KR100441893B1

KR100441893B1 - Ｍｅｍｓ소자를 이용한 핵산분리장치

Info

Publication number: KR100441893B1
Application number: KR10-2002-0045954A
Authority: KR
Inventors: 이승섭; 문상준; 남홍길; 윤재영
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2002-08-03
Filing date: 2002-08-03
Publication date: 2004-07-27
Also published as: KR20040012390A

Abstract

본 발명은 MEMS (Micro Electro Mechanical System)소자를 이용한 초소형 핵산분리장치, 핵산분리방법 및 그 핵산분리장치의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 초소형 핵산분리장치는 초소형의 MEMS소자로 빗살모양의 전극을 이용하여 핵산을 포함하는 물질을 선택적으로 수집하며, 히터(Heater)과 고상 필터를 이용하여 수집된 물질을 파괴하고 핵산만을 선택적으로 결합시킴으로써 핵산을 포함한 샘플로부터 순수한 핵산만을 효과적인 추출하고 정제할 수 있다.

본 발명에 따르면, MEMS소자를 이용함으로써 샘플의 양과 외래물질에 의한 오염을 최소화하면서 높은 정도(Quality)의 핵산을 분리할 수 있다. 또한 고상분리법과 전기분극(Dielectrophoresis), 내부열원을 동시에 이용함으로써 핵산의 선택적 추출의 질을 향상시키고, 부가적인 화학약품에 의한 화학처리공정을 제거할 수 있다.

Description

ＭＥＭＳ소자를 이용한 핵산분리장치{Nucleic acid separation device using MEMS component}

본 발명은 MEMS (Micro Electro Mechanical System)소자를 이용한 초소형 핵산분리장치, 핵산분리방법 및 그 핵산분리장치의 제조방법을 제공한다. 본 발명에따른 초소형 핵산분리장치는 초소형의 MEMS소자로 빗살모양의 전극을 이용하여 핵산을 포함하는 물질을 선택적으로 수집하며, 히터(Heater)과 고상 필터를 이용하여 수집된 물질을 파괴하고 핵산만을 선택적으로 결합시킴으로써 핵산을 포함한 샘플로부터 순수한 핵산만을 효과적인 추출하고 정제할 수 있다.

핵산 증폭 방법(PCR), 재조합 DNA 기법 및 서열 결정방법과 같은 분자생물학에 있어서의 최근의 발전은 투입 물질로서의 분리형 핵산에 좌우된다. 따라서, 복합시료로부터 핵산을 효과적으로 추출하고 정제하는 방법이 필요하다. 물론 이 방법은 가능한 단순하고 신속해야 하며, 출발물질로부터 고수율로 핵산을 얻을 수 있어야 한다. 또한 용이하게 자동화할 수 있는 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 일반적으로 핵산이 분리되는 출발물질은 핵산이 단백질 또는 지질등의 세포물질에 둘러싸여 존재하는 복합생물학적 물질이다. 이러한 물질은 예컨대 혈액, 혈청, 백혈구, 뇨, 배설물, 뇌척수액, 정액, 타액, 세포 배양물 등일 수 있다.

핵산 함유복합물질로부터 핵산을 분리하는 종래의 기술은 핵산함유 복합물질을 균질화 또는 선택적 분리를 통해 정제하고, 단백질 분해효소 존재 하에서 계면활성제를 사용하여 불필요한 생물학적 물질을 용해시킨 후 유기용매로 핵산과 분해물질(단백질 및 지질)을 분리, 추출하고 이로부터 에탄올을 가하여 핵산을 침전시키고 열 또는 건조의 방법으로 핵산을 투석한다(도 1 참조). 그러나, 이러한 방법은 각 단계마다 시료를 동시에 처리하는 경우 이종물질(외래 핵산)의 혼입이 발생하고, 유기용매와 같은 유독성 화학물질을 사용해야만 하는 어려움이 있다. 또한 이러한 각 공정에 사용되는 장비는 원심분리기, 혼합기, 히터 등 부피가 크거나랩(lab)차원에서 사용이 가능한 장비의존적인 작업이다.

이러한 단점을 보완한 방법들이 개발되었지만(대한민국 특10-1998-0706258, 10-2000-0005130, 10-1990-004012, PCT/FR92/00646, Nucleic Acid Research, vol17 no20, 1989, pp.8390), 이러한 핵산분리방법들(Protocols) 역시 전체 공정을 단일소자에서 작업하지 못하고 단위공정만을 Macro-scale의 장비 또는 수동형 소자를 이용한 분리 장비를 사용함으로써 종래의 단점을 보완하고 있다. 이러한 방법 또한 매크로 크기(Macro-scale)의 장비 또는 수동형 소자는 많은 량의 시료를 요구하며 전체공정 중에서는 원심분리기, 혼합기, 히터 등 부피가 큰 장비를 부가적으로 필요로 한다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 핵산을 포함하는 물질과 핵산을 포함하지 않은 물질은 각각 전기적으로 다른 성질을 가지고 있다는 점을 착안하여 초소형의 MEMS소자로 빗살모양의 전극을 이용하여 핵산을 포함하는 물질을 선택적으로 수집하고, 내부열원(Heater)과 고체상태의 지지물을 이용하여 수집된 물질을 파괴하고 핵산을 선택적으로 결합시킴으로써 핵산을 효과적인 추출을 할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 종래기술에서 사용하지 않은 MEMS소자를 이용함으로써 샘플의 양과 외래물질에 의한 오염을 최소화하면서 높은 정도(Quality)의 핵산을 분리할 수 있는 초소형 핵산분리장치를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 고체상분리법과 전기분극, 내부열원을 동시에 이용함으로써 핵산의 선택적 추출을 향상시키고 부가적인 화학약품에 의한 화학처리공정을 제거할 수 있는 새로운 핵산분리방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 MEMS 기술을 이용한 상기 초소형 핵산분리장치의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 분리된 핵산을 다중 PCR 칩(Multiplex PCR chip)과 연계하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)의 반응시료로 사용하고 다중 PCR 칩과 직접화된 순간현장적용(Point-of-care)방식의 손에 들고 다닐 수 있는(hand-held)장치 구현에 있다.

도 1은 종래의 핵산추출방법의 순서도이며,

도 2는 MEMS소자를 이용한 핵산분리장치의 단면도이며,

도 3은 MEMS소자를 이용한 핵산분리장치의 평면도 및 확대도이며,

도 4는 MEMS소자를 이용한 핵산분리장치의 제조공정도이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

(1) 샘플투입구 (2) 혼합반응용기

(3) 고상 필터 (4) 빗살모양 전극

(5) 세정액입구 (6) 샘플퇴출구

(7) 히터 (8) 센서

(9) 전기영동전극 (10) 기판

본 발명은 MEMS (Micro Electro Mechanical System)소자에 의한 초소형 핵산분리장치, 핵산분리방법과 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 초소형 핵산분리장치는 핵산을 포함한 샘플로부터 순수한 핵산만을 추출하고 정제한다. 핵산분리장치는 내부열원을 가지는 히터(Heater)와 온도제어를 위한 측온 저항체 센서(RTD: Resistance Thermometer Device)센서와 가변주파수에 따른 분극을 발생시키는 빗살(Comb)모양의 전극 어레이(Electrode Array)로 구성되어 있다. 또한, 각 장치는 500㎛²의 반응 면적을 가지는 최소형의 소자로 직접화 하였다. 각 소자는 외부 제어장치에 의해 제어된다. 핵산추출 및 정제 단계에서 핵산을 포함한 샘플은 핵산을 포함한 물질과 핵산을 포함하지 않은 물질로 분리된다. 또한 본 발명이 이루고자 하는 직접화 소자는 핵산을 포함한 물질(예컨대, 세포)이 원하지 않는 단백질,탄수화물, 지질 등을 포함하고 있으므로 이것을 분리하여 순수한 핵산만을 추출하는 장치이다. 핵산을 포함하고 있는 물질과 핵산을 포함하지 않은 물질은 각각 전기적으로 다른 성질을 가지고 있다는 점을 착안하여 초소형의 MEMS소자로 빗살모양의 전극을 이용하여 세포 및 핵산을 선택적으로 수집한다.

본 발명에 따른 초소형 핵산분리장치는 기존의 기술에서 사용하는 원심분리기, Voltex mixer, 항온조등을 대체할 수 있고 세포 및 핵산의 선택적 수집과 파괴를 위한 화학적 공정(유독성 유기용매)등과 같은 화학공정을 배제한다. 또한 수집된 샘플을 내부열원과 고체상태의 지지물을 이용하여 선택적으로 결합시킴으로써 효과적인 추출을 할 수 있다. 또한, 공지의 기술인 SPE(Solid Phase Extraction)와 같은 방법을 사용하지만 내부열원과 같이 병용하여 부가적인 화학약품을 사용하지 않음으로써 추출의 효율을 높이고 중간단계의 생성물을 이동시키지 않음으로써 외부핵산(NA: Nuclei Acid)과 같은 오염물질의 혼입을 방지할 수 있다.

본 발명에 따른 초소형 핵산분리장치는 MEMS 공정을 이용해 혼합반응용기, 단일열원, 열원감지센서(Sensor), 빗살모양전극, 고상물질결합필터(Filter)등이 일체화되고 적은 양의 핵산포함복합물질로부터 핵산을 분리하고 핵산만을 선택적으로 추출할 수 있는 소자의 복합체이다. 이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기판 위에 위치하여 열 발생과 열 검출에 사용되는 히터 및 센서부와, 상기 히터 및 센서부 위에 위치하여 전기장을 형성하는 전극부와, 상기 전극부 위에 위치하여 핵산의 결합을 위한 고상 필터부와, 상기 고상 필터부를 감싸며 용액의 혼합과 반응을 위한 공간을 형성하는 혼합반응 용기와, 상기 혼합반응 용기에 연결된 샘플 투입구 및 퇴출구를 포함하는 것을 특징으로 하는 초소형 핵산분리장치를 제공한다.

본 발명의 핵산분리장치에 있어서, 바람직하게는 상기 히터 및 센서부의 하부에 펠티어(Peltier)소자가 접합되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 히터 및 센서부는 핵산을 포함하는 물질, 예컨대 세포를 파괴하여 핵산을 용출시키는 역할을 하며, 펠티어 소자는 보조 냉각기의 역할을 한다.

본 발명의 핵산분리장치에 있어서, 바람직하게는 상기 히터 및 센서부는 단일평면상에 히터선과 센서선이 번갈아가며 형성되는 박막이나 기판 형태인 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 히터와 센서는 통상 같이 제작되며, 히터(선)는 전류를 가하여 열을 발생시키고 센서(선)는 낮은 전류를 흘려 열에 의해 변화된 저항을 측정한다. 본 발명에서 사용가능한 히터는 열저항식, 반도체방식 등이 있으며, 사용가능한 센서로는 열저항식, 서머커플(Thermocouple), 반도체방식 등이 있다.

본 발명의 핵산분리장치에 있어서, 바람직하게는 상기 전극부는 가변 주파수에 따른 분극을 발생시키는 빗살(Comb)모양의 전극 어레이인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 전극부는 핵산을 포함하는 물질(예컨대, 세포) 또는 핵산 자체를 선택적으로 수집하거나 결합시키는 역할을 한다. 본 발명에서, 전극부는 전기장이 MAX와 MIN이 동시에 형성되는 모양이면 무엇이든 상관없지만, 특히 빗살모양이면 효율이 좋게 된다. 또한, 빗살모양의 끝부분의 형태는 성곽모양의 사각형혹은 삼각형 혹은 원형으로 바꿀수 있지만 삼각형 또는 사각형 형태가 전기장의 집중을 위해 바람직하다. 불균일한 전기장 속에서는 분극된 물질이 밀집한 전기장(높은 전기에너지차이), 혹은 느슨한 전기장(낮은 전기에너지 차이)으로 힘을 받게 되어 분극된 물질의 분극 정도와 분극 현상에 따라 밀집 혹은 느슨한 전기장으로 이동하게 된다. 따라서 분리하고 싶은 물질에 따라 전기장의 모양을 바꾸어서 한쪽에만 높은 전기에너지차이를 형성하여 작동유체에 포함된 물질들을 분리할 수 있게 된다.

본 발명의 핵산분리장치에 있어서, 바람직하게는 상기 고상 필터부는 생물학적 분자가 많이 결합될 수 있도록 높은 표면적을 갖는 요철모양인 것을 특징으로 한다. 또한, 요철모양은 상대전극간에 가까운 부분과 먼 부분을 형성하여 전기장이 밀집한 부분과 느슨한 부분을 형성할 뿐만 아니라, 혼합반응용기 내부에서 유체의 흐름을 방해함으로써 샘플과 시약(Lysis용액, Wash용액)의 혼합을 촉진합니다. 여기서, 생물학적 분자에는 핵산을 포함하는 물질(예컨대, 세포) 또는 핵산 자체를 포함한다.

본 발명의 핵산분리장치에 있어서, 바람직하게는 상기 고상 필터부의 표면재질은 핵산의 말단화학기가 부착될 수 있도록 실리콘(Si), 실리콘 산화물(SiO2), 유리(glass) 및 PDMS로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 샘플 투입구를 통하여 샘플을 혼합반응 용기로 유입시키는 단계; b) 전극부에 의해 적절한 전기장을 가함으로써 핵산을 포함하는 물질을 고상 필터부에 선택적으로 결합시키는 단계; c) 혼합반응 용기에 유입시킨 세정액에 의해 핵산을 포함하지 않는 물질을 세정하는 단계; d) 히터 및 센서에 의해 일정온도로 가열함으로써 상기 핵산을 포함하는 물질을 파괴시키는 단계; e) 전극부에 의해 적절한 전기장을 가함으로써 용출된 핵산을 고상 필터부에 선택적으로 결합시키는 단계; f) 혼합반응 용기에 유입시킨 세정액에 의해 필터에 결합되지 못한 나머지 잔류물을 세정하는 단계; g) 세정액에 의해 고상 필터에 결합된 핵산을 용리시켜 수득하는 단계를 포함하는 초소형 핵산분리장치를 이용한 핵산분리방법을 제공한다.

본 발명의 핵산분리방법에 있어서, 바람직하게는 상기 핵산을 포함하는 물질은 예컨대, 백혈구와 같은 유핵 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 핵산분리방법에 있어서, 바람직하게는 상기 d) 단계 전에 또는 동시에 전극부에 교류전원을 인가하여 상기 핵산을 포함하는 물질을 양극화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 양극화를 이루면 세포질 내에 분포한 전하들이 양극화된 전기장에 의해 분극이 이루어지며, 이렇게 분극이 이루어진 세포에 전기충격(pulse)를 가하게 되면 분극된 세포의 표면전하들이 적정한 세포질의 모양을 이룰 수 있는 전하분포를 벗어나게 되며 외부 물질의 유입으로 더 이상 일정한 세포질의 모양을 형상할 수 없게 되어 궁극적으로 세포의 파괴(Lysis)가 일어나게 된다.

발명의 핵산분리방법에 있어서, 바람직하게는 상기 e) 단계 전에 혼합반응 용기에 카오트로픽 물질(chaotropic agent)를 유입시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 카오트로픽 물질이란 단백질 및 핵산의 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 변화시킬 수 있지만, 적어도 1차 구조는 온전하게 유지하는 임의 물질을 의미한다. 카오트로픽 물질의 예는 NaI, NaClO4 등이 있으며, 이들은 본 발명에서 핵산이 고상 필터에 선택적으로 결합되도록 보조하는 역할을 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 A) 실리콘 기판 위에 산화막(SiO2)을 형성하여 절연층을 형성하는 단계; B) 상기 절연층 위에 크롬/금(Cr/Au) 금속층을 차례로 증착하여 히터와 센서구조물을 형성하는 단계; C) 감광성 폴리머, 현상액과 식각액을 이용하여 히터와 센서부의 형상을 형상식각(patterning)하는 단계; D) 상기 히터와 센서부 위에 SOG(Spin-On-Glass)를 도포하여 절연층을 형성하는 단계; E) 감광성 폴리머, 현상액과 BHF(Buffered HF) 용액을 이용하여 히터와 센서부의 전극패드(Pad)를 노출시키는 단계; F) 상기 A) ∼ C)까지의 공정을 반복하여 SOG 절연층 위에 빗살모양 전극부를 형성하는 단계; G) 상기 D) ∼ E)까지의 공정을 반복하여 빗살모양 전극패드를 노출시키는 단계; H) 감광성 폴리머와 현상액을 이용하여 고상결합필터 구조물과 혼합반응 용기를 형성하는 단계; I) 상기 혼합반응 용기 위에 별도 성형된 PDMS 구조물을 접착시켜 샘플 투입구와 퇴출구를 형성하는 단계; J) 상기 PDMS 구조물 위에 별도 기계가공된 PMMA 구조물을 접착시켜 매크로 크기의 입구 형상를 형성하는 단계를 포함하는 초소형 핵산분리장치의 제조방법를 제공한다.

본 발명에 따른 초소형 핵산분리장치를 이용하여 핵산복합물질로부터 핵산을 분리하기 위한 핵산분리방법(protocol)을 자세히 살며보면 다음과 같다.

먼저 핵산포함복합물질은 샘플 투입구(1)로부터 전기삼투(Electro-osmosis)와 전기영동(Electrophoresis) 또는 외부 주사기(Syringe)에 의한 압력차로 혼합반응용기(chamber)(2)로 유입되고 고상물질결합필터(3)에 의해서 혼합되어 혼합반응용기(2)내에 저장된다. 혼합반응용기(2)하부에 생성되어 있는 빗살모양의 전극(4)에 수㎑~수백㎑의 주파수를 가진 교류전원만을 인가하거나 직류전원과 혼합하여 한쪽으로 극성이 치우친 교류전원을 인가하면 핵산포함복합물질은 인가한 전원에 의해 생성된 전자기장(Electro magnetic field)에 의해 핵산을 포함한 물질(핵산포함세포: 백혈구 등)과 핵산을 포함하지 않은 물질(적혈구등)로 분리된다. 적절한 전기장을 가함으로써 핵산을 포함한 물질만 전기적 힘에 의해서 잡을 수 있다. 이렇게 분리된 핵산포함물질은 샘플 세정입구(5)로부터 혼합 반응 용기 내에 유입시킨 세정액에 세정되지 않고 남고, 나머지 핵산을 포함하지 않은 물질은 혼합 반응 용기 내에서 잡히는 힘이 상대적으로 약하므로 세정액에 의해 출구(6)로 빠져나간다.

혼합 반응 용기 내부의 핵산포함물질로부터 핵산을 추출하기 위해 빗살모양의 전극(4)에 교류전원을 인가하여 핵산포함물질을 양극화시킨다. 이때 양극화와 함께 핵산포함물질의 파괴를 유도하기 위해 혼합반응용기하부의 단일열원(7)과 열원센서(8)를 이용하여 일정온도로 가열한 후 양극화를 유도하면 양극화의 최대 점에서 핵산포함물질은 파괴가 일어나고 내부의 핵산이 용출되어 나온다. 이때 혼합용기내부의 조건은 용출된 핵산을 고상물질결합필터에 선택적으로 결합시키기 위해 단백질 및 핵산의 2,3,4차 구조를 변경시키고 1차구조만을 유지시키는 카오트로픽(chaotropic)물질을 투입구(1)로부터 혼합반응용기(2)내부로 유입시켜 둔다. 용출된 핵산은 상기의 조건 하에서 선택적으로 고상물질결합필터에 결합된다. 필터에 결합하지 못하는 나머지 잔유물을 세정하기 위해 샘플세정입구(5)로부터 혼합 반응 용기 내에 유입시킨 세정액에 세정되어 출구(6)로 빠져나가고, 나머지 핵산(DNA 또는 RNA)은 고상물질결합필터에 결합에 의해 혼합 반응 용기 내에 남는다. 혼합반응용기내의 핵산과 고상물질결합필터의 복합체는 알코올-수용액 및 아세톤을 연속적으로 세정하여 수성용출용액에 용리시킨다.

상기의 공정으로 분리, 정제된 핵산물질은 혼합반응용기하부의 단일열원(7)과 열원센서(8)를 이용하여 일정 온도 하에서 증발성 세정액을 증발시킴으로써 얻을 수 있다. 또한 PCR과 같은 다음 과정을 위해 TE(1M Tris/ 1mM EDTA)완충액이나 PCR완충액등에 용출시켜 사용될 수 있다.

이하, 첨부 도면을 참조하여, 본 발명의 MEMS소자를 이용한 초소형 핵산분리장치제조방법을 더욱 구체적으로 설명한다.

도 2는 본 발명에 따른 초소형 핵산분리장치의 (측)단면도를, 도 3은 평면도 및 확대도를 보여준다. 도 3a의 좌측은 샘플유입구와 혼합반응용기, 고상물질결합필터를 포함한 상부 지지체를, 우측은 필터부위의 상세 확대도를 나타낸다. 도 3b의 좌측은 단일열원과 열원센서 가진 하부 지지체 1층 구조를, 우측은 열원과 센서형태의 확대도를 나타낸다. 도 3c의 좌측은 빗살모양 전극 어레이(Array)의 하부 지지체 2층 구조를, 우측은 전극형태의 확대도를 나타낸다. 도 3d는 상부 지지체와 하부 지지체를 결합한 완성된 초소형 핵산분리 MEMS소자 평면도를 보여준다.

도 4의 (A)를 참조하면, 실리콘 기판(500㎛두께, <100>방향, N 타입)이나 열전도성이 낮은 유리판(glass substrate)또는 상업용 시판 유리판(Pyrex glass, Corning glass)을 황산(H₂SO₄), 과산화수소(H₂O₂)의 1:2 희석액에 120℃ 40분 동안 세정(cleaning)하여 오염물질인 금속잔류물, 유기물(metal/organic)을 제거한후 실리콘 기판을 산화로에 넣어 1000℃에서 6시간 동안 DI(deionized) water와 함께 산화시켜 약 1.2㎛의 산화막(실리콘 산화물(SiO₂-Silicon Oxide))을 형성한다. 산화막을 입힌 후 절연성 향상과 박막형성을 위해 저응력 질화막(Low stress nitride)을 LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition)공정으로 4000Å을 부가적으로 입힐 수 있다. 박막을 형성하는 저응력 질화막의 경우, 실리콘 기판을 벌크에칭(Bulk etching)하여 박막을 형성한다.

도 4의 (B)를 참조하면, 절연층 위에 단일열원과 온도감지 센서구조물을 형성하기 위해 크롬/금(Cr/Au)금속층을 차례로 열증착기(Thermal evaporator)를 사용하여 증착한다. 크롬은 기판과 금과의 접착성을 향상시키기 위해 전류 55~60A사이에서 약 2분 동안 1Å/sec의 증착비율로 총 100Å을 증착하고 금은 전류 50~55A사이에서 약 10~15분 동안 1~1.5Å/sec의 증착비율로 총 1000Å을 증착한다.

도 4의 (C)를 참조하면, HMDS(HexaMethylDiSilazane)를 윗면에 0.3㎛정도 회전도포(250rpm에서 4초간, 5000rpm에서 35초간)하여 90℃에서 100초 동안 소프트 베이킹(soft baking)한 후 AZ 5214 감광성폴리머(photoresist)를 1.3㎛정도 회전도포(250rpm에서 4초간, 5000rpm에서 35초간)하여 90℃에서 50초 동안 소프트 베이킹한다. 열원과 센서형상을 형상식각(Patterning)하기 위해 자외선(UV) 마스크로 16㎽/㎠ 세기로 45초 동안 자외선 노광한다. AZ 300MIF 현상액에서 1분 동안 현상한 후, 오븐(Oven) 또는 핫플레이트(hot plate)에서 120℃ 100초간 하드베이킹(hard baking) 한다. 열원과 센서형상외의 크롬/금을 제거하기 위해 KI:I2:DI를 4g:1g:40㎖의 비율로 혼합하여 금 식각액(etchant)을 만들어 1㎛/min의 비율로 약 10초 동안 식각하고, 금 형상을 마스크(mask)로 사용하여 상업용 시판 Cr-etchant(Cr-7k)에서 약 5초정도 식각하여 형상을 제작한다. 식각된 기판을 TCE(TriChloroEylene)/Aceton/Methyl alcohol 용액 또는 전용 제거제(Stripper)를 사용하여 각 3분간 클리닝(cleaning)하여 유기물인 감광성폴리머를 제거한 후 질소(N₂)로 건조한다.

도 4의 (D)를 참조하면, 첫 번째 층(layer)의 단일열원과 빗살모양 전극사이의 절연층을 형성하기 위해 SOG(Spin-On-Gla ss)를 도포하여 절연층을 형성한다. SOG의 도포는 3000rpm/11sec, 1500rpm/3sec, 3000rpm/9rpm의 회전조건으로 약 4000Å의 두께를 형성하거나, 이중도포에 의해서 약 1.2㎛까지 두꺼운 절연층을 형성할 수도 있다. 도포된 SOG는 경화를 위해 Soft-backing/2min 한 후 250Å~425Å까지 변화시키면서 약 60min동안 경화(Curing)한다.

도 4의 (E)를 참조하면, HMDS를 윗면에 0.3㎛정도 회전도포(250rpm에서 4초간, 5000rpm에서 35초간)하여 90℃에서 100초 동안 소프트베이커 한 후 AZ 5214 감광성폴리머를 1.3㎛정도 회전도포(250rpm에서 4초간, 5000rpm에서 35초간)하여 90℃에서 50초 동안 soft baking한다. 단일열원과 센서의 전극패드(Pad)를 노출시키기 위해 자외선(UV) 마스크로 16㎽/㎠ 세기로 45초 동안 자외선 노광한다. AZ 300MIF 현상액에서 1분 동안 현상한 후, 오븐 또는 핫플레이트에서 120℃ 100초간 하드 베이킹 한다. 단일열원과 센서의 전극Pad외의 SOG를 제거하기 위해 BHF(Buffered HF)용액에서 15분 동안 절연층인 SOG층을 제거한다.

도 4의 (F)를 참조하면, 상기 도 4의 (A)~(C)까지의 공정을 반복하여 SOG절연층 위에 빗살모양 전극을 형성한다.

도 4의 (G)를 참조하면, 상기 도 4의 (D)~(E)까지의 공정을 반복하여 SOG절연층 위의 빗살모양 전극패드를 형성하여 전극을 개방한다.

도 4의 (H)를 참조하면, 혼합반응용기 및 고상결합필터구조물을 제작하기 위해 SU-8(70wt% EPON, 30wt% GBL)을 회전도포(200rpm에서 5초간, 1000rpm에서 35초간) 하여 약 85㎛두께의 용기를 형성한다. 95℃에서 15분 동안 프리베이킹(pre-baking)한다. SU-8이 음성감광제이므로 용기를 만들기 위한 UV(Ultra Violet)마스크로 300∼400mJ/㎠ 세기로 365㎚근처에서 노광한다. 95℃에서 15분 동안 포스트베이킹(post baking)하고 PGMEA(propyleneglycol monomethylether acetate)에서 15분 동안 현상하고 세척한다. 200℃에서 30분 동안 하드 베이킹한다. SU-8의 완벽한 제거를 위해 끓는 NMP(1-methyl-2-pyrrolidinone)나 O₂에 에셔(ashing)를 사용한다.

도 4의 (I)를 참조하면, 상기의 (H)와 같은 공정으로 채널의 샘플투입구(1)와 샘플세정입구(5), 퇴출구(6) 형상을 가진 SU-8구조물을 제작한다. 제작된 구조물은 PDMS(PolyDiMethylSiloxane)형상을 위한 주형으로 PDMS mold의 반대 형상이다. 용기구조물을 얻기 위해 SU-8구조물과 기판의 표면을 실란화(silanization)시켜 PDMS을 굳힌 후 쉽게 뗄 수 있게 한다. 실란화의 약품으로는 Trichloro(3,3,3 Trifluoro propyl)silane으로 약10㎕를 진공 용기에 8시간동안 넣어 실란화시킨다. PDMS 주형(mold)의 형성은 모노머(monomer)와 경화제(curing agent)를 10:1로 섞어서 기포를 제거한 PDMS를 미리 만들어진 SU-8구조물 형틀 위에 부어 제작한다. 붇는 과정에서 생긴 기포를 제거하고 100℃에서 약 1시간 동안 열처리를 한 후 굳어진 PDMS를 떼어내면 혼합반응용기구조물과 필터구조물을 얻을 수 있다. 이 때 PDMS구조물은 깨끗이 떨어지기 때문에 별도의 공정 없이 다시 경화제를 섞은 PDMS를 붇고 열처리하는 공정을 반복하면 쉽게 대량의 채널구조물을 얻을 수 있다. 만들어진 PDMS구조물과 SU-8구조물은 가역적 반응으로 쉽게 접착(bonding)이 가능하다. 또한 표면을 산화시켜 비가역적 접착으로 접착할 수 있다.

도 4의 (J)를 참조하면, PMMA(Poly Methyl Metacrylate)를 사용한 주입구(Port)의 입구 부분(part)은 전통적인 기계가공으로 제작되어지며 메크로 크기의 입구 형상은 PDMS채널과 결합되어 샘플 및 완충액, 웨이스트(waste)입구로 사용된다. PMMA와 SU-8구조물은 접착제를 사용하거나 감광성 폴리머(Photo-resist)를 용제로 사용하여 접착할 수 있다. 또한, 입구는 주사기(syringe)를 결합하거나 MEMS소자를 이용한 펌프(Pump), 밸브(Valve)등과 결합하여 사용된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 초소형 핵산분리장치는 MEMS공정을 사용하여 각 과정이 일체화되어 있는 단일소자를 제작하고, 핵산포함복합물질로부터 핵산을 선택적으로 고정화하여 분리하는 기술을 제공한다. 제작된 초소형MEMS소자는 손에 들고 다닐 수 있는 형으로 부가적인 후처리 장치(Multiplex PCR-Chip)등에 결합되어 사용되어 질 수 있다.

또한, 본 발명의 초소형 핵산분리장치는 MEMS소자를 이용함으로써 샘플의 양과 외래물질에 의한 오염을 최소화하면서 높은 정도(Quality)의 핵산을 분리할 수 있으며, 고체상분리법과 전기분극(Dielectrophoresis), 내부열원을 동시에 이용함으로써 핵산의 선택적 추출의 질을 향상시키고, 부가적인 화학약품에 의한 화학처리공정을 제거할 수 있다.

Claims

기판 위에 위치하여 열 발생과 열 검출에 사용되는 히터 및 센서부와,

상기 히터 및 센서부 위에 위치하여 전기장을 형성하는 전극부와,

상기 전극부 위에 위치하여 핵산의 결합을 위한 고상 필터부와,

상기 고상 필터부를 감싸며 용액의 혼합과 반응을 위한 공간을 형성하는 혼합반응 용기와,

상기 혼합반응 용기에 연결된 샘플 투입구 및 퇴출구를 포함하는 것을 특징으로 하는 초소형 핵산분리장치.
제 1항에 있어서, 상기 히터 및 센서부의 하부에 펠티어(Peltier)소자가 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 초소형 핵산분리장치.
제 1항에 있어서, 상기 히터 및 센서부는 단일평면상에 히터선과 센서선이 번갈아가며 형성되는 박막이나 기판 형태인 것을 특징으로 하는 초소형 핵산분리장치.
제 1항에 있어서, 상기 전극부는 가변 주파수에 따른 분극을 발생시키는 빗살(Comb)모양의 전극 어레이인 것을 특징으로 하는 초소형 핵산분리장치.
제 1항에 있어서, 상기 고상 필터부는 생물학적 분자가 많이 결합될 수 있도록 높은 표면적을 갖는 요철모양인 것을 특징으로 하는 초소형 핵산분리장치.
제 1항에 있어서, 상기 고상 필터부의 표면재질은 핵산의 말단화학기가 부착될 수 있도록 실리콘(Si), 실리콘 산화물(SiO2), 유리(glass) 및 PDMS로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 초소형 핵산분리장치.
a) 샘플 투입구를 통하여 샘플을 혼합반응 용기로 유입시키는 단계;

b) 전극부에 의해 적절한 전기장을 가함으로써 핵산을 포함하는 물질을 고상 필터부에 선택적으로 결합시키는 단계;

c) 혼합반응 용기에 유입시킨 세정액에 의해 핵산을 포함하지 않는 물질을 세정하는 단계;

d) 히터 및 센서에 의해 일정온도로 가열함으로써 상기 핵산을 포함하는 물질을 파괴시키는 단계;

e) 전극부에 의해 적절한 전기장을 가함으로써 용출된 핵산을 고상 필터부에 선택적으로 결합시키는 단계;

f) 혼합반응 용기에 유입시킨 세정액에 의해 필터에 결합되지 못한 나머지 잔류물을 세정하는 단계;

g) 세정액에 의해 고상 필터에 결합된 핵산을 용리시켜 수득하는 단계를 포함하는 초소형 핵산분리장치를 이용한 핵산분리방법.
제 7항에 있어서, 상기 핵산을 포함하는 물질은 유핵 세포인 것을 특징으로 하는 핵산분리방법.
제 7항에 있어서, 상기 d) 단계 전에 또는 동시에 전극부에 교류전원을 인가하여 상기 핵산을 포함하는 물질을 양극화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분리방법.
제 7항에 있어서, 상기 e) 단계 전에 혼합반응 용기에 카오트로픽 물질(chaotropic agent)를 유입시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분리방법.
A) 실리콘 기판 위에 산화막(SiO2)을 형성하여 절연층을 형성하는 단계;

B) 상기 절연층 위에 크롬/금(Cr/Au) 금속층을 차례로 증착하여 히터와 센서구조물을 형성하는 단계;

C) 감광성 폴리머, 현상액과 식각액을 이용하여 히터와 센서부의 형상을 형상식각(patterning)하는 단계;

D) 상기 히터와 센서부 위에 SOG(Spin-On-Glass)를 도포하여 절연층을 형성하는 단계;

E) 감광성 폴리머, 현상액과 BHF(Buffered HF) 용액을 이용하여 히터와 센서부의 전극패드(Pad)를 노출시키는 단계;

F) 상기 A) ∼ C)까지의 공정을 반복하여 SOG 절연층 위에 빗살모양 전극부를 형성하는 단계;

G) 상기 D) ∼ E)까지의 공정을 반복하여 빗살모양 전극패드를 노출시키는 단계;

H) 감광성 폴리머와 현상액을 이용하여 고상결합필터 구조물과 혼합반응 용기를 형성하는 단계;

I) 상기 혼합반응 용기 위에 별도 성형된 PDMS 구조물을 접착시켜 샘플 투입구와 퇴출구를 형성하는 단계;

J) 상기 PDMS 구조물 위에 별도 기계가공된 PMMA 구조물을 접착시켜 매크로 크기의 입구 형상를 형성하는 단계를 포함하는 초소형 핵산분리장치의 제조방법.