는 저열량 매체(공기)를 통해 열전달이 이루어지는 장점이 있다.Since the device 10 of the present invention circulates air instead of water as a heat transfer medium, there is an advantage that heat transfer is performed through a low calorie medium (air) that can be quickly warmed up.

샘플냉각 응답시간을 공지 공정에서 사용된 플라스틱 마이크로 튜브대신에 샘플유지에 얇은벽 유리 모세관 튜브를 사용하고 챔버(11) 내부의 재료의 열량을 최소화함으로써 매우 빠르다(도 5). 이러한 응답시간은 시간 및 온도 측면에서 폴리메라제 연쇄반응의 변성, 어닐링 및 신장 단계의 최적화를 허용한다.The sample cooling response time is very fast by using thin-walled glass capillary tubes for sample holding instead of the plastic microtubes used in known processes and minimizing the heat content of the material inside the chamber 11 (FIG. 5). This response time allows optimization of the denaturation, annealing and stretching steps of the polymerase chain reaction in terms of time and temperature.

게다가, 단축된 "램프"시간이 획득된다. 즉, 샘플의 온도는 한 온도 수준에서 다음 온도 수준이 되게 하는데 필요한 시간이 단축된다. 이것은 완전한 증폭에 필요한 시간을 감소시키고 폴리메라제 연쇄반응 프로토콜내에서 어닐링, 변성 및 효소반응의 특이성 연구를 허용한다.In addition, a shortened "lamp" time is obtained. In other words, the temperature of the sample is shortened to bring the temperature from one temperature level to the next. This reduces the time required for complete amplification and allows for the study of specificity of annealing, denaturation and enzymatic reaction within the polymerase chain reaction protocol.

필요시 샘플구획(27)내에서 적당한 온도 균일성을 달성하는데 배플(32, 33)이 사용될 수 있다. 배플(32, 33)은 반응 구획(30)의 온도 변화를 10℃에서 2℃로 감소시킨다. 필요시 반응구획(30)의 온도변화를 더욱 감소시키기 위해서 추가 배플이 사용될 수 있다. 혹은, 도 4 에 도시된 바와 같이 팬이 가열 코일(31)의 하류, 샘플구획(27)앞에 위치되어서 더욱 균일한 혼합을 할 수 있다.If desired, baffles 32 and 33 can be used to achieve adequate temperature uniformity within the sample compartment 27. The baffles 32 and 33 reduce the temperature change in the reaction compartment 30 from 10 ° C to 2 ° C. If necessary, an additional baffle may be used to further reduce the temperature change of the reaction compartment 30. Alternatively, as shown in FIG. 4, a fan may be located downstream of the heating coil 31 and in front of the sample compartment 27 to allow more uniform mixing.

장치(10)의 사용을 통해 수득된 증폭 생성물은 수동 수조 싸이클링 방법을 통해서 수득된 것과 정량적 및 정성적으로 유사하다. 그러나, 특이성 및 수율에서 향상과 반응 혼합물의 신속한 열제어가 가능하다. 도 6 은 본 발명의 열순환 장치(10)를 사용할 때 도 5 의 시간대 온도 프로파일의 변성 시간 변화가 DNA 증폭 수율에 미치는 효과를 보여준다. 밝은 수직 라인은 변성 온도에서 특정 시간에 대응한다. 수율은 변성시간이 짧을수록 크다. 이러한 신속한 응답은 공지 시스템으로는 불가능하다.The amplification products obtained through the use of the apparatus 10 are quantitatively and qualitatively similar to those obtained through the manual water tank cycling method. However, improvements in specificity and yield and rapid thermal control of the reaction mixture are possible. 6 shows the effect of the denaturation time change of the time zone temperature profile of FIG. 5 on the DNA amplification yield when using the thermocycling apparatus 10 of the present invention. Bright vertical lines correspond to specific times at denaturing temperatures. The yield is larger the shorter the denaturation time. This quick response is not possible with known systems.

도 7 은 열순환 장치(10) 사용시 도 5 의 시간대 온도 프로파일이 특이성에 미치는 효과를 보여준다(즉, 복수의 유사한 또는 "새도우" 생성물에 대응하는 특이성 생성물 수율). 램프 및 어닐링 시간이 짧을수록 생성물 특이성은 크다. 장치(10)의 신속한 온도 응답은 공지 시스템으로는 불가능한 특이성 및 수율향상을 가져왔다.FIG. 7 shows the effect of the time zone temperature profile of FIG. 5 on specificity when using thermocycling device 10 (ie, specific product yield corresponding to a plurality of similar or “shadow” products). The shorter the ramp and annealing time, the greater the product specificity. The rapid temperature response of the device 10 has resulted in specificity and yield improvements that are not possible with known systems.

장치(10)의 열용량을 감소시킴으로써 본 발명은 폴리메라제 연쇄반응에 필요한 총시간을 크게 감소시킬 수 있다. 추가로, 적은 샘플의 사용은 최대 90%까지 사용되어야 하는 값비싼 시약의 양을 감소시켜서 본 발명을 사용하여 절차를 수행하는 비용을 절감시킨다. 예컨대, 0.25 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수 있다. 어떤 경우에 0.02 내지 1.0㎜의 내경을 가진 모세관 튜브(108)가 사용될 수도 있다.By reducing the heat capacity of the device 10, the present invention can greatly reduce the total time required for the polymerase chain reaction. In addition, the use of fewer samples reduces the amount of expensive reagents that must be used by up to 90%, thereby reducing the cost of performing the procedure using the present invention. For example, a capillary tube 108 with an inner diameter of 0.25 to 1.0 mm can be used. In some cases a capillary tube 108 with an inner diameter of 0.02 to 1.0 mm may be used.

본 발명의 장치(10)는 임의의 소스로 부터 DNA를 증폭하는데 유용하다.The device 10 of the present invention is useful for amplifying DNA from any source.

본 발명의 또다른 구체예가 도 8a-c 에 나타난다. 도 8a 는 사시도이고 도 8b 는 단면도이다. 도 8a-c 에서 열발생 요소는 생물학적 샘플 용기에 인접하여서 생물학적 샘플의 가열 및 냉각 시간을 더 빠르게 한다.Another embodiment of the present invention is shown in Figures 8A-C. 8A is a perspective view and FIG. 8B is a sectional view. The heat generating elements in FIGS. 8A-C adjoin the biological sample vessel to speed up the heating and cooling time of the biological sample.

도 8a-c 의 장치는 열순환이 수행되는 속도에 있어서 공지 기술에 비해 귀다한 진보를 제공한다. 즉, 30, 15, 10 내지 5분 이내에 DNA 증폭을 15 또는 30 싸이클 할 수 있다. 게다가, 장치(100)는 더 양호한 열 균일화가 가능하게 한다.The apparatus of Figures 8a-c provides a significant advance over the known art in the speed at which thermal cycling is carried out. That is, DNA amplification can be performed 15 or 30 cycles within 30, 15, 10 to 5 minutes. In addition, the device 100 allows for better thermal uniformity.

도 8a 에 하우징(102)의 일반 구성이 도시된다. 하우징(102)은 피트(104)상에 놓이며 (도 8b) 구조물을 제자리에 유지시키며 뜨거운 구조물을 주변환경으로 부터 분리시키는 작용을 한다. 도 8a 의 장치(100)에 입력키(25) 및 디스플레이(26)가 포함된다.8a shows a general configuration of the housing 102. The housing 102 rests on the pit 104 (FIG. 8B) and holds the structure in place and serves to separate the hot structure from the environment. The device 100 of FIG. 8A includes an input key 25 and a display 26.

도 8b 의 단면도에서 샘플챔버는 브라켓(106)으로 표시된다. 힌지(131)에 의해 하우징(102)에 연결된 뚜껑(138)이 개방되어서 샘플 챔버(106)에 접근할 수 있다. 샘플 챔버(106)는 원통형일 수 있다. In the cross-sectional view of FIG. 8B the sample chamber is indicated by bracket 106. A lid 138 connected to the housing 102 by the hinge 131 can be opened to access the sample chamber 106. The sample chamber 106 may be cylindrical.

샘플챔버(106)는 흑색 발포물(110)로 라이닝되어서 이의 표면은 광흡수성을 가지며 발포물의 대부분 두께는 절연성을 가진다. 흑색 발포물은 쉽게 구매할 수 있다. 발포물(110)은 통과하는 공기에 의해 쉽게 냉각되는 물질이다. 즉, 이 물질은 낮은 열전도성과 다공성 표면을 가진다.The sample chamber 106 is lined with black foam 110 so that its surface is light absorbing and most of the foam is insulating. Black foam is readily available. Foam 110 is a material that is easily cooled by the air passing through it. That is, the material has a low thermal conductivity and a porous surface.

흑색 다공성 표면은 표면에 입사하는 짧은 파장의 복사에너지를 장파 에너지로, 즉 샘플 챔버에 복사되는 열로 전환한다.The black porous surface converts short wavelength radiation incident on the surface into long wave energy, ie heat radiated in the sample chamber.

발포물(110)은 샘플챔버를 하우징의 주변공기공간으로 부터 분리시키고 램프(112)에 의해 방출된 빛을 열에너지로 전환시킨다. 발포물(110)은 다른 구조물로 대체될 수 있다. 예컨대, 한면이 흑색 도장된 폴리카보네이트 박판과 같은 흑색 비반사 표면을 가지는 재료가 유리섬유 또는 발포물과 같은 절연재료에 의해 보강될 수 있다. 다양한 기질에 도장될 수 있는 흑색 표면은 입사한 단파장의 복사에너지를 열복사에너지로 전환시키며 절연재료는 샘플챔버를 주변환경으로 부터 절연시킨다.The foam 110 separates the sample chamber from the surrounding air space of the housing and converts the light emitted by the lamp 112 into thermal energy. Foam 110 may be replaced with other structures. For example, a material having a black anti-reflective surface, such as a polycarbonate sheet painted black on one side, may be reinforced by an insulating material such as glass fiber or foam. The black surface, which can be painted on various substrates, converts the incident short wavelength radiation into thermal radiation, and the insulating material insulates the sample chamber from the environment.

램프(112)는 500와트 할로겐 램프일 수 있다. 적절한 제어장치가 사용된다면 더 높은 출력의 램프나 복수의 램프가 사용될 수 있다. 램프소켓(112A)은 지지부(112B)에 의해 하우징(102)에 부착된다. 램프(112)는 샘플챔버(106)를 필요한 온도까지 신속하고 균일하게 가열할 수 있다. 니크롬선과 같은 적외선 복사원이 본 발명의 범위내에 사용될 수도 있다.Lamp 112 may be a 500 watt halogen lamp. Higher output lamps or multiple lamps may be used if suitable controls are used. The lampholder 112A is attached to the housing 102 by the support 112B. The lamp 112 can heat the sample chamber 106 quickly and uniformly to the required temperature. Infrared radiation sources such as nichrome wire may also be used within the scope of the present invention.

도 8b 에 2개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시된다. 두 개의 얇은벽 모세관 튜브(108)가 도시될지라도 샘플챔버(106)는 여러개의 이러한 튜브를 유지할 수 있다. 얇은벽 모세관 튜브(108)는 공지 장치에 비해서 몇가지 장점을 가지며 생물학적 샘플 유지 수단으로 사용된다.Two thin wall capillary tubes 108 are shown in FIG. 8B. Although two thin-walled capillary tubes 108 are shown, the sample chamber 106 may hold several such tubes. The thin wall capillary tube 108 has several advantages over known devices and is used as a biological sample holding means.

얇은벽 모세관 튜브(108)는 접근의 용이성을 위해 구멍(140)을 통해 샘플챔버 밖으로 부분 연장될수도 있지만 특정한 용도에 적합한 다른 수많은 유체 유지 구조물과 같이 샘플챔버(106)내에 완전히 내장될 수 있다. 선호되는 얇은벽 모세관 튜브(108)는 약 10㎕의 용량을 가진다. 샘플의 부피는 적게 유지되어야 하며 샘플 유지 구조물의 표면적은 비교적 커야 하며 비교적 적은 열용량을 가져야 한다. 샘플 유지 구조물은 0.1 내지 10,000㎕의 부피를 가질 수 있다.The thin wall capillary tube 108 may extend partially out of the sample chamber through the aperture 140 for ease of access, but may be fully embedded in the sample chamber 106 like many other fluid retention structures suitable for a particular application. Preferred thin wall capillary tubes 108 have a capacity of about 10 μl. The volume of the sample should be kept low and the surface area of the sample holding structure should be relatively large and have a relatively low heat capacity. The sample retention structure may have a volume of 0.1 to 10,000 μl.

램프(112)와 절연성 발포물(110)은 함께 얇은벽 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플과 샘플챔버(106)내의 공기를 빠르고 균일하게 가열한다. 열전쌍(134)이 샘플 챔버(106)내에 포함되어서 챔버내 온도를 감지하고 샘플챔버내에서 필요한 온도를 유지시키는데 사용된다.The lamp 112 and the insulating foam 110 together heat the sample contained in the thin wall capillary tube 108 and the air in the sample chamber 106 quickly and uniformly. A thermocouple 134 is included in the sample chamber 106 to sense the temperature in the chamber and to maintain the required temperature in the sample chamber.

열전쌍(134)은 이의 열응답이 생물학적 샘플과 이를 유지하는 용기의 열응답과 일치하며 구매가능한 것이다. 이러한 열전쌍은 Idaho Labs로 부터 금속 외장 J-형 열전쌍 형태로 구매할 수 있다. 생물학적 샘플과 용기의 열응답과 열전쌍의 열응답의 일치는 PhysiTem로 부터 구매가능한 모델 IT-23 열전쌍과 같은 마이크로 열전쌍을 선택된 용기에 담긴 생물학적 샘플속에 삽입하고 샘플과 열전쌍은 동일한 온도변화를 받게 함으로써 달성된다. 테스트중인 열전쌍은 열전쌍의 열응답이 샘플 및 용기의 열응답에 일치할때까지 변화될 수 있다. The thermocouple 134 is commercially available and whose thermal response matches that of the biological sample and the container holding it. These thermocouples are available from Idaho Labs in the form of metal sheathed J-type thermocouples. The thermal response of the biological sample and the thermocouple and the thermocouple match are achieved by inserting a micro thermocouple, such as the model IT-23 thermocouple, available from PhysiTem into the biological sample in the selected container, and the sample and the thermocouple subjected to the same temperature change. do. The thermocouple under test can be varied until the thermal response of the thermocouple matches the thermal response of the sample and the vessel.

도 8b 의 배열은 기존의 장치보다 더 균일한 샘플의 가열 및 냉각을 제공한다. 기존의 장치에서 샘플을 통한 열전달은 샘플을 통한 대류에 의해 이루어진다. 샘플유지에 어떠한 구조물이 사용되든 샘플의 대류 유도 운동이 적은 생물학적 샘플(10-100㎕)의 온도차에 의해 야기된다.The arrangement of FIG. 8B provides heating and cooling of the sample more uniform than conventional devices. In conventional devices, heat transfer through the sample is by convection through the sample. Whatever structure is used to hold the sample, the convective induction motion of the sample is caused by the temperature difference of the biological sample (10-100 μl) that is low.

샘플내의 온도차의 효과는 샘플에 대한 싸이클시간이 감소될 때 더욱 제어하기 곤란하다. 샘플내 불균일 온도의 존재와 샘플내에서 "대류에 의한 혼합"에 대한 의존성은 샘플에 대한 싸이클시간을 증가시키고 생물학적 샘플에 악영향을 준다. 장치(100)는 10㎕ 샘플내의 열차이가 30초 싸이클동안 ±1℃ 미만이 되도록 가열 및 냉각을 할 수 있다.The effect of the temperature difference in the sample is more difficult to control when the cycle time for the sample is reduced. The presence of non-uniform temperature in the sample and the dependence on “mixing by convection” in the sample increases the cycle time for the sample and adversely affects the biological sample. Apparatus 100 may be heated and cooled such that trains in 10 μl samples are less than ± 1 ° C. over a 30 second cycle.

더욱 균일한 냉각 및 가열을 촉진하기 위해서 얇은벽 모세관 튜브(108)가 램프(112)와 같은 열원으로 부터 다소 떨어지는 것이 좋다. 도 8c 는 도 8a-b 에서 도시된 장치(100)에 배열된 램프(112)와 복수의 얇은벽 모세관 튜브(108)의 평면도이다.In order to promote more uniform cooling and heating, the thin-walled capillary tube 108 may be somewhat separated from a heat source such as lamp 112. FIG. 8C is a top view of the lamp 112 and the plurality of thin wall capillary tubes 108 arranged in the apparatus 100 shown in FIGS. 8A-B.

도 8c 에서 램프(112)로 부터 가장 멀리있는 (F로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)는 램프에 가장 가까운 (N으로 표시된) 얇은벽 모세관 튜브(108)와 램프(112)간의 거리보다 램프(112)로 부터 40%, 특히 25% 정도 더 멀리 있다. 예컨대 N으로 표시된 거리는 7.3㎝이고 F로 표시된 거리는 8.5㎝이다. 얇은벽 모세관 튜브(108)의 배열은 원형 또는 반원형일 수 있다.In FIG. 8C, the thin wall capillary tube 108 (indicated by F) furthest from the lamp 112 is located at a distance greater than the distance between the thin wall capillary tube 108 (indicated by N) and the lamp 112 closest to the lamp. 40%, especially 25%, from (112). For example, the distance indicated by N is 7.3 cm and the distance indicated by F is 8.5 cm. The arrangement of the thin wall capillary tube 108 may be circular or semicircular.

게다가 열발생 요소와 샘플용기간의 거리를 측정하는 점은 열발생 요소의 크기 및 종류에 따라 변한다. 예컨대, 열발생요소는 크기 및 모양이 다양한 복수 램프 또는 전기저항요소일 수 있다. 샘플 챔버벽으로 부터 샘플 용기가 위치되는 거리를 고려하는 것도 중요하다. 구멍(140)(도 8a)은 샘플용기 유지수단으로 작용하지만 다른 구조물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.In addition, the measurement of the distance between the heat generating element and the sample period varies with the size and type of the heat generating element. For example, the heat generating element may be a plurality of lamps or electric resistance elements of various sizes and shapes. It is also important to consider the distance that the sample vessel is located from the sample chamber wall. The hole 140 (FIG. 8A) serves as a sample vessel holding means but other structures may be used in accordance with the present invention.

장치(100)는 모세관 튜브(108)에 담긴 샘플을 빠르고 균일하게 냉각하기도 한다. 샘플챔버(106)를 냉각하기 위해서, 하우징(102) 외부로 부터 공기가 모터(118)에 의해 구동되는 모터 샤프트(122)에 연결된 팬(116)에 의해 하부 하우징 입구(114)를 통해 하우징 내부로 들어온다. 샘플챔버의 신속한 냉각이 필요하므로 모터(118)와 팬(116)의 조합은 충분한 부피의 공기를 샘플챔버(106)에 이동시키고 이후에 공기를 샘플챔버(106) 내부에 분산시킬 수 있어야 한다. 도 8b 에 도시된 모터(118) 및 팬(116) 이외의 장치가 사용될 수 있다.The apparatus 100 may also cool the sample contained in the capillary tube 108 quickly and uniformly. To cool the sample chamber 106, inside the housing through the lower housing inlet 114 by a fan 116 connected to the motor shaft 122 driven by the motor 118 from outside the housing 102. Comes in. Since rapid cooling of the sample chamber is required, the combination of the motor 118 and the fan 116 should be able to move a sufficient volume of air into the sample chamber 106 and then disperse the air inside the sample chamber 106. Devices other than the motor 118 and fan 116 shown in FIG. 8B may be used.

액체와 다른 가스에 비해서 열전달 매체로서 공기를 사용하는 것은 저렴하며 쉽게 구할 수 있으며 쉽게 혼합되는 장점이 있다. 샘플을 담는 모세관 튜브의 높은 부피대 표면적 비는 열전달 매체로서 공기를 사용하여 신속하게 열을 전달시킨다.The use of air as a heat transfer medium over liquids and other gases has the advantage of being inexpensive, readily available and easily mixed. The high volume to surface area ratio of the capillary tube containing the sample quickly transfers heat using air as the heat transfer medium.

열싸이클중 냉각단계에서 팬(116)의 작용은 주변공기를 하우징(102)으로 들여보내는 것이다. 힌지(129)로 움직이는 통기도어(128)가 제공된다. 통기도어(128)는 솔레노이드(132)에 의해 자동으로 개방되어서 하우징(102)의 내부가 상부 하우징 입구(130)로 부터 밀폐된다. 솔레노이드(132)는 당해분야에 공지된 스테핑 모터로 대체될 수 있다. 스테핑 모터의 사용은 통기 도어(128)를 정확하고 증분적으로 샘플의 가열 및 냉각 필요성에 따라 개폐시킬 수 있게 한다. 당해분야 숙련자는 SC-149 스테핑 모터 제어기(Alpha products)를 사용하여 적절한 제어를 할 수 있다.The action of the fan 116 in the cooling phase of the heat cycle is to introduce ambient air into the housing 102. A ventilator 128 is provided that moves to the hinge 129. The ventilator 128 is automatically opened by the solenoid 132 so that the interior of the housing 102 is sealed from the upper housing inlet 130. Solenoid 132 may be replaced with a stepping motor known in the art. The use of a stepping motor allows the vent door 128 to be opened and closed accurately and incrementally according to the heating and cooling needs of the sample. One skilled in the art can use SC-149 stepping motor controllers (Alpha products) to make appropriate controls.

상부 샘플챔버 입구(126)의 위치 및 더 큰 단면적과 하부 샘플챔버 입구(120)의 배치로 인하여 실온의 공기가 샘플챔버(106)로 이동되고 분산되고 모터 샤프트(122)에 연결된 패들(124)에 의해 샘플 챔버(106)내에서 혼합된다. 패들(124)은 샘플챔버(106)내에서 분당 250미터, 특히 500미터, 더더욱 1000미터 정도의 공기 속도를 일으키기에 충분한 속도로 회전해야 한다. 고속회전하는 단일 또는 다중패들일 수 있는 패들(124)을 사용하여 공기가 샘플 챔버(106)내로 유입되거나 점선(136)으로 표시된 경로를 따라 챔버(106)로 부터 유출된다. 패들(124)의 회전은 샘플챔버(106)에 들어오는 공기의 혼합을 촉진하고 얇은벽 모세관 튜브(108)의 표면으로 부터 샘플 챔버(106)를 통과하는 공기로 가장 효과적인 열에너지 전달을 보장한다.Due to the location of the upper sample chamber inlet 126 and the larger cross-sectional area and placement of the lower sample chamber inlet 120, air at room temperature is moved to the sample chamber 106, dispersed and paddle 124 connected to the motor shaft 122. By mixing in the sample chamber 106. Paddle 124 must rotate at a speed sufficient to produce an air velocity of 250 meters per minute, in particular 500 meters, even 1000 meters, within sample chamber 106. Using paddle 124, which may be a single or multiple paddles rotating at high speed, air is introduced into or out of chamber 106 along the path indicated by dashed line 136. Rotation of the paddle 124 promotes mixing of air entering the sample chamber 106 and ensures the most efficient thermal energy transfer from the surface of the thin wall capillary tube 108 to the air passing through the sample chamber 106.

솔레노이드(132)가 통기도어(128)를 개방시키도록 활성화될 때 샘플챔버(106)에 유입된 실온의 공기는 샘플챔버 상부입구(126)와 상부 하우징 입구(130)를 통해 배출되어 샘플챔버(106)로 부터 열을 주변대기에 전달한다. 샘플 챔버(106)를 통과하고 분배된 공기의 빠른 혼합은 샘플의 균일하고 신속한 냉각을 가져온다.When the solenoid 132 is activated to open the ventilator 128, the air at room temperature introduced into the sample chamber 106 is discharged through the sample chamber upper inlet 126 and the upper housing inlet 130 to discharge the sample chamber ( 106) transfers heat to ambient air. Rapid mixing of the air passed through the sample chamber 106 and dispensed results in uniform and rapid cooling of the sample.

실시예 2Example 2

도 9a 는 4개의 온도/시간 프로파일(A-D)의 결과와 30싸이클후 증폭 생성물을 보여준다. 프로파일 A와 B는 공지기술의 마이크로 튜브를 사용하는 공지 가열블럭 장치를 사용하여 수득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 온도간의 전이는 느리며 프로파일 A 및 B에 수많은 비특이성 밴드가 존재한다. 프로파일 B는 각 샘플이 각 온도에서 유지되는 시간을 제한함으로써 비특이성 밴드의 일부가 제거됨을 (프로파일 A에 비해서) 보여주는데, 이것은 시간이 짧을수록 바람직한 결과가 얻어짐을 보여준다.9A shows the results of four temperature / time profiles (A-D) and amplification products after 30 cycles. Profiles A and B are obtained using known heating block devices using known microtubes. As shown in FIG. 9A, the transition between temperatures is slow and there are numerous nonspecific bands in profiles A and B. Profile B shows that part of the nonspecific band is removed (relative to Profile A) by limiting the time each sample is held at each temperature, which shows that the shorter the time, the better the results are obtained.

프로파일 c 및 b는 도 8a-b 의 장치를 사용하여 획득된다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 증폭이 특이적이며 수율이 c에서 최대일지라도 (60초 신장) D에서도 적절하다(10초 신장).Profiles c and b are obtained using the apparatus of FIGS. 8A-B. As shown in FIG. 9A, although amplification is specific and the yield is maximum at c (60 second elongation), it is also appropriate for D (10 second elongation).

인간 유전자 DNA로 부터 β-글로블린의 536bp의 증폭에 최적의 시간 및 온도 역시 결정된다. 변성(93℃) 및 어닐링(55℃)이 1초 미만일 때 증폭 수율 및 생성물 특이성이 최적이다. 더 긴 변성 또는 어닐링 시간으로 잇점이 없다. 77℃에서 더 오랜 신장시간으로 수율이 증가하지만 10-20초보다 긴 신장시간으로는 변화가 거의 없다. 이러한 예기치 못한 결과는 DNA 증폭에 사용된 기존의 장치가 반응의 물리적 및 효소적 조건을 최적화하는데 필요한 조건을 최대화하지 못함을 나타낸다.The optimal time and temperature for amplifying 536 bp of β-globulin from human gene DNA is also determined. Amplification yield and product specificity are optimal when denaturation (93 ° C.) and annealing (55 ° C.) is less than 1 second. There is no advantage with longer denaturation or annealing times. Yield increases with longer elongation at 77 ° C. but little change with elongation times longer than 10-20 seconds. These unexpected results indicate that existing devices used for DNA amplification do not maximize the conditions necessary to optimize the physical and enzymatic conditions of the reaction.

추가 정보가 다음으로 부터 획득될 수 있다:Additional information can be obtained from:

Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B., and Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis △F50B Locus," 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., and Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification," THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994).Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B., and Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis ΔF 50B Locus," 39 Clinical Chemistry 804 (1993) and Wittwer , Carl T., Reed, Gudrun H., and Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification," THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994).

도 9a 에 제공된 정보로 부터 샘플은 신속한 열순환이 되며 샘플의 온도는 0.5℃/초 이상의 속도로 증감된다. 폴리메라제 연쇄반응은 수행하는 본 발명의 경우에 온도변화는 30 내지 50℃에 대해서 수행된다. 열 싸이클은 40분후에 30이상의 열싸이클, 특히 20분후에 30회의 열싸이클, 더더욱 10분후에 30회의 열싸이클을 완료시키도록 충분히 빠르게 수행되는 것이 좋다.From the information provided in FIG. 9A, the sample is in rapid thermocycle and the temperature of the sample is increased or decreased at a rate of 0.5 ° C./sec or more. In the case of the present invention where the polymerase chain reaction is carried out, the temperature change is carried out for 30 to 50 ° C. The heat cycle is preferably performed fast enough to complete more than 30 heat cycles after 40 minutes, in particular 30 heat cycles after 20 minutes, and even 30 heat cycles after 10 minutes.

장치(100)는 1.0℃/초 이상, 특히 4.0℃/초 이상, 더더욱 10.0℃/초 이상의 속도로 샘플의 온도를 증감시킨다. 주변매체나 샘플용기가 아니라 생물학적 샘플이 지정된 열적 변화를 겪어야 한다. 기존의 장치의 본 발명의 장치만큼 빠르게 열적변화를 수행할 수 없으며 주변매체 및 용기의 온도가 아니라 샘플의 온도를 빠르고 균일하게 변화시키는 문제에 대한 인식이 없었다.The apparatus 100 increases or decreases the temperature of the sample at a rate of at least 1.0 ° C./sec, in particular at least 4.0 ° C./sec and even more at 10.0 ° C./sec. The biological sample, not the surrounding medium or sample vessel, must undergo a specified thermal change. There was no awareness of the problem of changing the temperature of the sample quickly and uniformly, rather than the temperature of the surrounding medium and vessel, as it was not possible to perform thermal changes as quickly as the device of the present invention of the existing devices.

도 9b 에서, 본 발명의 방법은 20℃ 이상, 특히 30℃ 이상, 더더욱 40℃ 이상의 온도범위에 걸쳐서 10℃/초이상, 특히 20℃/초이상의 속도로 열적 싸이클링을 이룰 수 있다. 도 9b 는 생물학적 샘플이 열싸이클을 받을 때 생물학적 샘플의 온도(℃)가 주변공기 또는 용기의 온도가 아님을 보여준다. 도 9b 는 74℃에서 시작되며 D로 표시된 변성온도 92℃에서 2초간 가열되는 PCR 샘플을 보여준다. 샘플은 이후에 A로 표시된 어닐링 온도 55℃까지 2초간 냉각된다. 변성온도와 어닐링온도간의 전이는 4초간 37℃로서 10℃/초 이상의 속도를 제공한다. 이후에 샘플은 도 9b 에서 E로 표시된 신장온도 74℃에서 5초간 데워진다. 변성온도, 어닐링온도 및 신장온도를 통한 샘플의 싸이클링은 30회 반복된다.In FIG. 9B, the process of the present invention can achieve thermal cycling at a rate of at least 10 ° C./sec., In particular at least 20 ° C./sec. 9B shows that the temperature (° C.) of the biological sample is not the temperature of the ambient air or vessel when the biological sample is subjected to a heat cycle. 9B shows PCR samples starting at 74 ° C. and heated at 92 ° C. for denaturation temperature 92 ° C. FIG. The sample is then cooled for 2 seconds to an annealing temperature of 55 ° C., indicated by A. The transition between denaturation temperature and annealing temperature gives a rate of 10 ° C./sec or higher at 37 ° C. for 4 seconds. The sample is then warmed for 5 seconds at an extension temperature of 74 ° C., indicated by E in FIG. 9B. Cycling of the sample through denaturation temperature, annealing temperature and stretching temperature is repeated 30 times.

도 9c-g 는 본 발명에 의해 달성되는 다른 선호되는 온도/시간 프로파일의 예시적인 싸이클을 보여준다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라서 지정된 공정을 수행하기 위해서 표시된 온도/시간 프로파일을 변경할 수 있을 것이다. 당해분야 숙련자는 고체 또는 액체르 통해 샘플에 열을 전도하는 공지 장치 및 방법이 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 인식할 것이다. 게다가 크로마토그래피 오븐과 같은 공기 및 전달매체를 활용하는 공지장치 및 방법은 여기서 기술된 온도/시간 프로파일을 제시하지 않음을 알 수 있을 것이다.9C-G show exemplary cycles of another preferred temperature / time profile achieved by the present invention. One skilled in the art will be able to alter the displayed temperature / time profile to perform the designated process in accordance with the present invention. Those skilled in the art will appreciate that known devices and methods for conducting heat to a sample through a solid or liquid do not present the temperature / time profile described herein. In addition, it will be appreciated that known devices and methods utilizing air and delivery media, such as chromatography ovens, do not present the temperature / time profiles described herein.

가장 빠른 열 싸이클링 시간을 제공하기 위해서 램프(112, 도 8a, 8b)의 정격전력은 2000와트이거나 유사한 출력의 복수의 램프가 포함될 수 있다. 또한 Alpha products(모델번호 SP-127)(Darian, Connecticut)로 부터 구매가능한 하이레벨 프로그램 인터프리터와 클록과 함께 8052 마이크로컨트롤러를 사용하는 A-버스 컨트롤러/획득 시스템과 관련하여 도 10 에 나타난 온도 기울기 제어회로를 포함시키는 것이 선호된다. 마이크로컨트롤러에 사용되는 프로그램 코드는 프로그램 코드 부록에 포함된다. 부록에 제공된 프로그램 코드는 마이크로컨트롤러에 다운로드를 위한 BASIC52 파일이며 열싸이클링동안 예시적인 온도 기울기 제어를 한다. 2000와트 열 발생장치와 제어기는 20℃/초의 속도가 달성될 수 있게 한다.To provide the fastest thermal cycling time, the rated power of the lamps 112 (FIGS. 8A, 8B) may be 2000 watts or include multiple lamps of similar output. Temperature gradient control shown in FIG. 10 with respect to an A-bus controller / acquisition system using an 8052 microcontroller with a high-level program interpreter and clock available from Alpha products (Model No. SP-127) (Darian, Connecticut). It is preferred to include the circuit. Program code for the microcontroller is included in the Program Code Appendix. The program code provided in the appendix is a BASIC52 file for download to the microcontroller and provides exemplary temperature gradient control during thermal cycling. The 2000 watt heat generator and controller allow a rate of 20 ° C./sec to be achieved.

도 10 에 도시된 온도 기울기 제어회로는 샘플온도응답에 일치되는 열전쌍(200)을 포함한다. 열전쌍(200)은 당해분야에서 AD595로 알려진 집적회로(206)에 연결되며, 이의 출력은 100㎐의 컷오프 주파수로 4차 저역 필터(208)와 출력이 온도의 디지탈 표시에 사용되는 12비트 아날로그-디지탈 전환기(210)에 전달된다.The temperature gradient control circuit shown in FIG. 10 includes a thermocouple 200 that matches the sample temperature response. The thermocouple 200 is connected to an integrated circuit 206 known in the art as the AD595, the output of which is a 12-bit analogue, with a fourth order lowpass filter 208 and an output used for digital display of temperature at a cutoff frequency of 100 Hz. Delivered to the digital converter 210.

회로(206)의 출력은 측정된 기울기 회로(212)에도 전달된다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(218), 100㏀ 전위차계(214), 1㏁ 전위차계(230), 22㎌ 축전기를 포함한다. 측정된 기울기 회로(212)는 353 연산 증폭기(246)의 역전 입력에 신호를 출력한다.The output of the circuit 206 is also transmitted to the measured slope circuit 212. The measured slope circuit 212 includes a 353 operational amplifier 218, a 100 kV potentiometer 214, a 1 kV potentiometer 230, and a 22 kV capacitor. The measured slope circuit 212 outputs a signal to the inverting input of the 353 operational amplifier 246.

기울기 설정 회로(222)는 양의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(226)와 음의 기울기 설정 디지탈-아날로그 전환기(224)를 포함한다. 디지탈-아날로그 전환기(224, 226)는 당해분야에서 DA147로 알려진 8비트 디지탈-아날로그 전환기이다. 기울기 설정 회로는 퍼스널 컴퓨터와 같은 또다른 디지탈 장치(도 10 에 도시안된)로 부터의 지령을 수신할 수 있다. 기울기 설정회로(228)의 출력은 합산 회로(240)에 전송된다.The slope setting circuit 222 includes a positive slope setting digital-analog converter 226 and a negative slope setting digital-analog converter 224. Digital-to-analog converters 224 and 226 are 8-bit digital-to-analog converters known in the art as DA147. The tilt setting circuit can receive a command from another digital device (not shown in FIG. 10) such as a personal computer. The output of the slope setting circuit 228 is transmitted to the summing circuit 240.

합산회로(240)는 100㏀ 저항기(236, 238, 244)와 353 연산증폭기(242)를 포함한다. 합산회로(240)의 출력은 연산증폭기(246)의 비-역전 입력에 전달되고 필요한 온도변화 기울기를 나타낸다. 연산증폭기(246)의 출력은 전력전환회로(262)내에 포함된 트랜지스터(248)에 제공된다.Summing circuit 240 includes 100 kΩ resistors 236, 238, 244 and 353 operational amplifier 242. The output of the summation circuit 240 is delivered to the non-inverting input of the operational amplifier 246 and represents the required temperature change slope. The output of the operational amplifier 246 is provided to a transistor 248 included in the power conversion circuit 262.

전력전환회로(262)는 트랜지스터(248)에 전류를 제공하는 5VDC 공급원(250)을 포함한다. 트랜지스터(248)는 330Ω 저항과 같은 저항(252)을 수단으로 3010회로(254)에 연결된 이미터를 가진다. 3010 회로(254)는 180Ω 저항과 같은 저항(256)과 직렬 연결된 출력을 포함한다. 트라이액(258)이 AC 전류원(260)으로 부터 램프(262) 또는 다른 열발생장치에 전달되는 전류 제어에 사용된다.The power conversion circuit 262 includes a 5VDC source 250 that provides a current to the transistor 248. Transistor 248 has an emitter connected to 3010 circuit 254 by means of a resistor 252, such as a 330 kΩ resistor. 3010 circuit 254 includes an output connected in series with a resistor 256, such as a 180 Hz resistor. Triac 258 is used to control the current delivered from the AC current source 260 to the lamp 262 or other heat generator.

다른 시스템 성분과 함께 도 10 에 도시된 온도기울기 제어회로는 생물학적 샘플을 30℃의 온도 범위에서 20℃/초, 특히 40℃의 온도 범위에서 20℃/초로 열 싸이클링을 받게 하며 전체 생물학적 샘플의 균일성이 유지되게 한다.The temperature gradient control circuit shown in FIG. 10 along with other system components subjects the biological sample to thermal cycling at 20 ° C./sec at 30 ° C., in particular 20 ° C./sec at 40 ° C., and provides uniformity of the entire biological sample. Keep the castle.

여기서 발표된 장치는 다음과 같은 응용분야에 사용될 수 있다: 폴리메라제 연쇄 반응; 싸이클 시이퀀싱; 리가아제 연쇄반응과 같은 다른 증폭 프로토콜. 본 발명은 샘플 챔버내에 위치된 샘플의 온도를 정확히 제어하는 장치를 제공하여서 예정된 시간대 온도 프로파일에 따라서 챔버에 위치된 샘플온도를 빠르고 정확하게 변화시킨다.The devices disclosed herein can be used in the following applications: polymerase chain reactions; Cycle sequencing; Other amplification protocols such as ligase chain reaction. The present invention provides an apparatus for accurately controlling the temperature of a sample located in a sample chamber so that the sample temperature located in the chamber can be quickly and accurately changed in accordance with a predetermined time zone temperature profile.

DNA 증폭의 연속 형광 모니터링Continuous Fluorescence Monitoring of DNA Amplification

앞서 기술된 바와 같이 폴리메라제 연쇄 반응은 신속히 수행될 수 있다. 기술된 장치 및 방법을 사용하여 필요한 횟수의 온도 싸이클이 공지 기술에서 보다 빠르게, 예컨대 15분 미만에 완결될 수 있다. 변성시간과 어닐링 시간을 최소화함으로써 신속히 싸이클링된 증폭의 특이성 및 수율이 이전보다 개선된다. 게다가, 신속한 열전달 촉진 뿐만 아니라 광학적으로 투명한 모세관 튜브의 사용은 본 발명에 따라서 DNA 증폭의 연속 형광 모니터링을 가능하게 한다.As described above, the polymerase chain reaction can be carried out quickly. The required number of temperature cycles can be completed faster in the known art, eg, in less than 15 minutes, using the apparatus and method described. By minimizing denaturation time and annealing time, the specificity and yield of rapidly cycled amplification is improved than before. In addition, the use of optically clear capillary tubes as well as rapid heat transfer promotion allows for continuous fluorescence monitoring of DNA amplification according to the present invention.

형광 프로브는 DNA 증폭을 탐지 및 모니터링 하는데 사용될 수 있다. 유용한 프로브는 이중쇄 DNA 특이성 염료와 서열특이성 프로브를 포함한다. 삽입물질 에티듐 브로마이드를 사용하여 모세관튜브 또는 마이크로 튜브에서 증폭후 UV활성화된 적색 형광이 증가한다. 서열 특이성 형광 탐지는 올리고누클레오타이드 교합 프로브를 사용하여 가능하다. 예컨대, 이중-라벨링된 형광제/로오다민 프로브는 폴리메라제 신장동안 5'-엑소누클레아제 활성에 의해 절단되고 형광단을 분리하여 형광제/로오다민 형광비를 증가시킬 수 있다.Fluorescent probes can be used to detect and monitor DNA amplification. Useful probes include double stranded DNA specific dyes and sequence specific probes. UV-activated red fluorescence is increased after amplification in capillary or microtubes using the insert ethidium bromide. Sequence specific fluorescence detection is possible using oligonucleotide occlusion probes. For example, a double-labeled fluorescent / rhoodamine probe can be cleaved by 5′-exonuclease activity during polymerase extension and separate fluorophores to increase the fluorescent / rhoodamine fluorescence ratio.

온도 싸이클링 완료후 생성물 축적을 모니터링하여 싸이클마다 한 번 또는 각 싸이클내에서 연속으로 형광이 측정될 수 있다. 본 발명과 대비하여 구매가능한 서열 특이성 방법은 종말점 분석으로 제한된다.After completion of the temperature cycling, the product accumulation can be monitored to measure fluorescence once per cycle or continuously within each cycle. Compared to the present invention, commercially available sequence specificity methods are limited to endpoint analysis.

본 발명은 초기 템플레이트 복제물 갯수의 정량화를 위해 싸이클마다 모니터링을 할 수 있다. 이러한 모니터링을 수행하기 위해서 각 싸이클의 신장 또는 조합된 어닐링/신장 단계동안 형광이 획득되고 생성물 농도와 관련된다. 삽입물질 YO-PRO-1을 사용하여 헤파티스 C RNA 정량분석이 당해분야에 공지된다. 형광 삽입물질의 존재하에서 PCR에 의한 헤파티스 C 바이러스 RNA의 균질 정량분석(Anal. Biochem. 229:207-213, Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, Y. Mitoma, 1995)참조. 본 발명 이전에는 각 싸이클내에서 연속 형광 모니터링이 효과적이고 정확하게 수행되지 못했다.The present invention can be monitored cycle by cycle for quantification of the initial template copy number. To perform this monitoring, fluorescence is obtained and related to product concentration during the stretching or combined annealing / extension steps of each cycle. Hepatis C RNA quantitation using insert YO-PRO-1 is known in the art. Homogeneous quantification of Hepatis C virus RNA by PCR in the presence of fluorescent inserts (Anal. Biochem. 229: 207-213, Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, Y. Mitoma, 1995). Prior to the present invention, continuous fluorescence monitoring was not performed effectively and accurately within each cycle.

연속 형광 모니터링을 제공하는 2-칼라 형광 광학과 집적된 신속한 온도 싸이클러가 발표된다. DNA 증폭에 선호되는 3개의 형광 기술이 본 발명의 특수예로서 제공된다. 당해분야 숙련자는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형광기술에서 에티듐 브로마이드의 사용에 익숙할 것이다. SYBR Green I(Molecular Probes of Eugene, Oregon)이 이중쇄 특이성 염료로 사용된다. 본 발명에 따라서 시간, 온도 및 형광이 200msec마다 획득된다. 이러한 데이타는 기존의 장치 및 방법으로는 얻을 수 없는 신속한 싸이클링동안 생성물 변성, 재어닐링 및 신장의 세부사항을 나타낸다. 게다가, 5'-엑소누클레아제 퀀칭 프로브를 사용하여 수득되는 결과는 이중쇄 특이성 형광 사용으로 수득된 결과와 비교된다. 게다가, 형광제로 부터 공지된 시아닌 염료 Cy5으로의 공명 에너지 전달과 인접한 교합 프로브에 기초한 신규한 형광 스킴의 사용이 발표된다. 이소티오 시아네이트 기를 함유한 시아닌 염료 라벨링 시약(Cytometry 10:11-19, Mujumdar, R.B., L.A. Ernst, S.R. Mujumdar, A.S. Waggoner, 1989).A rapid temperature cycler integrated with two-color fluorescence optics providing continuous fluorescence monitoring is presented. Three fluorescence techniques preferred for DNA amplification are provided as special examples of the present invention. One skilled in the art will be familiar with the use of ethidium bromide in fluorescence techniques that may be used in accordance with the present invention. SYBR Green I (Molecular Probes of Eugene, Oregon) is used as the double chain specific dye. According to the invention time, temperature and fluorescence are obtained every 200 msec. These data show details of product denaturation, reannealing and elongation during rapid cycling not available with conventional apparatus and methods. In addition, the results obtained using the 5'-exonuclease quenching probe are compared with the results obtained using the double chain specific fluorescence. In addition, the use of novel fluorescent schemes based on the occlusal probe adjacent to the resonance energy transfer from the fluorescent agent to the known cyanine dye Cy5 is disclosed. Cyanine dye labeling reagent containing isothiocyanate groups (Cytometry 10: 11-19, Mujumdar, R.B., L.A. Ernst, S.R. Mujumdar, A.S.Waggoner, 1989).

DNA 증폭을 겪고 있는 다중샘플의 싸이클마다 한 번 모니터링은 강력한 정량도구이다. 한 싸이클내에서 연속 모니터링은 프로브 형광의 성질을 식별하여 공지기술에서는 얻을 수 없는 DNA 증폭 메카니즘에 대한 직관을 제공한다.Monitoring once per cycle of multiple samples undergoing DNA amplification is a powerful quantitative tool. Continuous monitoring within one cycle identifies the nature of the probe fluorescence and provides an intuition for the DNA amplification mechanism not available in the prior art.

도 11 에서, 형광을 탐지하는 온도 싸이클러(300)가 개략적으로 도시된다. 고온 공기원(302)은 1600와트 가열코일과 팬을 포함한 시판장치이다. 냉각 공기원(304)은 Dayton(Niles, Illinois)으로 부터 모델번호 4C006B로 구매가능한 2200rpm 송풍기이다. 냉각 공기원(304)은 주변공기를 보통 제공하지만 주변공기보다 낮은 온도의 유체를 제공하는 수단을 활용할 수도 있다. 도 11 에서, 2.5㎝ 직경의 주름진 흑색 나일론 튜브(306, 308)가 고온 공기원(302)과 냉각 공기원(304)을 샘플챔버(310)에 연결시키는데 사용된다. 통기구(312)와 방출팬(314)을 샘플챔버(310) 밖으로 공기를 제거한다. 샘플챔버(310)의 내부는 외부의 빛으로 부터 차단된다.In FIG. 11, a temperature cycler 300 for detecting fluorescence is shown schematically. The hot air source 302 is a commercially available device including a 1600 watt heating coil and a fan. Cooling air source 304 is a 2200 rpm blower available from Dayton (Niles, Illinois) under model number 4C006B. Cooling air source 304 may provide a means for providing a fluid at a lower temperature than the ambient air, although normally providing ambient air. In FIG. 11, 2.5 cm diameter corrugated black nylon tubes 306, 308 are used to connect the hot air source 302 and the cooling air source 304 to the sample chamber 310. The vent 312 and the discharge fan 314 remove air from the sample chamber 310. The interior of the sample chamber 310 is blocked from external light.

샘플챔버(310)내의 샘플온도는 Idaho Technology(Idaho Falls, Idaho)로 부터 모델번호 1844로 구매가능하며 모세관 튜브에 담긴 샘플의 열응답에 일치되는 관형 금속외장 열전쌍(316)에 의해 모니터링된다. 샘플챔버(310)내의 온도 균일성은 중앙 샘플챔버팬(318)에 의해 달성된다. 샘플 챔버팬은 Idaho Technology로 부터 모델번호 1862로 구매가능한 1.7×11㎝ 팬날개와 샘플챔버(310)내에서 800 내지 1000m/분의 공기속도를 일으키는 모터(Idaho Technology, 모델번호 1861)를 포함한다.The sample temperature in the sample chamber 310 is available from Idaho Technology (Idaho Falls, Idaho) under model number 1844 and is monitored by a tubular metallic sheath thermocouple 316 that matches the thermal response of the sample contained in the capillary tube. Temperature uniformity in the sample chamber 310 is achieved by the central sample chamber pan 318. The sample chamber pan includes a 1.7 × 11 cm fan blade, available from Idaho Technology, model number 1862, and a motor (Idaho Technology, model number 1861) which produces an air velocity of 800 to 1000 m / min in the sample chamber 310. .

샘플챔버(310)내에 모세관 튜브(320)에 담긴 복수의 샘플이 회전가능한 카루셀(322)에 수직으로 위치된다. 카루셀(322)은 14㎝ 직경을 가지며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)에 의해 제어되는 400스텝/회전 스테핑 모터(324)에 회전된다. 스테핑 모터(324)는 New England Affiliated Technologies(Lawrence, Massachusetts)로 부터 모델번호 2198364로 구매가능하며 마이크로스테핑 구동 모듈(326)은 New England Affiliated Technologies로 부터 모델번호 MDM7로 구매가능한 것으로서, 카루셀(322) 회전당 12,800 스텝을 제공한다.A plurality of samples contained in the capillary tube 320 in the sample chamber 310 are positioned perpendicular to the rotatable carousel 322. The carousel 322 is rotated by a 400 step / rotation stepping motor 324 having a 14 cm diameter and controlled by the microstepping drive module 326. Stepping motor 324 is available from New England Affiliated Technologies (Lawrence, Massachusetts) under model number 2198364 and microstepping drive module 326 is available from New England Affiliated Technologies under model number MDM7, carousel (322). 12,800 steps per revolution.

도 11 에서, 형광 활성화 소스(328)가 제공된다. 형광 활성화 소스(328)는 타원형 반사기로 촛점이 잡히는 75와트 크세논 아아크 소스이며, Photon Technology International (South Brunswick, New Jersey)로 부터 모델번호 A1010으로 f/2.5 타원형 반사기와 함께 구매할 수 있다. 혹은, 광방출 다이오드가 사용될 수 있다. 형광 활성화 소스(328)에 의해 방출된 빛은 Rolyn(Covina, California)로 부터 모델번호 75.0125로 구매가능한 홍채(334)를 사용하여 2㎜까지 촛점이 잡힌다. 형광 활성화 소스(328)로 부터 방출된 빛은 Rolyn으로 부터 모델번호 60.4400으로 구매가능한 저온 거울(330)상에 입사하고 Rolyn으로 부터 모델번호 65.3130으로 구매가능한 열흡수 유리(332)를 통과한다. Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 렌즈(336)를 통해 조준된 후 Omega Optical (Brattleboro, Vermont)로 부터 모델번호 470RDF40으로 구매가능한 450-490㎚ 대역 간섭 필터(338), Rolyn으로 부터 모델번호 10.0260으로 구매가능한 평철 촛점 렌즈(340), Omega로 부터 구매가능한 1㎜ 실리카 창(342)을 통과한다. 기술된 활성화 경로를 사용하여 모세관 샘플 튜브(320A)의 5-7㎜ 섹션이 조사된다.In FIG. 11, a fluorescent activation source 328 is provided. Fluorescence activated source 328 is a 75 watt xenon arc source focused with an elliptical reflector and is available from Photon Technology International (South Brunswick, New Jersey) with an f / 2.5 elliptical reflector under model number A1010. Alternatively, a light emitting diode can be used. The light emitted by the fluorescent activation source 328 is focused up to 2 mm using the iris 334 available from Rolyn (Covina, California), model number 75.0125. Light emitted from the fluorescent activation source 328 is incident on the low temperature mirror 330, available from Rolyn, model number 60.4400, and passes through heat absorbing glass 332, available from Rolyn, model number 65.3130. 450-490 nm band interference filter (338), available from Omega Optical (Brattleboro, Vermont) and model number 470RDF40, after aiming through flat lens (336), available from Rolyn, model number 10.0260, model number from Rolyn It passes through a flat iron focus lens 340, available at 10.0260, a 1 mm silica window 342, available from Omega. A 5-7 mm section of capillary sample tube 320A is irradiated using the described activation pathway.

샘플(320A)로 부터 방출된 형광을 수집하기 위한 수집 경로가 도 11 을 참조로 기술될 것이다. 수집 경로의 광학성분은 다른 광학 성분상의 응축을 막기 위해서도 포함되는 1㎜ 실리카 유리(344)를 포함한다. 방출된 형광을 2×10㎜ 슬릿(348)에 촛점을 잡게 하며 Rolyn으로 부터 모델번호 17.1175로 구매가능한 비구면 렌즈(346A, 346B)가 대향하며, 슬릿은 공간 필터로서 기능을 하는 X-선 필름을 절단하여 제조된다. 공간 필터(348) 이후에 방출된 형광은 전자 셔터 제어기(352)를 통해 작동하는 35㎜ 전자 셔터에 입사한다. 35㎜ 전자셔터(350)는 Uniblitz 셔터 모델번호 VS35이며 전자 셔터 제어기(352)는 드라이버 모델번호 D122로서, 둘다 Vincent Associates (Rochester, New York)으로 부터 구매가능하다. Rolyn 모델번호 17.1175 조준 비구면 렌즈(354)가 제공된다.A collection path for collecting fluorescence emitted from sample 320A will be described with reference to FIG. 11. The optical components of the collection path include 1 mm silica glass 344, which is also included to prevent condensation on other optical components. The emitted fluorescence focuses on the 2 × 10 mm slit 348 and faces the aspherical lenses 346A, 346B, available from Rolyn, model number 17.1175, which slit the X-ray film which functions as a spatial filter. It is made by cutting. The fluorescence emitted after the spatial filter 348 enters the 35 mm electronic shutter operating through the electronic shutter controller 352. The 35 mm electronic shutter 350 is Uniblitz shutter model number VS35 and the electronic shutter controller 352 is driver model number D122, both available from Vincent Associates (Rochester, New York). A Rolyn model number 17.1175 aiming aspherical lens 354 is provided.

SYBR Green I 방출의 탐지가 요구될 때 필터(356)가 포함된다. 필터(356)는 Omega로 부터 모델 550RDF60으로 구매가능한 520-580㎚ 대역 통과 필터이며 단색 습득을 위해 사용된다. 다른 방출의 탐지를 위해 2색 필터(358)과 파장 필터(358A, 358B)의 조합이 필터블럭에 사용된다. 형광제와 로오다민 방출의 분리를 위해 Omega로 부터 모델 560 DRLP로 구매가능한 560㎚ 통과 2색 필터와 Omega로 부터 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용), Omega 모델 660DF40으로 구매가능한 580-620㎚ 대역 통과 필터(358B)(로오다민 탐지용)로 구성된 2색 필터(358)이 사용된다. 형광제와 Cy5 방출의 분리를 위해 2색 필터(358)는 Omega 모델 590 DRLP로 구매가능한 590㎚ 대역 통과 2색 필터와 Omega 모델 535DF30으로 구매가능한 520-550㎚ 대역 통과 필터(358A)(형광제 탐지용)와 Omega 모델 670DF20으로 구매가능한 660-680㎚ 대역 통과 필터(358B)(Cy5 탐지용)가 사용된다.Filter 356 is included when detection of SYBR Green I emissions is required. Filter 356 is a 520-580 nm bandpass filter available as a model 550RDF60 from Omega and is used for monochromatic acquisition. A combination of two color filters 358 and wavelength filters 358A, 358B is used in the filter block to detect other emissions. 560 nm pass-through two-color filter available as model 560 DRLP from Omega and 520-550 nm band pass filter (358A) available as model 535DF30 from Omega for separation of fluorescent and rhodaramine emission (for fluorescence detection) A two-color filter 358 consisting of a 580-620 nm band pass filter 358B (for rhodamine detection), available as an Omega model 660DF40, is used. For separation of fluorescent and Cy5 emission, the dichroic filter 358 is a 590nm bandpass bicolor filter available with the Omega model 590 DRLP and a 520-550nm bandpass filter 358A available with the Omega model 535DF30 (fluorescent agent). Detection) and a 660-680 nm bandpass filter 358B (for Cy5 detection), available with the Omega Model 670DF20.

도 11 에서, 필터(358) 이후에 형광은 Edmund(Barrington, New Jersey)으로 부터 모델 32970으로 구매가능한 두 개의 평철 렌즈(360A, 360B)를 통해 광전 배중관(362A, 362B)상에 촛점이 잡힌다. 광전 배증관(362A, 362B)은 Hamamatsu (Middlesex, New Jersey)로 부터 모델 R928로 구매가능하며 Photon Technology International으로 부터 모델 714로 구매가능한 하우징에 수용된다. PMT 및 데이타 획득제어 모듈(364)이 또한 제공된다. 당해분야에 공지된 수동 PMT 셔터(366A, 366B)가 제공된다.In FIG. 11, the fluorescence after the filter 358 is focused on the photovoltaic tubes 362A and 362B through two flat iron lenses 360A and 360B available from Edmund (Barrington, New Jersey) as model 32970. . Photomultipliers 362A, 362B are available in Hamamatsu (Middlesex, New Jersey) as models R928 and housed in housings as models 714 from Photon Technology International. PMT and data acquisition control module 364 is also provided. Manual PMT shutters 366A, 366B known in the art are provided.

앞서 기술된 광학 성분은 5㎝ 직경을 가지며 Rolyn으로 부터 모델 90.0190으로 구매가능한 5㎝ 범용 렌즈 장착부에 장착된다. 필요한 구조성분은 black Delrin으로 부터 기계가공된다.The previously described optical component is 5 cm in diameter and is mounted on a 5 cm general purpose lens mount available as a model 90.0190 from Rolyn. The necessary structural components are machined from black Delrin.

도 11 에 도시된 장치를 사용하여 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl2, 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민, 0.5μM 프라이머, 0.5mM 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트, 5㎕ 샘플당 Tag 폴리메라제 0.2U에서 DNA 증폭이 수행된다. 인체 유전자 DNA(1분간 끓여서 변성된) 또는 정제된 증폭 생성물이 DNA 템플레이트로 사용된다. 정제된 증폭 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 수득된다[Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), S.L. Berger, A.R. Kimmel (Eds.), 대규모 및 소규모 페놀 추출 및 핵산의 침전(33-48)(Wallace, D.M. 1997) 참조]. 이어서, Centricon 30 마이크로농축기(Amicon, Danvers, MA로 부터 구매가능)를 통해 반복된 세척에 의해 프라이머가 제거된다. 템플레이트 농도는 260㎚에서 흡수에 의해 결정된다. 템플레이트의 A260/A280 비는 1.7 이상이다.50 mM Tris, pH 8.5 (25 ° C.), 3 mM MgCl 2 , 500 μg / ml bovine serum albumin, 0.5 μM primer, 0.5 mM deoxynucleoside triphosphate, 5 μL Tag per device, using the device shown in FIG. 11. DNA amplification is performed at 0.2 U of polymerase. Human gene DNA (denatured by boiling for 1 minute) or purified amplification products are used as DNA templates. Purified amplification products are obtained by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation [Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), SL Berger, AR Kimmel (Eds.), Large and small scale phenol extraction and nucleic acid Precipitation (33-48) (Wallace, DM 1997)]. The primer is then removed by repeated washing through a Centricon 30 microconcentrator (commercially available from Amicon, Danvers, MA). Template concentration is determined by absorption at 260 nm. The template's A 260 / A 280 ratio is greater than 1.7.

프라이머는 표준 포스포아미다이트 화학, 예컨대 Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, NJ)에 의해 합성된다. 헤파티스 B 표면 항원 유전자의 180 염기쌍 조각은 프라이머 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1)와 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO:2) (Genbank sequence HVHEPB)를 사용하여 증폭된다. SYBR Green I은 몰레큘라 프로브(Eugene, Oregon)으로 부터 수득된다. β-액틴 프라이머와 형광제/로오다민 이중 프로브는 Perkin Elmer (Foster City, California)로 부터 모델 N808-0230으로 획득된다. 인체 β-글로블린 프라이머 RS 42/KM29(536 염기쌍) 및 PC03/PC04(110 염기쌍)은 고온공기를 사용한 모세관 튜브에서 자동화된 PCR, Nucl. Acids. Res. 17:4353-4357, (Wittwer, C.T., G.C. Fillmore, D.R. Hillyard)에 기술된다.Primers are synthesized by standard phosphoramidite chemistry such as Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, NJ). 180 base pair fragments of Hepatis B surface antigen gene were amplified using primers 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2) (Genbank sequence HVHEPB) do. SYBR Green I is obtained from a molecular probe (Eugene, Oregon). β-actin primers and fluorescent / rhoodamine double probes are obtained as model N808-0230 from Perkin Elmer (Foster City, California). Human β-globulin primers RS 42 / KM29 (536 base pairs) and PC03 / PC04 (110 base pairs) were prepared by automated PCR, Nucl. Acids. Res. 17: 4353-4357, (Wittwer, C.T., G.C.Fillmore, D.R.Hillyard).

단일 라벨링된 프로브5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-fluoresceinSingle labeled probe 5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-fluorescein

-3' (SEQ ID NO:3)와 5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-phosphate-3' (SEQ ID NO:4)은 형광제 포스포아미다이트(Glen Research (Sterling, Virginia)로 부터 모델 10-1963으로 구매가능한), Cy5 포스포아미다이트(Pharmacia로 부터 모델 27-1801-02로 구매가능)과 화학적 인산화 작용제(Glen Research로 부터 모델 10-1900)으로 구매가능)를 사용하여 합성된다. 이러한 인접한 프로브는 동일한 DNA쇄상에서 PC03/PC04 β-글로블린 프라이머쌍에 내부적으로 교합하고 한 개의 염기쌍만큼 분리된다. 프로브는 역상 C-18 HPLC에 의해 정제되고 균일성은 폴리아크릴아미드 전기영동 및 흡수성(A260과 형광단의 최대 흡수)에 의해 검사된다. 교합 프로브(β-액틴 및 β-글로블린)가 0.2μM로 각각 사용된다.-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-phosphate-3' (SEQ ID NO: 4) were model 10-based from fluorescent researcher (Glen Research (Sterling, Virginia) 1963), Cy5 phosphoramidite (commercially available from Pharmacia as model 27-1801-02) and a chemical phosphorylation agent (commercially available from Glen Research as model 10-1900). These adjacent probes internally occupy PC03 / PC04 β-globulin primer pairs on the same DNA strand and are separated by one base pair. The probe is purified by reversed phase C-18 HPLC and uniformity is checked by polyacrylamide electrophoresis and absorption (maximum absorption of A 260 and fluorophores). Occlusal probes (β-actin and β-globulin) were used at 0.2 μM, respectively.

5㎕의 증폭샘플이 모세관 튜브(230)에 충진된다. 모세관 샘플 튜브는 Idaho Technology로 부터 모델 1705로 구매가능한 1.02㎜ 외경과 0.56㎜ 내경을 가진 튜브이다. 충진후 모세관 샘플 튜브는 부탄 화염으로 밀폐된다. 모세관 샘플 튜브는 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)의 카루셀(322)에 들어가기 이전에 광학등급 메탄올로 세정된다.5 μl of amplified sample is filled into the capillary tube 230. The capillary sample tube is a 1.02 mm outer diameter and 0.56 mm inner diameter, available as model 1705 from Idaho Technology. After filling, the capillary sample tube is closed with butane flame. The capillary sample tube is cleaned with optical grade methanol prior to entering the carousel 322 of the rapid temperature cycler 300 for fluorescence detection.

도 11 에 도시된 성분의 제어는 LabView(National Instruments, Austin, Texas)으로 알려진 그래픽 프로그램 언어와 120㎒의 클록속도로 작동하는 80486 Intel 마이크로프로세서를 사용하는 PC상용성 컴퓨터(366)에서 12-비트 다기능 입/출력 카드(National Instruments, AT-MIO-E2)를 사용하여 이루어진다. 입/출력 카드상의 아날로그 출력 채널은 민감도 제어, 즉 각 광전 배증관(362A, B)의 PMT 전압을 제어하는데 사용된다. 입/출력 카드상의 아날로그 입력채널은 광전 배증관(362A, B)으로 부터 신호를 수신한다. PC상용성 컴퓨터는 입/출력 카드를 통해서 카루셀의 운동 방향, 위치 및 속도를 제어한다. 다중 모세관 샘플튜브가 충진될 때 카루셀(322)은 100msec동안 모니터링 위치에서 각 모세관 샘플 튜브(320)를 순차적으로 위치선정한다. 단일 모세관 샘플튜브(320A)의 연속 모니터링 동안 데이타는 200mses마다 평균되고 습득한다. 온도, 시간 및 형광 2채널은 싸이클 횟수대 형광과 온도대 형광 플롯으로 표시된다. 카루셀은 최대 형광 및 신호가 습득되는 곳에 위치되어야 한다. 단일 모세관 샘플 튜브(320A)가 분석될 때 신호는 200msec마다 습득되며 광전 배증관(364)상의 적분시간상수는 50msec로 설정된다. 다중 광전배증관(366A, B)이 사용될 때 시간상수는 0.5msec로 설정되고 각 모세관 샘플튜브(320)가 각 채널에 최대 형광을 제공하는 정확한 위치를 선정하기 위해서 카루셀이 다시 회전한다. 최대 형광이 수득되는 지점에 모세관 샘플 튜브(320A)가 위치선정된 이후에 각 PMT(362A, B)의 민감도가 조절되고 모든 모세관 샘플튜브(320)의 위치를 계산 및 선정하기 위해서 카루셀이 다시 한 번 회전한다. 100msec동안 모니터링 위치에서 카루셀(322)상에 각 모세관 샘플 튜브(320)를 위치시킴으로써 신장동안 각 증폭싸이클마다 신호가 수득된다. Systronics(Salt Lake City, Utah)로부터 BCI51로 구매가능한 8051 크로스 컴파일러와 Dallas development system(Systronics로 부터 DPB2로 구매가능한)을 사용하여 Idaho Technology로 부터 Rapidcycler로 구매가능한 신속한 온도 싸이클러로 부터 온도제어 프로그램이 변경된다.The control of the components shown in FIG. 11 is 12-bit in a PC compatible computer 366 using a graphics programming language known as LabView (National Instruments, Austin, Texas) and an 80486 Intel microprocessor operating at a clock rate of 120 MHz. This is accomplished using a multifunction input / output card (National Instruments, AT-MIO-E2). The analog output channel on the input / output card is used for sensitivity control, i.e. for controlling the PMT voltage of each photomultiplier 362A, B. The analog input channel on the input / output card receives a signal from the photomultipliers 362A, B. PC compatibility computers control the carousel's direction of movement, position and speed through input / output cards. When multiple capillary sample tubes are filled, the carousel 322 sequentially positions each capillary sample tube 320 at the monitoring position for 100 msec. During continuous monitoring of a single capillary sample tube 320A, data is averaged and learned every 200 mses. Temperature, time, and fluorescence two channels are represented by cycle number versus fluorescence and temperature versus fluorescence plots. Carousel should be located where maximum fluorescence and signal are acquired. When a single capillary sample tube 320A is analyzed, the signal is acquired every 200 msec and the integral time constant on the photomultiplier tube 364 is set to 50 msec. When multiple photomultipliers 366A and B are used, the time constant is set to 0.5 msec and the carousel rotates again to select the correct position where each capillary sample tube 320 provides maximum fluorescence in each channel. After the capillary sample tube 320A has been positioned at the point where maximum fluorescence is obtained, the sensitivity of each PMT 362A, B is adjusted and the carousel is recalculated to calculate and select the positions of all capillary sample tubes 320. Rotate once. A signal is obtained for each amplification cycle during stretching by placing each capillary sample tube 320 on the carousel 322 at the monitoring position for 100 msec. Using the 8051 cross compiler (available as BCI51 from Systronics (Salt Lake City, Utah)) and the Dallas development system (available as DPB2 from Systronics), the temperature control program is available from the rapid temperature cycler available as Rapidcycler from Idaho Technology. Is changed.

사실상, 형광 탐지용 신속 온도 싸이클러(300)의 온도 응답은 도 11a 에서 시간대 온도 차트로 표시된 20-30초 싸이클(10-15분후에 30싸이클)을 허용하는 도 8a-b 의 장치로 수득되는 응답과 유사하다. 2중쇄 특이성 형광 염료가 증폭동안 존재할 경우에 더 많은 2중쇄 생성물이 형성되므로 형광이 증가한다. 특이성 DNA 서열의 동시증폭 및 탐지, Bio/Technology 10:413-417 (Higuchi, R., G. Dollinger, P.S. Walsh, R. Griffith, 1992) 참조.In fact, the temperature response of the fast temperature cycler 300 for fluorescence detection is obtained with the apparatus of Figs. 8A-B allowing a 20-30 second cycle (30 cycles after 10-15 minutes), indicated by the time zone temperature chart in Fig. 11A. Similar to the response. If double chain specific fluorescent dyes are present during amplification, more double chain products are formed, resulting in increased fluorescence. Coamplification and Detection of Specific DNA Sequences, See Bio / Technology 10: 413-417 (Higuchi, R., G. Dollinger, P. S. Walsh, R. Griffith, 1992).

형광은 온도 싸이클링동안 온도와 교란 효과의 영향을 받으며, 이것은 일정한 신장온도에서 싸이클마다 형광을 고려함으로써 제거된다. 그러나, 신속한 싸이클 증폭동안 200msec마다 온도, 시간 및 형광이 수득된다면 도 12 에 표시된 공간에 3차원 나선이 나타난다. 도 12 에 표시된 3차원 곡선은 도 12 에서 시간대 온도, 시간대 형광, 온도대 형광의 2차원 플롯으로 투영된다. 도 12 의 시간대 온도 투영은 싸이클마다 반복되고 도 11a 와 동일한 정보를 제공한다. 형광은 온도에 대해 반비례하므로 매 싸이클마다 도 12 에 도시된 시간대 온도 투영은 시간대 온도 플롯의 거울 영상이다. 생성물이 축적됨에 따라 2중쇄 생성물의 경우 형광이 모든 온도에서 증가한다. 그러나 변성온도에서 형광은 기준선으로 복귀하는데, 그 이유는 단일쇄 DNA만이 존재하기 때문이다.Fluorescence is affected by temperature and disturbing effects during temperature cycling, which is eliminated by considering fluorescence per cycle at a constant stretching temperature. However, if temperature, time, and fluorescence are obtained every 200 msec during rapid cycle amplification, three-dimensional helix appears in the space shown in FIG. The three-dimensional curve shown in FIG. 12 is projected in FIG. 12 as a two-dimensional plot of time zone temperature, time zone fluorescence, and temperature zone fluorescence. The time zone temperature projection of FIG. 12 is repeated from cycle to cycle and provides the same information as in FIG. 11A. Since fluorescence is inversely proportional to temperature, the time zone temperature projection shown in FIG. 12 for each cycle is a mirror image of the time zone temperature plot. As the product accumulates the fluorescence increases for all double chain products. However, at denaturation temperatures fluorescence returns to baseline because only single-stranded DNA is present.

도 12 에 도시된 2중쇄 염료의 온도대 형광 투영도는 시간축을 제거하고 DNA 증폭동안 쇄 상태의 온도 종속성을 보여준다. 도 12 에 도시된 온도대 형광 투영도는 헤파티스 B 바이러스 DNA의 180 염기쌍 조각에 대한 것이다.The temperature versus fluorescence projection of the double chain dye shown in FIG. 12 removes the time base and shows the temperature dependence of the chain state during DNA amplification. The temperature band fluorescence projections shown in FIG. 12 are for 180 base pair fragments of Hepatis B virus DNA.

도 13 에 도시된 온도대 형광 투영도는 인체 β-글로블린 DNA의 536 염기쌍 조각에 대한 것이다. 도 13 에 표시된 초기 싸이클은 동일하게 나타나며 저온에서 형광이 비선형으로 증가한다. 증폭이 진행함에 따라 이후 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에 상승하는 루우프로서 나타나는데 이것은 상당한 히스테리시스를 보여준다. 즉, 가열동안 관찰되는 형광이 냉각동안 형광보다 크다. 샘플이 가열될 때 형광은 변성이 나타날때까지 높다(형광에서 예리한 강하). 샘플이 변성온도로 부터 어닐링 온도로 냉각될 때 2중쇄 신호는 빠르게 증가한다. 형광은 신장동안 계속 증가하며 온도는 일정하게 유지된다.The temperature band fluorescence projections shown in FIG. 13 are for 536 base pair fragments of human β-globulin DNA. The initial cycles shown in FIG. 13 appear identical and fluorescence increases nonlinearly at low temperatures. As the amplification proceeds, the cycle then appears as a rising loop between the annealing and denaturation temperatures, which shows considerable hysteresis. That is, the fluorescence observed during heating is greater than the fluorescence during cooling. When the sample is heated the fluorescence is high until sharp degeneration (sharp drop in fluorescence). The double chain signal increases rapidly when the sample cools from denaturation temperature to annealing temperature. Fluorescence continues to increase during elongation and the temperature remains constant.

다중 샘플이 SYBR Green I에 대해 싸이클마다 모니터링될 때 초기 템플레이트 농도중 107-108 범위가 도 14 에 표시된다. 데이타가 각 모세관 샘플튜브(320)의 최대형광 비율로 정규화될 때 100개의 초기 복제물이 명백히 10개의 복제물과 분리된다. 그러나, 1개의 복제물과 10개의 복제물간의 차이는 적으며 모세관 샘플튜브(320)마다 0과 1개의 평균 복제물간의 차이는 없다.When multiple samples are monitored per cycle for SYBR Green I, the range of 10 7 -10 8 of the initial template concentrations is shown in FIG. 14. When the data is normalized to the maximum fluorescence rate of each capillary sample tube 320, 100 initial replicates are clearly separated from 10 replicates. However, the difference between one replica and ten replicas is small and there is no difference between zero and one average replica per capillary sample tube 320.

이에 비해서 서열 특이성 프로브는 도 15 의 플롯과 유사한 동적 범위를 가지지만 단일한 초기 템플레이트 복제물과 음의 비교를 구별해낸다. 5'-엑소누클레아제 프로브로 신호 발생은 DNA 합성에 종속될 뿐만 아니라 이중 라벨링된 프로브의 형광단 사이에 교합과 가수분해를 필요로 한다. 이러한 가수분해는 퀀칭을 감소시키며 로오다민에 대한 형광제의 형광비가 증가한다. 2중쇄 염료에서 나오는 형광은 과도한 싸이클링으로 평균화 되지만 엑소누클레아제 프로브에서 나오는 신호는 각 싸이클에서 계속 증가한다. 순 생성물이 합성되지 않을지라도 프로브 교합과 가수분해는 계속 일어난다. 템플레이트 복제물 갯수가 103 이하로 감소하면 신호의 세기는 감소하지만 음의 비교 신호가 안정적이므로 적은 수의 복제물도 정량될 수 있다.In contrast, sequence specificity probes have a dynamic range similar to the plot of FIG. 15 but distinguish negative comparisons from a single initial template copy. Signal generation with 5′-exonuclease probes is not only dependent on DNA synthesis but also requires occlusion and hydrolysis between fluorophores of double labeled probes. This hydrolysis reduces quenching and increases the fluorescence ratio of the fluorescent agent to rhodamine. Fluorescence from the double chain dye is averaged by excessive cycling, but the signal from the exonuclease probe continues to increase in each cycle. Even though no net product is synthesized, probe bite and hydrolysis continue. Decreasing the number of template copies below 10 3 reduces the signal strength, but a small number of copies can be quantified because the negative comparison signal is stable.

5'-엑소누클레아제 프로브의 온도대 형광 플롯은 프로브 가수분해가 신호발생 메카니즘임을 확인시켜 준다. 도 16 에서, 2-온도 싸이클링의 온도대 형광 플롯이 β-액틴 엑소누클레아제 프로브에 대해 도시된다. 싸이클마다 형광비는 온도에 따라 선형으로 변하며 히스테리시스는 거의 없다. 프로브 가수분해가 일어날 때 어닐링/신장 단계동안 각 싸이클마다 신호가 증가한다. 형광제와 로오다민의 형광이 온도 증가시 감소할지라도 변화율은 로오다민이 더 커서 온도 증가시 비율이 증가한다. 5'-엑소누클레아제 프로브에서는 온도 종속적 교합 효과가 명백하지 않다. 도 16a 는 도 18 에 따라서 다양한 초기 템플레이트 복제물 갯수에 대한 싸이클 횟수대 형광의 플롯이다.Temperature versus fluorescence plots of 5′-exonuclease probes confirm that probe hydrolysis is a signaling mechanism. In FIG. 16, a temperature band fluorescence plot of 2-temperature cycling is shown for β-actin exonuclease probe. In each cycle, the fluorescence ratio changes linearly with temperature, with little hysteresis. When probe hydrolysis occurs, the signal increases for each cycle during the annealing / extension phase. Although the fluorescence of the fluorescent agent and rhodamine decreases with increasing temperature, the rate of change is higher because of the larger rhodamine. The temperature dependent occlusion effect is not apparent with the 5'-exonuclease probe. FIG. 16A is a plot of cycle number versus fluorescence for various initial template copy numbers according to FIG. 18. FIG.

이에 반하여, 형광 신호가 교합에만 의존할 때 도 17 에 도시된 바와 같이 2-온도 싸이클링동안 온도대 형광비 플롯은 다양한 패턴을 보이며 히스테리시스가 명백하다. 2개의 인접한 교합 프로브, 형광제로 3' 라벨링된 상류 프로브와 Cy5으로 5'라벨링된 하류 프로브가 존재한다. 이 프로브는 1개의 염기쌍만큼 분리된다. 어닐링/신장 단계동안 프로브는 축적생성과 Cy5, 형광제로 교합하여서 형광비가 증가한다. 생성물 변성 온도까지 가열하는 동안 프로브는 65 내지 75℃에서 해리되어서 기준 레벨까지 형광비가 복귀된다. 교합동안 형광비의 변화는 공명에너지 전달로 부터 Cy5 형광의 증가 때문이다.In contrast, when the fluorescence signal depends only on the occlusion, the temperature-to-fluorescence ratio plot during two-temperature cycling shows various patterns and hysteresis is evident as shown in FIG. 17. There are two adjacent occlusal probes, an upstream probe labeled 3 'with fluorescent and a downstream probe labeled 5' with Cy5. This probe is separated by one base pair. During the annealing / extension phase, the probes accumulate and associate with Cy5, a fluorescent agent, increasing the fluorescence ratio. During heating to the product denaturation temperature the probe dissociates at 65-75 ° C. and the fluorescence ratio is returned to the reference level. The change in fluorescence ratio during occlusion is due to the increase in Cy5 fluorescence from resonance energy transfer.

DNA 증폭동안 형광 모니터링은 강력한 분석기술이다. 실시간 모니터링을 제공하는 장치를 사용하여 존재하는 초기 템플레이트 복제물 갯수에 따라서 서열 특이성 탐지 및 정량화가 5 내지 20분후에 달성될 수 있다. 에티듐 브로마이드 또는 SYBR Green I과 같은 2중쇄 특이성 염료가 증폭의 표시물질로서 사용될 수 있다. SYBR Green I은 형광제 근처에서 최대의 활성을 가지며 에티듐 브로마이드의 가시적 활성화보다 DNA에 더 강한 신호를 제공하므로 선호된다. 2중쇄 염료는 증폭 프라이머에 고유한 특이성에 종속된다. 높은 싸이클 횟수에서 비특이성 증폭은 100개의 초기 템플레이트로 탐지 민감도를 한정하지만 (도 14) 본 발명은 증폭 특이성을 더욱 개선한다.Fluorescence monitoring during DNA amplification is a powerful analytical technique. Sequence specificity detection and quantification can be achieved after 5-20 minutes depending on the number of initial template copies present using a device that provides real-time monitoring. Double chain specific dyes such as ethidium bromide or SYBR Green I can be used as indicators of amplification. SYBR Green I is preferred because it has maximum activity near the fluorescent and provides a stronger signal to DNA than the visible activation of ethidium bromide. Double chain dyes are subject to specificity specific to the amplification primers. Nonspecific amplification at high cycle counts limits detection sensitivity to 100 initial templates (FIG. 14), but the present invention further improves amplification specificity.

적은 수의 복제물 탐지 및 정량이 필요할 때 신호발생을 위해 교합을 필요로 하는 형광 프로브에 의해서 추가 특이성이 제공될 수 있다. 이중-라벨링된 엑소누클레아제의 절단이 한가지 방법이다(형광 프로브를 사용한 닉-번역 PCR에 의한 대립형질 판별, Nucl. Acids Res. 21:3761-3766, L.G., C.R. Connell, W. Bloch. 1993; 반대 단부에서 형광 염료를 갖는 올리고누클레오타이드를 사용하여 PCR 생성물과 핵산 교합의 탐지에 유용한 퀀칭된 프로브 시스템, PCR Meth. Appl. 4:357-362, Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, 1995 참조). 이것은 음의 비교 신호로 부터 단일한 템플레이트 복제물을 구별할 수 있다(도 15). 적은 수의 복제물이 증폭될 때 감소된 증폭 효율로 인하여 최종형광신호가 감소될지라도 0과 백개의 복제물간의 정량화가 가능하다. 엑소누클레아제 프로브에 의해 발생된 신호는 축적적이며 간접적으로 생서물 농도에 관련된다. 그러므로 생성물의 양이 평형에 도달한 후에도 형광 신호는 계속 증가한다. 증폭 및 절단 효율의 제어에 대한 표준이 절대적인 정량화에 필요하다.Additional specificity can be provided by fluorescent probes that require occlusion for signaling when a small number of copies are detected and quantified. Cleavage of double-labeled exonuclease is one method (allele determination by nick-translation PCR using fluorescent probes, Nucl.Acids Res. 21: 3761-3766, LG, CR Connell, W. Bloch. 1993 Quenched probe systems useful for the detection of PCR products and nucleic acid engagement using oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends, PCR Meth.Appl. 4: 357-362, Livak, KJ, SJA Flood, J. Marmaro , W. Giusti, K. Deetz, 1995). This can distinguish a single template copy from the negative comparison signal (FIG. 15). When a small number of copies are amplified, the reduced amplification efficiency allows quantification between zero and one hundred copies, although the final fluorescence signal is reduced. The signals generated by the exonuclease probes are cumulative and indirectly related to the biologic concentration. Therefore, the fluorescence signal continues to increase even after the amount of product reaches equilibrium. Standards for control of amplification and cleavage efficiency are needed for absolute quantification.

5'-엑소누클레아제 프로브의 디자인, 합성 및 정제는 주의를 필요로 한다. 교합은 엑소누클레아제 유도 신호를 위한 필요조건이지만 충분조건은 아니며; 모든 프로브는 효과적으로 절단되지 않는다(형광 프로브를 사용한 닉-번역 PCR에 의한 대립형질 판별, Nucl. Acids Res. 21:3761-3766, L.G., C.R. Connell, W. Bloch. 1993; 반대 단부에서 형광 염료를 갖는 올리고누클레오타이드를 사용하여 PCR 생성물과 핵산 교합의 탐지에 유용한 퀀칭된 프로브 시스템, PCR Meth. Appl. 4:357-362, Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz, 1995 참조). 이중-라벨링된 프로브의 합성에는 로오다민의 수동첨가가 관련되며 역상 HPLC가 뒤따른다.Design, synthesis and purification of 5′-exonuclease probes requires attention. Occlusal is a necessary but not sufficient condition for exonuclease induced signals; All probes are not cleaved effectively (allele determination by nick-translation PCR using fluorescent probes, Nucl.Acids Res. 21: 3761-3766, LG, CR Connell, W. Bloch. 1993; fluorescent dyes at opposite ends A quenched probe system useful for the detection of PCR products and nucleic acid occlusion using oligonucleotides having an oligonucleotide, PCR Meth.Appl. 4: 357-362, Livak, KJ, SJA Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. See Deetz, 1995). Synthesis of double-labeled probes involves the manual addition of rhodaramine followed by reverse phase HPLC.

이중-라벨링된 프로브의 가수분해 중속성 대신에 공명에너지 전달을 통해 교합이 직접 탐지될 수 있다(에너지 전달 탐지 및 형광 퀀칭, 311-352, L. J. Kricka(Ed.), 비방사성 동위원소 DNA 프로브 기술, Academic Press, San Diego, Morrison, L.E., 1992). 형광제 및 Cy5와 별도로 라벨링된 2개의 인접한 프로브를 사용하여 Cy5로의 에너지 전달은 증폭 싸이클마다 생성물 축적과 더불어 증가한다(도 17). 엑소누클레아제 프로브에 비해서 형광제 및 Cy5의 아미다이트는 자동합성동안 직접 포함될 수 있으므로 프로브 합성이 비교적 간단하다. 공지기술은 공명에너지 전달쌍으로서 형광제와 Cy5의 사용을 발표하지 않았다. 스펙트럼 중첩이 작을지라도 Cy5의 몰흡수계수 및 흡수파장은 로오다민에 비해서 높다. 3가지 인자(중첩, 흡수성 및 파장)가 에너지 전달률을 결정하는 중첩 적분에 기여한다. Cy5는 형광제 흡수 파장에서 낮은 흡수성을 가지며 받게의 직접 활성화를 감소시킨다.Occlusal energy transfer can be detected directly via resonance energy transfer instead of the double-labeled probe hydrolysis medium (energy transfer detection and fluorescence quenching, 311-352, LJ Kricka (Ed.), Nonradioactive isotopic DNA probe technology , Academic Press, San Diego, Morrison, LE, 1992). Energy transfer to Cy5 increases with product accumulation per amplification cycle using two adjacent probes labeled separately from the fluorescence agent and Cy5 (FIG. 17). Compared with exonuclease probes, fluorescent synthesis and amidite of Cy5 can be included directly during autosynthesis, making probe synthesis relatively simple. The state of the art does not disclose the use of fluorescents and Cy5 as resonance energy transfer pairs. Although the spectral overlap is small, the molar absorption coefficient and absorption wavelength of Cy5 are higher than that of rhodamine. Three factors (overlapping, absorbency and wavelength) contribute to the overlapping integration, which determines the energy transfer rate. Cy5 has low absorbency at the fluorescence absorption wavelength and reduces direct activation of the recipient.

겔 전기영동에 의한 DNA 증폭의 종래적인 종말점 분석은 생성물 크기를 분류하고 순도를 추정한다. 그러나, 증폭이 처음에 확률적이고 이후에 지수함수적이며 마지막으로 정체적이므로 종말점 분석의 활용성은 정량화에 제한된다. 본 발명에 의해 제공되는 싸이클별 모니터링은 비교적 단순한 정량화를 제공하며 폐쇄된 튜브 형광 모니터링은 추가 장점을 가진다.Conventional endpoint analysis of DNA amplification by gel electrophoresis classifies product size and estimates purity. However, because amplification is initially probabilistic, then exponential, and finally static, the utility of endpoint analysis is limited to quantification. Cycle-by-cycle monitoring provided by the present invention provides a relatively simple quantification and closed tube fluorescence monitoring has additional advantages.

종말점 및 싸이클별 분석에 비해서 본 발명은 온도 싸이클내내 형광을 모니터링 할 수 있다. 2중쇄 특이성 염료를 사용한 연속 형광 모니터링이 온도 싸이클링 매개변수 조절에 사용될 수 있다. 특정량의 생성물이 합성된후 증폭이 중단되어 또다른 템플레이트의 과증폭을 방지할 수 있다. 각 싸이클의 신장 단계는 형광이 증가하는한 계속될 필요가 있다. 생성물 변성이 실시간으로 보장되며 형광이 기준선에 도달할때까지 온도를 증가시킨다. 생성물이 변성온도에 노출되는 시간을 제한하는 것은 긴 생성물의 증폭에 특히 유용하다.Compared to endpoint and cycle specific analysis, the present invention can monitor fluorescence throughout the temperature cycle. Continuous fluorescence monitoring with double chain specific dyes can be used to adjust the temperature cycling parameters. After a certain amount of product has been synthesized the amplification can be stopped to prevent overamplification of another template. The elongation phase of each cycle needs to be continued as long as the fluorescence increases. Product denaturation is guaranteed in real time and the temperature is increased until fluorescence reaches baseline. Limiting the time the product is exposed to denaturation temperature is particularly useful for amplifying long products.

형광 염료를 연속 모니터링의 추가 사용은 본 발명의 범위내에 있다. 예컨대 정확한 온도 제어와 2중쇄 특이성 염료를 사용하여 생성물 순도가 용융곡선에 의해 추정될 수 있다. 신속한 온도 제어를 사용하여 생성물의 절대농도가 재어닐링 반응에 의해 결정될 수 있다. 유일한 필요조건은 형광능력, 신속한 온도변화능력 및 샘플온도 균일성이다. 공기혼합의 용이성과 모세관 샘플튜브의 높은 부피대 표면적 비는 다른 디자인으로는 불가능한 속도로 샘플온도를 정확히 제어할 수 있게 한다. 예컨대, 모세관 튜브에서 시간대 샘플온도 플롯은 변성 및 어닐링 온도에서 예리한 스파이크를 보이지만 공지기술에서 사용된 원추형 플라스틱 튜브에서 평형에 도달하기 위해서 수초가 필요하다. 게다가 높은 부피대 표면적비가 에칭된 실리콘 또는 유리칩상에서 가능하지만 모세관 샘플튜브를 사용하는 본 발명에 의해 달성된 비에 도달하는데 보고된 싸이클 횟수가 없으며 샘플에 노출된 큰 칩표면에서 온도 균일성을 달성하기가 어렵다.Further use of continuous monitoring of fluorescent dyes is within the scope of the present invention. For example, using accurate temperature control and double chain specific dyes, product purity can be estimated by the melt curve. Using rapid temperature control, the absolute concentration of the product can be determined by the reannealing reaction. The only requirements are fluorescence, rapid temperature change and sample temperature uniformity. The ease of air mixing and the high volume to surface area ratio of the capillary sample tubes allow precise sample temperature control at rates that would be impossible with other designs. For example, time zone sample temperature plots in capillary tubes show sharp spikes at denaturation and annealing temperatures but require several seconds to reach equilibrium in conical plastic tubes used in the art. Moreover, although a high volume to surface area ratio is possible on etched silicon or glass chips, there are no reported cycles to reach the ratio achieved by the present invention using capillary sample tubes, and temperature uniformity is achieved on the large chip surface exposed to the sample. Difficult to do

본 발명을 사용하여 DNA 증폭의 여러 측면이 구별될 수 있다. 예컨대, 생성물 변성이 1초 미만에 일어나며, 반면에 공지기술에서는 변성에 10초 내지 1분이 필요하다. 본 발명에 따라서 2중쇄 염료의 실시간 형광 모니터링에 의한 생성물 용융 관찰(도 12, 13)은 더 짧은 변성시간의 사용이 효과적임을 보여준다. 도 13 에 도시된 바와 같이 생성물 재어닐링은 매우 빠르다. 사실상 증폭의 후반 싸이클동안 프라이머 어닐링 온도에 도달되기 이전에 냉각동안 대부분의 생성물은 재어닐링 된다. 이것은 본 발명에 의해서 5-10℃/초의 냉각 속도로 일어난다. 더 느린 공지기술의 온도 싸이클러 사용시 생성물 재어닐링은 더 크다. 생성물 재어닐링은 "평탄화 효과"의 주원인이다.Various aspects of DNA amplification can be distinguished using the present invention. For example, product denaturation occurs in less than 1 second, whereas in the prior art, 10 seconds to 1 minute is required for denaturation. Product melt observation by real-time fluorescence monitoring of the double chain dyes according to the present invention (FIGS. 12, 13) shows that the use of shorter denaturation times is effective. Product reannealing is very fast as shown in FIG. 13. In fact, most of the product is reannealed during cooling before the primer annealing temperature is reached during the second cycle of amplification. This takes place at a cooling rate of 5-10 ° C./sec by the present invention. Product reannealing is larger when using slower known temperature cyclers. Product reannealing is a major cause of the "flattening effect".

싸이클별 모니터링을 사용한 모니터링을 위한 신속한 싸이클 PCR의 형광 모니터링Fluorescence monitoring of rapid cycle PCR for monitoring with cycle-by-cycle monitoring

공지 기술에서, PCR 생성물의 분석은 증폭이 완료된 후에 보통 수행된다. PCR 정량에 사용될 때 종말점 방법은 정확한 결과를 위해 초기 템플레이트 농도의 양호한 추정을 필요로 한다. 정량적인 PCR을 위해 PCR 샘플의 형광 모니터링은 에티듐 브로마이드를 사용하였다. 본 발명은 싸이클마다 PCR 샘플을 형광 모니터링한다. 형광은 조합된 어닐링/신장단계동안 싸이클마다 보통 한 번 필요하다. 에티듐 브로마이드 형광은 dsDNA에 삽입될 때 향상되며 생성물 농도의 정도이다. dsDNA 사용시 싸이클마다 한 번 생성물의 양을 모니터링하면 초기 템플레이트 농도의 넓은 동적 범위가 분석될 수 있다.In the known art, analysis of PCR products is usually performed after amplification is complete. The endpoint method, when used for PCR quantification, requires a good estimate of the initial template concentration for accurate results. Fluorescence monitoring of PCR samples was used for quantitative PCR using ethidium bromide. The present invention fluoresces PCR samples every cycle. Fluorescence is usually needed once per cycle during the combined annealing / extension step. Ethidium bromide fluorescence is enhanced when inserted into dsDNA and is a degree of product concentration. By monitoring the amount of product once per cycle with dsDNA, a wide dynamic range of initial template concentrations can be analyzed.

본 발명의 한 측면에 따르면 2중쇄 DNA특이성 염료가 사용된다. 예컨대, SYBR Green I이 PCR 생성물 축적을 위해 선호되는 민감한 염료이다. 도 18 에서, 108배 범위에 걸쳐서 초기 템플레이트 복제물 갯수의 정량이 가능하다. 도 18 에서, 형광 곡선이 초기 템플레이트 농도에 따라서 수평으로 변위된다. 도 18 에 도시된 바와 같이 증폭 특이성이 완벽하지 않으므로 민감도는 낮은 초기 템플레이트 농도에 한정된다. 템플레이트가 존재하지 않을 때 프라이머 다이머와 같은 바람직하지 않은 생성물이 증폭된다. 따라서 0, 1 및 10개의 초기 템플레이트 복제물간에 차이가 적다.According to one aspect of the invention a double chain DNA specific dye is used. For example, SYBR Green I is the preferred sensitive dye for PCR product accumulation. In Figure 18, quantification of the initial template replicate number over a 108-fold range is possible. In Fig. 18, the fluorescence curve is displaced horizontally according to the initial template concentration. As shown in FIG. 18, the sensitivity is limited to low initial template concentrations as the amplification specificity is not perfect. Undesired products, such as primer dimers, are amplified when no template is present. Thus, there is little difference between 0, 1 and 10 initial template replicas.

매우 적은수의 복제물의 정량은 예전에 dsDNA 염료로는 달성되지 못했을지라도 본 발명은 이러한 염료를 단순성 때문에 사용할 수 있다. dsDNA 염료는 모든 증폭에 사용될 수 있으며 이러한 염료를 사용할 때 형광 라벨링된 올리고누클레오타이드가 불필요하다. dsDNA 염료를 써서 매우 적은 수의 복제물을 정량하기 위해서는 매우 양호한 증폭 특이성 또는 비특이성 증폭으로 부터 필요한 생성물을 분별하는 수단이 필요하다.Although quantification of very few copies has not been achieved with dsDNA dyes before, the present invention can use such dyes for simplicity. dsDNA dyes can be used for all amplifications and fluorescent labeled oligonucleotides are unnecessary when using these dyes. To quantify very few copies using the dsDNA dye, a means is needed to distinguish the required products from very good amplification specificity or nonspecific amplification.

도 18 에서, dsDNA 염료 SYBR Green I 염료를 사용하여 모니터링된 DNA증폭의 싸이클 횟수대 형광 플롯이 제공된다. 도 18 의 플롯은 SYBR Green I 1:10,000 희석물의 존재하에서 0 내지 109 평균 템플레이트 복제물로 증폭된 인간 β-글로블린 유전자의 536 염기쌍 조각을 사용하여 수득된다. 정제된 템플레이트 DNA는 PCR 증폭, 페놀/클로로포름 추출, 에탄올침전 및 초원심분리(Danvers(MA)의 Amicon으로부터 구매가능한 Centricon 30)에 의해 수득되고 260㎚에서 흡수에 의해 정량된다. 각 온도 싸이클은 28초였다(95℃ 최대, 61℃ 최소, 72℃에서 15초, 온도간의 평균속도 5.2℃/초). 모든 샘플은 동시에 증폭되었고 신장단계 5초 내지 10초 사이에서 100밀리초동안 모니터링 되었다. 모든 샘플의 각 싸이클마다 디스플레이가 갱신되었고 21분후에 45싸이클이 완료되었다. 각 모세관 튜브에 대한 데이타는 각 튜브의 최대값과 최소값간의 차이의 평균으로 정규화 되었다(도 18 에서 Y-축으로 표시됨).In FIG. 18, a fluorescence plot of cycles of DNA amplification monitored using the dsDNA dye SYBR Green I dye is provided. Plots of FIG. 18 are obtained using 536 base pair fragments of the human β-globulin gene amplified with 0-10 9 average template replicates in the presence of a SYBR Green I 1: 10,000 dilution. Purified template DNA is obtained by PCR amplification, phenol / chloroform extraction, ethanol precipitation and ultracentrifugation (Centricon 30, available from Amicon from Danvers (MA)) and quantified by absorption at 260 nm. Each temperature cycle was 28 seconds (95 ° C. maximum, 61 ° C. minimum, 15 ° C. at 72 ° C., average speed 5.2 ° C./sec between temperatures). All samples were amplified simultaneously and monitored for 100 milliseconds between 5 and 10 seconds of kidney phase. The display was updated for each cycle of every sample and 45 cycles were completed 21 minutes later. Data for each capillary tube was normalized to the average of the difference between the maximum and minimum values of each tube (indicated by the Y-axis in FIG. 18).

본 발명의 또다른 측면에 따라서, 서열 특이성 형광 모니터링이 제공된다. PCR 생성물의 서열 특이성 탐지는 본 발명에 의해 올리고누클레오타이드 프로브상에 두 개의 상이한 형광단을 포함시킴으로써 획득된다. 도 19a-d 에 도시된 본 발명의 범위내에서 2개의 배열이 선호된다. 배열은 받게의 흡수 스펙트럼을 중첩하는 방출스펙트럼을 갖는 도너를 필요로 한다.According to another aspect of the present invention, sequence specific fluorescence monitoring is provided. Sequence specificity detection of PCR products is obtained by including two different fluorophores on an oligonucleotide probe by the present invention. Two arrangements are preferred within the scope of the invention shown in FIGS. 19A-D. The arrangement requires a donor with an emission spectrum that overlaps the absorption spectrum of the receiver.

도 19a-d 는 PCR동안 서열 특이성 형광 모니터링을 위해 선호되는 두가지 배열을 보여준다. 도 19a 는 단일 올리고누클레오타이드 프로브상에 함께 존재하므로 초기에 받게(A)에 의해 퀀칭되는 도너(D)를 보여준다. 폴리메라제 5'-엑소누클레아제 활성에 의한 가수분해 이후에 도너와 박게는 분리되고 도너의 형광이 증가된다(도 19b). 도 19c 에 도시된 배열에서 도너는 프로브상에 있고 받게는 프라이머상에 있다. 프로브 및 프라이머상의 염료는 교합에 의해 근사된다. 이것은 받게로의 공명 에너지 전달을 가져와 받게의 형광을 증가시킨다(도 19d). 19A-D show two arrangements preferred for sequence specificity fluorescence monitoring during PCR. FIG. 19A shows the donor (D) initially quenched by recipient (A) as it coexists on a single oligonucleotide probe. After hydrolysis by the polymerase 5′-exonuclease activity, the donor and the crab are separated and the fluorescence of the donor is increased (FIG. 19B). In the arrangement shown in FIG. 19C the donor is on the probe and the receiver is on the primer. Dyes on probes and primers are approximated by occlusion. This results in resonance energy transfer to the recipient, increasing the fluorescence of the recipient (FIG. 19D).

도너와 받게가 동일한 올리고누클레오타이드상에서 합성된다면 받게 염료는 근접성 때문에 도너의 형광을 퀀칭시킨다(도 19a). 온도 싸이클링 동안 일부 프로브는 단일쇄 PCR 생성물에 교합하고 폴리메라제 5'-엑소누클레아제 활성에 의해 가수분해된다. 도너와 받게는 더 이상 연결되지 않으므로 도너는 받게의 퀀칭으로부터 해방되어 도너 형광이 증가한다. 형광신호는 교합이 아니라 프로브 가수분해에 달려있으므로 이러한 부류의 프로브를 "가수분해" 프로브라 칭한다.If the donor and the acceptor are synthesized on the same oligonucleotide, the acceptor dye quenches the fluorescence of the donor because of its proximity (FIG. 19A). During temperature cycling, some probes occupy single-chain PCR products and are hydrolyzed by the polymerase 5'-exonuclease activity. Since the donor and the acceptor are no longer connected, the donor is released from the quenching of the acceptor, increasing donor fluorescence. Since the fluorescence signal depends on probe hydrolysis, not occlusion, this class of probe is called a "hydrolysis" probe.

도 19c 및 d 에 따라서, 도너와 받게가 상이한 올리고누클레오타이드상에 위치된다면 상이한 형광 스킴이 가능하다. 도 19c 및 d 에서 도너는 프로브의 3'단부에 위치되고 하나의 프라이머가 받게로 라벨링된다. 이들은 별도의 올리고누클레오타이드상에 존재하므로 염료간의 상호작용은 최소이다. 온도 싸이클링 동안 프로브는 라벨링된 프라이머 근처에서 교합하고 공명 에너지 전달이 일어난다. 형광 신호는 프로브 교합에 종속되므로 이러한 부류의 프로브를 "교합" 프로브로 칭한다. According to Figures 19C and d, different fluorescence schemes are possible if donors and acceptors are placed on different oligonucleotides. In FIGS. 19 c and d the donor is located at the 3 ′ end of the probe and one primer is labeled as a recipient. Since they are on separate oligonucleotides, the interactions between the dyes are minimal. During temperature cycling the probe occludes near the labeled primers and resonance energy transfer occurs. Since the fluorescence signal is dependent on probe occlusion, this class of probe is called a "occlusion" probe.

도너 형광이 퀀칭되는지 또는 받게 형광을 증가시키는지 여부는 특이적 형광과 용매 조건에 의해 좌우된다. 도너 형광 증가가 가수분해 프로브를 사용한 PCR동안 관찰되지만 받게 형광 증가는 교합 프로브를 사용할 때 모니터링된다.Whether the donor fluorescence is quenched or increases the received fluorescence depends on the specific fluorescence and solvent conditions. An increase in donor fluorescence is observed during PCR using hydrolysis probes, but the increase in fluorescence received is monitored when using an occlusal probe.

가수분해 프로브상의 추가 정보 및 데이타가 제공된다. dsDNA 염료에 비해서, 서열 특이적 프로브는 도 20 에 도시된 바와 같이 매우 적은 수의 템플레이트를 정량할 수 있다. 단일 템플레이트 복제물은 템플레이트 부재로 부터 구별될 수 있다. 증폭의 효율은 초기 복제물 갯수가 1500미만으로 떨어질 때 감소한다. 가수분해는 누적적이고 엄밀하게 생성물 농도에 관련되지 않으므로 수많은 싸이클 후에도 형광 신호는 계속 증가한다.Additional information and data on hydrolysis probes are provided. Compared to dsDNA dyes, sequence specific probes can quantify very few templates as shown in FIG. 20. A single template copy can be distinguished from the template member. The efficiency of amplification decreases when the initial copy number drops below 1500. Since hydrolysis is cumulative and not strictly related to product concentration, the fluorescence signal continues to increase after many cycles.

도 20 에서, 이중-라벨링된 가수분해 프로브를 써서 모니터링된 DNA 증폭의 싸이클 횟수대 형광비(형광제/로오다민) 플롯이 나타난다. 가는선은 각 곡선의 긴-선형 부위를 표시한다. 인간 β-액틴 유전자의 280염기쌍 조각이 튜브마다 0.15 내지 15,000 평균 인간 유전자 DNA 복제물로 증폭된다. 활용되는 가수분해 프로브는 (0.2μM로 포함됨) Perkin Elmer (Forster City, California)로 부터 구매할 수 있다. 각 온도 싸이클은 26초이다(94℃ 최대, 60℃에서 15초, 온도간의 평균속도 6.2℃/초). 모든 샘플은 동시에 증폭되고 어닐링/신장 단계의 5초와 10초 사이에 100밀리초동안 모니터링된다. 모든 튜브의 각 싸이클마다 디스플레이가 갱신되고 20분 미만에 45 싸이클이 완료된다.In FIG. 20, a plot of the fluorescence ratio (fluorescent agent / rhoodamine) versus the number of cycles of DNA amplification monitored using a double-labeled hydrolysis probe is shown. Thin lines indicate the long-linear region of each curve. 280 base pair fragments of the human β-actin gene are amplified with 0.15-15,000 average human gene DNA copies per tube. The hydrolysis probe utilized (included in 0.2 μM) can be purchased from Perkin Elmer (Forster City, California). Each temperature cycle is 26 seconds (maximum 94 ° C., 15 seconds at 60 ° C., average speed 6.2 ° C./sec between temperatures). All samples are amplified simultaneously and monitored for 100 milliseconds between 5 and 10 seconds of the annealing / extension phase. The display is updated for each cycle in every tube and 45 cycles are completed in less than 20 minutes.

가숩누해 프로브에 비해서, 교합 프로브에서 나오는 형광신호는 누적적이 아니며 각 어닐링 단계동안 새로 전개된다. 교합은 의사-1차 반응이기 때문에 형광은 생성물 농도의 직접적 지표이다(용액 교합의 정량분석, 핵산교합: 실제적 방법, Hames B., Higgins S., eds, p.47-71, Washington D.C. IRL Press, Young B, Anderson M., 1985). 프로브의 농도는 생성물보다 훨씬 높으므로 프로브에 교합된 생성물의 비율은 생성물 농도와 무관하다.Compared to a poorly leaked probe, the fluorescence signal from the occlusal probe is not cumulative and develops newly during each annealing step. Because occlusion is a pseudo-first reaction, fluorescence is a direct indicator of product concentration (quantitative analysis of solution occlusion, nucleic acid occlusion: practical methods, Hames B., Higgins S., eds, p. 47-71, Washington DC IRL Press , Young B, Anderson M., 1985). The concentration of the probe is much higher than the product, so the proportion of product associated with the probe is independent of the product concentration.

SYBR Green I, 가수분해 프로브, 및 교합 프로브에서 나오는 형광신호가 도 21a-d 에서 직접 비교된다. 모든 프로브는 싸이클 20 부근에서 발생한 탐지가능한 형광으로 거의 동일한 민감도를 보인다. 연장된 증폭으로 신호는 가수분해 프로브의 경우 증가하고 SYBR Green I의 경우 그대로이며 교합 프로브의 경우 약간 감소한다. 교합 프로브의 경우 35 싸이클후 신호감소는 폴리메라제 엑소누클레아제 활성으로 인한 프로브 가수분해 때문에 초래된다. 가수분해 프로브에서 나오는 형광비의 변화가 교합프로브에서 나오는 것보다 클지라도(도 21b, c) 가수분해 프로브에서 나오는 형광의 분산계수가 더 크다(도 21d). 즉, 교합 프로브에서 나오는 형광이 절대 신호레벨을 낮을지라도 가수분해 프로브보다 정확하다.Fluorescence signals from SYBR Green I, hydrolysis probes, and occlusal probes are compared directly in FIGS. 21A-D. All probes show almost the same sensitivity with detectable fluorescence occurring near cycle 20. With prolonged amplification, the signal increases for hydrolysis probes, remains for SYBR Green I and slightly decreases for occlusal probes. For occlusal probes, signal degradation after 35 cycles is caused by probe hydrolysis due to polymerase exonuclease activity. Although the change in fluorescence ratio coming out of the hydrolysis probe is larger than that coming out of the occlusal probe (FIGS. 21B, c), the dispersion coefficient of the fluorescence coming out of the hydrolysis probe is larger (FIG. 21D). That is, the fluorescence from the occlusal probe is more accurate than the hydrolysis probe even if the absolute signal level is low.

도 21a-d 는 PCR동안 3개의 형광 모니터링 방법에 대한 비교를 제공한다. 형광 프로브는 dsDNA 염료 SYBR Green I(도 21a), 이중-라벨링된 형광제/로오다민 가수분해 프로브(도 21b), 및 Cy5 라벨링된 프라이머를 갖는 형광제 라벨링된 교합 프로브(도 21c)이다. 모든 증폭은 15,000 템플레이트 복제품(50ng 인간 유전자 DNA/10㎕)을 사용하여 10번 복제로 수행된다. 온도 싸이클은 31초이다(94℃ 최대, 60℃에서 20초, 온도간 평균속도 6.2℃/초). 어닐링/신장단계 15초와 20초 사이에 각 샘플에 대해 형광이 수득된다. 평균±표준편차가 각 점에 대해 도시된다. SYBR Green I이 프라이머 KM29와 PC04로 부터 205 염기쌍 인간 β-글로블린 조각의 증폭에서 1:10,000 희석비에서 사용된다. 가수분해 프로브와 조건은 도 20 에 도시된다. 가수분해 프로브 TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-형광제(SEQ ID NO:5)(Glen Research(Sterling, Virginia)로 부터 구매가능한 형광제 CPG)가 KM29 및 Cy5-라벨링된 프라이머 CAACTTCATCCACGTNCACC (SEQ ID NO:6)와 함께 사용된다. 여기서 N은 Cy5(Amersham (Arlington Heights, Illinois)로 부터 구매가능)으로 라벨링된 아미노-변성제 C6dT (Glen Research)이다. 3가지 형광 모니터링 기술의 정확도가 도 21D 에서 비교된다. 데이타는 기준선(평균 11-15싸이클)위의 형광비의 분산계수(표준편차/평균)로서 도시된다.21A-D provide a comparison of three fluorescence monitoring methods during PCR. Fluorescent probes are dsDNA dye SYBR Green I (FIG. 21A), double-labeled fluorescent / rhoodamine hydrolysis probes (FIG. 21B), and fluorescently labeled occlusion probes with Cy5 labeled primers (FIG. 21C). All amplifications are performed in 10 replicates using 15,000 template replicates (50 ng human gene DNA / 10 μl). The temperature cycle is 31 seconds (maximum 94 ° C., 20 seconds at 60 ° C., average speed 6.2 ° C./sec between temperatures). Annealing / extension step Fluorescence is obtained for each sample between 15 and 20 seconds. Mean ± standard deviation is shown for each point. SYBR Green I is used at a 1: 10,000 dilution in amplification of 205 base pair human β-globulin fragments from primers KM29 and PC04. Hydrolysis probes and conditions are shown in FIG. 20. Hydrolysis Probe TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-Fluorescent Agent (SEQ ID NO: 5) (Fluorescent CPG, available from Glen Research (Sterling, Virginia)) is used with KM29 and Cy5-labeled primer CAACTTCATCCACGTNCACC (SEQ ID NO: 6) . Where N is an amino-modifier C6dT (Glen Research) labeled Cy5 (commercially available from Amersham (Arlington Heights, Illinois)). The accuracy of the three fluorescence monitoring techniques is compared in FIG. 21D. Data is shown as the dispersion coefficient (standard deviation / mean) of the fluorescence ratio above the baseline (mean 11-15 cycles).

싸이클별 모니터링을 사용한 정량화 알고리즘이 기술된다. 초기 템플레이트 농도에 대한 정량적인 정보가 도 18 및 20 에 도시된 형광 곡선에 포함될지라도 당해분야 숙련자는 이러한 정보를 최상으로 추출하는 방법은 잘 모를 것이다. 도 22 에서 50ng의 유전자 DNA의 증폭에 비교된 정제된 템플레이트의 104 및 105 복제물의 증폭 곡선이 도시된다. 이러한 데이타는 유전자 DNA가 104 이상의 타겟 복제물을 포함함을 알 수 있게 하지만 복제물의 정확한 수에 대해서는 정보를 제공하지 않는다.A quantification algorithm using cycle-by-cycle monitoring is described. Although quantitative information about the initial template concentration is included in the fluorescence curves shown in FIGS. 18 and 20, those skilled in the art will not know how to best extract this information. In FIG. 22 amplification curves of 10 4 and 10 5 copies of the purified template compared to amplification of 50 ng of gene DNA are shown. These data indicate that the gene DNA contains more than 10 4 target copies but does not provide information on the exact number of copies.

도 22 에서, PCR 형광 곡선의 정량화를 위한 내삽 방법을 비교하는 플롯이 제공된다. 도 22 에 주어진 싸이클 횟수에서 미지 및 표준 형광을 비교하는 종말점 내삽이 도시된다. 또한 각 곡선이 주어진 형광레벨을 초과하는 싸이클횟수를 결정하는 한계치 내삽이 도시된다.In FIG. 22, a plot comparing the interpolation method for quantification of PCR fluorescence curves is provided. Endpoint interpolation is shown comparing the unknown and standard fluorescence at the number of cycles given in FIG. 22. Also shown is a threshold interpolation that determines how many cycles each curve exceeds a given fluorescence level.

본 발명에 따라서 2가지 데이타 내삽 방법이 발표된다. 한가지 방법은 전체곡선을 내삽시켜서 모든 관련 데이타 포인트를 사용하는 것이다. 이러한 방법은 가장 정확한 결과를 제공한다. 또다른 방법은 단일 수직선 또는 수평선을 따라 미지값을 내삽하는 것이다. 단일 수직선 내삽은 종래의 종말점 분석과 유사하다. 특정 싸이클 횟수에서 미지의 형광이 기지의 값 사이에 내삽된다. 표 1 에 싸이클 20-24의 수직 내삽 결과가 열거된다. 수평선을 따른 내삽은 형광 한계 확립을 필요로 한다. 10, 20, 30 및 40% 한계로 부터의 내삽이 표 1 에 또한 열거된다.Two data interpolation methods are disclosed in accordance with the present invention. One way is to interpolate the entire curve and use all relevant data points. This method gives the most accurate results. Another way is to interpolate the unknown along a single vertical or horizontal line. Single vertical interpolation is similar to conventional endpoint analysis. At certain cycle counts, unknown fluorescence is interpolated between known values. Table 1 lists the vertical interpolation results for cycles 20-24. Interpolation along the horizontal line requires establishing fluorescence limits. Interpolations from the 10, 20, 30 and 40% limits are also listed in Table 1.

형광 정량화를 위한 단일선 내삽 방법(도 22 참조)Single line interpolation method for fluorescence quantification (see FIG. 22) 종말점End point 한계Limit 싸이클Cycle 복제물Replica 형광(%)Neon(%) 복제물Replica 2020 41,00041,000 ------ ------ 2121 12,00012,000 1010 17,00017,000 2222 12,00012,000 2020 14,00014,000 2323 13,00013,000 3030 15,00015,000 2424 14,00014,000 4040 18,00018,000 평균Average 18,00018,000 평균Average 16,00016,000

종말점 또는 한계값 내삽은 많은 이용가능한 값을 사용하지 않으며 단일한 정도에서 벗어난 데이타 포인트에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 예컨대 싸이클 20에서 종말점. 본 발명은 향상된 내삽방법을 제공한다. 예컨대, 각 곡선의 로그-선형 부위내에서 데이타의 지수함수 F = AN(1+E)n 이다. 여기서 F는 형광신호이고 A는 형광계수인자이고 N은 출발 복제물 수이고 E는 증폭효율이고 n은 싸이클 횟수이다. A와 E는 미지값을 제외한 N의 값에 대해 먼저 결정될 수 있다. 이후에 미지의 N에 대한 최상의 값이 결정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하면 50ng의 게놈 DNA에서 유전자 복제물 수는 표 1 의 중앙값에 가까우며 허용치 1.5×104 에 가까운 1.7×104 이다. 다른 곡선은 위 지수함수 예보다 더 양호할 수 있다. 지수함수는 로그-선형 싸이클(45중 7)에 의존하며 이것은 형광 정확도가 낮은 지역에 해당한다(도 21d).Endpoint or limit interpolation does not use many available values and can be greatly affected by data points that deviate from a single degree. For example end point at cycle 20. The present invention provides an improved interpolation method. For example, the exponential function F = AN (1 + E) n of the data in the log-linear region of each curve. Where F is the fluorescence signal, A is the fluorescence coefficient factor, N is the starting replica number, E is the amplification efficiency, and n is the number of cycles. A and E may first be determined for a value of N except for an unknown value. The best value for unknown N can then be determined. Using this method, the number of gene copies in 50 ng of genomic DNA is 1.7 × 10 4 , close to the median in Table 1 and close to the tolerance of 1.5 × 10 4 . Other curves may be better than the above exponential example. The exponential function depends on the log-linear cycle (7 of 45), which corresponds to the region of low fluorescence accuracy (FIG. 21D).

본 발명에 따라서 유도단계, 로그-선형단계 및 정체단계를 기술하는 매개변수를 포함하며 모든 이용가능한 데이타를 사용하는 S자곡선이 사용된다. 데이타 포인트의 기대되는 정확도를 반영하기 위해서 가중된다. 곡선모양의 다양성 때문에 상이한 형광 프로브에 대해서 상이한 매개변수가 필요하다(도 21a-d).In accordance with the present invention an S-curve is used which includes parameters describing the derivation step, the log-linear step and the stagnation step and uses all available data. It is weighted to reflect the expected accuracy of the data points. Because of the variety of curves, different parameters are required for different fluorescent probes (FIGS. 21A-D).

각 PCR 싸이클내에서 여러번 모니터링하는 본 발명의 연속 모니터링의 특징이 기술될 것이다. PCR동안 형광 모니터링이 각 싸이클에 한 번 일정 온도에서 수행될 수 있을지라도 본 발명은 PCR 싸이클내내 연속 모니터링하는 장점을 제공한다. 형광이 온도의 함수로서 변하기 때문에 온도가 중요하다. 그러나, 본 발명에 따르면 온도변화동안 형광 모니터링하면 많은 정보를 얻을 수 있다. 예컨대, 형광이 온도 싸이클링내내 연속으로 수득된다면 가수분해 프로브는 온도에 따라 형광비가 선형으로 변하며 더 많은 프로브가 가수분해되므로 형광이 증가함을 보여준다(도 23a). 이에 비해서 교합 프로브의 형광비는 온도에 따라 급변한다(도 23b). 저온에서 프로브 교합동안 형광비가 증가하고 교합 프로브가 템플레이트를 용융시킬 때 기준선까지 감소한다. The features of the continuous monitoring of the present invention which will be monitored multiple times in each PCR cycle will be described. Although fluorescence monitoring during PCR can be performed at a constant temperature once for each cycle, the present invention provides the advantage of continuous monitoring throughout the PCR cycle. Temperature is important because fluorescence changes as a function of temperature. However, according to the present invention, much information can be obtained by fluorescence monitoring during temperature changes. For example, if fluorescence is obtained continuously throughout the temperature cycling, the hydrolysis probe shows that the fluorescence ratio changes linearly with temperature and the fluorescence increases as more probes are hydrolyzed (FIG. 23A). In contrast, the fluorescence ratio of the occlusal probe changes rapidly with temperature (FIG. 23B). At low temperatures, the fluorescence ratio increases during probe occlusion and decreases to baseline when the occlusion probe melts the template.

PCR동안 생성물 쇄상태의 온도 종속성이 도 24 에 도시된 바와 같이 SYBR Green I을 사용하여 온도대 형광 플롯으로 나타난다. 증폭이 진행될 때 온도 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에서 상승 루우프로서 나타난다. 샘플이 냉각될 때 형광이 증가하는데, 이것은 생성물 재어닐링을 나타낸다. 신장동안 온도가 일정할 때 증가하는 형광은 추가 DNA 합성과 상관된다. 도 24 는 dsDNA 염료 SYBR Green I을 사용한 DNA 증폭의 온도대 형광 플롯을 제공한다. 인간 β-글로블린 유전자의 536 염기쌍 조각이 정제된 템플레이트 106 복제물과 1:30,000 희석률의 SYBR Green I으로 부터 증폭되었다. 다른 조건은 도 18 과 관련하여 기술된 것과 동일하다. 싸이클 15-25 가 표시된다. 형광대 온도 데이타가 변형되어 온도가 형광에 미치는 효과를 제거한다.The temperature dependence of the product chain state during PCR is shown in the temperature band fluorescence plot using SYBR Green I as shown in FIG. 24. As the amplification proceeds, the temperature cycle appears as a rising loop between the annealing temperature and the denaturing temperature. Fluorescence increases as the sample cools, indicating product reannealing. Increasing fluorescence at constant temperature during elongation correlates with further DNA synthesis. 24 provides a temperature versus fluorescence plot of DNA amplification with dsDNA dye SYBR Green I. FIG. 536 base pair fragments of the human β-globulin gene were amplified from purified template 10 6 copies and SYBR Green I at a 1: 30,000 dilution. The other conditions are the same as described in connection with FIG. 18. Cycles 15-25 are displayed. Fluorescent band temperature data is modified to remove the effect of temperature on fluorescence.

생성물 변성 및 재어닐링을 모니터링하는 본 발명은 DNA 정량화를 위한 추가적인 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 DNA 정량방법은 각 온도 싸이클내에서 형광 모니터링을 필요로 하며 싸이클마다 한 번만 형광이 수득될 때 사용될 수 없다. 예컨대, PCR 생성물은 생성물의 GC/AT 비율과 길이에 종속적인 특성용융곡선을 가진다(도 25). 용융온도를 예견하는 실험적인 알고리즘을 사용할 경우 다양한 PCR 생성물은 50℃ 범위에 걸쳐서 용융해야 한다. 비특이성 생성물은 필요한 PCR 생성물과는 다르게 용융하므로 dsDNA 형광이 특이성 성분과 비특이성 성분으로 분리될 수 있다. 본 발명의 방법 사용시 SYBR Green I 또는 에티듐 브로마이드와 같은 게놈 dsDNA 염료를 사용하여 매우 적은수의 복제물 정량이 가능하다. 도 25 는 3가지 정제된 PCR 생성물의 용융곡선을 보여준다. PCR 생성물은 도 18 과 관련하여 설명된 바와 같이 정제되어 정량된다. 1:100,000 희석율의 SYBR Green I이 50nM Tris, pH 8.3 및 3mM MgCl2 10㎕에든 50ng의 DNA에 첨가되었다. 온도는 0.2℃/초로 증가되었고 형광이 수득되고 온도에 대해 도시되었다.The present invention for monitoring product denaturation and reannealing provides additional methods for DNA quantification. This DNA quantification method of the present invention requires fluorescence monitoring within each temperature cycle and cannot be used when fluorescence is obtained only once per cycle. For example, PCR products have a melting curve that is dependent on the GC / AT ratio and length of the product (FIG. 25). Using experimental algorithms to predict the melting temperature, various PCR products must melt over the 50 ° C range. The nonspecific product melts differently from the required PCR product so that dsDNA fluorescence can be separated into specific and nonspecific components. Very few replicates can be quantified using genomic dsDNA dyes such as SYBR Green I or ethidium bromide when using the methods of the present invention. 25 shows the melting curves of three purified PCR products. PCR products are purified and quantified as described in connection with FIG. 18. SYBR Green I at a 1: 100,000 dilution was added to 50 ng of DNA in 10 μl of 50 nM Tris, pH 8.3 and 3 mM MgCl 2 . The temperature was increased to 0.2 ° C./sec and fluorescence was obtained and plotted against temperature.

경쟁적인 정량화를 위해 용융곡선을 사용하는 본 발명의 특징이 기술될 것이다. 본 발명에 따라서 용융곡선의 추가 용도는 PCR의 경쟁적인 정량이다. 본 발명의 방법은 원시 템플레이트와 함께 증폭시키기 위한 경쟁 템플레이트를 필요로 한다. 비교용 템플레이트는 천연 앰플리콘과 용융 온도에서 상이하다. 생성물의 GC 비율을 7-8% 변화시킴으로써 용융곡선이 3℃ 이동될 수 있다(핵산 하이브리드, 형성 및 구조, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Meyers R., ed. pp. 605-608, New York: VCH, Wetmur, J., (1995)). 용융온도에서 3℃ 이동은 생성물 용융곡선의 원시 성분과 경쟁성분을 분리시키는데 충분하다(도 25). 증폭동안 수득되는 용융곡선은 용융피크로 미분되어서 경쟁자와 템플레이트의 상대적 양을 결정하는데 사용될 수 있다(Hillen, W., Goodman T., Benight, A., Wartell R. and Wells, R., (1981), High resolution experimental and theoretical thermal denaturation studies on small overlapping restriction fragments containing the Escherichia coli lactose genetic control region, J. Biol. Chem. 256, 2761-2766). 이러한 방법 사용은 온도 싸이클링후 샘플을 분석할 필요성을 제거해야 한다.Features of the invention using the melting curve for competitive quantification will be described. A further use of the melting curve according to the invention is the competitive quantification of PCR. The method of the present invention requires a competitive template for amplifying with the original template. The comparative template differs from the natural amplicon at the melting temperature. By changing the GC ratio of the product by 7-8%, the melting curve can be shifted by 3 ° C (nucleic acid hybrids, formation and structure, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Meyers R., ed. Pp. 605-608, New York: VCH, Wetmur, J., (1995)). A 3 ° C. shift at the melting temperature is sufficient to separate the raw and competition components of the product melt curve (FIG. 25). The melt curve obtained during amplification can be differentiated into melt peaks and used to determine the relative amounts of competitors and templates (Hillen, W., Goodman T., Benight, A., Wartell R. and Wells, R., (1981). , High resolution experimental and theoretical thermal denaturation studies on small overlapping restriction fragments containing the Escherichia coli lactose genetic control region, J. Biol. Chem. 256, 2761-2766). Use of this method should obviate the need to analyze the sample after temperature cycling.

본 발명에 따라서 절대적 정량화를 위한 교합반응이 토론될 것이다. 본 발명은 변성후 생성물-생성물 재어닐링의 모니터링을 허용하여 직접적이고 절대적인 DNA 정량방법을 제공한다. 샘플온도가 변성온도로 부터 급격히 하강되어서 더 낮은 온도에 유지될 때 생성물 어닐링 속도는 2차반응에 따른다(Young B. and Anderson, M., 1985, Quantitive analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B., Higgins, S. eds., pp. 47-71, Washington, D.C.: IRL Press). 상이한 농도의 DNA가 테스트될 때 재어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도에 따른다(도 26). 도 26 은 상이한 농도의 PCR 생성물에 대한 재어닐링 곡선을 보여준다. 상이한 양의 정제된 DNA의 536 염기쌍 조각이 50mM Tris, pH 8.3 및 3mM MgCl2 5㎕에든 1:30,000 희석비의 SYBR Green I과 혼합된다. 샘플은 94℃에서 변성되고 85℃까지 빠르게 냉각된다. 주어진 PCR 생성물과 온도에서 2차속도 상수가 측정될 수 있다. 속도상수가 알려지면 미지의 DNA 농도가 재어닐링 실험 데이타로 부터 결정될 수 있다. 속도 상수의 초기결정이 도 27 에 도시된다. 냉각은 순간적이지 않으며 일정한 온도에 도달하기 이전에 재어닐링이 일부 일어난다. 본 발명의 장치에 의해 가능한 신속한 냉각은 속도상수나 DNA 농도 결정에 이용가능한 데이타의 양을 최대화 한다. 도 27 은 2차 재어닐링 속도상수의 결정을 보여준다. 곡선은 비선형 최소자승 회귀분석과 일치하며 F최대, F최소, t0 및 k 는 부동 매개변수이다. 속도 상수(k)가 결정되면 DNA 농도가 미지의 샘플에 대해 결정될 수 있다.In accordance with the present invention, the occlusion reaction for absolute quantification will be discussed. The present invention allows for the monitoring of product-product reannealing after denaturation to provide a direct and absolute method of DNA quantification. The product annealing rate depends on the secondary reaction when the sample temperature drops sharply from the denaturation temperature and is maintained at a lower temperature (Young B. and Anderson, M., 1985, Quantitive analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B., Higgins, S. eds., Pp. 47-71, Washington, DC: IRL Press). When different concentrations of DNA were tested, the shape of the reanneal curve was dependent on the DNA concentration (FIG. 26). 26 shows reanneal curves for different concentrations of PCR product. 536 base pair pieces of different amounts of purified DNA are mixed with 5 μl of 50 mM Tris, pH 8.3 and 3 mM MgCl 2 at 1: 30,000 dilution SYBR Green I. The sample is denatured at 94 ° C. and rapidly cooled to 85 ° C. Secondary rate constants can be determined for a given PCR product and temperature. Once the rate constant is known, unknown DNA concentrations can be determined from reanneal experimental data. Initial determination of the rate constant is shown in FIG. Cooling is not instantaneous and some reannealing occurs before reaching a constant temperature. The rapid cooling possible by the device of the present invention maximizes the amount of data available for determining the rate constant or DNA concentration. 27 shows the determination of the secondary reanneal rate constant. The curve is consistent with nonlinear least-squares regression, where F max , F min , t 0, and k are floating parameters. Once the rate constant (k) is determined, DNA concentration can be determined for unknown samples.

본 발명의 방법은 순수 PCR 생성물을 필요로 하지만 이것은 온도 싸이클링동안 수득된 용융곡선에 의해 보장될 수 있다. 재어닐링 반응에 의한 본 발명의 정량 방법을 모세관 샘플 튜브간의 신호 차이에 무관하다.The method of the present invention requires pure PCR product but this can be ensured by the melting curve obtained during temperature cycling. The quantitative method of the present invention by reannealing reaction is independent of the signal difference between capillary sample tubes.

신속한 싸이클 PCR의 연속 모니터링Continuous Monitoring of Rapid Cycle PCR

본 발명은 생성물 순도 모니터링, 템플레이트 정량 및 PCR 동안 돌연변이 탐지에 단색 형광 방법을 사용한다. 이중쇄 DNA(dsDNA)의 존재는 PCR 동안 형광염료를 사용하여 추구될 수 있다. 각 싸이클 내에서 dsDNA가 변성될 때 형광은 감소하고 생성물 재어닐링 및 프라이머 신장으로 형광이 증가한다. 이들 염료는 서열 특이성이 아닐지라도 DNA 용융곡선의 모양을 분석하여 생성물 순도가 평가될 수 있다. 순수한 PCR 생성물은 예리한 용융전이를 가지지만 불순물은 넓은 온도범위에 걸쳐 용융한다.The present invention uses a monochromatic fluorescence method for product purity monitoring, template quantitation and mutation detection during PCR. The presence of double stranded DNA (dsDNA) can be pursued using fluorescent dyes during PCR. As dsDNA denaturates within each cycle, fluorescence decreases and fluorescence increases with product reannealing and primer extension. These dyes can be evaluated for product purity by analyzing the shape of the DNA melt curve even if they are not sequence specific. Pure PCR products have a sharp melt transition, but impurities melt over a wide temperature range.

PCR의 결쟁적인 정량화는 경쟁자로부터 천연 앰플리콘(amplicon)의 분리를 필요로 한다. 용융곡선이 상이한 용융온도를 가지는 생성물은 구별하는데 사용될 수 있다. 초기 템플레이트 복제물 갯수는 천연 앰플리콘과 용융곡선에서 상이한 비교 템플레이트를 사용한 경쟁적인 증폭에 의해 정량된다.Competitive quantification of PCR requires the isolation of native amplicons from competitors. Products with different melting temperatures with different melting curves can be used to distinguish. The initial template copy number is quantified by competitive amplification using different comparative templates in the natural amplicons and the melting curve.

용융곡선은 PCR동안 돌연변기 탐지에 사용될 수 있다. 이질접합 DNA의 증폭동안 형성된 헤테로듀플렉스는 완전 상보적인 생성물보다 저온에서 용융한다. 삭제 및 단일 염기 돌연변이를 식별하는 능력이 용융곡선 분석을 사용하여 설명될 것이다.Melt curves can be used to detect mutants during PCR. Heteroduplexes formed during the amplification of heterozygous DNA melt at lower temperatures than the fully complementary products. The ability to identify deletions and single base mutations will be described using melt curve analysis.

dsDNA 형성의 연속 모니터링이 직접적이고 절대적인 DNA 정량에 사용된다. 변성된 DNA가 급냉되어서 일정한 재어닐링 온도에 유지된다면 절대적인 DNA 농도가 재어닐링 속도에 의해 결정된다.Continuous monitoring of dsDNA formation is used for direct and absolute DNA quantification. If the denatured DNA is quenched and maintained at a constant reanneal temperature, the absolute DNA concentration is determined by the reanneal rate.

본 발명은 PCR 동안 서열 특이성 탐지를 위해 프로브 교합(가수분해가 아닌)에 종속되는 이중색 형광방법을 제공한다. 재어닐링 반응 및 교합 프로브의 용융은 형광단간의 엑소누클레아제 가수분해에 의존하는 프로브를 사용할때는 이용할 수 없는 정보를 제공한다. 초기 템플레이트 복제물 갯수는 템플레이트를 구별하기 위해서 프로브 용융온도를 사용하는 경쟁적 증폭에 의해 정량된다. 단일 염기 돌연변이가 프로브 용융온도 이동에 의해 탐지된다. 생성물 절대농도의 결정은 프로브 어닐링 반응의 분석에 의해 이루어진다.The present invention provides a bicolor fluorescence method that is dependent on probe occlusion (not hydrolysis) for sequence specificity detection during PCR. Reanneal reactions and melting of occlusal probes provide information that is not available when using probes that rely on exonuclease hydrolysis between fluorophores. The initial template replica number is quantified by competitive amplification using probe melting temperatures to distinguish the templates. Single base mutations are detected by probe melting temperature shift. Determination of absolute product concentration is made by analysis of the probe annealing reaction.

게다가, 본 발명은 신속한 싸이클 증폭동안 형광을 연속 모니터링하며 상업적으로 사용될 수 있는 값싼 기기를 제공한다. 본 발명의 열 싸이클러는 10-20분후에 증폭을 할 수 있으며 하나, 둘 또는 3개의 형광단을 탐지하는 광학 모듈에 연결된다. 본 발명의 선호되는 구체예는 24개의 샘플을 1 내지 10회/초의 속도로 모니터링한다. 본 발명에 따르면 샘플은 복합 플라스틱/모세관 용기에 96웰 포맷으로 준비되고 열 싸이클링 및 분석을 위한 장치(도 11)에 옮겨진다. 선호되는 구체예는 형광 데이터를 분석하여 표시장치에 연속으로 표시하는 사용자 중심 그래픽 인터페이스를 포함한다.In addition, the present invention provides an inexpensive instrument that can be used commercially and continuously monitor fluorescence during rapid cycle amplification. The thermal cycler of the present invention can amplify after 10-20 minutes and is connected to an optical module that detects one, two or three fluorophores. A preferred embodiment of the present invention monitors 24 samples at a rate of 1-10 times / second. According to the invention the samples are prepared in a 96-well format in a composite plastic / capillary vessel and transferred to an apparatus for thermal cycling and analysis (FIG. 11). Preferred embodiments include a user-centric graphical interface for analyzing fluorescence data and displaying them continuously on a display.

본 발명은 또한 증폭의 실시간 제어 및 최적화를 위해 형광 피이드백을 사용한다. 형광이 온도 싸이클링 제어에 사용된다. dsDNA 특이성 염료의 연속 모니터링으로 형광 증가가 중단되후에 각 싸이클마다 신장이 종료된다. 변성 조건은 생성물이 완전 용융될때까지 온도를 증가시킴으로써 자동으로 제어된다. 프라이머 어닐링은 Cy5-라벨링된 올리고누클레오타이드로의 공명에너지 전달로 모니터링된다. 온도 싸이클링은 특정량의 생성물이 형성된 이후에 자동으로 종료된다.The present invention also uses fluorescent feedback for real-time control and optimization of amplification. Fluorescence is used for temperature cycling control. Continuous monitoring of the dsDNA specific dye causes the extension to stop after each cycle after fluorescence increase ceases. Denaturation conditions are automatically controlled by increasing the temperature until the product is completely melted. Primer annealing is monitored by resonance energy transfer to Cy5-labeled oligonucleotides. Temperature cycling ends automatically after a certain amount of product has been formed.

신속한 온도 싸이클링의 장점이 인식되고 있다. 최소의 어닐링 및 변성 횟수와 신속한 온도 싸이클링은 PCR 정량을 개선하며 대립유전자 특이성 증폭의 구별능력을 개선한다. 신속한 싸이클링은 서열화 모호성을 감소시키며 디누클레오타이드 반복 증폭에서 "섀도우 밴딩"을 최소화 시킨다. 35kb까지의 긴 PCR의 경우에 높은 변성온도에 샘플이 가능한 적게 노출될 때 수율이 향상된다.The advantages of rapid temperature cycling are recognized. Minimal annealing and denaturation times and rapid temperature cycling improve PCR quantification and improve discrimination of allele specific amplification. Rapid cycling reduces sequencing ambiguity and minimizes "shadow banding" in dinucleotide repeat amplification. Long PCR up to 35 kb yields improved yields when the sample is exposed to as low as possible at high denaturation temperatures.

PCR 용으로 효과적이며 경제적인 신속한 싸이클러는 당해 산업에 큰 진보를 가져올 것이다. 공지 기술의 장치는 비싸고 복잡하다. 예컨대, Perkin Elmer 9600은 한시간 정도 이후에 두가지 온도 프로파일(60℃, 94℃)을 30싸이클 진행시키지만 비싸며 샘플내 온도 균일성이 문제이며 상당한 샘플내부 대류가 있다(Wittwer, C.T., G.B. Reed and K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification, in K. Mullis, F. Ferre, and R. Gibbs (Eds.), The Polymerase Chain Reaction, Springer-Verlag, Deerfield Beach, Florida, pp. 174-181, 1994 and Haff L., J.G. Atwood, J. Dicesare, E. Katz, E. Picozza, J.F. Williams, T. Woudenberg, A high-performance system for automation of the polymerase chain reaction, BioTechniques 10:102-112, 1991). 또다른 예는 kodak에 의해 개발되어 PCR증폭 및 탐지를 위해 열밀봉된 플라스틱 "PCR 포치"를 활용하는 폐쇄 용기 시스템을 사용하는 장치이다. kodak의 장치에서 샘플은 두 개의 가열/냉각 플레이트 사이에서 샌드위치로서 온도 싸이클링된다. 2개의 온도 프로파일(62℃, 94℃)의 30싸이클에 걸리는 시간은 약 30분이다. 이들 두가지 장치 모두 상당한 문제가 있다.An effective and economical fast cycler for PCR will bring great advances in the industry. Known devices are expensive and complex. For example, the Perkin Elmer 9600 proceeds 30 cycles of two temperature profiles (60 ° C, 94 ° C) after an hour or so, but it is expensive, temperature uniformity issues in the sample and significant internal convection (Wittwer, CT, GB Reed and KM Ririe). , Rapid cycle DNA amplification, in K. Mullis, F. Ferre, and R. Gibbs (Eds.), The Polymerase Chain Reaction, Springer-Verlag, Deerfield Beach, Florida, pp. 174-181, 1994 and Haff L., JG Atwood, J. Dicesare, E. Katz, E. Picozza, JF Williams, T. Woudenberg, A high-performance system for automation of the polymerase chain reaction, BioTechniques 10: 102-112, 1991). Another example is a device developed by kodak that uses a closed vessel system utilizing a heat sealed plastic "PCR porch" for PCR amplification and detection. In kodak's apparatus the samples are temperature cycled as sandwiches between two heating / cooling plates. The time taken for 30 cycles of two temperature profiles (62 ° C, 94 ° C) is about 30 minutes. Both of these devices have significant problems.

본 발명을 따르면, PCR반응 패러다임이 적절하다. PCR을 3가지 상이한 온도에서 일어나는 3개의 반응(변성, 어닐링, 신장)으로 생각하지 않으면 PCR 반응 패러다임은 더욱 적절할 수 있다(도 28). 반응 패러다임을 사용하면 온도대 시간 곡선은 중접 반응간의 연속 전이로 구성된다. 완전한 분석을 위해서는 모든 온도에 걸쳐 관련된 속도상수에 대한 지식이 필요하다. 모든 반응의 속도상수가 알려지면 "PCR의 물리학적 표현"이 개발된다. 이러한 속도상수 결정은 정확한 샘플 온도 제어를 필요로 하며 온도 싸이클링동안 반응을 모니터링 함으로써 도움을 받는다.According to the present invention, the PCR reaction paradigm is appropriate. The PCR reaction paradigm may be more appropriate if PCR is not considered to be three reactions (denaturation, annealing, elongation) occurring at three different temperatures (FIG. 28). Using the reaction paradigm, the temperature versus time curve consists of continuous transitions between overlapping reactions. A complete analysis requires knowledge of the relevant rate constants across all temperatures. Once the rate constants of all reactions are known, the "physical representation of PCR" is developed. This rate constant determination requires accurate sample temperature control and is aided by monitoring the reaction during temperature cycling.

본 발명은 샘플의 연속 모니터링으로부터 발생하는 장점을 제공한다. PCR 정량을 위해 싸이클마다 형광을 모니터링 하는 장점을 제공하며 에티듐 브로마이드를 사용할때도 좋다. 싸이클마다 한 번 모니터링 할 경우에 조합된 어닐링/신장 단계동안 싸이클마다 한 번 형광이 수득되어서 생성물 농도에 대한 상대적 값을 제공한다.The present invention provides the advantages resulting from continuous monitoring of the sample. It offers the advantage of monitoring fluorescence from cycle to cycle for PCR quantitation and is also good when using ethidium bromide. If monitored once per cycle, fluorescence is obtained once per cycle during the combined annealing / extension step to provide a relative value for product concentration.

본 발명에 따라서, 시간, 온도 및 dsDNA 형광이 200msec마다 수득되므로 생성물 변성 및 재어닐링에 대한 세부사항이 신속한 온도 싸이클링동안 관찰될 수 있다. 이러한 세부사항은 용융곡선에 의해 생성물 식별을 가능케 하며 상대적 및 절대적 생성물 정량 수단을 제공하며 돌연변이 탐지 및 온도 제어를 위한 순간적인 피이드백 수단을 제공한다. 연속 모니터링에 추가적으로 서열 특이성 프로브의 용융은 공명 에너지 전달에 의해 결정될 수 있다. 프로브 용융은 생성물 정량화 및 단일 염기 돌연변이 탐지에도 이용되는 특정 온도에서 일어난다.According to the present invention, time, temperature and dsDNA fluorescence are obtained every 200 msec so that details of product denaturation and reannealing can be observed during rapid temperature cycling. These details enable product identification by melt curves, provide relative and absolute product quantification means, and provide instantaneous feedback means for mutation detection and temperature control. In addition to continuous monitoring, the melting of sequence specificity probes can be determined by resonance energy transfer. Probe melting occurs at specific temperatures that are also used for product quantification and single base mutation detection.

PCR 정량에 본 발명의 적용이 기술될 것이다. 공지의 PCR 정량 방법은 노동 집약적이고 비싸다. 대개의 공지 방법은 종말점 분석을 사용하므로 정확한 결과를 위해서 양호한 초기 추정을 필요로 한다. 염료를 사용하여 싸이클마다 한 번 dsDNA 형광 모니터링하는 것은 넓은 동적 범위의 초기 템플레이트 농도가 분석될 수 있게하는 중요한 진보이다. 그러나, 온도 싸이클내에서 본 발명의 연속 모니터링은 생성물 순도 확인, 경쟁자와의 동시적 상대적 정량화, 및 생성물의 절대농도 결정을 가능케한다. 이러한 모든 정보는 10 내지 20분의 온도싸이클 내에서 게놈 dsDNA 인디케이터를 갖는 하나의 모세관 샘플 튜브로부터 수득될 수 있다. 내부 서열 특이성에 기초한 정량화 역시 두가지 색깔 분석과 공명에너지 전달을 사용하여 가능하다.Application of the invention to PCR quantification will be described. Known PCR quantification methods are labor intensive and expensive. Most known methods use endpoint analysis and require good initial estimates for accurate results. Monitoring dsDNA fluorescence once per cycle with the dye is an important advance that allows the initial dynamic concentration of a wide dynamic range to be analyzed. However, continuous monitoring of the present invention in temperature cycles allows for product purity confirmation, simultaneous relative quantification with competitors, and determination of absolute concentrations of product. All this information can be obtained from one capillary sample tube with genomic dsDNA indicator in a temperature cycle of 10-20 minutes. Quantification based on internal sequence specificity is also possible using two color analyzes and resonance energy transfer.

돌연변이 탐지에 본 발명의 응용이 기술된다. 유전자에서 돌연변이 스크린잉은 어려운 일이다. 공지 방법(변성 그레디언트 겔 전기영동, 온도 그레디언트 겔 전기영동, 단일쇄 구조다형성 및 서열화)은 전기 영동 이후의 PCR 증폭 및 후속 탐지를 필요로한다. dsDNA 염료를 사용한 용융곡선은 PCR 동안 헤테로듀플렉스를 생성하는 이질접합성 돌연변이를 식별할 수 있다. 추가 샘플처리나 설비의 필요성 없이 증폭동안 분석이 이루어진다. 예컨대, 이질접합 탐지는 유방암에 대한 게놈 민감성 평가에서 중요하다(Shattuck-Eidens D., M. McClure, J. Simard, F. Labrie, S. Narod, F. Couch, D. Hoskins, B. Wever, L. Castilla, M. Erdos, L. Brody, L. Friedman, E. Ostermeyer, C. Szabo, M.C. King, S. Jhanwar, K. Offit, L. Norton, T. Gelewski, M. Lubin, M. Osborne, D. Black, M. Boyd, S. Steel, S. Ingles, R. Haile, A. Lindblom, H. Olsson, A. Borg, D.T. Bishop, E. Solomon, P. Radice, G. Spatti, S. Gayther, B. Ponder, W. Warren, M. Stratton, Q. Liu, F. Fujimura, C. Lewis, M.H. Skolnick, D.E. Goldgar, A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarian cancer susceptibility gene, Implications for presymptomatic testing and screening, J. Amer. Med. Assoc. 273:535-541, 1995). BRCA1 및 BRCA2 유전자(>10,000염기)를 서열화 함으로써 돌연변이를 탐지하는 것은 임상 테스트로서 가능하지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 헤테로듀플렉스 스크린잉을 사용하여 테스트 비용이 크게 절감될 수 있다. 특이적 돌연변이가 PCR동안 공명에너지 전달을 통한 서열 특이성 프로브를 사용하여 탐지될 수 있다.The application of the invention to mutation detection is described. Mutation screening in genes is difficult. Known methods (denatured gradient gel electrophoresis, temperature gradient gel electrophoresis, single chain polymorphism and sequencing) require PCR amplification and subsequent detection after electrophoresis. Melt curves with dsDNA dyes can identify heterozygous mutations that produce heteroduplexes during PCR. Analysis is done during amplification without the need for additional sample processing or equipment. For example, heterozygosity detection is important in assessing genome sensitivity for breast cancer (Shattuck-Eidens D., M. McClure, J. Simard, F. Labrie, S. Narod, F. Couch, D. Hoskins, B. Wever, L. Castilla, M. Erdos, L. Brody, L. Friedman, E. Ostermeyer, C. Szabo, MC King, S. Jhanwar, K. Offit, L. Norton, T. Gelewski, M. Lubin, M. Osborne , D. Black, M. Boyd, S. Steel, S. Ingles, R. Haile, A. Lindblom, H. Olsson, A. Borg, DT Bishop, E. Solomon, P. Radice, G. Spatti, S. Gayther, B. Ponder, W. Warren, M. Stratton, Q. Liu, F. Fujimura, C. Lewis, MH Skolnick, DE Goldgar, A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarian cancer susceptibility gene, Implications for presymptomatic testing and screening, J. Amer. Med. Assoc. 273: 535-541, 1995). Detecting mutations by sequencing the BRCA1 and BRCA2 genes (> 10,000 bases) may not be possible as a clinical test. Using heteroduplex screening according to the present invention the test cost can be greatly reduced. Specific mutations can be detected using sequence specificity probes through resonance energy transfer during PCR.

PCR의 연속 모니터링에 최상의 프로브는 특이적이며 값이 싸야 할 것이다. 이중쇄 DNA(dsDNA)가 모든 증폭에 사용될 수 있으며 값이 싸다. 예컨대, SYBR Green I은 10㎕당 0.01센트이다. 추가로, 생성물 특이성이 용융곡선의 분석에 의해 가능하다. 그러나, 서열 특이성이 필요할 때 형광성 올리고누클레오타이드 프로브가 각 서열에 대해 합성되어야 한다. Perkin Elmer의 "TaqMan" 프로브는 각 프로브에 2개의 형광단을 포함시킨다. 프로브가 폴리메라제 엑소누클레아제 활성에 의해 가수분해될 때 형광이 발생된다. 이러한 프로브는 제조가 어렵고 비싸다; 프로브 0.1μmol당 1,200$. 타겟의 경쟁적인 정량에 두가지 프로브가 필요하다. 이에 비해서 가수분해에 종속되지 않는 형광 교합 프로브가 디자인될 수 있다. 교합프로브는 프로브마다 단일한 형광단을 필요로 하며 합성이 훨씬 쉽다. 이들의 형광은 가수분해가 아니라 교합에서 나오므로 프로브 형광의 온도 종속성이 돌연변이 탐지 및 정량에 사용될 수 있다.The best probes for continuous monitoring of PCR will be specific and inexpensive. Double-stranded DNA (dsDNA) can be used for all amplification and is cheap. For example, SYBR Green I is 0.01 cent per 10 μl. In addition, product specificity is possible by analysis of the melting curve. However, when sequence specificity is required, fluorescent oligonucleotide probes must be synthesized for each sequence. Perkin Elmer's "TaqMan" probe contains two fluorophores in each probe. Fluorescence occurs when the probe is hydrolyzed by the polymerase exonuclease activity. Such probes are difficult and expensive to manufacture; $ 1,200 per 0.1 μmol probe. Two probes are required for competitive quantitation of the target. In contrast, fluorescent bite probes that are not subject to hydrolysis can be designed. Occlusion probes require a single fluorophore per probe and are much easier to synthesize. Since their fluorescence comes from occlusion rather than hydrolysis, the temperature dependence of probe fluorescence can be used for mutation detection and quantification.

공지의 탐지 기기는 수많은 결점을 갖는다. 과거에는 기기의 한계 때문에 가수분해 프로브의 경우 종말점 탐지만 가능했었다. 본 발명의 시스템에 의해서 신속하고 정확한 온도 싸이클링이 제공된다. 본 발명의 시스템에 의해 제공된 연속 형광 모니터링을 사용하여 교합의 온도 의존성이 추구될 수 있다. 온도 싸이클링동안 교합을 추구함으로써 필요한 스펙트럼 색깔 또는 프로브의 갯수가 최소화될 수 있다. 경제적인 이유로 샘플 조사용 레이저 대신에 높은 세기의 빛을 방출하는 다이오드가 사용되며 포토다이오드가 탐지에 사용된다. 샘플은 유리 모세관 샘플튜브나 열밀봉을 필요로 하지 않은 96-웰 포맷으로 복합유리/플라스틱 샘플 튜브에 채워진다. 본 발명은 저렴한 비용으로 실시간 형광 분석을 제공한다. 온도 싸이클링의 실시간 형광 제어는 증폭질을 향상시킨다. 예컨대, 변성이 일어날때까지만 샘플의 온도가 증가된다면 고온에 생성물의 노출이 최소화된다. 이것은 생성물 및 효소의 분해를 제한시켜 수율을 증가시키고 높은 용융온도로 생성물의 증폭을 제한함으로써 특이성을 증가시킨다.Known detection devices have numerous drawbacks. In the past, due to instrument limitations, hydrolysis probes could only detect endpoints. The system of the present invention provides fast and accurate temperature cycling. The temperature dependence of the occlusion can be sought using the continuous fluorescence monitoring provided by the system of the present invention. By seeking occlusion during temperature cycling, the number of spectral colors or probes required can be minimized. For economic reasons, instead of the laser for sample irradiation, diodes emitting high intensity light are used, and photodiodes are used for detection. Samples are filled into composite glass / plastic sample tubes in 96-well format without the need for glass capillary sample tubes or heat seals. The present invention provides real time fluorescence analysis at low cost. Real-time fluorescence control of temperature cycling improves amplification. For example, if the temperature of the sample is increased only until denaturation occurs, exposure of the product to high temperatures is minimized. This increases specificity by limiting degradation of the product and enzymes, increasing yield and limiting amplification of the product to high melting temperatures.

도 29 는 증폭의 로그-선형 부위에서 10배 동적범위에 걸친 모니터링이 완전 수행됨을 보여준다. 게다가, 더 적은양의 템플레이트를 갖는 곤란한 증폭 뿐만 아니라 루틴 증폭(15,000 게놈 DNA 복제물/샘플튜브)을 수행한다.29 shows complete monitoring over a 10-fold dynamic range in the log-linear region of amplification. In addition, routine amplification (15,000 genomic DNA copies / sample tubes) is performed as well as difficult amplification with less template.

도 29 에 도시된 바와 같이, 형광비는 싸이클 횟수와 초기 템플레이트 농도에 따라 증가한다. 각 곡선의 로그-선형부위(직선, 가는선)는 4싸이클이다(DNA 농도에서 24 또는 16배 범위). 도 29 는 템플레이트의 단일 복제물이 무 템플레이트(0.15 평균 복제물 샘플중 하나가 단일 복제물을 포함)와 구별될 수 있음을 보여준다. 높은 초기 템플레이트 농도(15,000 및 1,500/샘플 튜브)에서 증폭 효율은 높고 일정하지만 더 낮은 초기 농도를 갖는 샘플에서 효율이 감소된다. 모든 샘플은 동시에 증폭되며 각 싸이클마다 데이타의 정량 표시와 분석이 된다. 20분 미만에 45싸이클 증폭이 완료된다.As shown in FIG. 29, the fluorescence ratio increases with cycle number and initial template concentration. The log-linear region (straight, thin line) of each curve is 4 cycles (24 or 16 times the range of DNA concentration). FIG. 29 shows that a single copy of a template can be distinguished from a template free (one of the 0.15 average replicate samples contains a single copy). At high initial template concentrations (15,000 and 1,500 / sample tubes) the amplification efficiency is high and constant but the efficiency is reduced in samples with lower initial concentrations. All samples are amplified simultaneously and quantitatively displayed and analyzed for each cycle. 45 cycles amplification is completed in less than 20 minutes.

도 30 은 단일 샘플의 연속 모니터링을 위한 구체예를 보여준다. 연속 모니터링 수행에 있어서 단일 샘플이 온도제어된 기류와 선형 광학 경로의 교차점에 놓인다. 모세관의 한면이 광방출 다이오드를 써서 조사되고 다른면은 포토다이오드를 써서 관찰된다. 공기가 샘플위로 일정하게 흐르며 상류 가열코일에 의해 온도가 제어된다. 샘플 및 용기의 모양 및 방향이 dsDNA 염료 SYBR Green I으로 염색된 인간 게놈 DNA를 써서 연구된다.30 shows an embodiment for continuous monitoring of a single sample. In performing continuous monitoring, a single sample is placed at the intersection of the temperature controlled air flow and the linear optical path. One side of the capillary is irradiated with a light emitting diode and the other side is observed with a photodiode. Air flows constantly over the sample and the temperature is controlled by an upstream heating coil. The shape and orientation of the samples and containers are studied using human genomic DNA stained with dsDNA dye SYBR Green I.

도 31 은 PCR 샘플의 연속 모니터링을 위한 또다른 구체예의 광학적 배치도이다. 모세관 샘플 튜브의 길이를 따른 총내부 반사("광 파이핑")가 이용되어서 활성화 및 방출률을 증가시킨다. 광학 경로가 선형으로 부터 변화되어서 활성화 및 방출되는 빛이 동일한 광학 경로를 따른다. 최대의 광 파이핑을 위해서 광학적 축이 모세관의 길이와 평행하며 모세관 팁이 촛점이 된다. 샘플의 굴절계수가 1.33이면 방출된 빛의 12.3%가 팁에 안내되어야 한다. 도 32 는 모세관 측부(개방원)보다는 팁(폐쇄된 다이아몬드)을 관찰함으로써 신호세기의 10배 증가로서 광파이핑의 효율을 보여주는 차트를 보여준다. 도 32 에서 두 개의 상이한 크기의 모세관 샘플튜브는 SYBR Green I으로 염색된 dsDNA를 써서 상이한 길이로 충진된다. 더 많은 샘플이 튜브에 첨가될 때 형광효율은 감소하지만 관찰된 형광은 증가한다.31 is an optical layout of another embodiment for continuous monitoring of PCR samples. Total internal reflection ("light piping") along the length of the capillary sample tube is used to increase the activation and emission rates. The optical path is changed from linear so that the light that is activated and emitted follows the same optical path. For maximum light piping, the optical axis is parallel to the length of the capillary and the capillary tip is focused. If the sample has a refractive index of 1.33, 12.3% of the emitted light should be guided to the tip. 32 shows a chart showing the efficiency of light piping as a 10-fold increase in signal strength by observing the tip (closed diamond) rather than the capillary side (open circle). In FIG. 32 two different size capillary sample tubes were filled with different lengths using dsDNA stained with SYBR Green I. As more samples are added to the tube the fluorescence efficiency decreases but the observed fluorescence increases.

도 11 에서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)가 연속 모니터링에 사용될 수 있다.In FIG. 11, a rapid temperature cycler 300 for detecting fluorescence may be used for continuous monitoring.

형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(300)가 도 11 에 표시된 유사기능 성분 대신에 광방출 다이오드(LED)와 포토다이오드를 사용하여 구축될 수 있다. 따라서, 형광 활성화 소스(328)는 광방출 다이오드를 가진다. 광 배증관(362A, B)이 포토다이오드 대신 사용될 수 있다. 민감성은 백그라운드 형광에 의해 한정되는데, 이의 대부분은 탐지 시스템이 아니라 프로브로 부터 나온다. 절대감도보다 안정성이 중요하다.A rapid temperature cycler 300 with fluorescence detection can be constructed using light emitting diodes (LEDs) and photodiodes instead of the similar functional components shown in FIG. 11. Thus, the fluorescent activation source 328 has a light emitting diode. Photomultipliers 362A, B may be used in place of photodiodes. Sensitivity is limited by background fluorescence, most of which comes from probes, not detection systems. Stability is more important than absolute sensitivity.

본 발명은 모세관 샘플 사용시 편광효과 때문에 발생하는 문제를 극복한다. 형광을 관찰하면 샘플의 편광은 광학 시스템이 편광된 빛을 무질서하지 않게 하는 것을 필요로 한다. 모세관 팁으로 부터 나오는 형광 모니터링은 다중 반사 때문에 편광을 무질서하게 만든다. 둥근 유리 모세관 측부에 편광된 빛이 조사될 때 관찰되는 편광은 도 33 에 도시된 활성화 비임에 대하여 튜브의 정확한 위치선정에 의해 좌우된다.The present invention overcomes the problems caused by the polarization effect when using capillary samples. Observing the fluorescence, the polarization of the sample requires the optical system to not disorder the polarized light. Fluorescence monitoring from the capillary tip disrupts polarization due to multiple reflections. The polarization observed when the polarized light is irradiated on the round glass capillary side depends on the exact positioning of the tube with respect to the activation beam shown in FIG. 33.

본 발명에 따라서 형광 편광 프로브가 사용될 수 있다. 편광 프로브는 상이한 길이의 아미노링커에 의해 연결된 5'-형광제를 써서 30-머 로서 합성된다. PCR동안 폴리메라제의 5'-엑소누클레아제 활성은 프로브를 절단하여 증폭동안 편광을 감소시킨다. 완전한 프로브는 포스포디에스테르아제 I로 가수분해될 때 35mp까지 감소되는 약 90 밀리편광 단위(mp)의 편광을 가진다. 도 34 는 템플레이트로서 게놈 DNA를 사용한 단일 복제물 유전자의 증폭에서 0.2μM로 포함되는 하나의 프로브를 사용하여 수득되는 결과를 보여준다. 편광은 20 내지 30싸이클에서 감소되며 적어도 50싸이클까지 계속 감소한다. 수직 편광에 평행한 비율로서 표현된 감소는 11%이다. 링커의 길이, 아미노링커의 종류 및 5'-비상보성 테일의 존재/부재는 PCR동안 관찰되는 변화를 크게 바꾸지는 않는다. 용액의 점도를 증가시키기 위해서 설탕을 첨가하면 완전한 프로브와 가수분해된 프로브의 편광을 증가시키지만 증폭후 발생된 신호차이를 변화시키지 못한다.Fluorescent polarization probes can be used in accordance with the present invention. Polarizing probes are synthesized as 30-mers using 5'-fluorescent agents linked by aminolinkers of different lengths. The 5'-exonuclease activity of the polymerase during PCR cleaves the probe to reduce polarization during amplification. The complete probe has a polarization of about 90 millipolar units (mp) that is reduced to 35 mp when hydrolyzed with phosphodiesterase I. 34 shows the results obtained using one probe included at 0.2 μM in amplification of a single copy gene using genomic DNA as a template. Polarization is reduced in 20 to 30 cycles and continues to decrease until at least 50 cycles. The reduction expressed as the ratio parallel to the vertical polarization is 11%. The length of the linker, the type of aminolinker and the presence / absence of 5'-complementary tails do not significantly alter the changes observed during PCR. Adding sugar to increase the viscosity of the solution increases the polarization of the complete and hydrolyzed probes but does not change the signal difference generated after amplification.

엑소누클레아제 가수분해에 의해서 편광이 감소하지만 가수분해없는 교합은 편광을 증가시킨다. 본 발명에 따르면 형광제로 라벨링된 15-단위 펩티드 핵산이 사용된다. 아미드 기본골격으로 인하여 엑소누클레아제 활성에 의해 가수분해되지 않는다. 10배의 정제된 상보적 단일쇄 PCR 생성물에 교합될 때 이의 편광은 85로부터 97mp로 증가한다.Polarization is reduced by exonuclease hydrolysis, but occlusion without hydrolysis increases polarization. According to the invention a 15-unit peptide nucleic acid labeled with a fluorescent agent is used. It is not hydrolyzed by exonuclease activity due to the amide backbone. When occluded in a 10-fold purified complementary single chain PCR product, its polarization increases from 85 to 97 mp.

요약하면, 형광제 라벨링된 프로브는 교합 또는 가수분해될 때 편광변화를 보인다. 이러한 변화가 PCR 모니터링에 사용될 수 있지만 변화는 작다. 본 발명은 쇄 변위 증폭을 위해 교합의 작은 편광 신호를 증가시키는 방법에 사용될 수 있다. 절단 활성이 부족하지만 결합 특이성을 유지하는 엔도누클레아제 EcoRI의 유전학적으로 변경된 형태가 복합물의 편광을 증가시키는데 사용되었다.In summary, fluorescently labeled probes show a polarization change when occlusion or hydrolysis. These changes can be used for PCR monitoring but the changes are small. The present invention can be used in a method of increasing the small polarized signal of the bite for chain displacement amplification. A genetically altered form of endonuclease EcoRI, which lacks cleavage activity but retains binding specificity, has been used to increase the polarization of the complex.

공명에너지 전달 프로브가 본 발명에 사용될 수 있다. 공명에너지 전달 프로브는 더 높은 신호세기로 인하여 PCR 모니터링을 하는데 편광 프로브에 비해 우월하다. PCR에서 공명에너지 전달의 공지기술의 사용은 단지 종말점 분석에 국한된다. 프로브 디자인은 신호 발생을 위한 엑소누클레아제 활성에 달려있다. 이중라벨링된 형광제/로오다민 프로브가 5'-엑소누클레아제 활성에 의해서 폴리메라제 신장동안 절단되고 형광단을 분리시키고 형광제/로오다민 방출비를 증가시킨다. 도 35 는 형광제와 로오다민 라벨사이에 5개의 염기가 있는 프로브에서 나오는 형광 PCR 결과를 보여준다. 도 11 의 형광탐지용 신속한 온도 싸이클러(300)를 사용하여 20분후에 45싸이클 증폭이 완료된다. 싸이클마다 형광비를 모니터링함으로써 초기 템플레이트 농도의 109배 범위가 구별될 수 있다. 증폭곡선은 초기 템플레이트 농도에서 10배 변화마다 약 3-4싸이클 이동된다. 초기 템플레이트 농도가 낮을 때 효율이 감소하지만 무템플레이트와 단일 복제물이 구별될 수 있다.Resonance energy transfer probes can be used in the present invention. Resonance energy transfer probes are superior to polarized probes for PCR monitoring due to their higher signal strength. The use of known techniques of resonance energy transfer in PCR is limited to endpoint analysis only. Probe design depends on exonuclease activity for signal generation. Dual-labeled fluorescent / rhoodamine probes are cleaved during polymerase extension by 5′-exonuclease activity to separate the fluorophores and increase the fluorescent / rhoodamine release ratio. FIG. 35 shows fluorescence PCR results from a probe with five bases between the fluorescent and rhodaramine labels. The 45 cycle amplification is completed after 20 minutes using the rapid temperature cycler 300 for fluorescence detection in FIG. By monitoring the fluorescence ratio from cycle to cycle, a range of 10 9 times the initial template concentration can be distinguished. The amplification curve shifts about 3-4 cycles every 10-fold change in initial template concentration. Efficiency is reduced when the initial template concentration is low, but a template and a single copy can be distinguished.

가수분해 모니터링에 의해 발생된 신호는 누적되어서 생성물 농도에 간접적으로 관련된다. 도 35 에 도시된 바와 같이 생성물의 양이 평형이 된 이후에도 형광비는 계속 증가한다. 그럼에도 불구하고 형광신호는 32P-dATP 포함에 의해 측정된 PCR 생성물의 양과 적어도 평형단계까지 잘 상관된다.The signal generated by hydrolysis monitoring accumulates and indirectly relates to product concentration. As shown in FIG. 35, the fluorescence ratio continues to increase even after the amount of the product is equilibrated. Nevertheless, the fluorescence signal correlates well with the amount of PCR product measured by inclusion of 32 P-dATPs, at least up to equilibrium.

도 36 에 도시된 바와 같이 프로브의 농도는 민감성에 거의 영향을 주지 않는다. 프로브 농도를 40배 증가시키면 곡선을 단지 2싸이클 이동시킬뿐이다. 더 낮은 프로브 농도는 약간 더 민감하지만 더 낮은 신호세기로 인하여 더욱 가변적이다. 도 36 의 데이타는 각 프로브 농도에서 최대 신호로 정규화된다. 프로브 농도 감소가 동일한 양의 가수분해된 프로브에 더 큰 신호를 제공하지만 이러한 장점은 더 낮은 교합률에 의해 상쇄된다. 타겟에 프로브의 교합률은 프로브 농도에 의해 직접적으로 좌우된다.As shown in FIG. 36, the concentration of the probe has little effect on sensitivity. Increasing the probe concentration by 40 times only shifts the curve by two cycles. Lower probe concentrations are slightly more sensitive but more variable due to lower signal strength. The data in FIG. 36 is normalized to the maximum signal at each probe concentration. Although decreasing probe concentration provides a greater signal to the same amount of hydrolyzed probes, this advantage is offset by lower occlusion rates. The occlusion rate of the probe to the target is directly dependent on the probe concentration.

형광제, 로오다민, 에오신 또는 BODITY 염료(Molecular probes로 부터 구매가능)로 라벨링된 수많은 가수분해 프로브가 사용될 수 있다. 일반적으로, 형광단간의 간격이 감소할 때 퀀칭 또는 에너지 전달은 증가하지만 PCR동안 가수분해는 감소한다. 가수분해를 필요로 하는 공명에너지 전달 프로브는 주목할만한 특성을 가진다. 한가지 특성은 일부 프로브가 가수분해에 대해 저항성이다는 점이다. 또다른 특성은 합성이 곤란하며 적어도 하나의 라벨의 수동 첨가와 정제를 위해 HPLC를 필요로 한다는 점이다.Numerous hydrolysis probes may be used that are labeled with a fluorescent agent, rhodamine, eosin or BODITY dye (available from Molecular probes). In general, as the spacing between fluorophores decreases, quenching or energy transfer increases but hydrolysis during PCR decreases. Resonant energy transfer probes that require hydrolysis have notable properties. One property is that some probes are resistant to hydrolysis. Another property is that synthesis is difficult and requires HPLC for the manual addition and purification of at least one label.

Cy5는 올리고누클레오타이드에 직접 포함시키기 위한 아미다이트로서 최근에 이용되는 적색 염료이다. 광학 성분으로 선택될 때 적색/적외선 지역의 스펙트럼에서 작용하는 것이 이득이 된다. 조사를 위해 레이저 다이오드가 사용되며 포토다이오드 탐지기는 탁월한 감도를 가지며 관련 스펙트럼 지역에서 대부분의 물질은 최소의 자가 형광을 가진다. 본 발명과 관련하여 Cy5/Cy7 프로브가 개발되었다. 이러한 프로브를 사용할 때 신호가 약하지만 증폭이 탐지가능하다. 이 프로브가 포스포디에스테르아제에 의해 완전 가수분해되면 단지 2배의 신호증가가 관찰된다. PCR의 20과 40싸이클 사이에서 도 37 에 도시된 대로 1.3배의 신호증가가 일어난다. Cy5/Cy7 프로브의 합성은 Cy7의 수동 첨가를 필요로 한다.Cy5 is a red dye recently used as an amidite for incorporation directly into oligonucleotides. It is advantageous to work in the spectrum of the red / infrared region when selected as an optical component. Laser diodes are used for irradiation, photodiode detectors have excellent sensitivity, and most materials in the relevant spectral region have minimal autofluorescence. Cy5 / Cy7 probes have been developed in connection with the present invention. When using these probes the signal is weak but amplification is detectable. When this probe is fully hydrolyzed by the phosphodiesterase, only a twofold increase in signal is observed. Between 20 and 40 cycles of PCR there is a 1.3-fold increase in signal as shown in FIG. 37. Synthesis of Cy5 / Cy7 probes requires manual addition of Cy7.

이중 라벨링된 형광제 및 Cy5 프로브는 자동화된 올리고누클레오타이드 합성기에서 용이하게 제조된다. 형광제/Cy5 프로브는 포스포디에스테르아제에 의해 완전 가수분해될 때 탁월한 형광비 변화를 보인다. 형광제와 Cy5의 방출 파장이 분리되고 도 38 에 도시된 대로 형광단 사이에 효과적인 공명에너지 전달이 일어난다. 스펙트럼 중첩이 작지만 Cy5의 몰 흡수계수와 흡수파장은 높다. 스펙트럼 중첩, 받게 흡수성, 및 받게 파장은 모두 에너지 전달속도를 결정하는 중첩 적분에 기여한다. Cy5는 형광제 활성화 파장에서 낮은 흡수성을 가지므로 Cy5의 직접적인 활성화는 최소이다.Dual labeled fluorescent agents and Cy5 probes are readily prepared in automated oligonucleotide synthesizers. Fluorescent / Cy5 probes show excellent fluorescence ratio changes when fully hydrolyzed by phosphodiesterases. The emission wavelength of the fluorophore and Cy5 is separated and effective resonance energy transfer occurs between the fluorophores as shown in FIG. Although the spectral overlap is small, the molar absorption coefficient and absorption wavelength of Cy5 are high. The spectral overlap, the receive absorbance, and the receive wavelength all contribute to the overlap integration, which determines the rate of energy transfer. Cy5 has low absorption at the fluorescent activation wavelength and therefore direct activation of Cy5 is minimal.

형광제/Cy5 프로브는 PCR동안 효과적으로 가수분해되지 않는다. 완전 가수분해로 형광비가 200배 증가할 수 있지만 선호되는 형광제/Cy5 프로브는 PCR의 20과 40 싸이클 사이에 단지 1.45배 증가를 제공한다(도 37). 형광단 사이에 다양한 스페이서로 그리고 5'단부에 형광제 또는 Cy5를 써서 여러 형광제/Cy5 프로브가 합성된다. 모든 프로브는 PCR에 낮은 신호를 제공한다. 가수분해 프로브를 사용한 결과가 아래에 요약된다:Fluorescent / Cy5 probes do not hydrolyze effectively during PCR. Full hydrolysis can increase the fluorescence ratio by 200-fold, but the preferred fluorophore / Cy5 probe provides only a 1.45-fold increase between 20 and 40 cycles of PCR (FIG. 37). Several fluorophores / Cy5 probes are synthesized with various spacers between the fluorophores and the fluorescent or Cy5 at the 5 ′ end. All probes provide low signal to PCR. The results using the hydrolysis probe are summarized below:

엑소누클레아제 프로브를 사용한 형광신호발생Fluorescence Signal Generation Using Exonuclease Probe

형광단 Fluorophores 완전가수분해로 형광비 증가Increased fluorescence ratio by complete hydrolysis PCR 40싸이클로 형광비 증가Increased fluorescence ratio with PCR 40 cycles 형광제Fluorescent 로오다민Roodamin 25배25 times 8배8 times 형광제Fluorescent Cy5Cy5 200배200 times 1.45배1.45 times Cy5Cy5 Cy7Cy7 2배Twice 1.3배1.3x

이중 라벨링된 형광제/Cy5 올리고누클레오타이드의 가수분해에 대한 저항성은 프로브 가수분해 대신에 프로브 교합에 의존하는 공명 에너지 전달 스킴을 개발함으로써 장점이 될 수 있다. 이중 라벨링된 프로브의 가수분해 대신에 PCR동안 공명에너지 전달에 의해 교합이 직접 탐지될 수 있다. 이중라벨링된 엑소누클레아제 프로브에 비해서 단일 라벨링된 프로브의 합성은 비교적 간단하다.Resistance to hydrolysis of the double labeled fluorescent agent / Cy5 oligonucleotide may be advantageous by developing a resonance energy transfer scheme that relies on probe occlusion instead of probe hydrolysis. The occlusion can be detected directly by resonance energy transfer during PCR instead of hydrolysis of the double labeled probe. Synthesis of single labeled probes is relatively simple compared to double labeled exonuclease probes.

PCR동안 교합의 공명에너지 전달 탐지를 위해 두가지 상이한 방법이 도 39 에 도시된다. 첫 번째 방법은 하나는 형광제로 3'이 라벨링되고 다른 하나는 Cy5로 5'이 라벨링된 두 개의 인접 교합 프로브를 사용하는 것이다. PCR동안 생성물이 누적될 때 각 싸이클의 어닐링 단계동안 프로브는 서로 인접하게 교합한다. 두 번째 방법은 Cy5로 라벨링된 프라이머와 단일 교합 프로브를 사용하는 것이다. 라벨링된 프라이머는 증폭동안 PCR 생성물에 포함되므로 단일 교합만이 필요하다. 두 방법에서 Cy5로의 형광 에너지 전달은 교합에 따라 증가하고 형광제에 대한 Cy5의 형광비로서 도시된다. 형광은 2-온도 어닐링/신장 세그멘트의 단부 근처에서 매 싸이클마다 모니터링 된다. 교합 프로브의 민감성은 가수분해 프로브와 유사하다(도 29 와 도 39 비교).Two different methods are shown in FIG. 39 for detection of resonance energy transfer of occlusion during PCR. The first method is to use two adjacent occlusal probes, one labeled 3 'with fluorescent and the other labeled 5' with Cy5. When products accumulate during PCR, the probes occupy adjacent one another during the annealing step of each cycle. The second method is to use a single occlusion probe with a primer labeled Cy5. Labeled primers are included in the PCR product during amplification, so only a single bite is required. In both methods the fluorescence energy transfer to Cy5 increases with occlusion and is shown as the fluorescence ratio of Cy5 to the fluorescent agent. Fluorescence is monitored every cycle near the end of the 2-temperature annealing / extension segment. The sensitivity of the occlusal probe is similar to that of the hydrolysis probe (compare FIGS. 29 and 39).

교합 프로브에서 나오는 형광의 온도 종속성이 도 40 의 형광대 온도 플롯으로 설명된다. 이 플롯은 200msec의 온도싸이클링마다 단일 샘플을 모니터링 함으로써 발생된다. 어닐링/신장 단계동안 프로브는 단일쇄 생성물로 교합하므로 형광비(Cy5/형광제)가 증가한다. 생성물 변성온도로 가열하는 동안 프로브는 70-75℃ 부근에서 해리하고 형광비는 백그라운드 비율로 복귀한다. 이에 비해서, 가수분해 프로브는 이러한 온도 종속성을 보이지 않는다(도 41). 가수분해 프로브 사용시 형광대 온도 플롯은 온도에 따라 형광의 선형 종속성을 보일 뿐이다. 온도 싸이클링 동안 형광으로 교합을 모니터링하는 것은 강력한 도구이다. 서열 특이성 프로브의 용융온도는 PCR동안 생성물을 식별 및 판별할 수 있다.The temperature dependence of fluorescence coming out of the occlusal probe is illustrated by the fluorescence band temperature plot of FIG. 40. This plot is generated by monitoring a single sample every 200 msec temperature cycling. During the annealing / extension step the probes occupy single chain products, thus increasing the fluorescence ratio (Cy5 / phosphor). During heating to product denaturation temperature the probe dissociates around 70-75 ° C. and the fluorescence ratio returns to the background ratio. In contrast, hydrolysis probes do not exhibit this temperature dependency (FIG. 41). Fluorescence band temperature plots using hydrolysis probes only show a linear dependence of fluorescence with temperature. Monitoring occlusion with fluorescence during temperature cycling is a powerful tool. The melting temperature of the sequence specificity probe can identify and discriminate the product during PCR.

본 발명의 다양한 측면에 따라서 이중쇄 특이성 염료가 사용될 수 있다. PCR 생성물의 쇄 상태는 dsDNA의 존재하에서 형광을 발휘하는 염료를 사용하여 추구될 수 있다. 증폭동안 SYBR Green I이 존재할 때 더 많은 dsDNA가 형성됨에 따라 형광이 증가한다. 그러나, 형광은 도 42a 및 42b 에 도시된 바와 같이 온도에 반비례하므로 온도 싸이클링은 교란효과를 도입한다. 형광이 PCR동안 온도 및 시간의 함수로서 연속 모니터링될 때 데이타는 도 12 에 도시된 대로 3차원 나선을 형성한다. 도 12 에 도시된 3차원 곡선은 온도대 시간, 형광대 시간, 형광대 온도의 2차원 플롯으로 투영될 수 있다. 도 12 의 온도대 시간 투영도는 싸이클마다 반복되며 유사한 형태가 도 42b 의 하부에 도시된다. 도 12 의 형광대 시간 투영도는 도 42b 에 도시된 온도대 시간 플롯의 거울상이다. 생성물이 축적됨에 따라 변성온도에서를 제외하고는 형광이 증가하며, 변성 온도에서 형광은 도 12 에 도시된 대로 기준선으로 복귀한다.Double chain specific dyes may be used in accordance with various aspects of the present invention. The chain state of the PCR product can be pursued using a dye that fluoresces in the presence of dsDNA. Fluorescence increases as more dsDNA is formed when SYBR Green I is present during amplification. However, since fluorescence is inversely proportional to temperature as shown in Figs. 42A and 42B, temperature cycling introduces a disturbing effect. When fluorescence is continuously monitored as a function of temperature and time during PCR, the data forms three-dimensional helices as shown in FIG. 12. The three-dimensional curve shown in FIG. 12 may be projected as a two-dimensional plot of temperature zone time, fluorescent zone time, fluorescent zone temperature. The temperature versus time projection of FIG. 12 is repeated cycle by cycle and a similar form is shown at the bottom of FIG. 42B. The fluorescence band time projection of FIG. 12 is a mirror image of the temperature band time plot shown in FIG. 42B. As the product accumulates, the fluorescence increases except at the denaturation temperature, and the fluorescence returns to the baseline as shown in FIG. 12.

형광대 온도 투영도는 PCR동안 쇄 상태의 온도 종속성을 보여준다(도 24, 도 24a). 증폭이 진행함에 따라 온도 싸이클은 어닐링 온도와 변성온도 사이에서 상승 루우프로서 나타난다. 샘플이 가열될 때 변성이 일어날때까지 형광은 높다. 샘플이 냉각될 때 dsDNA 형성으로 나오는 형광이 증가하는데, 이것은 생성물 재어닐링을 반영한다. 신장동안 온도가 일정할 때 증가하는 형광은 추가 DNA 합성과 상관된다. 형광대 온도 데이타는 온도가 형광에 미치는 효과를 제거하기 위해서 변형될 수 있다(도 24). 본 발명에 따라서, 생성물 Tm과 용융곡선이 증폭 특이성 평가에 사용된다. 많은 경우에 이 방법은 교합프로브 합성 필요성을 제거한다. 교합온도에 기초한 판별은 식별 및 정량에 강력한 도구이며 다색 분석에 의한 스펙트럼 판별과 더불어 사용될 수 있다.Fluorescent band temperature projection shows the temperature dependence of the chain state during PCR (FIGS. 24 and 24A). As the amplification proceeds, the temperature cycle appears as a rising loop between the annealing and denaturation temperatures. Fluorescence is high until denaturation occurs when the sample is heated. As the sample cools, the fluorescence resulting from dsDNA formation increases, which reflects product reannealing. Increasing fluorescence at constant temperature during elongation correlates with further DNA synthesis. Fluorescence band temperature data can be modified to eliminate the effect of temperature on fluorescence (FIG. 24). According to the invention, the product T m and the melt curve are used for the amplification specificity evaluation. In many cases this method eliminates the need for occlusal probe synthesis. Occlusal temperature-based discrimination is a powerful tool for identification and quantification and can be used with spectral discrimination by multicolor analysis.

PCR 연속 모니터링용 프로브의 요약은 다음과 같다. 다음 테이블은 PCR의 연속 모니터링에 유용한 dsDNA 염료, 가수분해프로브, 교합 프로브를 비교한다. dsDNA 염료의 형광은 DNA의 쇄 상태에 종속된다. 이중라벨링된 가수분해 프로브는 퀀칭된다. 퀀칭된 형광단의 형광은 프로브가 가수분해될 때 증가한다. 교합프로브는 교합이 2개의 형광단을 가깝게 할 때 증가되는 공명에너지 전달에 종속적이다.The summary of the probe for PCR continuous monitoring is as follows. The following table compares dsDNA dyes, hydrolysis probes, occlusion probes useful for continuous monitoring of PCR. The fluorescence of the dsDNA dye is dependent on the chain state of the DNA. Double labeled hydrolysis probes are quenched. The fluorescence of the quenched fluorophore increases when the probe is hydrolyzed. The occlusal probe is dependent on the transfer of resonance energy that increases when the occlusion closes two fluorophores.

PCR의 연속 모니터링용 형광 프로브Fluorescent Probes for Continuous Monitoring of PCR

형광 프로브Fluorescent probes dsDNA 염료dsDNA dye 가수분해 프로브Hydrolysis probe 교합 프로브Bite probe 메카니즘Mechanism 쇄 상태Chain status 퀀칭Quenching 전달relay 프로브 합성Probe synthesis 불필요Unnecessary 곤란Difficulty 단순simple 특이성Specificity 생성물 Tm Product T m 서열order 서열order 용융 분석Melt analysis 예 Yes 아니오no 예Yes 다색 분석Multicolor analysis 아니오no 예Yes 예Yes

도 11 에 도시된 형광 탐지용 신속 온도 싸이클러(300)는 신속한 온도 제어를 할 수 있는 형광장치의 특성을 포함한다. PCR은 10 내지 20분의 온도 싸이클링동안 수행되고 분석될 수 있다. 1) 각 온도 싸이클내에서 연속 형광 모니터링, 2) 교합의 온도 및 시간 종속성 분석의 조합은 장점을 제공한다.The rapid temperature cycler 300 for fluorescence detection shown in FIG. 11 includes the characteristics of the fluorescent device capable of rapid temperature control. PCR can be performed and analyzed for temperature cycling of 10-20 minutes. The combination of 1) continuous fluorescence monitoring within each temperature cycle, and 2) temperature and time dependency analysis of occlusion provide advantages.

본 발명은 PCR동안 생성물 순도 모니터링, 템플레이트 정량 및 돌연변이 탐지를 위한 단색 형광 방법을 제공한다. SYBR Green I은 이중쇄 DNA와 착물이 될 때만 고형광성이 되는 민감성 염료이다. PCR 반응에서 신장온도에서 변성온도로 가열될 때 SYBR Green I의 형광 강하로서 변성이 관찰될 수 있다. 용융곡선은 변성되는 생성물의 특성이다. 작은 PCR 생성물의 경우에 용융전이는 좁은 온도 범위에서 일어나며 용융의 종말점이 Tm이다. 3개의 정제된 PCR 생성물의 형광 용융곡선이 도 43a 에 도시된다. 도 43a 의 데이타는 온도를 0.2℃/초의 속도로 증가시키는 동안 SYBR Green I으로 형광을 모니터링 함으로써 수득된다. 상대적 용융 위치가 GC 함량과 길이를 Tm에 관련시키는 실험식으로 부터 예견될 수 있다. PCR 생성물의 겉보기 Tm은 도 43 과 같이 가열속도에 달려있다. 가열속도가 감소하면 용융곡선은 저온으로 이동하므로 더 예리해진다. 용융곡선의 최대 상세화 및 Tm의 정확한 추정을 위해서 반응속도의 효과가 최소화될 필요가 있다. PCR 생성물의 겉보기 Tm은 도 44 와 같이 dsDNA 염료의 농도에도 의존한다. 염료 농도가 높을수록 이중나선의 안정성과 관찰된 Tm의 안정성이 증가한다.The present invention provides a monochromatic fluorescence method for product purity monitoring, template quantitation and mutation detection during PCR. SYBR Green I is a sensitive dye that becomes solid only when complexed with double stranded DNA. In the PCR reaction, denaturation can be observed as the fluorescence drop of SYBR Green I when heated from extension temperature to denaturation temperature. Melt curves are a characteristic of the product being modified. For small PCR products, the melt transition occurs over a narrow temperature range and the end point of the melt is T m . Fluorescence melt curves of the three purified PCR products are shown in FIG. 43A. The data in FIG. 43A is obtained by monitoring fluorescence with SYBR Green I while increasing the temperature at a rate of 0.2 ° C./sec. Relative melt locations can be predicted from empirical formulas relating the GC content and length to T m . The apparent T m of the PCR product depends on the heating rate as shown in FIG. As the heating rate decreases, the melting curve shifts to lower temperatures, making it sharper. For maximum detail of the melting curve and accurate estimation of T m , the effect of reaction rate needs to be minimized. The apparent T m of the PCR product also depends on the concentration of the dsDNA dye as shown in FIG. 44. Higher dye concentrations increase the stability of the double helix and the observed Tm.

상이한 dsDNA 염료의 특성이 PCR동안 용융곡선을 위한 최적의 염료 선택을 위해 기술되고 PCR 생성물 순도 평가와 증폭동안 돌연변이 탐지를 위해 용융곡선이 설명될 것이다. 마지막으로 경쟁적인 PCR 정량과 생성물 절대 정량에 dsDNA 염료의 사용이 설명될 것이다.The properties of the different dsDNA dyes will be described for optimal dye selection for the melt curve during PCR and the melt curve will be described for mutation detection during PCR product purity evaluation and amplification. Finally, the use of dsDNA dyes for competitive PCR quantification and absolute product quantification will be explained.

다양한 dsDNA 염료가 설명된다. 본 발명에 사용가능한 이중쇄 특이성 염료는 많다. 선호되는 염료는 활성화 스펙트럼이 형광제와 비슷하기 때문에 에티듐 브로마이드 보다 선호되는 SYBR Green I이다. 1) PCR 억제, 2) 탐지 감도, 3) 가열속도가 용융곡선에 미치는 효과, 4) 염료농도가 용융곡선에 미치는 효과를 평가하기 위해서 다양한 이중쇄 염료가 테스트된다. 먼저, 신속한 싸이클 PCR과 상용적인 염료의 최고 농도가 결정된다. 이러한 농도는 최적의 광학 필터를 써서 PCR동안 연속 모니터링 함으로써 탐지 감도를 평가하는데 사용될 수 있다. 전이속도 및 염료농도가 용융곡선에 미치는 효과는 염료 특이성이다. 데이타는 도 43 및 도 44 에 표시된다. 아래 열거된 염료가 SYBR Green I과 비교된다:Various dsDNA dyes are described. There are many double chain specific dyes usable in the present invention. The preferred dye is SYBR Green I, which is preferred over ethidium bromide because its activation spectrum is similar to that of fluorescent agents. Various double-chain dyes are tested to evaluate 1) PCR inhibition, 2) detection sensitivity, 3) the effect of heating rate on the melting curve, and 4) the effect of dye concentration on the melting curve. First, the highest concentration of dye compatible with rapid cycle PCR is determined. This concentration can be used to assess detection sensitivity by continuous monitoring during PCR using an optimal optical filter. The effect of transition rate and dye concentration on the melting curve is dye specificity. Data is shown in FIGS. 43 and 44. The dyes listed below are compared to SYBR Green I:

용융곡선을 위한 또다른 dsDNA 염료Another dsDNA Dye for Melt Curves

(Fu Y-H, DPA Kuhl, A Pizzute, M Pieretti, JS Sutcliffe, S Richards, AJMH Verkerk, JJA Holden, RG Fenwick, ST Warren, BA Oostra, DL Nelson, and CT Caskey, Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox, Cell 67:1047-1058, 1991)(Fu YH, DPA Kuhl, A Pizzute, M Pieretti, JS Sutcliffe, S Richards, AJMH Verkerk, JJA Holden, RG Fenwick, ST Warren, BA Oostra, DL Nelson, and CT Caskey, Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox, Cell 67: 1047-1058, 1991)

염료dyes 활성화Activation 방출Release 주석Remark 피코 그린Pico Green 490㎚490 nm 520㎚520 nm 정량화 촉진Quantification 에티듐 브로마이드Ethidium bromide 520520 590590 값싼 삽입물질Cheap insert 아크리딘 오렌지Acridine orange 490490 550550 620㎚에서 단일쇄 방출Single chain emission at 620 nm 티아졸 오렌지Thiazole orange 510510 540540 결합 DNA상의 높은 형광High Fluorescence on Binding DNA YO-PRO-1YO-PRO-1 490490 510510 AT 선호AT preferred 크로모마이신 A3Chromomycin A3 440440 550550 GC 선호GC Preferred

SYBR Green I의 경우에 0.1-0.5℃/초의 가열속도와 1:7,000-1:30,000의 희석비를 사용한다. GC 고함량 및 GC 저함량 PCR 정제 생성물의 용융 곡선이 각 염료에 대해 수득된다. 상이한 염료를 사용한 용융곡선은 AT/GC 선호 및 결합방식에 따라 다양한다. 에티듐 브로마이드와 같이 상이한 DNA 도메인의 용융동안 염료가 재분배될 수 있다. 본 발명에 따라서, 용융곡선을 위해 필요한 최상의 염료, 농도 및 가열속도가 결정될 수 있다.For SYBR Green I use a heating rate of 0.1-0.5 ° C / sec and a dilution ratio of 1: 7,000-1: 30,000. Melt curves of GC high and GC low content PCR purification products are obtained for each dye. Melt curves using different dyes vary depending on AT / GC preference and binding mode. The dye may be redistributed during melting of different DNA domains, such as ethidium bromide. According to the present invention, the best dye, concentration and heating rate required for the melting curve can be determined.

생성물 순도가 설명될 것이다. 크기 및 GC 함량에서 이질성 때문에 PCR 생성물은 40-50℃ 범위에 걸쳐서 용융할 수 있다. 예컨대, 프라이머 다이머는 저온에서 용융해야 하며 불균질 비특이성 생성물은 넓은 범위에 걸쳐서 용융해야 하며 순수한 PCR 생성물은 특정 Tm에서 예리하게 용융해야 한다. 이러한 특성은 필요한 생성물을 제공하기 위해서 최적화된 PCR 증폭의 아가로스 겔 전기영동에 대해 형광 용융 곡선을 비교함으로써 설명된다. 긴 PCR 생성물은 식별의 지문으로 사용될 수 있는 내부 용융 도메인을 가지지만 더 작은 DNA 조각(<300bp)은 하나의 전이에서 용융한다. 서열에 따라서 DNA 용융 도메인은 40 내지 600 염기쌍일 수 있다.Product purity will be explained. Due to heterogeneity in size and GC content, the PCR product can melt over a range of 40-50 ° C. For example, primer dimers should melt at low temperatures, heterogeneous non-specific products should melt over a wide range and pure PCR products should sharply melt at certain T m . This property is explained by comparing fluorescence melting curves against agarose gel electrophoresis of optimized PCR amplification to provide the required product. Long PCR products have internal melt domains that can be used as fingerprints of identification, but smaller DNA fragments (<300 bp) melt in one transition. Depending on the sequence, the DNA molten domain can be 40 to 600 base pairs.

돌연변이 탐지가 본 발명에 따라서 고려되어야 한다. 용융곡선을 사용하여 유전적 다형성 및 돌연변이가 결정된다. 반복 다형성(VNTRs, 디누클레오타이드 반복)은 크기가 다양하지만 서열은 크게 변하지 않는다. DNA 조각에서 동질접합 돌연변이(염기 치환)은 변성 그레디언트 겔 전기영동과 온도 그레디언트 겔 전기영동에 의해 탐지될 수 있지만 온도 이동은 <1℃이므로 이러한 차이는 정밀기술을 사용할때만 탐지가능하다. 그러나, PCR에서 DNA 타겟이 이질접합형일 때 헤테로듀플렉스가 냉각동안 형성되며 관찰된 온도이동이 1-5℃이다. 이질접합 돌연변이의 대부분은 PCR동안 단순한 용융곡선에 의해 탐지될 수 있다. 가장 일반적인 낭포성 섬유증 돌연변이의 3-염기쌍 삭제 지점을 에워싸는 지역(△F508)이 본 발명에 따라서 DNA로 부터 증폭된다. 동질접합 야생형, 이질접합 △F508, 동질접합 △F508의 용융곡선이 비교된다. 동질접합 샘플은 거의 구별불가능하지만 이질접합 곡선은 낮은 Tm의 헤테로듀플렉스 용융을 보이며 정상적인 "호모듀플렉스" 용융이 뒤따른다. 앰플리콘이 적을수록 이러한 효과는 더욱 심오하다.Mutation detection should be considered in accordance with the present invention. Melt curves are used to determine genetic polymorphisms and mutations. Repeat polymorphisms (VNTRs, dinucleotide repeats) vary in size but do not change much in sequence. Homozygous mutations (base substitutions) in DNA fragments can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis and temperature gradient gel electrophoresis, but the temperature shift is <1 ° C, so this difference can only be detected using precision techniques. However, heteroduplexes are formed during cooling when the DNA target is heterozygous in PCR and the observed temperature shift is 1-5 ° C. Most of the heterozygous mutations can be detected by simple melting curves during PCR. The region (ΔF 508 ) surrounding the 3-base pair deletion point of the most common cystic fibrosis mutation is amplified from DNA according to the present invention. The melting curves of homozygous wild type, heterozygous ΔF 508 and homozygous ΔF 508 are compared. Homozygous samples are almost indistinguishable, but the heterojunction curves show low T m heteroduplex melting followed by normal “homoduplex” melting. The fewer amplicons, the more profound this effect.

혈전증의 유전적 위험인자는 인자 V유전자의 단일지점 돌연변이이다. 돌연변이를 둘러싸는 이질접합 및 동질접합 DNA가 증폭되고 용융곡선이 수득된다. 동질접합 돌연변이는 동일한 양의 야생형 DNA와 함께 증폭시켜 탐지된다. 관찰한 혼성 용융곡선은 이질접합 증폭과 동일하게 나타난다. 야생형 DNA가 1:2 비율로 테스트 샘플과 혼합되면 이질접합자는 2:1의 야생형:돌연변이 용융을, 동질접합 돌연변이는 1:2의 야생형:돌연변이 용융을 보인다.The genetic risk factor for thrombosis is a single point mutation of the factor V gene. The heterozygous and homozygous DNA surrounding the mutation is amplified and a melting curve is obtained. Homozygous mutations are detected by amplification with the same amount of wild type DNA. The observed hybrid melt curves are the same as for heterojunction amplification. When the wild-type DNA is mixed with the test sample in a 1: 2 ratio, the heterozygote shows a 2: 1 wild type: mutant melt and the homozygous mutation shows a 1: 2 wild type: mutant melt.

BRCA1은 유방암의 5%의 원인으로 식별된 제 1 유방암 민감성 유전자이다. 대개의 돌연변이는 단지 한 개나 두 개의 염기의 치환, 삽입 또는 삭제이며 민감성은 돌연변이의 이질접합성에 의해 부여된다. 이질접합자는 자동 서열화에 의해 탐지될 수 있지만 5,000 코드 염기 이상을 서열작업하는 임상테스트는 공지장치 및 방법을 사용해서는 비싸고 어렵다. 영향받은 앰플리콘을 증폭하고 용융곡선을 관찰하고 야생형과 비교함으로써 본 발명을 사용하여 10개의 알려진 BRCA1 돌연변이가 테스트 되었다. 프라이머와 알려진 DNA 샘플은 Myriad Diagnostics 로부터 구매가능하다.BRCA1 is the first breast cancer susceptible gene identified as the cause of 5% of breast cancers. Most mutations are substitutions, insertions or deletions of only one or two bases and sensitivity is imparted by heterozygosity of the mutations. Heterozygotes can be detected by automatic sequencing, but clinical tests that sequence more than 5,000 code bases are expensive and difficult using known devices and methods. Ten known BRCA1 mutations were tested using the present invention by amplifying the affected amplicons, observing the melting curve and comparing it with the wild type. Primers and known DNA samples are available from Myriad Diagnostics.

본 발명을 사용하여 경쟁적인 PCR 정량이 가능하다. 생성물 용융온도에서 차이를 탐지할 수 있는 능력이 본 발명에 의해 PCR 정량에 이용되어서 PCR 생성물과 경잴물질사이를 구별할 수 있다. 초기 템플레이트 복제물 갯수는 동일한 프라이머를 사용하지만 천연 앰플리콘으로 부터 용융온도에서 상이한 비교 템플레이트와 함께 경쟁적인 증폭함으로써 정량된다. 이러한 방법의 잇점은 도 45 및 도 46 에 도시된다. 도 45 는 Tm이 2℃ 차이가 나는 두 개의 정제된 PCR생성물이 혼합될 때 수득되는 용융곡선을 보여준다. 온도가 형광에 미치는 효과를 보정하고 온도에 대한 형광의 도함수를 도시함으로써 각 PCR 생성물의 상대적인 양이 도 46 에 도시된대로 정량될 수 있다.Competitive PCR quantitation is possible using the present invention. The ability to detect differences in product melting temperature can be used in the PCR quantification by the present invention to distinguish between PCR products and light materials. The initial template copy number is quantified by using the same primers but competitive amplification from the natural amplicons with different comparative templates at melting temperature. The advantages of this method are shown in FIGS. 45 and 46. 45 shows the melting curve obtained when two purified PCR products with T m differing by 2 ° C. are mixed. By correcting the effect of temperature on fluorescence and plotting the derivative of fluorescence over temperature, the relative amounts of each PCR product can be quantified as shown in FIG. 46.

본 발명에 따라서 경쟁적인 템플레이트가 앞서 기술된 프라이머로 부터 헤파티스 B 표면 항원 유전자의 180 염기쌍 조각의 증폭을 위해 발생된다. Tm에서 3℃ 차이가 나는 경쟁 템플레이트가 템플레이트 길이, GC 함량 또는 둘의 조합을 변화시킴으로써 수득될 수 있다. 더 작은 헤파티스 B 조각의 PCR 증폭과 말단 중첩을 통한 연결에 의해 다음과 같은 템플레이트가 합성된다.Competitive templates according to the invention are generated for the amplification of 180 base pair fragments of the Hepatis B surface antigen gene from the primers described above. Competitive templates with a 3 ° C. difference in T m can be obtained by changing the template length, GC content or a combination of the two. The following template is synthesized by PCR amplification of smaller Hepatis B fragments and ligation through terminal overlap.

야생형과 TWild type and T mm 이 3℃ 차이가 나는 경쟁적인 헤파티스 B PCR 템플레이트Competitive Hepatis B PCR Template with this 3 ℃ difference

템플레이트Template GC 함량GC content 길이Length 추정도 Tm 이동(℃)Estimation T m shift (℃) 야생형Wild type 50.050.0 180180 00 #1#One 50.050.0 8787 -3-3 #2#2 57.357.3 180180 +3+3 #3# 3 42.742.7 180180 -3-3

템플레이트(#1,#2,#3)는 싸이클마다 한 번 SYBR Green I을 사용한 모니터링에 의해 결정되는 증폭효율과 A260에 의해 정량된다. 3가지 템플레이트(#1,#2,#3)에 의한 야생형 DNA의 경쟁적인 정량화가 교합을 사용한 표준 임상방법에 비교된다.The templates (# 1, # 2, # 3) are quantified by A 260 and amplification efficiency determined by monitoring with SYBR Green I once per cycle. Competitive quantification of wild-type DNA by three templates (# 1, # 2, # 3) is compared to standard clinical methods using occlusion.

생성물의 절대적인 정량도 본 발명에 의해 가능하다. 이중쇄 DNA 형성의 연속 모니터링은 재어닐링 반응에 의해 직접적이고 절대적인 DNA 정량을 허용한다. 샘플온도는 변성온도로 부터 빠르게 떨어지고 프라이머 어닐링을 방지하기에 충분히 높은 더 낮은 온도에서 일정하게 유지된다. 생성물 재어닐링 속도는 2차 반응을 따른다. 상이한 농도의 DNA가 테스트될 때 재어닐링 곡선의 모양은 DNA 농도의 특성이다(도 26). 주어진 PCR 생성물 및 온도에서 2차 속도 상수가 측정될 수 있다. 속도상수가 알려지면 미지의 DNA 농도가 실험적인 재어닐링 데이타로 부터 결정될 수 있다. 원리는 도 27 에 도시된다. 곡선은 앞서 설명된 LabView 프로그램잉 환경을 사용하여 실시간으로 온도 싸이클링 하는 동안 비선형 최소 자승 회귀분석에 의해 조절된다. 냉각은 순간적이지 않으며 일정온도 도달전에 일부 재어닐링이 일어나지만 회귀분석은 이를 허용한다(도 27). 이 기술은 순수한 PCR 생성물을 필요로 하지만 온도 싸이클링 동안 수득되는 용융곡선에 의해 보장받을 수 있다. 재어닐링 반응에 의한 정량은 신호 레벨과 무관하며 사소한 샘플 차이에 의해 영향받지 않는다.Absolute quantification of the product is also possible by the present invention. Continuous monitoring of double chain DNA formation allows direct and absolute DNA quantification by reannealing reactions. The sample temperature drops rapidly from denaturation temperature and remains constant at lower temperatures high enough to prevent primer annealing. Product reanneal rate follows the secondary reaction. When different concentrations of DNA are tested, the shape of the reannealing curve is a characteristic of the DNA concentration (FIG. 26). Secondary rate constants can be measured at a given PCR product and temperature. Once the rate constant is known, unknown DNA concentrations can be determined from experimental reanneal data. The principle is shown in FIG. The curve is adjusted by nonlinear least-squares regression analysis during temperature cycling in real time using the LabView programming environment described above. Cooling is not instantaneous and some reannealing occurs before reaching a constant temperature, but regression analysis allows this (FIG. 27). This technique requires pure PCR products but can be ensured by the melting curve obtained during temperature cycling. Quantitation by the reanneal reaction is independent of signal level and is not affected by minor sample differences.

생성물 재어닐링의 2차 반응 가정이 상이한 DNA 농도에서 속도상수를 결정함으로써 확인된다. 일부 형광 염료는 농도 종속 방식으로 재어닐링에 영향을 준다. 관계가 한정되고 정량이 가능하다. 재어닐링 반응에 의한 정량이 각 신장기간의 말엽에 형광을 사용하는 정량에 비교된다.Secondary assumptions of product reannealing are confirmed by determining rate constants at different DNA concentrations. Some fluorescent dyes affect reannealing in a concentration dependent manner. Relationships are limited and quantifiable. Quantification by the reannealing reaction is compared to quantification using fluorescence at the end of each elongation period.

본 발명은 PCR동안 서열 특이성 탐지를 위해 프로브 교합(가수분해가 아니라)에 의존하는 이중색상 형광방법을 제공한다. 본 발명에 따라서 형광제와 Cy5로 라벨링된 인접 교합 프로브간의 공명에너지 전달이 증폭 모니터링에 사용될 수 있다. 그러나, 프로브간의 최적 거리, 프로브 길이, 프로브 농도의 효과도 고려되어야 한다.The present invention provides a bicolor fluorescence method that relies on probe occlusion (not hydrolysis) for sequence specificity detection during PCR. In accordance with the present invention, resonance energy transfer between fluorescent agent and adjacent occlusion probe labeled Cy5 can be used for amplification monitoring. However, the effects of optimum distance between probes, probe length, and probe concentration should also be considered.

본 발명은 인접한 교합 프로브의 최적화를 제공한다. 프로브간의 거리의 효과가 결정된다. 본 발명에 따라서 형광제 조절된 기공 유리(Glen Research) 및 Cy5 아미다이트(Pharmacia)를 써서 5, 3'-형광제 라벨링된 30-단위 및 5, 5'-Cy5-라벨링된 30-단위가 합성된다. 형광제와 Cy5간의 프로브간 거리가 0 내지 25 염기인 β-글로블린 지역에서 프로브가 동일쇄에 교합하도록 설계된다. HPLC와 형광 모니터가 정제에 사용된다. 순도는 분석 겔 전기영동과 A260:A490 또는 A260:A650 비율에 의해 검사된다. PCR동안 프로브는 0.2μM로 포함되고 2-온도 싸이클링이 사용된다. PCR동안 형광비 변화가 프로브간 거리에 대해 도시되어서 프로브간 최적의 거리를 결정한다.The present invention provides for optimization of adjacent occlusal probes. The effect of the distance between the probes is determined. According to the present invention, 5, 3'-fluorophore labeled 30-units and 5, 5'-Cy5-labeled 30-units using fluorescently controlled pore glass (Glen Research) and Cy5 amidite (Pharmacia) Are synthesized. The probes are designed to occlude in the same chain in the β-globulin region where the distance between the fluorescent agent and Cy5 probe is 0 to 25 bases. HPLC and fluorescence monitors are used for purification. Purity is checked by analytical gel electrophoresis and the ratio A 260 : A 490 or A 260 : A 650 . During PCR the probe is included at 0.2 μM and two-temperature cycling is used. Fluorescence ratio changes during PCR are shown for interprobe distance to determine the optimal interprobe distance.

최적의 프로브간 거리를 사용하여 20, 25 및 35 염기로된 프로브 길이가 합성되고 30-단위 프로브와 비교된다. 이들 프로브의 용융온도가 PCR동안 관찰되고 프로브 길이에 대해 도시된다. 더 긴 프로브의 사용은 프라이머 어닐링 단계와 프로브 어닐링 단계가 있는 3-온도 싸이클의 사용을 허용한다. PCR동안 프로브 농도가 탐지 민감도 및 신호 세기에 미치는 효과가 측정된다.Using the optimal interprobe distance, probe lengths of 20, 25, and 35 bases are synthesized and compared to 30-unit probes. Melting temperatures of these probes were observed during PCR and plotted against probe length. The use of longer probes allows the use of three-temperature cycles with a primer annealing step and a probe annealing step. The effect of probe concentration on detection sensitivity and signal strength during PCR is measured.

교합 프로브로의 공명에너지 전달을 위한 라벨링된 프라이머 사용은 본 발명의 또다른 측면이다. 인접한 공명 에너지 전달 프로브중 하나가 도 39 에 도시된 대로 PCR 프라이머에 포함될 수 있다. 도시된 경우에 라벨링된 프로브가 라벨링된 프라이머를 포함하는 단일쇄 PCR 생성물에 교합한다. 라벨링된 프라이머는 Cy5(Amersham/BDS)로의 수동 커플링을 위해 아미노링커(Glen Research)를 갖는 변성 dT 아미다이트를 써서 합성된다. 본 발명은 PCR를 방해하지 않으면서 프라이머의 3'-단부에 변성된 Cy5-dT를 폐쇄하는 방법을 포함한다. 이것은 상이한 위치에서 라벨링된 염기를 갖는 여러개의 라벨링된 프라이머를 필요로 한다. 다음에 여러개의 3'-형광제-라벨링된 프로브를 합성 및 테스트 함으로써 형광단 간의 최적의 거리가 발견된다.The use of labeled primers for the transfer of resonance energy to the occlusal probe is another aspect of the present invention. One of the adjacent resonance energy transfer probes may be included in the PCR primers as shown in FIG. 39. In the case shown, labeled probes occupy single chain PCR products comprising labeled primers. Labeled primers are synthesized using denatured dT amidites with aminolinkers (Glen Research) for manual coupling to Cy5 (Amersham / BDS). The present invention includes a method of closing a denatured Cy5-dT at the 3'-end of a primer without interfering with PCR. This requires several labeled primers with labeled bases at different positions. The optimal distance between fluorophores is then found by synthesizing and testing several 3'-phosphor-labeled probes.

공명에너지 전달에 의해 교합을 탐지하기 위해서 다른 포맷을 사용하는 것도 본 발명의 범위내에 있다. 선호되는 방법에서 인접한 교합 프로브 스킴은 "비경쟁적 포맷"으로 칭한다. 이것은 두 개의 상보적인 올리고누클레오타이드가 형광단으로 단일 라벨링되는 "경쟁적 포맷"과 비교된다. 프로브는 서로에 대해 교합하거나(에너지 전달이나 퀀칭을 가져옴) 경쟁 타겟에 교합한다. 이것은 축적되는 PCR 생성물이다. 20-, 25-, 및 30-단위 5'-Cy5 라벨링 및 3'-형광제 라벨링된 상보적 프로브의 합성 및 테스트가 본 발명에 따라 수행될 수 있다.It is also within the scope of the present invention to use other formats for detecting occlusion by resonance energy transfer. In the preferred method, the adjacent occlusal probe scheme is referred to as "noncompetitive format". This is compared to the “competitive format” in which two complementary oligonucleotides are single labeled with fluorophores. Probes occupy one another (bring energy transfer or quenching) or occupy a competitive target. This is the accumulating PCR product. Synthesis and testing of 20-, 25-, and 30-unit 5′-Cy5 labeling and 3′-phosphor labeled complementary probes can be performed according to the present invention.

Morrison의 "삽입물질 포맷"은 교합할 때 이중쇄 특이성 염료와 상호작용하는 라벨링된 프로브를 필요로 한다(Morrison L.E., Detection of energy transfer and fluorescence quenching, in L.J. Kricka (ed.), Nonisotopic DNA probe techniques, Academic Press, San Diego, pp. 311-352, 1992). 이중쇄 특이성 염료로서 SYBR Green I의 사용과 3' 및 5' 단부에서 Cy5로 이중라벨링된 20-, 25-, 및 30-단위 프로브의 합성이 본 발명의 범위내에 있다. PCR생성물 형성은 Cy5의 증가된 방출로서 관찰가능한 교합을 가져온다. 이 방법은 서열 특이성 생성물과 이중쇄 DNA가 동시에 모니터링 될 수 있는 장점을 가진다.Morrison's "insert format" requires labeled probes that interact with double-chain specific dyes when occlusion (Morrison LE, Detection of energy transfer and fluorescence quenching, in LJ Kricka (ed.), Nonisotopic DNA probe techniques , Academic Press, San Diego, pp. 311-352, 1992). The use of SYBR Green I as a double chain specific dye and the synthesis of 20-, 25-, and 30-unit probes double-labeled with Cy5 at the 3 'and 5' ends are within the scope of the present invention. PCR product formation results in observable occlusion with increased release of Cy5. This method has the advantage that both sequence specificity products and double stranded DNA can be monitored simultaneously.

본 발명은 돌연변이 탐지, 경쟁적 PCR 정량, 생성물 정량을 위한 이중색상 서열 특이성 방법을 적용한다. 교합 프로브의 Tm은 단일 염기 불일치가 존재하면 10℃ 이동한다. 교합 프로브가 돌연변이 지점에 놓이면 프로브 용융에서 10℃ 이동으로서 단일염기 돌연변이가 탐지가능하다. 단일 염기 판별을 위에서 언급된 인자 V돌연변이와 인접한 형광제/Cy5 프로브를 사용하여 설명된다.The present invention applies bicolor sequence specificity methods for mutation detection, competitive PCR quantification, and product quantification. The T m of the occlusal probe shifts by 10 ° C. in the presence of a single base mismatch. Once the occlusal probe is at the point of mutation, a single base mutation is detectable as a 10 ° C. shift in probe melting. Single base determination is described using a fluorophore / Cy5 probe contiguous with the factor V mutation mentioned above.

경쟁적 PCR 템플레이트가 내부 염기 변화를 디자인될 수 있다. 상이한 온도에서 상이한 타겟을 순차적으로 용융시키는 탐지 프로브가 사용된다면 상대적인 정량이 가능하다. 프로브 어닐링 반응에 의해서 생성물의 절대적인 정량이 가능하다. 라벨링된 프라이머와 교합 프로브가 사용된다면 어닐링 반응은 의사 1차반응이며 공지의 템플레이트 농도를 써서 테스트된다.Competitive PCR templates can be designed for internal base changes. Relative quantitation is possible if detection probes are used that sequentially melt different targets at different temperatures. Absolute quantification of the product is possible by probe annealing reactions. If labeled primers and occlusal probes are used, the annealing reaction is pseudo first order and tested using known template concentrations.

도 47 은 모세관 샘플 튜브의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)를 보여준다. 형광 탐지를 포함한 본 발명의 다양한 특징의 비교가 아래에 제공된다.47 shows a rapid temperature cycler 400 with fluorescence detection at the tip of a capillary sample tube. A comparison of the various features of the present invention including fluorescence detection is provided below.

특성characteristic 단일샘플 구체예Single Sample Embodiment 다중샘플 구체예Multisample Embodiment 다중샘플 구체예Multisample Embodiment 용량Volume 단일샘플Single sample 다중샘플Multi Sample 다중샘플Multi Sample 광원Light source LEDLED 크세논 아아크Xenon arc LEDLED 탐지기detector 포토다이오드Photodiode PMTsPMTs 포토다이오드Photodiode 광학경로Optical path 선형Linear 분리된Separated 에피플루오레센트Epifluorescent 방출밴드Emission band 1, 21, 2 1, 21, 2 1,2,3 연속1,2,3 continuous 모세관 조사Capillary probe 측부/팁Side / tip 측부Side 팁tip 편광 가능성Polarization possibility 예Yes 아니오no 아니오no

도 47 에 도시된 모세관 샘플 튜브의 팁에서 형광탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러가 특히 이득이 된다. 샘플 챔버내 온도는 400W 가열 카트리지(Reheat, Inc.)와 챔버팬을 구동하는 DC 희토유 브러쉬 모터(Escap AG., RPM MAX=15,000, 고장시간 10,000시간)를 사용하여 조절된다. 가열동안 카트리지는 비례적으로 조절되고 팬은 저속으로 움직여서(12V, 0.5A) 전체 샘플 챔버에 온도 균일성을 제공한다. 냉각동안 가열 카트리지는 작동 중지되며 팬은 최대 속도로 움직인다(27V, 1.4A). 팬은 공기를 중심구멍에 유입시키고 배출구멍을 통해 방출시킨다. 가열 및 냉각요소는 중심축 주위에 대칭적이며 스테핑 모터를 써서 위치선정되는 원형카루셀에 최대 24샘플이 놓인다. 스테핑 모터(New England Affiliated Technologies)는 카루셀 1회전마다 10,000 스텝 이동시킨다.Particularly advantageous is a rapid temperature cycler that detects fluorescence at the tip of the capillary sample tube shown in FIG. 47. The temperature in the sample chamber is controlled using a 400W heating cartridge (Reheat, Inc.) and a DC rare earth brush motor (Escap AG., RPM MAX = 15,000, downtime 10,000 hours) to drive the chamber fan. During heating, the cartridge is controlled proportionally and the pan moves at low speed (12V, 0.5A) to provide temperature uniformity throughout the sample chamber. During cooling, the heating cartridge is deactivated and the fan moves at full speed (27V, 1.4A). The fan introduces air into the center hole and discharges it through the outlet hole. The heating and cooling elements are symmetrical around the central axis and up to 24 samples are placed in a circular carousel positioned with a stepping motor. Stepping motors (New England Affiliated Technologies) move 10,000 steps per carousel.

도 47 에 도시된 구체예의 광학 디자인은 모세관 팁의 에피플루오레센트 조사에 기초한다. 활성화 소스는 "매우 밝은" 청색광 방출 다이오드(LEDtronics)이다. 형광신호는 집적된 탐지기/필터 모듈(Ealing Electronics, TO5 패키지에 고성능 실리콘 포토다이오드를 갖는 0.5인치 간섭 필터)로 부터 획득된다. 활성화 및 탐지 성분은 관련 전자장치와 함께 하나의 회로 보오드에 직접 장착된다. 모든 광학요소는 0.5인치 직경을 가진다.The optical design of the embodiment shown in FIG. 47 is based on epifluorescent irradiation of the capillary tip. The activation source is a "very bright" blue light emitting diode (LEDtronics). The fluorescence signal is obtained from an integrated detector / filter module (Ealing Electronics, 0.5 inch interference filter with high performance silicon photodiode in TO5 package). The activation and detection components are mounted directly on one circuit board with associated electronics. All optical elements have a 0.5 inch diameter.

샘플은 도 47a-d 에 도시된 복합 플라스틱/유리 샘플용기에 충진된다. 5㎕ 샘플이 각 튜브에 첨가되고(도 47a) 저속으로 원심분리되어 샘플이 모세관 팁에서 1㎝ 유체 칼럼으로 놓이게 된다(도 47b). 이후에 복합 플라스틱/유리 용기의 입구가 플라스틱 플러그로 밀봉되고(도 47c) 모세관 샘플 튜브의 팁에서 형광 탐지를 하는 신속한 온도 싸이클러(400)에 놓인다(도 47d). 도 47a-d 에서 모세관 샘플 튜브에 플라스틱 충진 및 밀봉 구조물의 첨가는 바람직한 열적 특성을 유지시키면서 유리 모세관 튜브의 효과적인 사용을 제공한다. 샘플은 복합 플라스틱/유리 샘플용기에 첨가되고 96-웰 포맷으로 원심분리될 수 있지만 기기에 개별적으로 충진된다. 복합 플라스틱/유리 샘플 용기는 도 47 에 도시된 바와 같이 팁을 광학적 촛점에 정렬시키는 황동 슬리이브에 끼워진다. 이러한 끼워 맞춤은 축을 벗어나서 제조 순간에 각 슬리이브의 정확한 정렬을 허용한다.Samples are filled in the composite plastic / glass sample container shown in FIGS. 47A-D. 5 μl sample is added to each tube (FIG. 47A) and centrifuged at low speed so that the sample is placed in a 1 cm fluid column at the capillary tip (FIG. 47B). The inlet of the composite plastic / glass container is then sealed with a plastic plug (FIG. 47C) and placed in a rapid temperature cycler 400 with fluorescence detection at the tip of the capillary sample tube (FIG. 47D). The addition of plastic fill and seal structures to the capillary sample tubes in FIGS. 47A-D provides effective use of glass capillary tubes while maintaining desirable thermal properties. Samples can be added to a composite plastic / glass sample container and centrifuged in a 96-well format but filled individually in the instrument. The composite plastic / glass sample container fits into a brass sleeve that aligns the tip to optical focus as shown in FIG. 47. This fit allows accurate alignment of each sleeve off the axis at the moment of manufacture.

복합 플라스틱/유리 샘플 용기는 편리하고 값싼 샘플 홀더를 제공한다. 0.8㎜ 내경과 1.0㎜의 외경을 가지며 한 단부는 밀폐되고 다른 단부는 개방된(도 47a-d 에 도시된 플라스틱 밀봉장치를 수용하는) 유리 모세관 튜브가 값싸게 제조될 수 있다. 플라스틱 성분 역시 값싸게 제조될 수 있다. 이들 성분이 조립되어 충진의 용이성 및 보호를 위해 96-웰 랙에 놓인다. 평평한 팁 뿐만 아니라 다양한 외부 곡률 및 내부 곡률을 갖는 팁이 본 발명에서 사용가능하다.The composite plastic / glass sample container provides a convenient and inexpensive sample holder. Glass capillary tubes with 0.8 mm inner diameter and 1.0 mm outer diameter and one end closed and the other open (accommodating the plastic seal shown in FIGS. 47A-D) can be inexpensively manufactured. Plastic components can also be made inexpensively. These components are assembled and placed in a 96-well rack for ease of filling and protection. As well as flat tips, tips having various external and internal curvatures can be used in the present invention.

샘플에서 1-10회/초 형광을 수득하는 도 47 의 구체예에서 샘플이 비교적 빠르게 회전될 필요가 있다. 24 샘플을 위치시키는 스테핑 모터를 사용할 경우 각 샘플은 4.2-42msec 할당된다.In the embodiment of FIG. 47 where 1-10 times / second fluorescence is obtained in the sample, the sample needs to be rotated relatively quickly. When using a stepping motor to position 24 samples, each sample is allocated 4.2-42 msec.

도 47 에 도시된 구체예의 경우 사용자 인터페이스와 기기 제어는 도 11 에서 설명된 것과 동일 또는 유사하다. 도 47 에 도시된 구체예의 제어기는 광 방출 다이오드의 디지탈 I/O 제어를 제공하며 스테핑 모터의 방향, 히터 및 챔버팬을 제어한다. 효과적인 사용자 인터페이스가 제공된다.For the embodiment shown in FIG. 47, the user interface and device control are the same or similar to those described in FIG. 11. The controller of the embodiment shown in FIG. 47 provides digital I / O control of the light emitting diode and controls the direction of the stepping motor, the heater and the chamber fan. An effective user interface is provided.

도 48 은 형광 교합 모니터링의 온도대 시간 세그멘트를 보여준다. 변성온도까지 느린 온도 증가동안 생성물 용융곡선이 획득된다. 변성후 온도를 일정한 온도로 신속히 낮춤으로써 생성물, 프로브 또는 프라이머 어닐링이 보조적으로 행해진다. 프로브 용융곡선은 프로브 Tm 주변온도로 느리게 가열함으로써 수득된다. 도 47 의 구체예는 즉각적인 실시간 표시를 제공하며 온도 싸이클링 동안 모든 분석을 제공한다.48 shows temperature versus time segments of fluorescence occlusion monitoring. The product melt curve is obtained during a slow temperature increase to denaturation temperature. After denaturation, the product, probe or primer annealing is assisted by rapidly lowering the temperature to a constant temperature. The probe melt curve is obtained by slow heating to the probe T m ambient temperature. The embodiment of FIG. 47 provides an instant real time display and provides all analysis during temperature cycling.

본 발명의 구체예가 한가지 또는 두가지 색상 분석을 활용하지만 도 47 에 도시된 구체예는 수집 광학장치에 또다른 이색 포토다이오드/필터 어셈블리를 첨가함으로써 3-색 분석도 가능하다(도 31). 게다가, 다색 획득을 위해 선형 포토다이오드 배열상에 파장의 동시적 분리를 허용하는 것도 본 발명의 범위내에 있다. 선형 포토다이오드 배열이 사용될 때 도 47 에 도시된 수집 광학장치는 다중 파장 탐지를 위해 프리즘 또는 회절 격자, 렌즈, 및 포토다이오드 배열 또는 CCD로 대체된다. 선형 포토다이오드 배열은 500 내지 800㎚ 사이에서 10-20㎚의 15-30 파장 빈을 수집한다. 다양한 구성(대개의 단색측정기에서 사용된 회절격자를 위한 Littrow 자가조준 구성)이 사용되어서 수집효율, 스펙트럼 분해 및 공간 조건의 균형을 잡을 수 있다.While embodiments of the present invention utilize one or two color analysis, the embodiment shown in FIG. 47 is also capable of three-color analysis by adding another dichroic photodiode / filter assembly to the collecting optics (FIG. 31). In addition, it is also within the scope of the present invention to allow simultaneous separation of wavelengths on linear photodiode arrays for multicolor acquisition. When the linear photodiode array is used, the acquisition optics shown in FIG. 47 are replaced with prisms or diffraction gratings, lenses, and photodiode arrays or CCDs for multiple wavelength detection. The linear photodiode array collects 15-30 wavelength bins of 10-20 nm between 500 and 800 nm. Various configurations (Littrow self aiming configurations for diffraction gratings used in most monochromators) can be used to balance acquisition efficiency, spectral resolution and spatial conditions.

본 발명은 증폭의 최적화 및 실시간 제어를 위하여 형광 피이드백을 활용한다. 실시간 형광 모니터링은 온도 싸이클링 조절에 사용된다. 이중쇄 특이성 염료를 사용하여 형광이 증가를 중단한 이후에 신장이 싸이클마다 종결될 수 있다. 변성을 위해서는 생성물이 완전 용융될때까지만 온도가 증가할 필요가 있다. 마지막으로, 일정량의 생성물이 형성된후 온도 싸이클링이 자동으로 종결될 수 있다. 이러한 실시간 제어는 형광 온도 싸이클러에서 옵션으로서 프로그램된다.The present invention utilizes fluorescence feedback for optimization and real-time control of amplification. Real-time fluorescence monitoring is used to control the temperature cycling. The extension can be terminated cycle by cycle after fluorescence ceases to increase using a double chain specific dye. For denaturation, the temperature needs to increase only until the product is completely melted. Finally, the temperature cycling can be automatically terminated after a certain amount of product has been formed. This real time control is programmed as an option in the fluorescent temperature cycler.

어닐링의 제어 및 실시간 모니터링이 본 발명에 의해 제공된다. 프라이머중 하나는 Cy5로 3'-라벨링 될 때 신장은 일어날 수 없다. 라벨링된 프라이머(1-10%)가 라벨링안된 프라이머(90-99%)와 혼합된다면 증폭 효율이 약간 감소되지만 이중쇄 특이성 염료로 부터 Cy5로의 형광 에너지 전달로서 어닐링이 관찰가능하다. 이것은 위에서 기술된 "삽입물질 포맷"이다. 최저의 Tm(최근 열역학에 의해 결정되는)을 갖는 프라이머가 이중쇄 특이성 염료로서 SYBR Green I을 사용하여 라벨링된다. 어닐링동안 증폭효율 및 Cy5 형광이 라벨링된 프라이머의 백분율에 대해서 비교된다.Control of annealing and real time monitoring are provided by the present invention. Elongation cannot occur when one of the primers is 3'-labeled with Cy5. If labeled primers (1-10%) are mixed with unlabeled primers (90-99%), the amplification efficiency is slightly reduced but annealing as fluorescence energy transfer from the double chain specific dye to Cy5 is observable. This is the "insert material format" described above. Primers with the lowest T m (as determined by recent thermodynamics) are labeled using SYBR Green I as a double chain specific dye. Amplification efficiency and Cy5 fluorescence during annealing are compared for the percentage of labeled primers.

본 발명의 직접 모니터링은 Cy5 라벨링된 프라이머를 써서 직접 수행되거나 등가의 상보적인 올리고누클레오타이드를 써서 간접적으로 수행된다. 최저의 용융 프라이머로서 동일한 길이 및 Tm의 올리고머누클레오타이드가 증폭된 서열에 대한 상보성 없이 디자인된다. 이러한 올리고누클레오타이드는 Cy5로 5'-라벨링되고 이의 상보물은 형광제로 3'-라벨링된다. 쌍의 교합으로 Cy5로의 공명 에너지 전달이 일어난다. 형광제 라벨링된 올리고누클레오타이드(0.005μM)와 Cy5 라벨링된 올리고누클레오타이드(0.5μM)는 프라이머 어닐링 반응과 유사한 의사 1차 반응으로 어닐링된다. 이러한 방식으로 어닐링 효율이 모니터링 되어서 어닐링 시간 및 온도 조절에 사용된다. 어닐링 효율 모니터링에 의한 어닐링 조건의 제어부는 제어장치에 보조적으로 포함된다.Direct monitoring of the present invention is performed directly using Cy5 labeled primers or indirectly using equivalent complementary oligonucleotides. As the lowest melting primers, oligomeric nucleotides of the same length and T m are designed without complementarity to the amplified sequence. This oligonucleotide is 5'-labeled with Cy5 and its complement is 3'-labeled with a fluorescent agent. The occlusion of pairs causes resonance energy transfer to Cy5. Fluorescently labeled oligonucleotides (0.005 μM) and Cy5 labeled oligonucleotides (0.5 μM) are annealed in a pseudo primary reaction similar to the primer annealing reaction. In this way the annealing efficiency is monitored and used for the annealing time and temperature control. The control unit of the annealing condition by the annealing efficiency monitoring is included auxiliary in the control apparatus.

전통적인 PCR은 증폭 이전에 모든 싸이클링 매개변수를 프로그램하여 수행된다. 연속 모니터링을 위해 온도 싸이클링 조건의 결정이 증폭동안 어닐링, 신장 및 변성의 연속 관찰에 기초하여 이루어진다. 최저 용융 프라이머와 등가의 상보적 올리고누클레오타이드를 사용하여 초기 싸이클 동안에도 어닐링 효율이 조절된다. 그러나, 신장 및 변성은 충분한 생성물이 형성되는 나중 싸이클동안에 dsDNA 염료를 써서 모니터링 될 수 있다. 변성 및 신장 조건은 대개의 생성물 증폭에 충분히 허용적이므로 이것은 문제가 아니며 제 1 증폭으로 부터 나오는 데이타가 후속 시행을 최적화 하는데 사용될 수 있다.Traditional PCR is performed by programming all cycling parameters prior to amplification. Determination of temperature cycling conditions for continuous monitoring is made based on continuous observation of annealing, stretching and denaturation during amplification. Annealing efficiency is controlled during the initial cycle using complementary oligonucleotides equivalent to the lowest melting primers. However, elongation and denaturation can be monitored using dsDNA dye during later cycles when sufficient product is formed. This is not a problem since denaturation and stretching conditions are usually sufficiently acceptable for product amplification and the data from the first amplification can be used to optimize subsequent runs.

폴리메라제 연쇄반응동안 DNA 용융곡선의 분석에 의한 생성물 분리의 추가예가 기술될 것이다.Further examples of product separation by analysis of DNA melt curves during polymerase chain reactions will be described.

PCR은 50mM Tris, pH 8.5(25℃), 3mM MgCl2, 500㎍/㎖ 소과 혈청 알부민, 0.5mM 데옥시누클레오사이드 트리포스페이트, 0.5μM 프라이머, 5㎕ 샘플마다 0.2U의 Taq 폴리메라제에서 수행된다. SYBR Green I이 별도 언급이 없는한 1:20,000 희석비로 포함된다.PCR was performed at 50 mM Tris, pH 8.5 (25 ° C.), 3 mM MgCl 2 , 500 μg / ml bovine serum albumin, 0.5 mM deoxynucleoside triphosphate, 0.5 μM primer, 0.2 U of Taq polymerase per 5 μl sample. Is performed. SYBR Green I is included in a 1: 20,000 dilution unless otherwise noted.

템플레이트로서 사용된 증폭 생성물은 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전, Centricon 30 농축기(Amicon, Danvers, MA)를 통해 반복된 세정에 의해 정제된다. 템플레이트 농도는 260㎚에서 흡수성에 의해 결정되며 1.7이상의 A260/A280 비를 가진다.The amplification product used as template is purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, repeated washing through Centricon 30 concentrator (Amicon, Danvers, MA). Template concentration is determined by absorbance at 260 nm and has an A 260 / A 280 ratio of at least 1.7.

프라이머는 표준 포스포아미다이트 화학(Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus of Piscataway, New Jersey)에 의해 합성된다. 180 염기쌍 헤파티스 B 표면 항원 유전자 증폭을 위한 프라이머는 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1) 및 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SE1 ID NO:2)이다. 292 염기쌍 프로스테이트 특이성 항원 유전자 증폭을 위한 프라이머는 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID NO:7) 및 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO:8)이다. 536 염기쌍 인간 β-글로블린 유전자 증폭을 위한 프라이머는 RS42 및 KM29이다.Primers are synthesized by standard phosphoramidite chemistry (Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus of Piscataway, New Jersey). Primers for 180 base pair Hepatis B surface antigen gene amplification are 5′-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and 5′-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3 ′ (SE1 ID NO: 2). Primers for 292 base pair prostate specific antigen gene amplification are 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO: 8). Primers for 536 base pair human β-globulin gene amplification are RS42 and KM29.

도 8a 및 8b 의 24 샘플 열 싸이클러와 집적되며 광학 모듈이 장치된 (모델번호 2210, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho) 마이크로볼륨 형광측정계를 사용하여 SYBR Green I에서 나오는 형광을 습득하여 DNA 용융곡선이 획득된다. PCR 시약(5㎕ 부피)을 복합 유리/플라스틱 반응튜브의 개방된 플라스틱 저장원에 피펫으로 옮기고 저속으로 원심분리하여 샘플을 유리 모세관의 팁에 위치되고 플라스틱 플러그로 내부가 밀봉된다. 용융 곡선을 위한 형광 데이타가 0.1-10.0℃/초의 속도로 95℃까지 선형온도 전이하는 동안 0.25-2.0초에 걸쳐 신호를 적분함으로써 획득된다. 이 데이타는 제어장치를 사용하여 연속으로 표시된다.DNA fusion curves obtained by fluorescence from SYBR Green I using a microvolume fluorometer integrated with the 24 sample thermal cycler of FIGS. 8A and 8B and equipped with an optical module (Model No. 2210, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho). Is obtained. The PCR reagent (5 μl volume) is pipetted into an open plastic reservoir of the composite glass / plastic reaction tube and centrifuged at low speed so that the sample is placed at the tip of the glass capillary and sealed inside with a plastic plug. Fluorescence data for the melting curve is obtained by integrating the signal over 0.25-2.0 seconds during a linear temperature transition to 95 ° C. at a rate of 0.1-10.0 ° C./sec. This data is displayed continuously using the control.

일련의 변환이 용융곡선을 용융피크로 전환시키는데 사용된다(도 49). 정제된 PCR 생성물의 용융 온도 이상에서 용융 곡선에 대해 선형 회위분석(L1)을 수행함으로써 배경 형광이 제거된다(T1). 근사로 (R2 = 0.96, 도 49 용융곡선) 이 라인은 온도의 함수로서 배경 형광을 표현한다. 생성물 용융온도 아래에서 용융곡선의 선형 회귀분석(L2)이 사용되어 온도가 형광에 미치는 영향을 제거한다. 마지막으로 분광학적 용융곡선을 용융피크로 전환하는데 사용된 것과 유사한 방법에 의해서 온도에 대해서 형광의 도함수(-dF/dT)를 도시함으로써 데이타가 용융피크(T2)로 재매핑된다. 전체 용융 피크에 걸쳐 적분에 의해 분할된 특이성 생성물의 예견된 용융범위에 걸친 용융 피크 곡선의 적분은 비특이성 생성물의 비율에 대한 상한을 제공한다.A series of transformations are used to convert the melting curves into melt peaks (FIG. 49). The background fluorescence is removed (T1) by performing linear displacement analysis (L1) on the melting curve above the melting temperature of the purified PCR product. Approximately (R2 = 0.96, FIG. 49 melt curve) This line represents the background fluorescence as a function of temperature. Below the product melting temperature, linear regression analysis (L2) of the melting curve is used to eliminate the effect of temperature on fluorescence. Finally, the data is remapped to melt peak (T2) by plotting the derivative of fluorescence (-dF / dT) versus temperature by a method similar to that used to convert the spectroscopic melt curve to melt peak. The integration of the melt peak curve over the foreseen melt range of the specific product divided by the integral over the entire melt peak provides an upper limit for the ratio of nonspecific products.

PCR동안 온도의 함수로서 dsDNA 특이성 염료에서 나오는 형광 그래프(도 50)는 각 반응 싸이클 동안 쇄의 상태의 모니터링을 허용한다. 초기 온도 싸이클은 그래프의 하부에 걸친 배경 형광으로 나타난다. 증폭생성물이 축적될 때 어닐링온도로 전이동안 및 폴리메라제 활성이 새로운 생성물을 합성할 때 형광이 싸이클마다 상승한다. 변성온도를 향한 가열동안 생성물 변성을 나타내는 별도의 스팬 위로 배경 레벨까지 형광이 갑자기 떨어진다. 이것은 PCR의 형광대 온도 플롯의 시계방향 나선 구조를 가져온다.The fluorescence graph coming out of the dsDNA specific dye as a function of temperature during PCR (FIG. 50) allows monitoring of the state of the chain during each reaction cycle. The initial temperature cycle is represented by the background fluorescence across the bottom of the graph. Fluorescence rises from cycle to cycle during transition to the annealing temperature when amplification products accumulate and as the polymerase activity synthesizes new products. During heating to denaturation temperature, the fluorescence suddenly drops to a background level over a separate span indicating product denaturation. This results in a clockwise helix structure of the fluorescence band temperature plot of the PCR.

25 온도 싸이클 이후에 용융곡선 습득 싸이클이 개시된다(도 51). 생성물이 변성되고 마지막 어닐링되고 이후에 0.2℃/초의 속도로 변성온도에서 느리게 가열된다. 용융은 85℃에서 시작하고 형광은 87℃ 정도에서 배경 레벨로 떨어진다.After the 25 temperature cycles the melt curve acquisition cycle is initiated (FIG. 51). The product is denatured and finally annealed and then heated slowly at denaturation temperature at a rate of 0.2 ° C./sec. Melting begins at 85 ° C and fluorescence drops to background level at around 87 ° C.

PCR 생성물 용융 곡선의 절대위치는 SYBR Green I의 농도의 영향을 받는다(도 52a). 염료의 농도가 증가될 때 용융곡선은 더 고온으로 이동된다. 1 내지 7,000 이상의 농도는 PCR에 의한 증폭을 방지한다.The absolute position of the PCR product melt curve is affected by the concentration of SYBR Green I (FIG. 52A). As the dye concentration increases, the melting curve shifts to higher temperatures. Concentrations of 1 to 7,000 or more prevent amplification by PCR.

변성온도를 통한 신속한 온도전이는 반응효과 때문에 용융곡선을 더 높은 겉보기 Tm으로 이동시킨다(도 52b). 5℃/초 이상의 온도 전이 속도는 겉보기 Tm은 3℃정도 이동시킨다. 겉보기 Tm은 전이속도를 0.1에서 0.2℃/초로 증가시킴으로써 0.2℃ 이동된다. 후속의 용융곡선 분석이 0.2℃/초의 전이속도로 행해진다. 이러한 속도에서 용융곡선 분석은 도 50 에 도시된 8분의 반응에 30초를 추가한다.Rapid temperature transitions through the denaturation temperature shifts the melting curves to higher apparent T m because of reaction effect (Fig. 52b). Temperature transition rates of 5 ° C./sec or more shift the apparent T m by 3 ° C. The apparent T m is shifted by 0.2 ° C. by increasing the transition rate from 0.1 to 0.2 ° C./sec. Subsequent melt curve analysis is performed at a transition rate of 0.2 ° C./sec. Melt curve analysis at this rate adds 30 seconds to the 8 minute reaction shown in FIG.

3개의 상이한 정제 PCR 생성물에 대한 용융곡선이 수득된다(도 53). 3개의 생성물은 예리한 용융 곡선을 가지며 2℃내에서 용융한다. 180 염기쌍 헤파티스 B 조각(50.0% GC)의 겉보기 Tm은 536 염기쌍 β글로블린 조각(53.2% GC)보다 2도 낮으며 이들은 쉽게 구별가능하다. 292 염기쌍 프로스테이트 특이성 항원 조각(60.3% GC)의 겉보기 Tm은 더 큰 β-글로블린 조각보다 거의 5도 높은 용융온도를 가진다.Melt curves are obtained for three different purified PCR products (FIG. 53). The three products have a sharp melting curve and melt within 2 ° C. The apparent T m of the 180 base pair hepatis B fragment (50.0% GC) is 2 degrees lower than the 536 base pair β globulin fragment (53.2% GC) and these are easily distinguishable. The apparent T m of the 292 base pair prostate specific antigen fragment (60.3% GC) has a melting temperature nearly 5 degrees higher than that of the larger β-globulin fragment.

정제된 PCR 생성물이 혼합될 때 용융곡선이 중첩된다(도 54). 용융피크로 전환 이후에 2℃ 미만 Tm에서 차이가 나는 반응 생성물의 혼합물을 별도의 피크로 분해하는 것이 가능하다(도 55).Melt curves overlap when purified PCR products are mixed (FIG. 54). It is possible to decompose the mixture of reaction products, which differs in T m below 2 ° C. after conversion to the melt peak, into separate peaks (FIG. 55).

용융곡선 분석이 프라이머 다이머와 같은 비특이성 생성물로 부터 의도된 생성물을 분리하는데 사용된다(도 56). 프라이머 다이머는 75-85℃ 범위에서 넓은 용융 피크를 가지므로 특이성 PCR 증폭 생성물의 예리한 용융 피크와 구별된다. 낮은 어닐링에서 여러번 수행하여 나타난 더 큰 이질 생성물은 순수한 PCR 생성물에 비해서 더 낮고 더 넓은 용융곡선을 가진다.Melt curve analysis is used to separate the intended product from non-specific products such as primer dimers (FIG. 56). Primer dimers have broad melt peaks in the 75-85 ° C. range and are distinguished from the sharp melt peaks of specific PCR amplification products. The larger heterogeneous product shown by several runs at low annealing has a lower and wider melting curve compared to pure PCR product.

본 발명의 생성물 순도 결정 방법은 dsDNA 특이성 염료의 형광을 싸이클마다 한 번 모니터링한 것에 기초한 정량적인 PCR을 개선시키는데 사용된다. 초기 템플레이트 농도에서 상이한 일련의 반응동안 생성물의 폴리메라제 신장이후에 싸이클마다 한 번 형광이 수득된다(도 57). 배경 형광위로 로그-선형 증가는 초기 템플레이트 농도에 의존한 싸이클 횟수에서 시작한다. 반응마다 106 내지 102 복제물에 대한 5개의 반응 플롯이 약 4싸이클 분리된다. 반응마다 102 복제물을 갖는 반응은 반응효율의 감소를 보이며 100미만 초기 복제물 갯수를 갖는 반응은 덜 유용한 형광 프로파일을 제공한다. 10 및 1개의 복제물 함유 반응동안 형광 프로파일은 역순으로 상승하고 음의 비교는 30싸이클후 증폭을 보인다. 이것은 dsDNA 특이성 염료의 싸이클마다 한 번 형광 모니터링에 의한 의도된 생성물로 부터 구별될 수 없는 프라미어 다이머 및 기타 비특이성 증폭 생성물 때문에 일어난다.The product purity determination method of the present invention is used to improve quantitative PCR based on monitoring the fluorescence of dsDNA specific dye once per cycle. Fluorescence is obtained once per cycle after polymerase extension of the product during a different series of reactions at the initial template concentration (FIG. 57). The log-linear increase with background fluorescence starts with the number of cycles depending on the initial template concentration. Five reaction plots for 10 6 to 10 2 replicates are separated by about 4 cycles per reaction. Reactions with 10 2 replicates per reaction show a decrease in reaction efficiency and reactions with an initial replica number of less than 100 provide a less useful fluorescence profile. During 10 and 1 replicate containing reactions the fluorescence profile rises in reverse order and the negative comparison shows amplification after 30 cycles. This occurs because of prime dimers and other nonspecific amplification products that cannot be distinguished from the intended product by fluorescence monitoring once per cycle of dsDNA specific dye.

각 샘플에 대해 용융 피크가 수득되며(도 58) 전기영동 결과와 잘 상관됨이 발견된다(도 60). 0 및 1개의 초기 템플레이트 복제물 함유 반응은 예견된 536 염기쌍 위치에서 구별할 수 없는 전기영동 밴드를 생성한다. 10 내지 100개의 초기 복제물 함유 반응은 약한 전기영동 밴드를 보인다. 이것은 용융 피크 분석과 잘 일치하며, 이 경우 0 및 한 개의 초기 복제물 함유 반응동안 의도된 생성물의 범위(90-92℃)에서 DNA 용융이 발견되지 않으며 10 및 100개의 복제물에 대한 온도 범위에서 작은 피크를 보인다. 103-106 초기 복제물 함유 반응동안 강한 전기영동 밴드는 90-92℃에서 큰 용융 피크와 잘 상관된다.Melt peaks were obtained for each sample (FIG. 58) and found to correlate well with the electrophoresis results (FIG. 60). Reactions containing zero and one initial template copy result in indistinguishable electrophoretic bands at the predicted 536 base pair positions. Reactions containing 10 to 100 initial replicates show weak electrophoretic bands. This is in good agreement with the melt peak analysis, in which case no DNA melting is found in the intended product range (90-92 ° C.) during the 0 and one initial copy containing reaction and small peaks in the temperature range for 10 and 100 replicates. Seems. 10 3 -10 6 during the first reproduction-containing reaction Strong electrophoresis bands are correlated well with large melting peaks in the 90-92 ℃.

총생성물에 대한 의도된 생성물의 비는 용융 피크 적분에 의해 결정되는데 105 복제물에 대해서는 0.28이고 0 초기 복제물에 대해서는 0.0002이다. 도 57 의 각 데이타 포인트는 적절한 비율이 곱해져서 보정된 플롯이 된다(도 59). 이러한 과정은 10 및 1개의 초기 복제물까지 정량화의 유효동적범위를 연장시킨다.The ratio of the intended product to the total product is determined by the melt peak integration, which is 0.28 for 10 5 replicas and 0.0002 for 0 initial replicas. Each data point in Fig. 57 is multiplied by an appropriate ratio to form a corrected plot (Fig. 59). This process extends the effective dynamic range of quantification up to 10 and one initial replicate.

PCR 생성물 탐지와 분석은 증폭동안 온도 싸이클링과 동시에 이루어진다. 생성물 크기, 서열 또는 용융 프로파일과 같은 DNA의 기본적인 성질이 PCR동안 생성물을 선택적으로 식별할 수 있다면 더 이상의 분석은 불필요하다.PCR product detection and analysis takes place simultaneously with temperature cycling during amplification. No further analysis is necessary if the basic properties of the DNA, such as product size, sequence or melt profile, can selectively identify the product during PCR.

증폭동안 서열 특이성 탐지가 형광 프로브를 써서 가능하다. 단일 프로브는 2개의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 염료를 써서 라벨링될 수 있다. 폴리메라제 엑소누클레아제에 의한 프로브의 가수분해는 퀀칭으로 부터 도너염료를 방출시킨다. 증폭이 진행함에 따라 도너염료에서 나오는 형광은 누적으로 증가한다. 혹은 FRET 염료가 인접 교합하는 2개의 단일 라벨링된 프로브상에 위치될 수 있다. 가수분해와 교합 기술은 증폭과 서열 특이적 생성물 탐지를 가능하게 한다. 그러나 각 타겟에 대해서 고유한 프로브가 필요하다. 프로브 합성 및 정제는 특히 이중라벨링된 프로브의 경우에 사소하지 않다.Sequence specificity detection during amplification is possible using fluorescent probes. A single probe can be labeled using two fluorescence resonance energy transfer (FRET) dyes. Hydrolysis of the probe by the polymerase exonuclease releases the donor dye from quenching. As amplification proceeds, the fluorescence from the donor dye increases cumulatively. Alternatively, the FRET dye can be located on two single labeled probes with adjacent occlusion. Hydrolysis and occlusion techniques allow for amplification and sequence specific product detection. However, a unique probe is required for each target. Probe synthesis and purification is not particularly trivial in the case of bilabeled probes.

나선 안정성이 PCR 생성물 식별에 사용될 수 있다. 예컨대 단일쇄 구조 다형성, 변성 그레디언트 겔 전기영동 및 온도 그레디언트 겔 전기영동은 상이한 구조의 안정성에 기초하여 생성물을 분리한다. 교합 안정성은 FRET를 써서 실시간으로 모니터링 될 수 있다. 용융곡선의 모니터링은 교합 기술에 의한 서열화에 있어서 추가 판별 기준으로 사용된다.Helix stability can be used to identify PCR products. For example, single chain structure polymorphism, modified gradient gel electrophoresis and temperature gradient gel electrophoresis separate products based on the stability of different structures. Occlusal stability can be monitored in real time using FRET. Monitoring of the melting curve is used as a further discrimination criterion in sequencing by the occlusion technique.

에티듐 호모다이머와 에티듐 브로마이드가 DNA 변성 모니터링에 사용된다. PCR은 에티듐 브로마이드와 SYBR Green I을 포함한 많은 dsDNA 특이적 염료와 양립할 수 있다. 이들 염료는 싸고 구매가 용이하며 프로브 합성이 불필요하다. 에티듐 브로마이드가 PCR에 포함되면 유리 모세관 샘플튜브내 샘플에서 나오는 형광이 증가한다. 자외선 조사 및 CCD 카메라를 써서 PCR 반응은 모니터링 할수도 있다. 생성물 종류가 확인되므로 이러한 게놈 염료를 사용한 모니터링은 증폭후 별도의 분석단계 필요성을 제거한다. 절대적인 서열 특이성이 드물게 필요하지만 생성물 분리가 종종 필요하다.Ethidium homodimers and ethidium bromide are used to monitor DNA denaturation. PCR is compatible with many dsDNA specific dyes, including ethidium bromide and SYBR Green I. These dyes are cheap and easy to purchase and do not require probe synthesis. Inclusion of ethidium bromide in the PCR increases the fluorescence from the sample in the free capillary sample tube. Ultraviolet irradiation and CCD cameras can also be used to monitor PCR reactions. As product types are identified, monitoring with these genomic dyes eliminates the need for a separate assay step after amplification. Absolute sequence specificity is rarely required but product separation is often necessary.

PCR 생성물은 그의 모양이 GC 함량, 길이 및 서열의 함수인 용융곡선의 분석에 의해 증폭동안 분리될 수 있다. PCR 생성물이 용융하는 온도는 다양하다. 당해분야에 공지된 실험식을 사용하여 DNA의 GC 함량이 용융온도(Tm)에 미치는 효과가 알려지며 0% GC 듀플렉스는 100% GC 듀플렉스보다 41℃ 더 낮은 온도에서 용융한다. GC 함량이 주어지면 40염기쌍 프라이머 다이머는 1000염기쌍 생성물보다 12℃ 아래에서 용융한다. 그러므로 PCR 생성물의 Tm 범위는 적어도 50℃에 걸쳐 있다. 이러한 넓은 범위는 대개의 PCR 생성물이 용융곡선에 의해 구별될 수 있게 한다. 길이 차이로 인하여 프라이머 다이머는 원하는 PCR 생성물보다 낮은 온도에서 용융한다. 이질 생성물은 순수한 PCR 생성물보다 넓은 범위에서 용융한다. 긴 PCR 생성물은 식별을 위한 지문으로 사용될 수 있는 내부 용융 도메인을 가지지만 작은 PCR 생성물은 하나의 주 전이온도에서 용융한다(도 53).PCR products can be isolated during amplification by analysis of a melt curve whose shape is a function of GC content, length and sequence. The temperature at which the PCR product melts varies. The effect of the GC content of DNA on the melting temperature (T m ) is known using experimental formulas known in the art and the 0% GC duplex melts at 41 ° C. lower than the 100% GC duplex. Given the GC content, the 40 base pair primer dimer melts below 12 ° C. above the 1000 base pair product. Therefore the T m range of the PCR product spans at least 50 ° C. This wide range allows most PCR products to be distinguished by melting curves. Due to the difference in length, the primer dimer melts at a lower temperature than the desired PCR product. Heterogeneous products melt in a wider range than pure PCR products. Long PCR products have internal melt domains that can be used as fingerprints for identification while small PCR products melt at one main transition temperature (FIG. 53).

겔 전기영동과 다르게 용융곡선 분석은 길이가 같지만 GC/AT 비가 상이한 생성물을 구별할 수 있다. 추가로, 길이와 GC 함량이 같지만 GC 분포에서 상이한 2개의 생성물은 상이한 용융 곡선을 가진다. 헤테로듀플렉스가 형성되는 경우에 이질접합성 DNA의 증폭에서 작은 서열 차이가 관찰될 수도 있다. 이질접합성 DNA에서 단일 염기 차이는 완전 상보적인 DNA에 비해서 헤테로듀플렉스의 경우에 1-5℃의 온도 이동을 가져온다.Unlike gel electrophoresis, melt curve analysis can distinguish products of the same length but different GC / AT ratios. In addition, two products of the same length and GC content but different in the GC distribution have different melting curves. Small sequence differences may be observed in the amplification of heterozygous DNA when heteroduplexes are formed. Single base differences in heterozygous DNA result in temperature shifts of 1-5 ° C. for heteroduplexes compared to fully complementary DNA.

2℃ 미만 분리된 PCR 생성물이 본 발명을 사용하여 혼합물내에서 구별될 수 있다(도 56). 게다가, 존재하는 상이한 생성물의 상대적 양을 추정하기 위해서 용융곡선이 생성물 피크로 분해될 수 있다(도 61). 상이한 PCR 생성물의 상대적 양 결정능력은 매우 유용하다. 예컨대, 총 dsDNA에 대한 의도된 생성물의 상대적 양을 알면 반응이 dsDNA 염료에 의해 모니터링될 때 비특이적 증폭에 대해 보정할 수 있다. 에티듐 브로마이드 또는 SYBR Green I을 사용하여 초기 템플레이트 농도의 6-8배 크기에 대한 정량이 가능하다. 그러나, 낮은 초기 템플레이트 복제물 갯수에서 민감성은 비특이적 증폭에 의해 제한된다(도 57). 용융곡선(도 58)는 특히 적은 갯수의 초기 복제물에서 다중 PCR 생성물을 보이며 이것은 겔 전기영동후 관찰되는 다중 생성물과 잘 상관된다(도 60). 총 생성물에 대한 예견된 범위에서 용융하는 생성물의 비는 비특이적 증폭에 대한 보정에 사용될 수 있다(도 59). 이 비율은 총 생성물에 대한 예견된 양의 상한을 제공한다. 두 개이상의 생성물이 함께 이동함으로써 전기영동 결과를 오판할 수 있는 것처럼 예견된 범위에서 용융하는 생성물의 일부가 의도된 생성물이 아닐 수 있다. 그러나, 예견된 생성물의 범위에서 dsDNA가 용융하지 않는다면 예견된 생성물이 존재하지 않는다고 결론내릴 수 있다.PCR products separated below 2 ° C. can be distinguished in the mixture using the present invention (FIG. 56). In addition, the melt curve can be broken down to product peaks to estimate the relative amounts of different products present (FIG. 61). The ability to determine the relative amounts of different PCR products is very useful. For example, knowing the relative amount of the intended product relative to the total dsDNA can correct for nonspecific amplification when the reaction is monitored by the dsDNA dye. Ethidium bromide or SYBR Green I can be used to quantify 6-8 times the initial template concentration. However, at low initial template replicate numbers, sensitivity is limited by nonspecific amplification (FIG. 57). Melt curves (FIG. 58) show multiple PCR products, especially in a small number of initial replicates, correlating well with the multiple products observed after gel electrophoresis (FIG. 60). The ratio of the melting product in the predicted range to the total product can be used for correction for nonspecific amplification (FIG. 59). This ratio provides an upper limit of the predicted amount for the total product. Some of the melting product in the foreseen range may not be the intended product, as two or more products move together to mislead the results of electrophoresis. However, if the dsDNA does not melt in the range of predicted products, it can be concluded that no predicted product is present.

용융곡선 분석은 더 작은 갯수의 복제물까지 정량화의 동적 범위를 연장하는데 사용될 수 있다. 용융 곡선 분석은 비특이적 증폭보다 의도된 생성물로 부터 형광을 유도할 더 큰 확실성을 제공한다. PCR에서 형광 모니터링의 유용성은 생성물 식별에 겔 전기영동이 필요하다면 제한된다. 용융 피크 분석은 후속의 전기영동 없이도 PCR동안 생성물을 식별할 수 있게 한다.Melt curve analysis can be used to extend the dynamic range of quantification to a smaller number of replicates. Melt curve analysis provides greater certainty to induce fluorescence from the intended product than nonspecific amplification. The utility of fluorescence monitoring in PCR is limited if gel electrophoresis is required for product identification. Melt peak analysis allows for product identification during PCR without subsequent electrophoresis.

2PCR 생성물의 상대적 양을 분해하는 능력은 경쟁적인 PCR 정량에 유용하다. 동일한 프라이머를 갖는 경쟁적 템플레이트가 본 발명에 따라서 생성물의 길이 또는 GC/AT 비를 변화시킴으로써 천연 앰플리콘으로 부터 용융온도가 2-3℃ 다르게 디자인된다. 경쟁물질의 일정량이 미지의 양의 천연 템플레이트에 첨가되고 템플레이트가 증폭되고 용융곡선이 수득되고 생성물 피크가 분해된다. 생성물이 동일한 효율로 증폭한다고 가정하면 생성물간의 비는 초기 템플레이트간의 비이다.The ability to degrade the relative amount of 2PCR product is useful for competitive PCR quantification. Competitive templates with identical primers are designed according to the present invention by varying the melting temperature 2-3 ° C. from the natural amplicons by varying the length or GC / AT ratio of the product. A certain amount of competition is added to an unknown amount of natural template, the template is amplified, a melt curve is obtained and the product peak is degraded. Assuming that the products amplify at the same efficiency, the ratio between products is the ratio between the initial templates.

용융곡선 분석은 몇가지 한계를 가진다. 용융곡선의 폭과 절대위치는 온도전이속도(도 52b)와 염료농도(도 52a)의 영향을 받는다. 에티듐 브로마이드의 첨가는 용융온도를 증가시키고 용융전이를 넓힌다. 평형 보장을 위해서 용융곡선이 0.5℃/분의 속도로 획득되지만 12℃/분의 속도가 용융온도에서 2℃ 이하 차이가 나는 생성물을 구별하는데 사용될 수 있다(도 53). 전이 속도가 느리거나 샘플 온도 균일성이 크면 더욱 미세한 분해가 가능하다.Melt curve analysis has several limitations. The width and absolute position of the melting curve are affected by the temperature transition rate (Fig. 52b) and the dye concentration (Fig. 52a). The addition of ethidium bromide increases the melting temperature and broadens the melting transition. Melt curves are obtained at a rate of 0.5 ° C./min to ensure equilibrium but a rate of 12 ° C./min can be used to distinguish products that differ by less than 2 ° C. from the melting temperature (FIG. 53). Slower transition rates or greater sample temperature uniformity allow for finer resolution.

본 발명의 용융 피크 분석은 PCR과 완전 일체가 되는 생성물 구별방법을 제공한다. 겔 전기영동에 의한 크기분리와 유사하게 용융 피크 분석은 DNA의 기본 특성을 측정하고 증폭된 생성물 식별에 사용될 수 있다. 용융 곡선 분석과 PCR 형광 모니터링의 조합은 동시 증폭, 탐지, PCR 생성물 구별을 위한 전망이 있는 방법을 제공한다.Melt peak analysis of the present invention provides a method of product differentiation that is fully integrated with PCR. Similar to size separation by gel electrophoresis, melt peak analysis can be used to measure the basic properties of DNA and to identify amplified products. The combination of melt curve analysis and PCR fluorescence monitoring provides a promising method for simultaneous amplification, detection, and PCR product differentiation.

신속한 열 싸이클링을 사용한 온-라인 DNA 분석 시스템에 관한 정보가 미국특허 출원 08/381,703 (1995. 1. 31 출원)에 발표된다.Information on on-line DNA analysis systems using rapid thermal cycling is published in US patent application 08 / 381,703 (filed Jan. 31, 1995).

프로그램 코드 부록 AProgram Code Appendix A

서열표 리스트Sequence Listing

(1)일반정보(1) General Information

(i)출원인; 위터, 칼 티 (i) the applicant; Wyter, Cal Tee

리리 커크 엠Liri Kirk M

라스센, 랜디 피Rassen, Randy P

힐야드, 데이비드 알 Hillyard, David R

(ii) 발명의 명칭; 셍물학적 공정을 실행하고 이를 모니터하는 시스템 및 방법(ii) the name of the invention; Systems and methods for executing and monitoring biophysical processes

(iii) 서열의 수; 6(iii) number of sequences; 6

(iv) 통신 주소(iv) communication address

(A) 주소: 토르프, 노스 & 웨스턴 일일피(A) Address: Torp, North & Western Daily

(B) 거리 : 사우스 700 이스트 9035, 슈이트 200 (B) Street: South 700 East 9035, Suite 200

(C) 도시 : 샌디(C) City: Sandy

(D) 주 : 유타(D) State: Utah

(E) 나라 : USA(E) Country: USA

(F) 우편코드 : 84070(F) ZIP Code: 84070

(v) 컴퓨터 판독 형태(v) computer-readable form

(A)매체형태; 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 용량(A) medium form; Diskette, 3.5 in, 1.44 Mb Capacity

(B)컴퓨터; 도시바 T2150CDS(B) a computer; Toshiba T2150CDS

(C)작동시스템; 윈도우 95(C) the operating system; Windows 95

(D)소프트웨어; 워드 퍼펙트 7.0(D) software; Word Perfect 7.0

(vi) 현재 출원 데이터(vi) current application data

(A) 출원번호; (A) application number;

(B) 출원일자; 1997년 6월 4일(B) filing date; June 4, 1997

(C) 분류(C) classification

(vii) 우선권 출원 데이터(vii) priority application data;

(A) 출원번호; US08/658,993(A) application number; US08 / 658,993

(B) 출원일자; 1996년 6월 4일(B) filing date; June 4, 1996

(vii) 우선권 출원 데이터(vii) priority application data;

(A) 출원번호; (A) application number;

(B) 출원일자; (B) filing date;

(viii) 대리인 정보(viii) agent information

(A) 이름; 그랜트 알. 클레톤(A) name; Grant R. Cleton

(B) 등록번호; 32,462(B) registration number; 32,462

(C) 서류 번호; 8616.CIP5(C) the document number; 8616.CIP5

(ix) 통신 정보(ix) communication information

(A) 전화번호; (801) 566-6633(A) a telephone number; (801) 566-6633

(B) 팩스번호; (801) 566-0750(B) a fax number; (801) 566-0750

(2)서열 1에 대한 정보(2) Information about sequence 1

(i)서열특징 (i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 1(xi) SEQ ID NO 1

[서열 1][SEQ ID NO 1]

(2)서열 2에 대한 정보(2) Information about sequence 2

(i)서열특징 (i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상;선형(D) phase; linear

(xi)서열 2(xi) SEQ ID NO: 2

[서열 2][SEQ ID NO 2]

(2)서열 3에 대한 정보(2) Information about sequence 3

(i)서열특징 (i) Sequence features

(A)길이; 35bp(A) length; 35 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 3(xi) SEQ ID NO 3

[서열 3][SEQ ID NO 3]

(2)서열 4에 대한 정보(2) Information about sequence 4

(i)서열특징 (i) Sequence features

(A)길이; 30bp(A) length; 30 bp

(B)형태; 핵산(B) form; Nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 4(xi) SEQ ID NO: 4

[서열 4][SEQ ID NO 4]

(2)서열 5에 대한 정보(2) Information about sequence 5

(i)서열특징 (i) Sequence features

(A)길이; 22bp(A) length; 22bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 5(xi) SEQ ID NO: 5

[서열 5][SEQ ID NO: 5]

(2)서열 6에 대한 정보(2) Information about sequence 6

(i)서열특징 (i) Sequence features

(A)길이; 20bp(A) length; 20 bp

(B)형태;핵산(B) form; nucleic acid

(C)가닥; 단일 쇄(C) strands; Single chain

(D)위상; 선형(D) phase; Linear

(xi)서열 6(xi) SEQ ID NO: 6

[서열 6][SEQ ID NO: 6]

Claims (11)

다음을 포함하는, 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄 반응 증폭을 실시간을 모니터링 하는 방법. :A method for monitoring real-time for polymerase chain reaction amplification of a target DNA sequence of a biological sample, comprising: : 타겟 서열의 인접지역까지 교합하는 두 개의 핵산 프로브의 존재하에서 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 서열을 증폭하고, 상기 프로브중 하나는 받게 형광단으로 라벨링 되고 다른 하나는 타겟 서열과 두 프로브의 교합시 도너(donor)와 받게(acceptor) 형광단이 서로의 0 내지 25 누클레오타이드내에 있도록 하는 형광에너지 전달쌍의 도너 형광단으로 라벨링 되며, 상기 폴리메라제 연쇄반응은 타겟 핵산서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 생물학적 샘플에 첨가하고 적어도 변성온도와 신장온도사이에서 생물학적 샘플을 열싸이클링을 받게 하는 단계를 포함하며;Amplify the target sequence by polymerase chain reaction in the presence of two nucleic acid probes occlusion to the adjacent region of the target sequence, one of which is labeled with a fluorophore and the other at the time of occlusion of the target sequence with the two The donor fluorophore is labeled with a donor fluorophore of fluorescent energy transfer pairs such that the donor and acceptor fluorophores are within 0-25 nucleotides of each other, and the polymerase chain reaction is followed by primers and heat for the target nucleic acid sequence. Adding a stable polymerase to the biological sample and subjecting the biological sample to thermal cycling at least between denaturation and extension temperatures; 도너 형광단에 의해 흡수되는 파장에서 생물학적 샘플을 빛으로 활성화시키는 단계 및 생물학적 샘플에서 나오는 방출을 탐지하는 단계.Activating the biological sample with light at a wavelength absorbed by the donor fluorophore and detecting the emission from the biological sample. 제 1항에 있어서, 생물학적 샘플로 부터 온도 종속성 형광을 모니터링 하는 단계를 더욱 포함하는 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간을 모니터링 하는 방법.The method of claim 1, further comprising monitoring temperature dependent fluorescence from the biological sample. 제 1항에 있어서, 아래의 단계를 더욱 포함하는 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간을 모니터링 하는 방법. :The method of claim 1, further comprising the following steps: polymerase chain reaction amplification of the target DNA sequence of the biological sample. : 상기 샘플에서 나오는 형광 방출을 모니터링하고;Monitor fluorescence emission from the sample; 모니터링으로부터 발생된 데이터에 따라서 온도 및 시간 매개변수를 조절하여 생성물 수율 또는 특이성을 최적화하는 단계.Adjusting temperature and time parameters in accordance with data generated from monitoring to optimize product yield or specificity. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 공명 에너지 전달쌍이 도너로서 형광제와 받게로서 Cy5를 포함함을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간을 모니터링 하는 방법.4. The polymerase chain reaction amplification of a target DNA sequence of a biological sample according to claim 1, wherein the resonance energy transfer pair comprises a fluorescent agent as donor and Cy5 as a acceptor. 5. How to monitor real time. 제 1항에 있어서, 광학적으로 투명한 재료로 된 모세관 튜브에 생물학적 샘플을 넣는 단계를 더욱 포함하며; 그리고 상기 탐지 단계는 모세관 튜브의 단부를 통해 형광을 탐지하는 더욱 포함함을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간을 모니터링하는 방법.The method of claim 1, further comprising placing the biological sample in a capillary tube of optically transparent material; And the detecting step further comprises detecting fluorescence through an end of the capillary tube. 제 5항에 있어서, 활성화 단계는 모세관 튜브의 단부를 통해 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간을 모니터링 하는 방법.6. The method of claim 5, wherein the activating step further comprises irradiating the sample through an end of the capillary tube. 제 6항에 있어서, 활성화 단계는 탐지된 형광의 광학 경로를 따라 샘플을 조사하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 타겟 DNA서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간을 모니터링 하는 방법.7. The method of claim 6, wherein the step of activating further comprises irradiating the sample along the optical path of the detected fluorescence to amplify the polymerase chain reaction amplification of the target DNA sequence of the biological sample. 제 5항, 제 6항, 또는 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 부피에 대한 표면적의 비가 4mm-1 이상인 모세관 튜브를 사용하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열의 폴리메라제 연쇄반응 증폭을 실시간을 모니터링 하는 방법.8. The polymerase chain reaction of a target DNA sequence of a biological sample according to any one of claims 5, 6 or 7, wherein a capillary tube having a surface area to volume ratio of at least 4 mm −1 is used. How to monitor real time to amplify. 다음의 단계를 포함하는, DNA 서열 다형성, 이질 접합성 또는 돌연변이 여부확인을 위해 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열을 분석하는 방법.:A method of analyzing a target DNA sequence of a biological sample for DNA sequence polymorphism, heterozygosity, or mutation, comprising the following steps: (a) 생물학적 샘플에 유효량의 두 개의 핵산 프라이머와 핵산 프로브를 첨가하고, 상기 프라이머 및 프로브중 하나는 받게 형광단과 도너 형광단을 포함하는 형광 에너지 전달쌍중 하나로 라벨링되며 라벨링된 프로브는 라벨링된 프라이머의 0 내지 25 누클레오타이드내에서 타겟 핵산 서열의 증폭된 복제물로 교합하며,(a) adding an effective amount of two nucleic acid primers and a nucleic acid probe to a biological sample, one of the primers and probes being labeled with one of the fluorescent energy transfer pairs comprising a fluorophore and a donor fluorophore and the labeled probe is labeled primer Occupy an amplified copy of the target nucleic acid sequence within 0 to 25 nucleotides of (b) 타겟 핵산 서열을 위한 프라이머와 열안정성 폴리메라제를 첨가하고 적어도 변성온도와 신장온도 사이에서 생물학적 샘플을 열싸이클링을 받게하는 단계를 포함하는 폴리메라제 연쇄반응에 의해 타겟 핵산 서열을 증폭하고;(b) amplifying the target nucleic acid sequence by polymerase chain reaction comprising adding a primer for the target nucleic acid sequence and a thermostable polymerase and subjecting the biological sample to thermal cycling at least between denaturation and extension temperatures and; (c) 상기 도너 형광단에 의해 흡수되는 선택된 파장의 빛을 사용하여 생물학적 샘플을 조사하고 샘플의 형광 방출을 탐지하는 단계(c) irradiating a biological sample using light of a selected wavelength absorbed by said donor fluorophore and detecting fluorescence emission of the sample 제9항에 있어서, 샘플의 온도 종송성 형광을 모니터링하는 단계를 더욱 포함하는 DNA 서열 다형성, 이질 접합성 또는 돌연변이 여부확인을 위해 생물학적 샘플의 타겟 DNA 서열을 분석하는 방법.The method of claim 9, further comprising monitoring the temperature dependent fluorescence of the sample. 10. The method of claim 9, wherein the target DNA sequence of the biological sample is analyzed for DNA sequence polymorphism, heterozygosity, or mutation. 제 9항에 있어서, 공명에너지 전달쌍이 도너로서 형광제와 받게되서 Cy5를 포함함을 특징으로 하는 DNA서열 다형성, 이질 접합성 또는 돌연변이 여부확인을 위해 생물학적 샘플의 타겟 DNA서열을 분석하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the resonance energy transfer pair is subjected to a fluorescent agent as a donor and comprises Cy5. 11.
KR10-1998-0709729A 1996-06-04 1997-06-04 DNA amplification monitoring by fluorescence KR100479767B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1998-0709729A KR100479767B1 (en) 1996-06-04 1997-06-04 DNA amplification monitoring by fluorescence

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8/658,993 1996-06-04
US08/658,993 1997-03-17
KR10-1998-0709729A KR100479767B1 (en) 1996-06-04 1997-06-04 DNA amplification monitoring by fluorescence

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000016161A KR20000016161A (en) 2000-03-25
KR100479767B1 true KR100479767B1 (en) 2005-07-05

Family

ID=43667681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1998-0709729A KR100479767B1 (en) 1996-06-04 1997-06-04 DNA amplification monitoring by fluorescence

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100479767B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20000016161A (en) 2000-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0912760B1 (en) System and methods for monitoring for dna amplification by fluorescence
US7670832B2 (en) System for fluorescence monitoring
US7745205B2 (en) Container for carrying out and monitoring biological processes
US7081226B1 (en) System and method for fluorescence monitoring
JPH07163397A (en) Method of simultaneous observation and analysis of double amplification reaction
KR100479767B1 (en) DNA amplification monitoring by fluorescence
KR100479782B1 (en) Biological Process Monitoring Methods and Systems
KR20000015939A (en) Monitoring hybridization during pcr
JPH08298998A (en) Detection of gene mutation and device therefor

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130311

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140311

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150309

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160309

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170315

Year of fee payment: 13

EXPY Expiration of term