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KR100429709B1 - 효소-처리헤스페리딘,그의제조방법및효소-처리헤스페리딘의이용방법 - Google Patents

효소-처리헤스페리딘,그의제조방법및효소-처리헤스페리딘의이용방법 Download PDF

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KR100429709B1
KR100429709B1 KR1019970027216A KR19970027216A KR100429709B1 KR 100429709 B1 KR100429709 B1 KR 100429709B1 KR 1019970027216 A KR1019970027216 A KR 1019970027216A KR 19970027216 A KR19970027216 A KR 19970027216A KR 100429709 B1 KR100429709 B1 KR 100429709B1
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미야께 도시오
유모또 다까시
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가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
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Abstract

알파-글루코실 헤스페리딘 1 중량부 당, 헤스페리딘 함량이 0.1 중량부 이하이고 ; 베타-모노글루코실 헤스페레틴의 함량이 0.1 내지 0.5 중량부인,
알파-글루코실 헤스페리딘, 헤스페리딘 및 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 포함하여 이루어지는 효소-처리 헤스페리딘.
본 발명은 또한 알파-글루코실 헤스페리딘과 미반응 헤스페리딘을 함유하는 용액을 알파-L-람노시다아제로 처리하여 미반응 헤스페리딘을 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 전환시키는 것을 포함하여 이루어지는 효소-처리 헤스페리딘의 제조 방법을 제공한다.
수용성이 뛰어나고 장기간 저장하더라도 결정 침전(흐려짐)이 없는 본 효소-처리 헤스페리딘은 알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 함유하는 물질로부터 물질에 상기의 간단한 처리를 수행함으로써 제조할 수 있다. 본 발명은 또한 효소-처리 헤스페리딘의 이용 방법을 제공한다. 본 효소-처리 헤스페리딘은 귤 통조림의 흐림 방지와 천연 착색 물질의 퇴색 방지에 사용될 수 있다.

Description

효소-처리 헤스페리딘, 그의 제조방법 및 효소-처리 헤스페리딘의 이용방법
본 발명은 뛰어난 수용성을 갖는 효소-처리 헤스페리딘과 아울러 그 제법 및 용도에 관한 것이다.
헤스페리딘은 하기식 [I]에서 보는 바와 같이 헤스페레틴 또는 5, 7, 3' -트리히드록시-4'-메톡시플라바논의 7-위치에 있는 히드록실기에 베타-결합을 통해 루티노스 또는 L-람노실-(알파-6)-글루코스가 결합되어진 화합물의 명칭이다.
Figure pat00001
Figure pat00002
감귤류의 익지 않은 과피 내에 함유되어 있는 헤스페리딘은 모세혈관 강화,출혈 예방 및 혈압 조절 등의 다양한 생리학적 활성을 나타내는 비타민 P의 공급원으로서 약품 및 화장품에 사용되고 있다. 헤스페리딘은 알칼리 수용액에는 용해되나 물과 산에는 거의 녹지 않는다. 주위 온도에서 50리터의 물에 단지 약 1g 헤스페리딘(약 0.002v/v%)만이 녹는다. 예컨데 통조림 제품의 시럽 속에 소량으로만 헤스페리딘이 함유된 경우에도, 시럽은 혼탁화되어 그 상품적 가치가 떨어질 수 있다.
헤스페리딘 존재로 인한 시럽내 혼탁화를 방지할 수 있는 여러 가지 방법이 제안되어 왔다.
예를 들어, 일본국 특허 공개 제 91-7593 호에 수용성이 증가된 효소-처리 헤스페리딘의 제조 방법이 개시되어 있으며, 이 방법에서는 당-전달 효소, 특히 알파-글루코실 트랜스퍼라아제 활성을 갖는 효소를 알파-글루코실 당화합물인 부분 녹말가수분해산물의 존재하에 헤스페리딘에 작용시켜 하기식[II]로 나타내어지는 알파-글루코실 헤스페리딘을 형성한다.
Figure pat00003
알파-글루코실 헤스페리딘은 상기식[II]에서 보는 바와 같이, 상기식[I]로나타내어지는 헤스페리딘의 4-위치에 있는 글루코스에 n(1 내지 20)단위의 글루코스(G)가 1,4-결합에 의해 순차적으로 결합되어진 단일 화합물, 또는 글루코스 단위의 수가 서로 상이한 알파-글루코실 헤스페리딘들의 혼합물이다.
상기 효소 반응에서, 액상 물질내 40 내지 80%의 헤스페리딘이 효소 처리동안 알파-글루코실 헤스페리딘으로 전환되어진 반면, 20 내지 60%의 헤스페리딘은 미반응인 채로 남는다. 알파-글루코실 헤스페리딘이 공존하는 때에 미반응 헤스페리딘이 수용액 내에서 비교적 높은 용해도를 나타내더라도, 미반응 헤스페리딘의 알파-글루코실 헤스페리딘에 대한 높은 비율은 단시간 내에 헤스페리딘의 불용화 및 침전을 초래한다.
미반응 헤스페리딘의 침전을 방지할 수 있는 또다른 방법이 고안될 수 있으며, 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 점착 물질을 헤스페리딘을 갖는 용액에 첨가하여 그 점도를 높이는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 부적합한데 그 이유는 점착 물질의 첨가는 수요자의 관심을 저하시킬 수 있다는 것과 점착 물질의 사용은 수출용 제품 내에서 금지되기 때문이다.
미반응 헤스페리딘의 침전을 지연시킬 수 있는 또다른 방법은 미반응 헤스페리딘을 침전시킨 후 예컨데 여과에 의해 분리 제거하여 미반응 헤스페리딘의 알파-글루코실 헤스페리딘에 대한 비를 감소시키는 것이다.
그러나, 이 방법은 미반응 헤스페리딘이 장시간 경과 후에 여전히 침전을 야기한다는 단점으로 인해 완전한 해결책을 주지 못한다.
또다른 방법이 있으며, 이 방법에서는 알파-글루코실 헤스페리딘과 미반응헤스페리딘을 둘다 함유하는 수용액으로부터 그 사용 전에 예컨데 크로마토그래피 분리를 이용하여 알파-글루코실 헤스페리딘의 분획을 분리시킨다. 그러나, 이 방법은 비용 증가를 초래하여 경제적 관점에서 부적합하다.
이들 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 광범위하고 집중적인 연구를 한 결과, 용액 내 알파-글루코실 헤스페리딘과 미반응 헤스페리딘을 알파-L-람노시다아제(E. C. 3. 2. 1. 40)로 처리하는 경우, 전자인 알파-글루코실 헤스페리딘은 아무변화가 없이 거의 미반응인 채 남는 반면, 후자인 헤스페리딘은 람노오스와 하기식[III]으로 나타내어지는 모노글루코실 헤스페레틴으로 가수분해된다는 사실과 아울러, 이는 장시간 정치시켜 두어도 혼탁화를 야기할 우려가 없는 매우 뛰어난 수용성을 갖는 효소-처리 헤스페리딘을 수득한다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견들을 토대로 한 것이다.
이와 관련하여, 헤스페리딘의 수용성을 증가시키기 위하여, 알파-L-람노시다아제를 그에 작용시켜 헤스페리딘을 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 전환시키는 방법이 귤 통조림의 시럽내 혼탁화 방지를 위해 공업적 규모로 실시되어 왔다.
그러나, 알파-L-람노시다아제 활성을 갖는 효소인 헤스페리디나아제를 알파-글루코실 헤스페리딘과 미반응 헤스페리딘을 둘다 함유하는 용액에 작용시켜 전자인 알파-글루코실 헤스페리딘 내의 람노오스 성분은 미반응인채로 남는 한편, 후자인 헤스페리딘은 특이적으로 가수분해되어 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 변화됨으로써 용액의 수용성을 증가시키는 본 발명의 방법은 어느 문헌에도 개시된 바 없다.
일본국 특허 공개 제 96-80177 호에는 헤스페리딘을 갖는 용액에 가용화된 헤스페리딘을 첨가하는 것에 의한, 헤스페리딘 결정의 침전을 방지하는 방법이 개시되어 있다. 상기 일본국 특허 공개 공보에는 가용화된 헤스페리딘이 헤스페리딘내 글루코스 성분의 4-위치에서 1 내지 10 또는 그 이상의 글루코스 성분이 알파-1,4-결합에 의해 순차적으로 결합되어진 화합물인 것과 아울러, 헤스페리딘을 시클로덱스트린 존재하에 CGT아제 또는 1, 4-알파-D-글루칸; 1,4 -알파-D-(1, 4-글루카노)-트랜스퍼라아제(E. C. 2, 4. 1. 19) [예컨데, 바실루스(Bacillus) 속의 A2-5a 균주의 배양물로부터 수확된 것]일 수 있는 당-전달 효소로 처리함으로써 가용화된 헤스페리딘을 제조할 수 있다는 것이 기술되어 있다.
그러나, 상기 일본국 특허 공개 공보에서는 헤스페리딘을 갖는 생성물 내에서 헤스페리딘 결정의 침전을 방지하기 위하여 가용화된 헤스페리딘을 미반응 헤스페리딘과 혼합시키는 기술적 착상만이 개시되어 있다. 또한, 이러한 방법은 미반응 헤스페리딘이 미반응인 채 잔존하는 알파-글루코실 헤스페리딘과 헤스페리딘의 혼합물을 제공한다. 즉, 이 방법으로 제조된 통조림 제품은 그들의 시럽이 점차 혼탁화된다는 단점을 갖는다. 이 문제를 극복하기 위하여, 상기 일본국 특허 공개 공보의 실시양태에서는 사용전에 알파-모노글루코실 및 알파-디글루코실 헤스페리딘의 분획들을 분리시킨다. 그러나, 저비용으로 분획들을 분리하고자 한다면 기술적 곤란을 겪을 수 있다.
본 발명은 종래 기술의 이러한 문제점들을 해결하기 위한 것이다. 본 발명의주된 목적은 단순공정에 의해 알파-글루코실 헤스페리딘과 헤스페리딘의 혼합물로부터 수득할 수 있는, 수용성이 뛰어나고 장기간 저장시에도 결정 침전이나 혼탁을 야기하지 않는 효소-처리 헤스페리딘을 제공하는 것과 아울러, 그 제법 및 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 귤 통조림내에서 혼탁을 방지하는데 매우 유용한 효소-처리 헤스페리딘을 제공하는 것이다.
본 발명의 그외 또다른 목적은 천연 착색제의 퇴색을 방지하기 위한 제제로서 사용되기에 적합한 효소-처리 헤스페리딘을 제공하는 것이다.
본 발명의 효소-처리 헤스페리딘은 알파-글루코실 헤스페리딘과 함께 헤스페리딘 및 베타-모노글루코실 헤스페레틴을, 특히 알파-글루코실 헤스페리딘 1중량부 당 0.1 중량부 이하의 헤스페리딘과 0.1 내지 0.5 중량부의 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라서 효소-처리 헤스페리딘을 제조하는 방법은 알파-글루코실 헤스페리딘과 헤스페리딘을 둘다 함유하는 용액에 알파-L-람노시다아제를 작용시켜 후자인 헤스페리딘을 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 전환 또는 변화시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 처리되어질 알파-글루코실 헤스페리딘과 헤스페리딘을 함유하는 용액에 관하여는, 헤스페리딘과 함께 알파-글루코실 당화합물을 함유하는 용액에 당-전달 효소를 작용시켜 얻어지는 것들을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 알파-L-람노시다아제 활성을 갖는 효소인 헤스페리디나아제를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에서, 바람직하게는 이렇게 하여 얻어진 효소-처리 헤스페리딘은 알파-글루코실 헤스페리딘과 함께 헤스페리딘 및 베타-모노글루코실 헤스페레틴을, 특히 알파-글루코실 헤스페리딘 1 중량부 당 0.1 중량부 이하의 헤스페리딘과 0.1 내지 0.5 중량부의 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 함유한다.
또한 본 발명에서는, 알파-L-람노시다아제 활성을 갖는 효소, 특히 헤스페리디나아제를 알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 함유하는 용액에 작용시켜 후자인 헤스페리딘을 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 전환시킨다 : 전자인 알파-글루코실 헤스페리딘은 본 효소와 함께 글루코아밀라아제(E. C. 3. 2. 1. 3) 또는 베타-아밀라아제(E. C. 3. 2. 1. 2)로 동시에 또는 연속적으로 처리함으로써 알파-모노 글루코실 및 알파-디글루코실 헤스페리딘으로 변화될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 실시에 의해, 수용성이 매우 뛰어나고 결정의 침전이나 혼탁을 야기하지 않는 효소-처리 헤스페리딘을 알파-글루코실 헤스페리딘 및 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 포함하는 조성물 형태로 쉽게 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 알파-글루코실 헤스페리딘의 용액을 HP-20 및 XAD-7과 같은 선활성화된(preactivated) 흡착성 수지의 컬럼에 적용하여 글루코사이드 분획의 흡착을 일으키고, 물로 씻고 알코올수로 용출시키는 것에 의해, 알파-글루코실 헤스페리딘 함량과 상업적 가치가 모두 상승된 효소-처리 헤스페리딘을 얻을 수 있다.
본 발명의 효소-처리 헤스페리딘은 귤 통조림내에 혼입될 때 혼탁을 방지할수 있다. 본 효소-처리 헤스페리딘은 또한 감귤류 음료 내에 혼입될 때에 혼탁을 방지할 수 있다. 또한, 본 효소-처리 헤스페리딘은 조합하여 사용될 때 천연 착색제의 퇴색을 방지할 수 있다. 나아가 또한, 이러한 착색제를 효소-처리 헤스페리딘 및 효소-처리 루틴 및/또는 L-아스코르빈산과 함께 사용함으로써 천연 착색제의 퇴색은 더욱 효과적으로 방지된다.
효소-처리 헤스페리딘과 그 제법 및 용도를 하기에 상세히 기술한다.
본 발명의 효소-처리 헤스페리딘은 알파-글루코실 헤스페리딘과 함께 헤스페리딘 및 베타-모노글루코실 헤스페레틴을, 특히 알파-글루코실 헤스페리딘 1 중량부 당 0.1 중량부 이하의 헤스페리딘과 0.1 내지 0.5 중량부의 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 함유한다.
본 발명은, 이러한 효소-처리 헤스페리딘을 제조하기 위하여, 상기식 [I] 및 [II]로 각각 나타내어지는 알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 둘다 함유하는 용액을 알파-L-람노시다아제 활성을 갖는 효소, 특히 헤스페리디나아제로 처리하여 용액내의 후자 헤스페리딘을 하기식 [III]으로 나타내어지는 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 전환 또는 변화시키는 것을 특징으로 한다.
Figure pat00004
알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 함유하는 용액
조성 및 농도에 관계없이 알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 둘다 함유하는 한 어떠한 용액도 이러한 효소 처리에 적합하다 : 처리되어질 용액 내 알파-글루코실 헤스페리딘의 농도는 0.1 내지 30 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%이고, 헤스페리딘의 농도는 0.02 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 5 중량%이며;
여기에서 알파-글루코실 헤스페리딘 100 중량부 당 1 내지 200, 바람직하게는 1 내지 25 중량부의 헤스페리딘이 함유된다.
이러한 용액의 예는 다음과 같다 :
(1) 일본국 특허 공개 제 91-7593 호에 기재되어 있는 알파-글루코실 헤스페리딘 및 미반응 헤스페리딘을 함유하는 용액(이것은 알파-글루코실 트랜스퍼라아제활성을 갖는 효소인 당-전달 효소를 알파-글루코실 당 화합물인 부분 녹말 가수분해산물의 존재하에 헤스페리딘에 작용시켜 얻어짐)과
(2) 헤스페리딘의 알파-글루코실 헤스페리딘에 대한 비율이 감소된 용액(이것은 상기에서 얻어진 생성물 내의 헤스페리딘을 침전시키고, 여과에 의해 헤스페리딘을 분리 및 제거하여 얻어짐).
알파-L-람노시다아제 활성을 갖는 효소
알파-L-람노시다아제 활성을 갖는 한 어떠한 효소도 본 발명에 적합하다 : 이러한 효소의 예로는 나린기나아제 및 바람직하게는 헤스페리디나아제가 포함되며; 이들은 둘다 다나베 세이야꾸 사(Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan)로부터 시판되고 있다.
이러한 효소는 알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 함유하는 용액 내에서 헤스페리딘 100 중량부 당 바람직하게는 0.05 내지 50 중량부, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 15 중량부의 양으로 사용된다.
이러한 용액 내에서 효소를 헤스페리딘에 작용시키기 위하여, 용액을 일반적으로 pH 3 내지 7, 바람직하게는 pH 3 내지 4 및 40 내지 70℃, 바람직하게는 50 내지 60 ℃에서 0.5 내지 48 시간 동안, 바람직하게는 6 내지 24 시간 동안 항온처리한다.
알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 함유하는 용액을 이들 조건 하에 효소처리하는 경우, 용액 내 알파-글루코실 헤스페리딘의 함량은 처리 전 및 후에 변화가 없는데, 그 이유는 알파-글루코실 헤스페리딘은 알파-L-람노시다아제에 거의 비감수성이기 때문이다.
이렇게 하여 얻어진 효소-처리 헤스페리딘은 알파-글루코실 헤스페리딘 1 중량부 당 0.1 중량부 이하, 바람직하게는 0.02 중량부 이하, 더욱 바람직하게는 0 내지 0.01 중량부의 양으로 헤스페리딘을 함유하고, 그와 함께 0.1 내지 0.5 중량부, 바람직하게는 0.15 내지 0.4 중량부, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 0.3 중량부의 양으로 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 함유한다.
이러한 효소-처리 헤스페리딘은 수용성이 뛰어나다 : 예를 들면, 이것은 30 중량% 수용액으로 제조한 후 주위 온도(25 ℃)에서 4주간 육안으로 관찰하면서 정치시켰을 때에도 헤스페리딘의 침전으로 인한 덩어리 형성이 거의 없다.
이렇게 하여 얻어진 효소-처리 헤스페리딘 내 알파-글루코실 헤스페리딘은 인체 내에 섭취될 때 비타민 P에 고유한 다양한 활성을 나타내는데, 그 이유는 헤스페리딘을 방출하는 인체내 효소에 민감하기 때문이다. 이 경우에, 비타민 C와의 조합은 모세혈관의 저항력 증대를 포함하여 비타민 P 활성에서의 상승 작용을 얻게 한다. 또한, 효소-처리 헤스페리딘은 천연 착색제의 퇴색을 방지하기 위한 용도에도 적합하다.
이 경우, 효소-처리 헤스페리딘은 천연 착색제로 착색되는 생성물의 중량 당 0.001 내지 0.2 중량%, 바람직하게는 0.005 내지 0.1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.05 중량%의 양으로 사용된다.
더욱 상세히 설명하면, 헤스페리딘의 사용은 UV 민감성(uviosensitive)이어서 퇴색을 일으키는 착색제, 특히 천연 착색제의 퇴색 방지에 거듭 시도되어 왔는데, 그 이유는 헤스페리딘이 자외선 영역에서 특징적인 흡수 스펙트럼을 가지되 헤스페리딘을 거의 무색으로 만드는 가시광 영역에서는 뚜렷한 흡수를 보이지 않기 때문이다. 그러나 이러한 시도들은 헤스페리딘이 그 낮은 수용성으로 인해 원하는 활성을 나타내지 못하므로써 성공적이지 못한 것으로 입증되었다. 수용성을 증가시키도록 변형된 통상적 효소-처리 헤스페리딘들은 미반응 헤스페리딘의 침전 및 침착이 수요자 관심을 떨어뜨릴 수 있다는 이유로 만족스럽지 못하였다.
대조적으로, 본 발명의 효소-처리 헤스페리딘은 물에 쉽게 용해되고 침전을 일으킬 우려가 없기 때문에 천연 착색제의 퇴색을 방지하는데 광범위하게 사용가능하다: 특히, 이것은 파프리카, 베타-카로틴, 아스타크산틴, 포도 껍질 추출물 및 잇꽃 옐로우와 같은 카르테노이드 및 플라보노이드 계열의 착색제와 아울러 베타닌, 쿠르쿠마, 아데니아 옐로우 및 앵그-크학(ang-khak)을 포함하는 다른 착색제와 함께 유효하게 사용될 수 있다.
이 경우, 효소-처리 루틴 및/또는 L-아스코르빈산 또는 L-아스코르빈산 나트륨과의 조합은 퇴색 방지에 있어서 상승 효과를 얻는다.
글 통조림 내의 혼탁을 방지하기 위하여 효소-처리 헤스페리딘을 사용하는 경우에, 효소-처리 헤스페리딘의 양은 귤 통조림 내의 귤과 시럽 내에 존재하는 미반응 헤스페리딘 1 중량부 당 0.1 내지 10 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량부, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 1 중량부로 설정된다.
또한, 본 효소-처리 헤스페리딘은 통상 헤스페리딘을 함유하는 감귤류 음료, 예컨데 귤(Citrus unshiu), 발렌시아 오렌지 및 그레이프후르트의 음료 내 혼탁화를 방지하는데 사용가능하다: 이 경우, 효소-처리 헤스페리딘의 양은 용액 내에 존재하는 미반응 헤스페리딘 1 중량부 당 0.1 내지 10 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량부, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 1 중량부로 설정된다.
또한 나아가서, 본 효소-처리 헤스페리딘은 자외선 영역에서 특징적 흡수를 가지지만, 매우 엷은 색상을 나타내므로 화장품 내에 UV 흡수제로서 사용가능하다.
본 발명의 실시에 의해, 알파-L-람노시다아제, 특히 알파-람노시다아제 활성을 갖는 효소인 헤스페리디나아제를 알파-글루코실 헤스페리딘 및 헤스페리딘을 함유하는 용액에 작용시킴으로써 수용성이 매우 뛰어난 효소-처리 헤스페리딘을 아주 쉽게 저비용으로 얻을 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 효소-처리 헤스페리딘은 장기간 정치시켜 두더라도 헤스페리딘의 침전을 일으키지 않으며, 그 이유는 그것이 헤스페리딘을 거의 함유하지 않거나, 또는 함유한다 할지라도 그 함량이 알파-글루코실 헤스페리딘 1 중량부에 대해 0.1 중량부 이하로 매우 작기 때문이다.
본 발명의 효소-처리 헤스페리딘은 천연 착색제의 퇴색을 효과적으로 방지한다.
본 효소-처리 헤스페리딘은 귤 통조림 및 감귤류 음료 내에 혼입될 때 그 혼탁화를 효과적으로 방지한다.
인체 내에 섭취될 때, 본 발명의 효소-처리 헤스페리딘 내의 주성분인 알파-글루코실 헤스페리딘은 비타민 P에 고유한 다양한 활성을 나타내는 헤스페리딘을방출하는 효소에 민감한데, 그 이유는 알파-글루코실 헤스페리딘이 알파-람노시다아제 외의 다른 효소에는 노출되지 않았기 때문이다.
본 발명의 효소-처리 헤스페리딘은 음료 및 건강 식품을 포함하는 통상적인 식료품과 아울러, 생리학적 활성을 갖는 1 이상의 성분이 사람의 건강 유지 및 촉진을 위해 혼입되어진 생리학적 기능성 식품에도 널리 사용가능하다.
또한, 자외선 영역에서의 특징적 흡수로 인하여 본 효소-처리 헤스페리딘은 UV 흡수제로서 사용가능하다.
실시예
본 발명을 하기 실시예를 참고하여 더욱 상세히 기술할 것이나, 이들은 어떤 식으로든 본 발명의 영역을 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
50 g의 헤스페리딘을 주위 온도(25 ℃)에서 0.25 N 수산화나트륨에 용해시키고, 얻어진 용액에 150 g의 덱스트린 (DE 8)을 첨가하고 용해시켰다.
결과물을 4N 황산을 첨가하여 pH 9.0으로 조정하고, 바실루스 스테아로더모필루스(Bacillus stearothermophilus) 종으로부터 유도된 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제(Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. Okayama, Japan)를 15 단위/덱스트린 고형물 g의 양으로 첨가하고, 60 ℃ 까지 가열하면서 4 N 황산을 적가하여 pH 7.0으로 조정하고, 68 ℃까지 가열하고 40 시간 동안 반응하게 둔다.
반응 완료 후, 반응 혼합물을 95 ℃에서 30 분간 가열하여 효소를 비활성화시킨 후 여과하여 효소-처리 헤스페리딘의 용액(이후 "용액 A"라 표기함)을 얻는다.
하기 조건 하에 용액 A를 HPLC 분석한 결과는, 출발 용액 내의 72 중량%의 헤스페리딘이 알파-글루코실 헤스페리딘으로 전환된 한편, 나머지 28 중량%는 미반응인 채 남았음을 보였다.
HPLC의 분석 조건
사용된 칼럼은 C18; 용출제는 메탄올/물/아세트산 (부피비 30: 65 : 5)의 혼합물 ; 검출, 280 nm; 온도, 40 ℃; 및 유속은 0.5 ml/분이었다.
(자외선 영역 내 흡수 스펙트럼은 PDA 검출기를 사용하여 200 내지 400 nm에서 측정하였다.)
용액 A를 4 N 황산으로 pH 4.0으로 조정하고, 알파-L-람노시다아제 활성을 갖는 헤스페리디나아제 생성물인 "헤스페리디나아제(HESPERIDINASE) #2"(Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan) 2.0 g을 가하고, 60 ℃에서 6 시간 동안 반응하게 둔다.
반응 완료 후, 반응 혼합물을 95 ℃에서 30 분간 가열하여 효소를 비활성화시킨 후 여과하여 효소-처리 헤스페리딘의 용액(이후 "용액 B"라 표기함)을 얻는다.
상기 조건 하에 용액 B를 HPLC 분석한 결과는, 알파-글루코실 헤스페리딘은 거의 변화가 없고 용액 B 내에 미반응인 채로 남는 한편, 용액 A 내의 대부분(99 중량% 이상)의 미반응 헤스페리딘은 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 변화되었음을 보였다.
헤스페리딘, 베타-모노글루코실 헤스페레틴, 알파-모노글루코실 헤스페리딘 및 알파-글루코실 헤스페리딘의 확인
헤스페리딘, 베타-모노글루코실 헤스페레틴, 알파-모노글루코실 헤스페리딘 및 알파-글루코실 헤스페리딘을 하기 방법으로 확인하였다.
1. 헤스페리딘
헤스페리딘의 정격 시약 (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 확인을 수행하였다.
2. 베타-모노글루코실 헤스페레틴
헤스페리딘의 정격 시약을 먼저 알파-L-람노시다아제로 처리한 후, 상기 조건하에 고성능 액체 크로마토그래피(이후에 "HPLC"로 약기)로 분석하였다. 그 다음, 헤스페리딘의 피크( RT(체류시간)=10.90 )에 뒤따르는 단일 피크 분획( RT=12.13 )을 수집하고, 가수분해하고 글루코스에 대해 측정하였다. 또한, 이 분획의 자외선 흡수 스펙트럼은 헤스페리딘의 그것과 아주 잘 일치하였으며, 이렇게 하여 단일 피크 분획이 베타-모노글루코실 헤스페레틴 또는 헤스페레틴-7-글루코시드의 것임이 확인되었다.
3. 알파-모노글루코실 헤스페리딘 및 알파-글루코실 헤스페리딘
헤스페리딘의 정격 시약으로부터의 반응 혼합물을 상기 조건 하에 HPLC로 분석하였다. 각 피크 분획의 자외선 흡수 스펙크럼을 헤스페리딘의 그것과 일치하는지에 대해 조사하였다. 또한, 반응 혼합물을 글루코아밀라아제로 처리한 다음, 상기 조건 하에 HPLC로 분석하였다. 결과로서, 각 피크 분획은 헤스페리딘의 그것(RT=10.90)에 선행하는 단일 피크(RT=10.34)를 공통적으로 제공한다.
분획 (RT=10.34) 수집 후, 그것이 알파-글루코시다아제(E.C.3.2.1.20)로 처리할 때 글루코스와 헤스페리딘을 제공함을 확인하였다. 즉, 피크(RT= 10.34)을 알파-모노글루코실 헤스페리딘인 것으로 확인하였으며, 한편 이 피크와 더 작은 RT를 갖는 피크군을 알파-글루코실 헤스페리딘인 것으로 확인하였다.
헤스페리딘, 베타-모노글루코실 헤스페레틴, 알파-모노글루코실 헤스페리딘 및 알파-글루코실 헤스페리딘의 중량 측정
헤스페리딘, 베타-모노글루코실 헤스페레틴, 알파-모노글루코실 헤스페리딘 및 알파-글루코실 헤스페리딘의 중량을 하기 방법으로 측정하였다.
1. 헤스페리딘
시료를 HPLC로 분석하고 헤스페리딘의 정격 시약 (Tokyo Chemical Industry co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 중량을 측정하였다.
2. 베타-모노글루코실 헤스페레틴
시료를 HPLC로 분석하고 헤스페리딘의 정격 시약을 사용하여 그들의 분자량을 추정하면서 중량을 측정하였다.
3. 알파-모노글루코실 헤스페리딘
시료를 HPLC로 분석하고 헤스페리딘의 정격 시약을 사용하여 그들의 분자량을 추정하면서 중량을 측정하였다.
4. 알파-글루코실 헤스페리딘 분획
1 g의 분획을 50 ml의 물에 용해시키고, SV 1에서 농축 에탄올수 내에서 활성화된 XAD-7 100 ml에 적용하고 물로 씻은 후 200 ml의 50 % 에탄올수로 용출시킨다. 용출액을 에탄올로부터 분리하고, 농축하고, 건조시키고 중량을 측정한다. HPLC 분석 후의 용출액 내에서 헤스페리딘 및/또는 베타-모노글루코실 헤스페레틴이 검출되면, 용출액에 대해 측정된 중량으로부터 상기 항목 1 및 2에 따라서 측정된 중량을 감하였다.
실시예 2
별도로 제조된 알파-글루코실 헤스페리딘 용액인 용액 A에 아마노 파마슈티컬 사(Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Japan)에서 시판하는 글루코아밀라아제 생성물(4,200 단위/ml)인 "글루크자임 (GLUCZYME) NL 4.2" 0.5 ml와 다나베 세이야꾸사(Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 시판하는 헤스페리디나아제 생성물인 "헤스페리디나아제(HESPERIDINASE) # 2" 2.0 g을 가하고, 4 N 황산으로 pH 4.0으로 조정하고 55 ℃에서 48 시간 동안 반응하게 둔다.
반응 완료 후, 반응 혼합물을 90 ℃에서 30 분간 가열시켜 효소를 비활성화시킨 후 여과하여 효소-처리 헤스페리딘의 용액(이후 "용액 C"라 표기함)을 얻는다.
실시예 1의 조건하에 용액 C를 HPLC 분석한 결과는, 용액 C 내에서 대부분의 알파-글루코실 헤스페리딘이 알파-모노글루코실 헤스페리딘으로 변화된 한편, 대부분(99 % 이상)의 미반응 헤스페리딘이 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 변화되었음을 보였다.
그 다음, 용액 C를 농축 에탄올수 내에서 활성화된 중간 극성의 다공성 흡착수지인 1.5 L "XAD-7"의 컬럼에 적용한 후, 컬럼을 수지 부피보다 2배 많은 양의 물로 씻은 다음에 3 L의 60 (v/v)% 에탄올수를 사용하여 흡착된 성분을 탈착시켰다.
용출액을 에탄올로부터 분리시키고 친유화시켜 44.8 g의 효소-처리 헤스페리딘(이후 "고체 D"라 표기함)을 얻었다.
실시예 3
별도로 제조한 효소-처리 헤스페리딘의 용액인 용액 A에 0.5 ml의 "글루크자임(GLUCZYME NL 4.2)"을 가하고, 4 N 황산으로 pH 5.0으로 조정하고 55 ℃에서 24 시간 동안 반응하게 둔다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 90 ℃에서 30 분간 가열하여 효소를 비활성화시킨 후 여과하여 효소-처리 헤스페리딘의 용액(이후 "용액 E"라 표기함)을 얻는다.
실시예 1의 조건하에 용액 E를 HPLC 분석한 결과는, 용액 E 내에서 대부분의 알파-글루코실 헤스페리딘이 알파-모노글루코실 헤스페리딘으로 변화된 한편, 미반응 헤스페리딘은 용액 E 내에서 거의 변화가 없음을 보였다.
그 다음, 실시예 2에서와 유사하게, 농축 에탄올수 내에서 활성화시킨 중간 극성의 다공성 흡착수지인 1.5 L "XAD-7"의 컬럼에 용액 E를 적용한 후, 컬럼을 수지 부피보다 2 배 많은 양의 물로 씻은 후, 3 L의 60 (v/v)% 에탄올수를 사용하여 흡착된 성분을 탈착시켰다.
용출액을 에탄올로부터 분리한 후 친유화시켜 48.0 g의 효소-처리 헤스페리딘(이후 "고체 F"라 표기함)을 얻었다.
응집 시험
효소-처리 헤스페리딘의 용액인 용액 A 및 B에 따로 물을 첨가하여 각각 고형물 함량 30 중량%로 만들고 한편, 고체 D 및 F를 순수에 따로 용해시켜 각각 고형물 함량 15 중량%로 만든 다음, 각 용액을 가열로써 소독하고, 멸균 유리 바이알내에 200 ml 분량씩 배분한 후 4주간 정치시켜 두면서 정치일수와 정치 동안 형성된 덩어리 양 사이의 관계를 조사하였다.
결과는 표 1에 나와 있는 바와 같다.
[표 1] (응집 관찰 결과)
Figure pat00005
평가 기준은 다음과 같다 : "-" 부호는 덩어리가 전혀 없는 경우에 주어지며; "+"는 미량의 덩어리가 형성된 경우에; "++"는 소량의 덩어리가 형성된 경우에; "+++"는 다량의 덩어리가 형성된 경우에; 그리고 "++++"는 무척 많은 양의 덩어리가 형성된 덩어리가 형성된 경우에 주어진다.
효소-처리 헤스페리딘 시료 내의 성분들에 대한 중량비는 표2에 나타낸 바와 같다.
[표 2]
(효소-처리 헤스페리딘의 성분 중량비)
Figure pat00006
실시예 4
시트르산 1수화물 형태의 시트르산 1과1/2 g, 시트르산 3나트륨 2수화물 형태의 시트르산 나트륨 0.13 g 및 과립 슈크로스 200 g을 물에 용해시켜 전체량 1,000 g을 만들었다. 얻어진 용액에 알칼리수, 특히 0.2 N 수산화나트륨수에 용해시킨 헤스페리딘을 2.0 중량% 까지 첨가하고, 1 N 염산으로 pH 3.0으로 조정하여, 헤스페리딘 함량 0.05 중량%의 시험 용액을 얻었다.
200 g 분량씩의 시험 용액에, 10 중량%까지 용해시킨 실시예 2의 고체 D 200 mg을 첨가하여, 0.01 중량%의 효소-처리 헤스페리딘을 갖는 "시험 물질(test run) 1"을 제공한다.
상기와 유사하게, 각각 0.02 중량% 및 0.04 중량%의 효소-처리 헤스페리딘을 갖는 "시험 물질 2" 및 "시험 물질 3"을 제공하였다.
또한 대조용으로서 효소-처리 헤스페리딘이 없는 물질을 제공하였으며, 표 3에 나와 있는 바와 같다.
시험 물질 1 내지 3과 대조용을 주위 온도에서 1주간 정치시켜 두면서 이들을 혼탁도에 대해서 육안으로 조사하였다.
결과는 표 3에 나와 있는 바와 같다.
[표 3] (혼탁도의 육안 조사)
Figure pat00007
* : 다량의 침전이 발생함.
평가는 하기 기준에 따라 행하였다 :
평가 기준은 다음과 같다 : 부호"-"는 혼탁이 전혀 발생하지 않은 경우에 주어지고 ; "±"는 미량의 혼탁이 발생한 경우에 ; "+"는 소량의 혼탁이 발생한 경우에 ; 그리고 "++"는 다량의 또는 뚜렷한 혼탁이 발생한 경우에 주어진다.
실시예 5
효소-처리 헤스페리딘인 실시예 2의 고체 D를 시트르산 완충액 (pH 3.3) 내 0.05 중량% 가데니아 옐로우에 가하여 효소-처리 헤스페리딘의 함량이 0.02 또는 0.04 중량%가 되게 한 후, 표 4에 나와 있는 바와 같이, 도요 슈가 리파이닝 사(Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokyo, Japan)에서 시판하는 "알파 G 루틴 PS(alpha G Rutin PS)"(77.5 중량%의 알파-모노글루코실 루틴, 14.5 중량%의 이소쿠에르시트린, 5.2 중량%의 당 및 2.8 중량%의 물로 구성되는 효소-처리 루틴)와 L-아스코르빈산 중 하나 또는 둘다를 동시에 가하고, 밀폐 용기 내에서 가열하여소독한 후 형광 램프(7,000 lux)로 조사하면서 분광분석법으로 442nm 파장에서 이틀에 한번씩 가데니아 옐로우의 잔존 비율(%)을 측정하였다.
시험 조건 및 결과는 각각 표 4 및 5에 주어진 바와 같다.
표 4 및 5에 나타낸 바와 같이 첨가가 없는 또다른 실시물질이 대조용으로서 제공된다.
또한 표 4 및 5에 나와 있는 바와 같이 각각 효소-처리 루틴 및 L-아스코르빈산을 갖는 : "시험 물질 10" 및 "시험 물질 11"이 제공된다.
[표 4-1] (시험 조건/단위 : 중량%)
Figure pat00008
[표 4-2] ( 시험 조건/단위: 중량% )
Figure pat00009
주 : 9번 시험 : 공실험 (대조용 구성)
[표 5-1] (결과 /수치는 가데니아 옐로우 착색물질의 생존율%을 가리킴)
Figure pat00010
[표 5-2] (결과 /수치는 가데니아 옐로우 착색물질의 생존율%을 가리킴)
Figure pat00011
주 : 9번 시험 : 공실험 (대조용 구성)
각 시험물질은 대조용에서의 경우와 비교하여 가데니아 옐로우의 잔존율(%)이 개선됨을 보여 준다. 효소-처리 헤스페리딘이 상이한 양으로 사용되나 효소-처리 루틴이나 L-아스코르빈산은 첨가되지 않은 시험물질 1과 시험물질 5를 비교하면, 효소-처리 헤스페리딘의 용액 내 첨가가 0.02에서 0.04 중량%로 증가된 경우에 4일째에 측정한 잔존율이 12% 만큼 증진된 것이 확인된다.
효소-처리 헤스페리딘을 효소-처리 루틴 및/또는 L-아스코르빈산과 조합하여 사용한 경우에는 상승 효과가 확인되었다.
실시예 5
귤(Citrus unshiu)로부터의 과즙 300 g, 슈크로스 과립 95 g, 시트르산 1수화물 형태의 시트르산 0.12 g 및 향미제 1.0 ml를 물에 혼합하여 감귤류 음료 (과즙 기재의 음료) 1,000 g을 얻었다. 100 ml 분량씩의 음료에 실시예 1의 용액 A를 건조 고형물 기준으로 4 mg (0.004 중량%), 8 mg (0.008 중량%) 또는 12 mg (0.012 중량%)의 양으로 첨가하여, 각각 시험물질 1 내지 3을 얻었다. 용액 A 대신에 실시예 1의 용액 B를 4 mg (0.004 중량%), 8mg (0.008 중량%) 또는 12 mg (0.012 중량%)의 양으로 사용하는 것만 제외하고, 상기와 유사하게 하여 시험물질 4 내지 6을 제공하였다. 또한 대조용으로서 효소-처리 헤스페리딘이 없는 물질을 제공하였다. 각 물질을 주위 온도에서 정치시켜 두면서 이들을 혼탁도에 대해 육안으로 조사하였다.
결과는 표 6에 나와 있는 바와 같다.
[표 6] (육안 조사 결과)
Figure pat00012
혼탁도 :
- : 투명,
± : 약간 혼탁,
+ : 낮은 수준의 혼탁,
++ : 낮지만 증가된 수준의 혼탁, 및
+++ : 매우 혼탁 (다량의 침전).

Claims (10)

  1. 알파-글루코실 헤스페리딘 1 중량부 당, 헤스페리딘 함량이 0.1 중량부 이하이고 ; 베타-모노글루코실 헤스페레틴의 함량이 0.1 내지 0.5 중량부인,
    알파-글루코실 헤스페리딘, 헤스페리딘 및 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 포함하여 이루어지는 효소-처리 헤스페리딘.
  2. 제 1 항에 있어서, 알파-글루코실 헤스페리딘 1 중량부 당 0.15 내지 0.4 중량부의 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 함유하는 효소-처리 헤스페리딘.
  3. 알파-글루코실 헤스페리딘과 미반응 헤스페리딘을 함유하는 용액을 알파-L-람노시다아제로 처리하여 미반응 헤스페리딘을 베타-모노글루코실 헤스페레틴으로 전환시키는 것을 포함하여 이루어지는 효소-처리 헤스페리딘의 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 용액은 헤스페리딘과 함께 알파-글루코실 당 화합물을 함유하는 용액을 당-전달 효소로 처리하는 것에 의해 수득가능한 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 알파-L-람노시다아제가 헤스페리디나제인 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 효소-처리 헤스페리딘이 알파-글루코살 헤스페리딘1 중량부 당, 0.1 중량부 이하의 헤스페리딘과 0.1 내지 0.5 중량부의 베타-모노글루코실 헤스페레틴을 함유하는 방법.
  7. 유효량의 제 1 항의 효소-처리 헤스페리딘을 귤 통조림 내에 혼입하는 것을 포함하여 이루어지는, 귤 통조림 내의 혼탁을 방지하는 방법.
  8. 유효량의 제 1 항의 효소-처리 헤스페리딘을 감귤류 음료 내에 혼입하는 것을 포함하여 이루어지는, 감귤류 음료 내의 혼탁을 방지하는 방법.
  9. 제 1 항의 효소-처리 헤스페리딘을 천연 착색제와 공존하게 하는 것을 포함하여 이루어지는, 천연 착색제의 퇴색 방지 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 효소-처리 헤스페리딘을 효소-처리 루틴 또는 L-아스코르빈산, 또는 효소-처리 루틴 및 L-아스코르빈산과 조합하여 사용하는 방법.
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