KR100449906B1

KR100449906B1 - 재조합 구제역 2ｃ 비구조단백질 항원 및 단클론항체를이용한 구제역 진단방법

Info

Publication number: KR100449906B1
Application number: KR10-2001-0082977A
Authority: KR
Inventors: 현방훈; 엄재구; 구복경; 이광녕; 김인중; 고영준; 권창희; 주이석; 안수환
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2004-09-22
Also published as: KR20030052859A

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV) O/SKR/2000 유래의 재조합 2C 비구조단백질(Non-Structural Protein) 및 단클론 항체를 이용한 구제역 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 구제역 바이러스의 2C 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 곤충세포 또는 대장균에서 발현시켜 제조한 재조합 2C 비구조단백질 항원 및 2C 비구조단백질에 특이적인 단클론항체를 제조하고 이를 이용한 간접결합효소면역측정법(Indirect Sandwitch Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay; IR-ELISA)을 실시함으로써 구제역 백신접종축과 야외감염축을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 구제역의 진단방법에 관한 것이다.

Description

재조합 구제역 2Ｃ 비구조단백질 항원 및 단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 {A diagnostic method of foot-and-mouth disease using recombinant FMDV 2C non-structural protein and monoclonal antibody}

본 발명은 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV) O/SKR/2000 유래의 재조합 2C 비구조단백질(Non-Structural Protein) 및 단클론 항체를 이용한 구제역 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 2C 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 곤충세포 또는 대장균에서 발현시켜 제조한 재조합 2C 비구조단백질 항원 및 2C 비구조단백질에 특이적인 단클론항체를 제조하고 이를 이용한 간접결합효소면역측정법(Indirect Sandwitch Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; IS-ELISA)을 실시함으로써 구제역 백신접종축과 야외감염축을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 구제역의 진단방법에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-Mouth Disease)은 최근 영국 등을 비롯하여 전 세계적으로 발생하고 있는 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 동물(우제류)에 감염되는 전염성이 매우 강한 질병이다. 감염 초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코, 발굽 사이 등에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승되며 식욕이 저하되는 등의 증상이 나타나다가 급성폐사에 이르게 된다. 구제역 바이러스는 치사율이 55%에 이르는 질병으로서, 국제수역사무국(OIE)에서 A급 질병으로 분류하였고 우리나라에서도 제 1종의 가축 전염병이다. 축산물 자유무역의 증대로 인해 발생국인 경우 무역규제 대상국가가 되는 등 경제적으로 큰 피해를 주는 질병이다.

구제역에 대한 최초의 발병보고는 1514년 이태리의 수도승 히로니머스 프래카스토리우스(Hironymus Fracastorius)에 의하여 베로나(Veronar) 지역의 소에서 발생하였으며, 전염성이 강한 질병으로 기록되어 있다.

구제역의 원인체인 구제역 바이러스(FMDV)는 미생물 분류상 피코르나 바이러스과(Family; Picronavidae), 아프토바이러스속(Genus; Aphtovirus)에 속하며 A,O, C, Asia 1, SAT 1, SAT 2, SAT 3 타입의 혈청형이 있고 80여 가지의 아형이 알려져 있다. 본 발명에 사용된 국내발생 구제역 바이러스 O/SKR/2000는 type O에 속한다. 구제역 바이러스는 약 7,800개의 염기로 구성된 포지티브 스트랜디드(Positive-stranded) 게놈(genome)의 단쇄상(single-stranded) RNA 바이러스이다. 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 구성하는 네 개의 주요한 구조 단백질(Structural Protein: SP) VP1, VP2, VP3, VP4로 구성되고, 이러한 구조 단백질 이외에 L, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D의 비구조단백질(Non-Structural Protein: NSP)이 있는데 비구조단백질은 주로 감염세포내에서 발현되는 폴리펩티드(polypeptide)로 바이러스 증식에 보조적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.

한편, 현재 사용중인 구제역 예방백신은 생산과정 중에 바이러스입자만을 정제하여 제조하고 있어 구조단백질만이 함유되며, 비구조단백질은 함유되지 않아 예방백신을 접종한 동물에는 비구조단백질에 대한 항체가 생기지 않는 것으로 알려져 있다. 이러한 비구조단백질은 구조단백질에 비해 변이가 적어 여러 혈청형에서 동일한 항원결정기를 가지고 있기 때문에, 구제역 바이러스 비구조단백질의 이러한 특성을 이용하여 여러 혈청형에서의 야외감염축 항체 확인은 물론 예방백신 접종축 항체와의 감별이 가능한 진단법에 대한 연구가 세계적으로 활발히 진행되고 있다.

이에, 세계적으로 많은 국가에서는 구제역에 대한 예방백신을 비축하고 있고 아울러 구제역 발생시 조기근절을 위한 다양한 검사방법에 대하여 연구하고 있으며, 이에 비구조단백질을 이용한 효소면역검사법(ELISA) 또는 보체결합반응 등이개발되어 있으나, 불완전하여 백신축과 감염축을 정확하게 감별하기 위한 다른 비구조단백질을 이용한 효소면역검사법의 보완이 절실히 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 특별한 기술없이 단시간에 수행가능하고 특이성 및 민감성이 높은 진단법으로 알려진 간접결합효소면역측정법(IR-ELISA)을 이용한 구제역의 진단방법에 대해 연구한 결과, 구제역 바이러스의 2C 비구조단백질이 구제역 바이러스의 혈청형과 관계없이 변이가 적고 구제역 예방백신의 생산과정에서 비구조단백질은 백신중에 포함되지 않는다는 사실로부터, 대장균 및 곤충세포에서 발현시킨 재조합 2C 비구조단백질 및 2C 비구조단백질에 대한 단클론항체를 이용한 IR-ELISA법으로 구제역을 진단할 경우, 구제역 백신접종축과 야외감염축을 손쉽고 정확하게 감별할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 대장균 또는 곤충세포 발현 재조합 구제역 바이러스 2C 비구조단백질 항원과 2C 비구조단백질에 특이적인 단클론항체를 작성하고 이를 이용한 간접효소결합면역측정법을 실시함으로써 특별한 시설 및 기술 없이 구제역 백신접종축과 야외감염축을 감별하여 진단할 수 있는 구제역 진단방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 구제역 2C 비구조단백질 발현벡터 제작 및 발현 모식도이다.

도 2은 구제역 2C 유전자를 PCR 증폭하고 확인한 결과이다.

레인 1 : 1kb DNA 크기 마커

레인 2∼7 : 증폭된 구제역 2C 유전자

도 3은 구제역 2C 유전자가 클로닝된 재조합 벡터의 개열지도이다.

A는 대장균 재조합 벡터 pMAL2C

B는 배큘로바이러스 재조합 벡터 pFBHTb2C

도 4는 대장균에서 발현한 재조합 2C 비구조단백질을 확인한 결과이다.

A는 웨스턴블럿팅으로 확인한 MBP와 융합한 형태의 2C 비구조단백질

레인 M : 단백질 분자량 크기 마커

레인 1∼2 : MBP 융합 2C 비구조단백질

B는 정제 후 SDS-PAGE하여 확인한 MBP와 융합한 형태의 2C 비구조단백질

레인 M : 단백질 분자량 크기 마커

레인 1∼3 : MBP 융합 2C 비구조단백질

도 5는 배큘로바이러스에서 발현한 재조합 2C 비구조단백질을 확인한 결과

A는 웨스턴블럿팅으로 확인한 2C 비구조단백질

레인 M : 단백질 분자량 크기 마커

레인 1 : 정제 재조합 2C 비구조단백질

B는 정제 후 SDS-PAGE하여 확인한 2C 비구조단백질

레인 M : 단백질 분자량 크기 마커

레인 1∼2 : 정제 재조합 2C 비구조단백질

도 6은 베큘로바이러스 발현 재조합 2C 비구조단백질을 이용하여 작성한 단클론항체를 확인한 결과이다.

A는 2C-13-2 단클론항체로 확인한 감염세포

B는 2C-1A-99 단클론항체로 확인한 감염세포

C는 음성 대조 단클론항체로 확인한 감염세포

도 7은 2C 항체의 검출을 위한 구제역 바이러스 양성 및 음성혈청을 이용한 최적항원농도와 효소면역진단법 적용 농도를 나타낸 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 구제역 진단방법은 대장균 또는 곤충세포에서 발현된 재조합 구제역 바이러스 2C 비구조단백질 항원 및 단클론항체를 이용한 간접결합효소면역측정법을 실시하여 구제역 바이러스 2C 비구조단백질 항원에 대한 항체를 검출함으로써 구제역을 진단함을 특징으로 한다.

구제역 바이러스와 예방접종 바이러스를 구별하는 부위로 널리 알려진 비구조단백질 중 본 발명에서 이용한 2C 비구조단백질은 3ABC 등 기타 구제역 바이러스 비구조단백질에 비하여 특히 불안정하여 항체소실기간이 짧기 때문에, 과량의 백신을 동물에 접종할 경우 오염된 백신에 혼합되어 있는 2C 비구조단백질에 의해 나타날 수 있는 비특이 혈청반응이 짧아서 백신접종축과 야외감염축을 보다 정확히 감별할 수 있는 이점이 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

간접결합효소면역측정법을 이용한 본 발명 구제역 진단방법은,

(1) 2C 비구조단백질에 대한 단클론항체를 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;

(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계;

(3) 상기 (2)의 플레이트에 재조합 2C 비구조단백질 항원을 반응시키는 단계;

(4) 상기 (3)에서 부착되지 않은 재조합 2C 비구조단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;

(5) 상기 (4)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;

(6) 상기 (5)에서 제조합 2C 비구조단백질 항원에 결합하지 않은 가검 혈청을 세척하여 제거하는 단계;

(7) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (5)의 가검혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;

(8) 상기 콘쥬게이트에 결합된 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계;

를 포함하여 구성된다.

상기 ELISA에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있다.

상기 본 발명 구제역 진단방법의 단클론항체를 이용한 효소면역측정법은 항원에 특이적인 단클론항체를 작성하여 사용하기 때문에 그 민감도 및 정확도가 매우 뛰어나고, 항원으로 사용한 3ABC 단백질이 구제역 바이러스의 7가지 혈청형에 관계없이 공통으로 발현되는 비구조단백질이기 때문에 이를 항원으로 이용할 경우 각기 다른 혈청형의 구제역 바이러스의 감염여부에 대하여 신속한 진단이 가능하다는 이점이 있다. 또한, 백신중에는 비구조단백질 항원이 포함되지 않으므로 비구조단백질 항원에 대한 항체는 구제역에 야생감염된 축에 한하여 발현되고 백신접종축에서는 발현되지 않기 때문에 백신감염축과 야생감염축을 진단할 수 있는 이점이 있다.

본 발명에서는 한국에서의 구제역 검역을 효과적으로 수행하기 위하여, 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 유전자를 획득하고(Gene Bank Access numberAF377945), 이 유전자를 주형으로 PCR을 실시하여 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 2C 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 획득하였다.

한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 2C 비구조단백질의 발현을 위하여, 상기 유전자를 대장균 또는 곤충세포 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 발현 벡터, 제한효소, 시약 및 반응조건은 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.

2C 비구조단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켜 구제역 재조합 2C 비구조단백질 항원을 작성할 수 있다.

상기의 재조합 2C 비구조단백질 항원을 일반적인 동물에 면역하고 이로부터 분리한 면역 세포를 계속적인 세포증식을 위한 일반적 암세포종과 융합시켜 하이브리도마 세포주를 작성하고 이로부터 재조합 2C 비구조단백질 특이 단클론항체를 작성할 수 있다. 상기 하이브리도마는 당업계에 통상적인 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 재조합 2C 비구조단백질 항원 특이 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 예로는, 생명공학 연구소 유전자은행에 2001년 12월 14일자로 기탁된 2C-1A-99 KCTC 10137 BP가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함됨을 밝혀둔다.

실시예 1: 대장균 또는 베큘로바이러스 발현을 위한 재조합 벡터의 작성

제 1단계. 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 2C 비구조단백질 유전자 획득

충주지역에서 분리한 구제역 바이러스(O/SKR/2000, 국립수의과학검역원)를 주화세포인 BHK-21(ATCC CCL-10) 세포주에 접종한 후, 4대째 계대배양한 바이러스 감염세포와 상층액으로부터 UltraspecII RNA isolatio kit(Biotecx, USA)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 전체 RNA를 추출하였다.

구제역 바이러스 O/SKR/2000 2C 비구조단백질 유전자의 cDNA의 합성은 상기 추출한 전체 RNA와 S.Forss 등(1984,Nucleic Acid ResearchVol.12. No.16, 6587-6601)이 보고한 구제역 바이러스 2C 유전자의 염기서열을 참고로 하고, BamHI 사이트 및 정지코돈(stop codon)을 함유하는 프라이머 F2CR (5'-CGGGATCC-CTA-CTGCTTGAAGATCGGGTGAC-3') 및 역전사효소(reverse transcriptase; RTase: superscript Gibco BRL)를 사용하여 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 첫번째 가닥 cDNA를 BamHI 사이트 및 전이시작코돈(initiation codon)를 포함하는 프라이머 F2CF (5'-CGGGATCC-ATG-CTCAAAGCACGTGACATCAA-3')과 상기 F2CR를 사용하여 95℃에서 10분간 열처리 한 후 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction;PCR) 증폭기(PE 9600;Perkin-Elmer)에서 30 사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA 합성을 실시하였다. 반응이 끝난 PCR 증폭산물을 pGEM-T Easy(Promega) 플라스미드에 클로닝하여 작성한 pG2C를 자동염기서열 분석기(ABI 377, USA)로 분석하였다(서열번호1 참조).

제 2단계. FMDV O/SKR/2000의 2C 비구조단백질 발현을 위한 발현벡터 작성

FMDV O/SKR/2000의 2C 비구조단백질의E.coli발현벡터인 pMAL2C 및 배큘로바이러스 발현벡터인 pFBHTb2C를 제작하는 과정을 도 1에 나타내었다.

상기 제 1단계의 pG2C 벡터를 BamHI으로 처리하여 972bp의 DNA 단편을 추출하였다. 그 다음, P_tac프로모터, 말토오즈 결합 단백질(Maltose-binding Protein; MBP) 전이시작코돈 및 MBP를 코딩하는 malE 유전자를 가진 pMAL-c2 플라스미드(New England Biolabs; NEB, U.S.A)를 BamHI으로 처리한 후 상기 DNA 단편을 삽입하여 재조합 발현벡터 pMAL2C(도 2, A 참조)를 작성하였다.

한편, 베큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter)를 가지며 6개의 히스티딘(6xHis)이 융합한 형태로 발현될 수 있도록 제작된 pFastBacHTb 벡터(GibcoBRL, USA)를 BamHI으로 처리하고, 상기 DNA를 삽입하여 재조합 발현 벡터 pFBHTb2C를 작성하였다(도 2, B 참조).

실시예 2 : E.coli 형질전환체 작성 및 대장균 발현 재조합 2C 단백질의 정제

상기 작성된 2C 비구조단백질 발현E.coli발현벡터 pMAL2C를E.coliDH5-α에 형질도입(Transformation)하여 제조사의 시약(NEB #E8000S, pMAL Protein Fusion and Purification System)을 사용하여 매뉴얼에 따라 재조합 2C 비구조단백질을 발현 및 정제하였다.

배지 1ℓ당 2g의 글루코스 및 100㎍/㎖ 농도로 앰피실린(ampicilline)을 첨가한 80㎖의 Rich medium(트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g)에 상기 형질도입된 대장균을 37℃, 15시간 이상 배양하고 최종농도가 0.3mM이 되도록 IPTG (isopropyl-D-thiogalactosidase)를 첨가한 후 2시간 추가 배양하여 발현하였다.

상기 배양된 세포를 컬럼 완충액(20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 1mM EDTA)에 풀어 단파장으로 2분간 초음파분쇄하고 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 이 상층액을 컬럼 완충액으로 다시 1:5로 희석하고 아밀로즈 수지(amylose resin)가 충진된 컬럼에 부어 반응시킨 다음, 컬럼 완충액으로 세척 후 10mM 말토오즈가 함유된 컬럼 완충액으로 추출하여 대장균 발현 재조합 구제역 2C 비구조단백질을 정제하였다.

실시예 3: 곤충세포 발현을 위한 재조합 베큘로바이러스 BacBtB2C의 작성

GibcoBRL(USA)사의 BAC-TO-BAC 배큘로바이러스 발현시스템을 이용하여 본 발명 재조합 배큘로바이러스 BacBtB2C를 작성하였다.

상기 실시예 1에서 작성한 pFBHTb2C 벡터를E.coliDH10BAC에 형질도입하여 작성한 2C의 Bacmid DNA 5㎍과 배큘로바이러스 선형화 DNA 0.5㎍을 100㎕의 무혈청 그레이스(Grace's) 배지 및 100㎕의 리포펙틴 용액(0.1㎎/㎖, Gibco)과 혼합하여 공동형질감염 혼합물(cotransfection mixture)을 제조하고 실온에서 20분간 방치하였다. 그 다음, 10% FCS(Fetal Calf Serum)과 Antibiotic-antimycotic(Gibo,100×)이 첨가된 무혈청 그레이스 배지에서 28℃의 온도조건하에서 배양된 High Five 세포(Invitrogen사; 3×10⁶세포)를 60mm 페트리디쉬에 첨가한 후, 배지를 제거하고,상기에서 제조한 공동형질감염 혼합물을 첨가하여 28℃에서 6∼12시간 동안 배양하였다. 공동형질감염 혼합물에 5% FCS를 함유하는 새 그레이스 배지를 2∼3㎖ 가하여 27℃에서 4∼6일간 배양하면서 세포병원성 작용(CPE) 출현 여부를 관찰하였다.

형질감염 배양상층액으로부터 재조합 베큘로바이러스를 분리하기 위하여 플라크 정제(plaque purification)를 다음과 같이 실시하였다. 2×10⁶개의 High Five 세포(Invitrogen 사)를 직경 60㎜ 조직배양 페트리디쉬에 단층으로 도포한 후, 상기 공동형질감염 상층액 100㎕를 접종하여 28℃에서 90분간 감작한 후, 1.5% 저융점 아가로스가 포함된 그레이스 배지를 그 위에 층을 이루도록 도포(overlayer)하여 3∼4일간 28℃에서 배양하여 나타난 단일 플라크를 취하였다. 선발된 바이러스를 연속 2∼3회 플라크 정제하여 본 발명 구제역 2C 비구조단백질 유전자 재조합 배큘로바이러스 BacBtB2C을 선발하였다.

실시예 4: 구제역 바이러스 재조합 2C 비구조단백질 항원 특이 단클론항체의 작성

제 1단계. 면역항원의 작성

단클론항체를 작성하기 위하여, 상기 실시예 3의 재조합 배큘로바이러스 BacBtB2C를 곤충세포에 감염시켜 발현한 재조합 2C 비구조단백질 항원을 제조하였다. 선발된 실시예 3의 재조합 배큘로바이러스 BacBtB2C을 접종한 High Five 세포(Invitrogen 사)에 1% NP 40 용해 완충액(1% NP 40, 10mM Tris-Hcl pH 7.4, 150mM NaCl)를 4부피 첨가하고 얼음에서 30분동안 정치한 후 12,000×g에서 5분동안 원심분리하고 상층액을 수확하여 획득한 재조합 구제역 바이러스 2C 비구조단백질 항원을 면역항원으로 이용하였다.

제 2단계. 하이브리도마 및 단클론항체의 작성

상기의 재조합 구제역 바이러스 2C 비구조단백질 항원을 인컴플리트 애쥬반트(incomplete adjuvant, Gico BRL사)와 1:1로 잘 혼합한 후 발브시(Balb/C) 마우스 뒷다리 발바닥에 50∼100㎕씩 주사하여 단클론항체 생산세포주 작성을 위한 마우스 면역을 실시하였다. 면역 후 10∼15일에 서혜임파절을 채취하여 세포융합에 사용하였다.

세포융합에 사용할 골수세포주는 세포융합 4∼5일 전에 질소통에서 골수종(myeloma) 세포인 SP2/0-Ag14를 꺼내 10% 우태아 혈청(FBS)을 첨가한 DMEM 배지에 현탁시키고 500×g에서 5분간 윈심분리한 다음 상층액을 버리고 침전세포를 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM에 다시 현탁하여 5% 탄산가스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.

세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 면역이 끝난 마우스의 서혜임파절에서 림프절을 적출하고 DMEM으로 분적출한 임파세포를 상기 배양한 골수종 세포와 혼합하고 PEG 1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포를 HAT 배지에 적당히 희석한 후 96well 조직배양 플레이트에 분주하였다.

2C 비구조단백질에 특이하게 반응하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선발하기 위하여, 구제역 바이러스를 주화세포인 BHK-21(ATCC CCL- 10)세포주에 접종한 후 4대째 계대배양한 구제역 바이러스 감염세포를 이용한 형광항체법으로 확인하였다. 즉, 구제역 바이러스 감염세포에 상기 하이브리도마 배양 상층액을 각각 1시간 반응하고 인산완충액으로 10회 세척한 후 항마우스 FITC 콘쥬게이트(Pierce, USA)를 반응시켰다. 다시 인산완충액으로 10회 세척하고 마운팅버퍼를 가한 후 암시야에서 형광현미경으로 관찰하여 2C 비구조단백질에 특이하게 반응하는 단클론항체를 선발하였다. 도 6의 A 및 B와 같이 2C-13-2 및 2C-1A-99 두 종의 단클론항체에서 강한 형광을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 대장균 또는 곤충세포 발현 재조합 2C 비구조단백질의 웨스턴 블럿팅(western blotting) 분석

대장균 또는 곤충세포를 이용하여 발현한 재조합 2C 비구조단백질을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿팅을 실시하였다.

상기 실시예 2에서 정제한E.coli발현 재조합 2C 비구조단백질과 상기 실시예 4에서 하이브리도마 작성을 위한 면역항원으로 사용한 곤충세포 발현 재조합 2C 비구조단백질을 -20℃에 보관하면서 웨스턴 블럿팅 시료로 공시하였다. 시료 완충액(10%-머캅토에탄올, 10% SDS, 25% 글리세롤, 10mM Tris-Hcl pH 6.8)을 시료의 1/4 부피가 되게 첨가하고 5분간 끓인 다음 12000×g에서 5분동안 원심분리하고, Lammli등의 방법으로 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전개하여 PVDF 막(Boehringer mannheim, Germany)에 전사시킨 후 다음의 방법으로 면역염색을 실시하였다. 2C 비구조단백질에 특이적인 상기 단클론항체를 반응시키고 세척한 후, 항마우스 HRP 콘쥬게이터를 반응시키고 세척한 다음 디아미노벤지딘(DAB, Pierce)으로 발색시켰다.그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.

대장균에서 발현한 MBP 융합형태의 재조합 2C 비구조단백질은 MBP의 분자량 42.5kDa 및 2C 비구조단백질의 아미노산서열로 추정한(DNASIS program, Hitachi) 분자량 약 35kDa가 합해진 약 77kDa의 단백질임을 알 수 있었다(도 4의 A). 한편, 곤충세포에서 발현한 재조합 2C 비구조단백질은 약 2.5kDa로 예상되는 6개의 히스티딘(6xHis)과 유합한 형태로 예상한 약 37kDa의 단백질임을 알 수 있었다(도 5의 A). 또한, 각각의 정제 재조합 2C 비구조단백질들에서도 동일한 분자량을 확인할 수 있었다(도 4의 B 및 도 5의 B).

실시예 6 : 재조합 2C 비구조단백질을 이용한 간접효소면역측정법(IS-ELISA)

상기 실시예 2에서 확보한 대장균 발현 정제 재조합 2C 비구조 단백질과 상기 실시예 4에서 선발한 단클론항체 2C-1A-99를 이용하여 간접결합효소면역학적 측정법(Indirect Sandwitch Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, IS-ELISA)으로 구제역 바이러스의 2C 항체를 검출하는 방법은 다음과 같다.

(1) 상기 실시예 4에서 작성한 재조합 2C 단클론항체(KCTC 10137 BP)의 복수액(ascite)을 흡착용 코팅 완충용액(증류수 200㎖에 Na₂CO₃0.376g, NaHCO₃0.542g, NaCl 1.462g을 녹인 용액; pH 9.6; 2주간 냉장 보관하고, 2주 경과시 다시 만들어 사용한다)으로 최적농도인 400배 희석하여 면역분석용 플레이트에 100㎕씩 분주한 후 4℃에서 밤새 보전하여 항체를 흡착하였다. 흡착이 끝난 후, 항체를 플레이트에서 버리고 ELISA 세척용액(100㎖ PBS에 Tween 20[BioRad] 100㎕를 녹인 용액; PBS-T)으로 1회 세척한 후, 차단완충용액(Blocking buffer solution; 100㎖ PBS에 3g 스킴밀크(Difco)를 녹인 용액)을 플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 차단하였다.

(2) 상기 실시예 3에서 정제한E.coli발현 재조합 2C 비구조단백질(1㎎/㎖)을 1.5% 차단완충용액(100㎖ PBS에 1.5g 스킴밀크를 녹인 용액)을 사용하여 최적 희석농도인 200배로 희석(5㎍/㎖)하여 면역분석용 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 37℃에서 2시간 동안 흡착시켰다.

(3) 항원이 부착된 상기 플레이트의 차단반응이 끝나면 차단용액을 버리고, 가검 동물에서 채취한 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 이 혈청을 1.5% 차단완충용액을 사용하여 다른 희석용 플레이트에서 최적 혈청희석배수인 100배로 희석한 가검 혈청을 100㎕씩 분주하였다. 혈청이 분주된 플레이트를 37℃에서 1시간동안 배양한 후, ELISA 세척용액(PBS-T)으로 약 5분씩 3회 이상 세척을 실시하였다.

(4) 콘쥬게이트인 항-소 IgG HRP(Kpl사)를 1.5% 차단완충용액(PBS 100㎖에 1.5g 스킴밀크를 녹인 용액)을 사용하여 최적의 희석농도인 3,000배로 희석한 후 세척된 상기 플레이트에 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다.

(5) 반응 후 상기 플레이트를 ELISA 세척용액으로 3회 이상 세척한 후 발색제 TMB(Sigma)를 제조사의 농도대로 첨가하여 발색시킨 후, 1.25M 황산(Sigma) 용액을 첨가하여 정지시켰다.

(6) 발색이 정지된 플레이트내 반응을 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 판정하였다.

표준 양성 및 음성 혈청을 선정하여 대조군으로 하고 2배 단계 희석하여 위와 같은 방법으로 IS-ELISA를 수행하였다. 이상의 실험에서 양성혈청 흡광도/음성혈청 흡광도 비율이 2이하로 떨어지는 희석배수의 역수를 항체가로 결정하였다.

도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 구제역 바이러스의 2C 항체를 검출하는 방법이 양성 및 음성 혈청을 비교할 때 항원 희석 농도 5㎍/㎖에서 양성혈청 흡광도/음성혈청 흡광도 비율이 4이상을 나타내므로, 본 발명에 따른 구제역 검출법의 유효성을 확인할 수 있었다.

이상의 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 유전자 재조합 방법으로 대량생산된 구제역 바이러스 재조합 2C 비구조단백질 항원 및 2C 단클론항체를 이용한 간접결합효소면역측정법에 의한 구제역 진단방법은 구제역 바이러스에 대한 항체를 신속하고 신속하고 간편하게 검출하고 백신 접종축 및 야외감염축을 정확하게 감별할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 구제역 예방 및 조기 근절을 위해 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA : National Veterinary Research and Quarantine Service <120> A diagnostic method of foot-and-mouth disease using recombinant FMDV 2C non-structural protein and monoclonal antibody <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 972 <212> DNA <213> Foot-and-mouth disease virus O/SKR/2000 <400> 1 ggatccatgc tcaaagcacg tgacatcaat gacatattcg ccattctcaa gaacggcgag 60 tggttggtca agctgattct tgccatccgc gactggatca aggcatggat cgcctcagaa 120 gaaaaatttg tcaccatgac agacctggta cctggcatcc ttgaaaagca gcgggatctt 180 aacgacccaa gcaagtacaa ggaggccaag gagtggctcg acaacgcgcg ccaagcgtgt 240 ttgaagagcg ggaacatcca cattgcaaac ctttgtaaag tagttgcccc agcacccagc 300 aggtcgaggc ctgaacccgt ggtcgtttgc ctccgtggca aatcgggcca gggcaagagt 360 ttccttgcga acgtgcttgc acaagcaatt tcaacccact tcactggcag aaccgattca 420 gtttggtact gcccacctga ccctgaccac ttcgacggtt acaaccagca gaccgttgta 480 gtaatggatg atttgggcca gaaccccgac gggaaggact tcaaatactt cgcccaaatg 540 gtttcaacta cggggtttat cccgcccatg gcttcactcg aggacaaagg caaacctttc 600 aacagcaagg tcatcatcgc caccaccaac ctgtactcgg gcttcacccc gagaactatg 660 gtgtgccctg atgcactgaa ccgaaggttc cactttgaca ttgacgtgag cgccaaggac 720 gggtacaaaa ttaacaacaa attggacatc accaaagctc ttgaagatac ccacaccaac 780 ccagtggcaa tgtttcaata cgactgtgcc cttctcaacg gcatggccgt tgagatgaag 840 agaatgcaac aagatatgtt caagcctcaa ccgcccctcc agaacgtcta ccagcttgtt 900 caggaggtga ttgaccgggt cgagctccac gagaaggtgt cgagtcaccc gatcttcaag 960 cagtagggat cc 972

Claims

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서열번호 1의 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 재조합 2C 비구조단백질을 동물에 접종하고 그로부터 채취한 면역 세포를 암세포와 융합하여 제조함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주(KCTC 10137 BP).
상기 제 4항 기재의 하이브리도마 세포주로부터 발현됨을 특징으로 하는 2C 비구조단백질 특이 단클론항체.
구제역 바이러스 유래의 2C 비구조단백질 항원 및 이에 대한 단클론항체를 이용한 구제역 진단방법에 있어서,

(1) 수탁번호 KCTC 10137 BP인 하이브리도마 세포주 3F-11에 의해 생성되는 2C 비구조단백질 특이 항원에 대응하는 제 5항의 단클론항체를 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;

(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계;

(3) 상기 (2)의 플레이트에 서열번호 1의 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 재조합 2C 비구조단백질 항원을 반응시키는 단계;

(4) 상기 (3)에서 부착되지 않은 재조합 2C 비구조단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;

(5) 상기 (4)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;

(6) 상기 (5)에서 재조합 2C 비구조단백질 항원에 결합하지 않은 가검 혈청을 세척하여 제거하는 단계;

(7) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (5)의 가검 혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;

(8) 상기 콘쥬게이트에 결합된 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계를 포함하는 ELISA법으로 수행함을 특징으로 하는 구제역 진단방법.
제 6항에 있어서, 상기 재조합 2C 비구조단백질이 대장균 발현 재조합 2C 비구조단백질임을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
제 6항에 있어서, 상기 2C 비구조단백질에 대한 단클론항체가 제 5항 기재의 재조합 구제역 2C 비구조단백질 특이 단클론항체임을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.