KR100417183B1

KR100417183B1 - 유기시아닐화제로활성화된가용성탄수화물을이용한면역원성구조체제조

Info

Publication number: KR100417183B1
Application number: KR1019970706604A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 리스
Original assignee: 헨리 엠. 잭슨 파운데이션 포 더 어드벤스먼트 오브 밀리터리 메디신
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2004-05-31
Also published as: DE122009000055I1; FR09C0047I1; DE122009000056I1; NL300413I1; JP5594612B2; KR19980703201A; FR09C0047I2; NL300414I1; JP2012116850A

Abstract

면역원을 제조하는 방법은 적어도 하나의 탄수화물-함유 성분을 활성화하고, 이 제1 성분과 제2 성분이 공유결합적으로 결합하는 단계를 포함한다. 제1 성분은 바람직하게 폴리사카라이드이고, 제2 성분은 단백질이다. 면역원성 구조물은 제1 및 제2 성분의 직접 또는 간접 컨쥬게이션 공정으로 제조된다.

Description

유기 시아닐화제로 활성화된 가용성 탄수화물을 이용한 면역원성 구조체 제조

파상풍 톡소이드와 같은 제제는 면역반응을 본원적으로 트리거할 수 있고, 따라서 수정 없이도 백신으로 투여할 수 있는 것이다. 다른 제제들은 면역원은 아니지만 면역원 분자 또는 구조체로 전환하여 면역반응을 유도할 수 있는 것이 있다.

일반적으로, 본 발명은, 면역원성 구조체를 형성하는 바람직한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 결과 면역원성 구조체, 이로부터 제작된 백신, 및 이 면역원성 구조체의 용도에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 면역원성 구조체의 형성에 사용되는 탄수화물-함유한 항원을 활성화하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 면역원성 구조체는 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디니움 테트라플루오로보레이트(1-cyano-4-(dimethylamino)-pyridinium tetrafluoroborate)(CDAP)와 같은 유기 시아닐화제로 탄수화물-함유한 성분을 활성화하여 제조한다.

여러 가지의 시아닐화제는 그 자체로 예를 들면 크로마토그래피의 친화성을 위한 겔을 제조하기 위한 불용성 입자를 활성화하는 제제로 알려져 있다. Wilcheck et al., Affinity Chromatography. Meth. Enzymol., 104C:3-55 참조. Wakelsman et al. (J.C.S. Chem. Comm. 1976:21(1976))은 CDAP가 단백질의 시스테인 기를 수정하기 위해 사용할 수 있는 마일드한 제제라는 것을 보고하였다. Kohn et al.(Anal. Biochem, 115:375(1981))은 CDAP를 N-시아노트리에틸-암모니움 테트라플루오로보레이트(N-cyanotriethyl-ammonium tetrafluoroborate(CTEA))와 P-니트로페닐시아네이트(P-nitrophenylcyanate(pNPC))를 불용성 폴리사카라이드 수지인 아가로스의 활성화제로서 비교하였다. 다른 연구자들은 세파로스와 글리세릴-제어 기공글래스(Sepharose and glyceryl-controlled pore glass)와 같은 여러 형태의 불용성 입자를 활성화하는 데 CDAP를 사용해 왔다. Carpenter et al., Journal of Chromatography, 573:132-135(1992).

Kagedal 등의 미국특허 제3,788,948호는 제1 또는 제2 아미노기를 가진 유기 화합물을 하나 이상의 하이드록시 및/또는 제1 및/또는 제2 아미노기를 가진 중합체에 결합시키는 것에 즉, 수용성 효소를 불수용성 중합체에 결합시키는 것에 유기 시아네이트 화합물을 사용하는 방법을 개시하고 있다. Kagedal 등은 시아노겐 브로마이드보다 바람직한 것으로 pNPC와 같은 일정한 유기 시안화합물을 사용하는 방법을 개시하였다.

유사하게, Andersson 등은 International Journal of Cancer, 47:439-444(1991)에서 단백질과 콘주게이션하기 전에 CDAP를 이용하여 가용성 폴리사카라이드를 활성화하는 방법을 보고하였다. 이들은 상피성장인자(EGF)를 시아네이트로 활성화한 저분자량의 40kDa 덱스트란에 직접 콘주게이션하고, 이때, 대략 50:1(wt./wt.)의 EGF에 대한 고비율의 덱스트란을 사용하여 덱스트란-EGF콘주게이션을 생산하였고, 배양된 세포에 이 콘주게이션을 연결하는 연구를 하였다.

그러나, Kagedal 등과 Andersson 등은 면역원 구조체에 대해서 관심을 기울이지 않았다. 게다가, 저분자량 덱스트란에 단백질을 콘주게이션하는 것은 불량하거나 면역원의 기능이 없다고 보고되어 있다. T.E, Wilwman, J. Pharm. Pharmacology, 38:264 (1985).

물론, 이 면역원성능도(degree of immunogenicity)는 백신화를 위한 면역원 구조체의 중요한 특성이다. 백신화의 공정은 질병을 일으키지는 않지만 항체의 형성을 자극할 수 있는 항원으로 신체를 면역화하므로서 병균에 대항하여 자신을 보호하는 신체 본연의 능력을 이용하는 것이다. 예를 들면, 죽은 유기물이 발열장티프스 및 백일해와 같은 박테리아성 질병에 대한 저항을 가지기 위해서 주사되고, 톡소이드는 파상풍 및 디프테리아에 대한 저항을 가지기 위해서 주사되고, 약독화된 유기물은 회백수염 및 마진과 같은 바이러스성 질병에 대한 저항을 가지기 위해서 주사된다.

그러나, 단순히 외래물질을 주사하는 것으로 언제나 항체형성을 자극할 수 있는 것은 아니다. 백신제제는 면역원성이여야 한다. 즉, 면역반응을 유도할 수 있어야만 한다. 면역반응은 일련의 복잡한 반응으로, 일반적으로 다음과 같이 설명될 수 있다: (ⅰ)항원이 신체로 침입하여, 항원으로 진행하고 표면에서 항원의 단편을 유지하는 항원-존재세포와 만나게 되고, (ⅱ)항원존재세포에 있는 항원단편은 B 세포에 도움을 주는 T세포에 의해서 인식되고: (ⅲ)B세포는 증식하도록 자극되어 항원에 대해 저항하는 항체를 분비하는 항체형성 세포로 분화된다.

대부분의 박테리아성 폴리사카라이드에 대해서 항원은 박테리아를 캡슐화 함으로서 감염에 대한 보호를 할 수 있다. 신생아 및 유아가 폴리사카라이드에 의해서 예시된 바와 같은 T-세포 의존성(TI) 항원 반응을 준비할 수 없다는 것은 이들 유기물에 의해 일생동안 위협받는 감염에 대한 과도한 민감성을 가지게 되는 결과를 낳는다. 이 손상된 TI 항원에 대한 면역반응은 T-세포 에피토프를 폴리사카라이드에 콘주게이션하여, T-세포 의존성(TI)항원으로 전환시킴으로 극복될 수 있다.

면역원적 폴리사카라이드 구조체를 생산하기 위해서 일반적으로 사용되는 2가지 방법은 다음과 같다. (1)탄수화물과 단백질의 직접 콘주게이션: 및 (2)이기능성의 링커 또는 스페이서 제제를 통한 탄수화물과 단백질의 간접 콘주게이션. 일반적으로, 직접 및 간접 콘주게이션 모두 이들의 유도 전에 탄수화물 성분의 화학적 활성화를 요구한다.

화학적 활성화는 기능기를 부가적인 화학반응을 실행할 수 있는 형태로 전환하는 것, 즉 기능기 부가 또는 단백질과 같은 대형성분의 부가를 의미한다. 유도는 기능성 화학기 또는 스페이서 제제를 단백질에 부가하는 것이다.

불행하게도, 당업자들은 활성화 방법을 이용한 콘주게이션을 통한 면역원성구조체를 형성하는데 여러 가지의 문제와 만나게 되었다. 예를 들면, 콘주게이션 백신의 생산은 폴리사카라이드를 활성화하고 그들의 면역원성 에피토프를 퇴화하거나 손상하지 않는 조건에서 단백질과 콘주게이션해야한다는 어려움 때문에 대단한 도전이 되고 있다. 면역원성 구조체를 제조방법은 분자 위의 중요한 항원자리 즉, 에피토프를 유지하도록 충분히 온화하여야 한다. 그러므로, 구조의 완전성을 유지하는 것이 바람직하고, 이들 화합물의 에피토프를 보전하는 것이 바람직하다. 불행히도, 최근 이 분야에서 사용되고 있는 제조방법은 종종 온화하지 않기 때문에, 본래의 탄수화물 및/또는 단백질 구조를 파괴할 수 있다.

또한, 탄수화물 수정을 위한 많은 기지의 기술은 무수의 조건을 요구한다. 그러나 불행히도, 탄수화물은 종종 유기용매에 불용성이다. Marburg et al., J. Amer. Chem. Soc. 108:5282(1986).

따라서, 비록 탄수화물의 수정을 설명하는 많은 량의 화학문헌이 있지만, 이들중 대다수는 수성 항원에 이용하기에 부적합하다. 한 가지의 접근법은 폴리사카라이드가 유기용매에서 가용성을 강화하도록 수정하는 것이다. 예를 들면, 소수성 테트라부틸 암모니움 카운터-이온으로 특정 산성 폴리사카라이드에 산성수소를 대치하므로서 Marburg 등은 폴리사카라이드를 유기용매에 가용화 할 수 있고, 드라이 용매에 사용되는 제제인 카본일 디이미다졸로 하이드록실기를 활성화 할 수 있었다. 이 방법은Haemophilus influenzaePRP 및Pneumococcal6B 및 19F와 같은 폴리사카라이드가 사용된다. 단백질의 커플링은 폴리사카라이드의 환원성 단말에서 발견되거나 또는 탄수화물의 산화에 의해서 만들어진 알데하이드를 이용한 환원성아미노화를 통해서 이루어 질 수 있다. 이 두개의 접근 모두 본질적 제한을 가지고 있다. 즉, 고분자량 폴리사카라이드는 환원성 단말을 통한 커플링은 보통 느리고 비효율적이며, 종종 산화는 폴리사카라이드 체인의 분열을 가져오고 또한 항원의 영향을 미치게 된다.

아미노기 또는 카르복실기와 같은 일련의 기를 가진 탄수화물은 콘주게이션하기 전에 보다 쉽게 활성화하거나 유도될 수 있다. 예를 들면,Pseudomonas피셔 I 형에 속한 아미노기는 이오도아세틸기로 쉽게 유도 될 수 있고, 티올화된 단백질과 결합될 수 있다.Pneumonococcal피셔 III형과 같은 탄수화물에서 카르복실기는 EDC와 같은 수용성 카보디이미드(carbodiimide)로 용이하게 활성화될 수 있고, 그후 단백질과 직접 결합될 수 있다. 그러나 불행하게도, 이러한 탄수화물 군은 제한되어 있다.

다른 탄수화물은 유도 및 콘주게이션에 이용될 수 있는 최종 환원단말에 알데하이드기를 가진다. 또한, 과요오드화나트륨과 같은 산화제로 알데하이드기를 형성하는 것도 가능하다. 알데하이드기는 단백질에 있는 아미노기 또는 이기능성 링커제에 의해서 농축될 수 있다. 그러나, 이 농축반응, 특히 고분자량의 폴리사카라이드의 최종 환원단말로 농축된 축합반응은 종종 매우 느리고, 비효율적이다. 이것은 탄수화물의 알데하이드가 단백질에 직접 콘쥬게이션된 경우에 추가 발생된다. 그러므로, 이 방법을 사용한 수율은 종종 너무 낮다. 또한, 과요오드화나트륨은 탄수화물을 작은 분획으로 분해 및/또는 에피토프를 붕괴하여 불리하게 한다.

대부분의 탄수화물은 콘주게이션되기 전에 활성화되어야만 하고, 시아노겐브로마이드는 종종 선택의 활성화제이다. Chu et al., Inf. & Imm., 40:245(1983), Dick & Beurret, "박테리아성 탄수화물 항원의 글리코콘주게이트", Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis(eds.), vol. 10, 48-114(1989) 참조. 첫번째로 등록된 콘주게이션백신은 CNBr로 HIB PRP를 활성화하여 제조하고, 지방성 디하이드라지드(dihydrazide)로 유도하고, 수용성 카보디이미드를 이용하여 파상풍 톡소이드에 결합된다.

CNBr-활성법을 간단하게 요약하면, 시아노겐 브로마이드를 pH10 내지 12의 높은 pH에서 탄수화물과 반응한다. 이 정도의 높은 pH에서, 시아네이트 에스테르가 탄수화물의 하이드록시기에 의해서 형성된다. 이들은 이기능성 제제, 일반적으로 디아민 또는 디하이드라지드와 반응한다. 이들 유도된 탄수화물은 이기능성기를 통해서 축합된다. 일정하게 제한된 경우에서, 시아네이트 에스테르는 바로 단백질과 반응할 수도 있다.

높은 pH는 시아네이트 이온에 있는 하이드록시 이온을 친핵공격(nucleophilic attack)하는 것을 요구하기 때문에, 하이드록시기를 요오드화하는데 필수적이다. 결과적으로, 시아노겐 브로마이드는 많은 부반응을 만들고 이들 중 일부는 새로운 항원을 폴리사카라이드에 부가하는 것이다. M. Wilcheck et al., Affinity Chromatography. Meth. Enzymol., 104C:3-55. 더욱 중요한 것은 많은 탄수화물 또는 HIB PRP 및 Pn6과 같은 성분들이 시아노겐 브로마이드 활성화를 실시하기 위해서 필수적인 높은 pH에 의해서 분해되거나 손상될 수 있다.

CNBr-활성화법에 따른 다른 문제점은 형성된 시아네이트 에스테르가 높은 pH에서 불안정하고 빠르게 분해되어, 유도된 탄수화물의 수율이 감소되고 따라서 단백질에 콘주게이션된 탄수화물의 전체 수율이 감소한다. 카바메이트 및 직선상 이미도카보네이트를 생산하는 것과 같은 다른 비생산적인 부반응은 높은 pH에 의해서 항진된다. Kohn et al., Anal. Biochem, 115:375(1981). 또한, 시아노겐 브로마이드 자체는 매우 불안정하고, 높은 pH에서 자발적으로 분해되어 총수율을 더욱 감소시킨다.

또한, 시아노겐 브로마이드 활성화는 실행하기가 어렵고 신뢰성이 없다. 시아노겐 브로마이드는 독성이 높고, 잠제적인 폭발성이 있다. 제조공정시에 다량으로 사용할 경우 비상한 주의가 필요하다. 모든 공정은 적당한 퓸후드에서 실시하여야만 한다. 이 기술의 기술자들에게 일군의 시아노겐 브로마이드는 반응성이 높지만, 다른 것은 그렇지 않기 때문에 활성화가 용이하게 재현되지 않는 다는 것은 알려져 있다. 시아노겐 브로마이드는 또한 불에 난용성이기 때문에, 탄수화물과 반응할 수 있는 수용성 시아노겐 브로마이드의 양을 조절하는 것이 어렵다. 같은 종류의 시아노겐 브로마이드를 사용한 경우에도 이상적 반응조건은 항상 이상적인 결과를 유도하지 않는다.

상기한 단점 외에, 시아노겐 브로마이드를 사용하여 활성화된 탄수화물 활성화도를 제어하는 것은 매우 어렵다. 또한 이 방법을 사용하여 높은 탄수화물 활성화도를 획득하는 것은 매우 어렵다. 시아노겐 브로마이드의 존재량을 증가하는 것은 비효율적이고, 활성화의 증가없이 오직 부반응의 증가만을 유도할 뿐이다. Kohn et al., Applied Biochem and Biotech, 9:285(1984).

따라서, 시아노겐 브로마이드 활성화는 매우 유용한 방법으로 중명되었지만 많은 제한이 있다. 예를 들면, 시아노겐 브로마이드는 하이드록실이 시아네이트 이온과 반응하도록 충분히 친핵화하기 위해서 높은 pH(10-12)를 요구한다. 그러나 CNBr 이나 시아네이트 에스테르 중간체는 높은 pH에서 안정하지 않고, 이후의 대부분의 제제는 분해되거나 또는 비생산성 또는 원하지 않는 부반응을 실행하게된다. 따라서, 폴리사카라이드 활성화의 효율을 낮다. 또한, 활성화에 요구되는 높은 pH는 분해되거나 많은 pH-민감한 폴리사카라이드에 손상을 가할 수가 있다. 또한, CNBr은 독성이 있어 소량으로 작업하기에도 어렵다.

또한, 상기한 바와 같이, 다른 콘주게이션법도 여러 가지의 단점을 가지고 있다. 예를 들면, 비록Crptococcus neoformans및Pheumocccal폴리사카라이드 3형 및 Ⅵ형 항원은 카르복실기를 가지고 단백질과 결합하도록 제조되어 카보디이미드로 활성화될 수 있다.Pseudomonas피셔 Ⅲ형과 같은 폴리사카라이드는 유용하게 사용될 수 있는 아미노기를 가진다. 이들 항원은 모든 폴리사카라이드의 상대적으로 제한된 기를 형성한다. 따라서 다른 연구에서는 다수의 폴리사카라이드를 활성화하거나 관능화하는 것이 필요하다.

하나의 제안된 방법은 소수의 반응성 알데하이드가 생산되고 아민과 결합되는 환원성 아민화 공정이 있다. P. Anderson, Infection. Immun., 39, 233-238(1983) 참조. 다른 방법은 헤테로리게이션(heteroligation) 즉, 가수분해시 독특한 아미노산을 생산하는 티올-에테르 결합을 사용한 Marburg 등의 헤테로유전자의 스페이서방법 이다. Marburg et al., J. Amer. Chem. Soc., 108, 5282(1986) 참조. 그러나 이 방법은 폴리사카라이드가 드라이 유기용매에서 가용성일 것을 요구한다.

핵산 디아민 또는 지방성 디하이드라지드와 같은 제한된 수의 스페이서 군을 부가함으로써 단백질을 제한적으로 유도하는 것도 또한 시도되었다. 이들은 예를 들면 시아노겐 브로마이드법에 의해서 첨가된다. 이 방법에서, 단백질 카르복실은 카보디이미드로 활성화되었고, 아민 또는 하이드라지드와 반응하였다. 그러나 이 방법은 대규모의 단백질과 폴리사카라이드의 크로스링킹과 단백질의 고분자화를 생성하였다.

따라서, 유화하고, 탄수화물과 단백질의 구조의 통합을 유지하고, 화합물에서 에피토프를 보전할 수 있고, 실시용이하고, 신뢰성있고, 재현성이 뛰어나고, 빠르게 측정하고 다양한 종류의 폴리사카라이드로 작업할 수 있는 면역원성 구조체를 생산할 수 있는 방법이 필요하다.

본 발명은 1993년 9월 22일에 출원된 미국 출원번호 08/124,491의 부분 계속 출원인 1995년 3월 22일 출원된 미국출원번호 08/408,717의 부분계속 출원이다. 1

본 발명은 본 발명의 소유자에게 특허사용료를 지불하지 않고도 미국 정부 공공의 목적을 위해 제작되고, 등록되고, 사용될 수 있다.

도 1은 유기 시아닐화제를 사용하여 탄수화물의 활성화를 나타내는 예시적인 일반 개념도.

도 2는 활성화된 탄수화물이 단백질에 콘쥬게이션되는 예시적인 개념도로서, 도면의 좌측 하단에는 직접 콘쥬게이션을 나타내었으며 도면의 우측 하단에는 이기능성 제제를 사용한 간접 콘쥬게이션을 나타내었다.

도 3은 면역원성 구조체의 모델.

도 4는 덱스트란 10mg/㎖에서 덱스트란 단위 몰당 CDAP 몰수에 대하여 덱스트란에 도입된 NH₂기를 나타내는 그래프.

도 5는 S400SP 겔 여과 칼럼에서의³H-BSA-dextra 콘쥬게이트의 용출 특성을 나타내는 그래프.

도 6은 S400SP 겔 여과 칼럼에서 용출된 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 면역원성 구조체의 OD280 흡수 특성을 나타내는 그래프.

도 7은 S400SP 겔 여과 칼럼에서의 Hδ ^a/1-(CDAP)-덱스트란의 용출 특성을 나타내는 그래프.

도 8은 Hδ ^a/NH₂-(CDAP)-덱스트란을 충진한 S400SP 겔 여과 칼럼에서 용출된 칼럼 시료의 OD280 및 OD430의 값을 나타내는 그래프.

도 9는 본 발명의 제조 방법을 사용하여 제조된 면역원성 구조체의 면역활성을 나타내는 그래프.

도 10은 덱스트란 1.6mg/㎖에서 CDAP(CDAP/mg 덱스트란의 mg 수에 대한 NH₂/100kDa 덱스트란)와 헥산 디아민을 사용하여 덱스트란의 유도 결과를 나타내는 그래프.

도 11은 폴리사카라이드 농도에 대하여 CDAP 활성의 효율을 나타내는 그래프.

도 12는 CDAP 활성을 위한 다양한 CDAP:폴리사카라이드의 비에서 덱스트란에 대한 BSA의 직접 콘쥬게이션을 나타내는 그래프.

도 13은 단백질을 CDAP-활성 덱스트란에 첨가하는 시간에 대한 BSA/덱스트란 비를 나타내는 그래프.

도 14는 물에서의 CDAP의 안정성을 나타내는 그래프.

도 15는 CDAP-활성 폴리사카라이드에 대한 단백질 커플링의 거동특성(kinetics)을 나타내는 그래프.

도 16은 CDAP 활성에서 pH의 효과를 나타내는 그래프.

도 17은 pH 및 CDAP-활성 덱스트란에 대한 BSA의 커플링에서의 다양한 완충 용액의 효과를 나타내는 그래프

본 발명의 목적은 면역원성 구조체를 생산할 수 있는 유화한 방법을 제공하는 것이다. 다른 목적은 탄수화물과 단백질의 구조의 통합을 유지하고 이 화합물에 에피토프를 보전하는 면역원성 구조체를 제조하는 방법에 도달하는 것이다. 부가적인 목적은 실시용이하고, 실뢰성이 있고, 재현성이 높은 면역원성 구조체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 다양한 종류의 폴리사카라이드를 이용할 수 있는 면역원성 구조체를 형성하는 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 가용성 콘주게이션된 백신을 형성하기 위한 용이한 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 방법은 용이하게 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 상기한 목적 또는 다른 목적과 장점은 이하의 상세한 설명에서 분명하게 될 것이다.

안전하고, 용이하고, 염가이며, 유화한 탄수화물 활성화법을 이용하는 콘주게이션공정으로 상기한 목적을 달성하여, 본 발명은 면역원성 구조체를 생산하는 종래의 방법의 문제점 및 단점을 극복한다. 또한, 본 발명의 방법은 균일한 공정을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 탄수화물-함유한 성분을 활성화하기 위해서 유기 시아닐화제를 사용하는 것이 바람직하고, 특히 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디니움 테트라플루오로보레이트(CDAP)를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 방법을 이용하여, 폴리사카라이드와 단백질의 콘주게이션은 폴리사카라이드가 수정된 경우에만 제조될 수 있고, 단백질을 회수하는 것이 가능하다. 또한, 수용성 및/또는 표면활성제-가용성 성분의 콘주게이션은 본 발명에 따라서 이미 가능할 것이다.

하나의 바람직한 실시예에서, 본 발명은 활성화된 탄수화물-함유된 성분을 수용성 단백질과 같은 제2 성분에 직접 콘주게이션하는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서는 본 발명의 방법은 기능성(이기능성(二機能性) 또는 이성기능성(異性機能性) 시약을 활성화된 탄수화물 함유한 성분에 공유결합하는 것을 포함하고, T-의존성 항원과 같은 제2 성분과 기능성 성분을 반응하여 콘주게이션된 면역원성 구조체를 형성하는 것을 추가로 포함한다. 이때, 탄수화물-함유한 성분 및 TD 성분은 기능성 시약으로 형성된 링커 또는 스페이서로 결합된다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 면역원성 구조체는 1992년 2월 11일에 출원된미국특허 출원번호 07/834,067호 및 1993년 2월 10일 출원된 부분 계속출원 제08/055,163호와 관련되어 설명된 형태의 이중-담체 구조이다. 이러한 구조의 일례의 제1 케리어는Pneumococcal14형(Pn14) 및 DNA 중합체를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서는, 단백질과 같은 제2 성분에 활성화된 탄수화물-함유한 성분을 콘주게이션하여 낮은 pKa를 가진 친핵성을 형성하도록 유도 되는 단계를 포함한다. 이러한 유도의 일례인 친핵체는 하이드라진 및 티올을 포함한다.

본 발명은 다양한 종류의 가용성 탄수화물-함유한 성분에 바람직하게 적용할 수 있어, CDAP로 활성화한 후에 단백질에 직접 콘주게이션할 수 있거나, 또한 스페이서 또는 링커에 의해서 단백질과 간접 콘주게이션할 수 있다. 본 발명은 또한 종래의 방법으로 제조된 면역원성 구조체보다 높은 효율과 염가로 생산할 수 있도록 한다.

또한, CDAP 및 반응조건은 유화하므로, 탄수화물 구조의 붕해 및 천연발생적인 에피토프의 손상 우려가 크게 감소되었다. 또한, 이 방법은 시아노겐 브로마이드를 사용한 방법과 비교하여 아래의 표 1에 요약된 장점을 가진다.

표 1

CDAP를 사용하는 부가적인 장점은 미리 제조할 수 있고 수개월 동안 용액으로 저장할 수 있고, 활성 제제의 농도는 301nm의 흡광도에서 쉽게 결정될 수 있다.(Kohn et al., Anal. Biochem., 115:375(1981)). 이것은 시약농도의 표준화가 가능하게 되고 탄수화물 유도가 보다 재현성있도록 하여서 백신제조에서 이의 사용이 중요하게 된다.

본 발명의 다른 장점은 pH 제어로 탄수화물과 단백질의 결합을 선택적 또는 우선적으로 할 수 있다는 것이다. 단백질과 펩타이드에서 발견되는 일반적인 다수의 친핵체는 상대적으로 높은 pKa 값을 가지기 때문에, 낮은 pH에서 낮은 pKA 값을 가진 기를 선택적으로 다른 기의 존재시 활성화된 탄수화물에 콘주게이션할 수 있다. 낮은 pH에서 선택적인 결합하는 것은 많은 부가적인 장점을 가지고 있다. 활성화된 탄수화물은 낮은 pH에서 안정할 것이고, 가수분해가 잘되지 않는다. 또한, 낮은 pH에서, 탄수화물 하이드록시기는 낮은(상대적으로) 친핵성을 가지고, 사이클릭중간체, 시아네이트 에스테르와 크로스링킹하는 중간 또는 내부의 체인의 형성을 최소화한다. 적게 가수분해하고 작은 부반응을 하는 것은 전체 결합반응의 효율을 증가하고, 탄수화물의 활성을 위한 시약을 적게 요구하고, 수정이 적으므로, 항원성 및 면역원성이 증가된다.

또한, 단백질은 제한된 수의 낮은 pKa치를 가진 친핵성으로 용이하게 유도되므로 최소한 수정된다. 낮은 pH에서 유도된 단백질을 활성화된 탄수화물에 결합하는 것은 낮은 pH에서 유도된 단백질에 있는 소수의 반응기 덕분에 단백질-폴리사카라이드 결합수를 감소한다.

또한, 하이드라지드로 단백질을 유도하는 것은 하이드라진 중간체(즉, TNBS, 방사능 탐침 등등)의 특성화의 용이를 포함한 부가적인 장점을 가지고 있다. 항원성 및 면역원성이 수정된 정도뿐 아니라 결합 전에 활성화도를 미리 결정할 수 있게 하여, 보다 우수한 질의 제어와 유도의 적정화 기회를 부여한다. 또한, 결합 전후에 유리 하이드라진 수를 측정하므로서 단백질-폴리사카라이드 결합 수를 측정할 수 있다. 또한, 콘주게이션물의 결합이 가수분해되었다는 것을 의미하는 유리 하이드라지드의 수가 증가가 모니터링할 수 있으므로 품질 제어가 향상된다.

부가적인 장점은 카르복실기 또는 아민기의 선택적 수정을 포함한 하이드라진을 단백질에 도입하는 다수의 기지의 방법을 포함한다. 따라서, 이 방법은 특히 상대적으로 소수의 아민과 일반적으로 불량한 커플을 가진 톡소이드의 결합에 바람직할 것이다. 또한, 하이드라진과 시아네이트 에스테르의 반응 생성은 생리학적 pH에서 충전하지 않지만, 아민과 시아네이트 에스테르의 반응산물은 충전된다.

상기한 장점은 탄수화물에 단백질의 직접 콘주게이션과 스페이서를 통한 간접 콘주게이션에도 모두 적용할 수 있다는 것이다. 본 발명의 부가적인 목적과 장점은 이하의 상세한 설명과 도면에서 분명하게 될 것이다.

도 1은 유기 시아닐화제(이 제제는 일반적으로 식 R-CN 또는 {R⁺-CN}X^-로 나타낼 수 있으며, 여기에서 R은 유기 성분이며 X는 반대 이온이다)를 사용하여 탄수화물을 활성화시키는 일반적인 개념도를 나타낸다. 도 2는 활성화된 탄수화물이 단백질에 콘쥬게이션되는 것을 나타낸다.

여기에서 사용된 "면역원성 구조체"는 면역 반응을 자극할 수 있는 어떤 실체를 나타낸다. 이러한 면역원성 구조체는 최소한 하나의 제1 성분으로서 이루어지며, 이 성분은 제2 성분에 콘쥬게이팅된다. 여기에 사용된 "성분(moiety)"은 자체로써 또는 커플링되어서 면역 시스템을 자극하는데 사용될 수 있는 어떠한 물질이다.

이러한 성분으로서는 탄수화물, 폴리비닐 알코올, 단백질 및 당단백질과 같은 합성 폴리머, 펩티드, 기타의 항원, 보조 분자, 합텐, DNA 및 이들의 조합 및 유도체를 사용할 수 있다. 합텐은 화학물질, 더스트 및 알레르겐과 같은 작은 분자를 의미하며, 이들 자체로서는 항체 반응을 유발할 수 없지만, 이들이 캐리어 즉, TNP와 커플링되면 항체 반응을 유발할 수 있다. 항원은 적절한 상황에서 항체의 형성을 유발할 수 있는 분자이다. 이러한 합텐 및 항원은 박테리아, 리케치아(rickettsia), 균류(fungi), 바이러스, 기생생물(parasite), 약품(drug) 또는 화학물질로부터 생성될 수 있으나, 이들에만 제한되지 않는다. 이러한 것들로는 펩티드, 올리고당(즉,H. influenzae의 폴리리보실-리비톨-포스페이트 올리고머), DNA 올리고머, 리피드(lipid), 톡소이드(toxoid), 엔도톡신(endotoxin) 등과 같은 작은 분자를 예를 들 수 있다. 바람직한 성분으로서는 수용성이거나 계면활성제에 용해될 수 있는 것이다.

바람직한 실시예에 있어서는, 제1 성분은 탄수화물을 포함하는 성분이다. 여기에 사용된 "탄수화물"은 용해될 수 있는 일탄당, 이탄당, 올리고당 또는 폴리사카라이드를 의미한다. 제1 성분은 폴리사카라이드인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 수용성 폴리사카라이드인 것이 바람직하다. 바람직한 폴리사카라이드는 예시적인 백신을 열거한 하기한 차트에 나타내었다. 이러한 탄수화물-함유 성분은 천연적이거나, 반합성적이거나 또는 완전히 합성한 분자량이 큰 분자인 것이 바람직하다. 바람직한 실시예에 있어서, 최소한 하나의 탄수화물-함유 성분은E. coli폴리사카라이드,S. aureus폴리사카라이드, 덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로스, 아가로즈(agarose),Pneumococcal폴리사카라이드(Pn), 피콜(Ficoll),Cryptococcus neoformans, Haemophilus influenzaePRP,P. aeroginosa, S. pneumoniase, 지질폴리사카라이드, 그룹 A 및 B 스트렙토코쿠스,N. meningitidis, 및 이들의 조합이다.

아주 바람직한 실시예에 있어서, 상기한 탄수화물-함유 성분은 텍스트란이다. 여기에 사용된 "텍스트란"(덱스: dex)은 여러 가지 소스(즉, 제약품)로부터 얻어질 수 있는 하나의 당으로 구성되는 폴리사카라이드를 의미한다. 기타의 바람직한 탄수화물-함유 성분은 비활성이며, 반합성이고, 비이온성이며, 분자량이 큰 고분자인 Ficoll이 사용될 수 있다.

이러한 탄수화물-함유 성분은 유기 시아닐화제를 사용하여 활성화된다. 바람직한 유기 시아닐화제는 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디움 테트라플루오로보레이트(CDAP), N-시아노트리에틸암모니움 테트라플루오로보레이트(CTEA), 및 p-니트로페닐시아네이트(pNPC). 이러한 제제들 중에서 CDAP가 가장 바람직하다. 시아네이트 기를 가지거나, 다양한 반대 이온을 선택적으로 가지는 기타의 유기 컴플렉스도 사용될 수 있다. 특별히 바람직한 유기 시아닐화제는 테트라플루오로보레이트와 같은 비친핵성 반대 이온을 가진 것들이다.

유기 시아닐화제를 사용한 활성화 후에, 제1 성분은 제2 성분에 콘쥬게이션된다. 제2 성분은 바이러스, 박테리아, 기생충, 동물 및 균류의 단백질에서 선택되는 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 특별히 바람직한 제2 성분은 지질 단백질, 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA), 파상풍 톡소이드(TT), 백일해 톡소이드(PT), 디프테리아 톡소이드(DT), 열 쇼크 단백질, T-세포 슈퍼항원(T-cell superantigen) 및 박테리아성 외부-멤버레인 단백질(bacterial outer-membrane protein)이며, 이들 모두는 생화학 회사, 제약 회사로부터 공급받을 수 있으며 또는 표준 방법에 따라 제조될 수 있다(J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.),Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunlogy, vol . 10 (1989) 본 명세서에서 참조로 사용됨). 기타의 적당한 단백질은 본 분야에서 통상적으로 알려진 것에서 선택될 수 있다.

제2 성분으로서 사용할 수 있는 기타의 바람직한 실시예는 알부민, 톡소이드, 펩티드, T-세포 또는 B-세포 애쥬번트(adjuvant), 또는 기타의 T-세포의 도움을 활성화하거나 가입할(recruiting) 수 있는 화합물이다. 이러한 제2 성분은 도 3에 나타낸 것과 같이 T-독립 항원이될 수 있다.

본 발명의 제2 성분은 최소한 하나의 탄수화물-함유 성분에 콘쥬게이션될 수 있다. 제2 성분은 탄수화물-함유 성분과 반응할 수 있거나 탄수화물-함유 성분과 반응하도록 화학적으로 조작될 수 있는 작용기를 포함할 수 있다.

본 발명의 특별히 바람직한 실시예에 있어서, 제2 성분은 선별적인 커플링을 위하여 충분히 낮은 pKa를 가지는 친핵체(nucleophile)를 형성하도록 유도된다. 여기에서 사용된 "충분히 낮은 pKa"의 의미는 단백질 또는 펩티드에서 친핵체의 pKa가 다른 반응기의 pKa보다 충분히 낮음을 뜻하며, 커플링을 위하여 선택된 pH에서 반응할 경우, 친핵체는 프로톤화되지 않지만 기타의 반응기는 프로톤화된다. 달리 표현하면, 친핵체가 선택되어서 단백질 또는 펩티드에서 기타의 기가 거의 반응하지 않는(즉, 상당히 프로톤화되는) 특별한 pH에서 반응하는(즉, 프로톤화되지 않는) 것이다.

커플링을 위하여 적당한 pH는 여러 가지 인자들 중에서도 사용되는 특별한 친핵체에 의하여 정해진다. 선택되는 pH는 약 8 이하인 것이 바람직하다. 적당한 친핵체로서는 히드라지드(hydrazide) 및 티올(thiol)이 있다.

특별히 바람직한 실시예에 있어서, 단백질 또는 펩티드의 작용기는 히드라지드를 형성하도록 유도된다. 히드라지드는 종래의 알려진 방법에 따라서 단백질 또는 펩티드에 첨가될 수 있다.

예를 들어, 폴리펩티드상의 하나 이상의 카르복실기는 아디픽 히드라지드와같은 높은 농도의 비스 히드라지드의 존재하에서 EDAC와 같은 카르보디이미드(carbodiimide)에 의하여 활성화된다. 메틸이미다졸 및/또는 NHS를 첨가하면 부반응을 억제할 수 있다. 유도의 정도는 폴리펩티드에 대한 카르보디이미드의 몰비로서 조절할 수 있다.

이와 유사하게, 단백질상의 아민은 Traut 제제, SPDP 또는 SATA(비보호(deprotection)에 뒤따름)를 사용하여 티올화될 수 있으며, EMCH(티올 활성 말레이미드 및 히드라지드를 포함하는 이기능성 물질)와 같은 이성기능성(heretobifunctional) 제제와 반응한다. 유도의 정도는 최초의 티올화에 의하여 조절된다. 다른 방법으로서 단백질은 표준 헤테로화 기술을 사용한 후 티올 히드라지드와 반응시킨 티올 반응기(말레이미드 또는 요오도아세틸과 같은 전자친화도가 높은 제제)로 유도할 수 있다. 또한, 아민은 유사 히드록시기를 포함하는 다양한 제제와 반응할 수 있다. 제조된 제품은 소디움 퍼요오데이트(sodium periodate)로 쪼개어진 후 비스 히드라지드와 반응한다.

항체와 같은 글리코실화된 단백질은 pH 5에서 소디움 퍼요오데이트와 같은 적당한 제제를 사용하여 산화시킬 수 있다. 산화된 제품은 비스 히드라지드와 반응하여 본 발명에서 사용되는 바람직한 유도체를 형성한다.

히드라지드 및 티올과 같은 친핵체는 합성과정에서 단백질, 펩티드, 올리고 뉴클레오티드 및 많은 약품에 도입될 수 있다. 히드라지드는 시스테인 잔여물(cysteine residue)을 원하는 부분에 위치시킨 즉시 EMCH와 반응시켜 첨가할 수 있다. 이와 유사하게 히드라지드는 알파-할로 케톤기를 원하는 위치에 포함하는펩티드를 첫 번째로 합성하여 첨가할 수 있다. 그후 이러한 기는 티올 히드라지드와 반응시켜 히드라지드로 전환시킬 수 있다. Ivanov 등,Bioconjugate Chemistry, 6, 269 (1995) 참조.

활성화 이후에 제1 성분은 제2 성분에 콘쥬게이션된다. 많은 종류의 제2 성분뿐만 아니라 특정한 제2 성분의 많은 유사체가 탄수화물-함유 성분에 콘쥬게이션될 수 있다. 다수개의 제2 성분 유사체가 제1 성분에 커플링되면 제2 성분에 대한 항체의 형성을 상당히 증가시킨다.

본 발명의 방법을 사용하면 면역원성 구조체의 물리 및 화학적 특성을 유리하게 조절할 수 있다. 본 발명에 의하면, 본 분야의 기술자는, 제1 성분 및 제2 성분의 양을 유리하게 변경할 수 있고(양이온화된 단백질이 보다 면역원성이라는 관점에 따른 장점), 탄수화물-함유 성분의 크기를 변경함으로써 구조체의 크기를 유리하게 조절할 수 있으며, 내외간 체인 구조체의 크로스링킹 정도를 유리하게 선택할 수 있고(크기 및 삼차원 매트릭스의 다양성을 얻기 위하여), 탄수화물-함유 성분에 콘쥬게이션되는 제2 성분 유사체의 수를 유리하게 조절할 수 있으며, 그리고 선택된 세포의 수를 유리하게 표적화할 수 있다(항원의 존재를 강화하기 위한 마크로파지와 같이). Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,"Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), vol. 10, 14-114 (1989) 참조.

본 발명의 구조체에 대한 면역 반응은 면역조절인자 및/또는 세포-표적 성분의 첨가에 의하여 더욱 강화될 수 있다. 예를 들면, 이러한 것들로서 (1) 해독된지질폴리사카라이드 또는 유도체, (2) 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide) (3) 구조체를 면역원성으로 적당한 세포로 타겟화하는 세포 표면 결정인자(cell surface determinant)와 상호 작용할 수 있는 카르보하이드레이트, 리피드 및 펩티드 (4)인터루킨(interleukin) (5) 항체 및 (6) DNA 올리고머 등이다.

그러므로, 사용 가능한 다른 실시예에 있어서, 제3 성분은 여기에서 기술된 CDAP 활성화 또는 기타의 방법을 사용하여 하나 이상의 제1 및/또는 제2 성분에 콘쥬게이션될 수 있다. 미합중국 특허출원번호 제07/834,067호 및 08/055,163호는 제3 성분에 대한 향상된 항체 반응을 촉진하는 콘쥬게이션을 개시한다. 여러 가지 성분을 제1 또는 제2 성분에 콘쥬게이션하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있는데, 즉 사용 가능한 작용기(아미노, 카르복실, 티오 및 알데히드기)를 통하여 커플링을 유도하는 방법 등이다. 본 발명에서 참조로 사용된 S.S. Wong,Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press(1991), 및 Brenkeley 등, "Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-Linking Agents,"Bioconjugate Chemistry, 3:1 (Jan. 1992) 참조. 그러므로, 단기능성 제제는 제3 성분으로 사용될 수 있는데, 즉 양을 변경하고, 소수성(hydrophobicity)을 변경하며, 구조체를 특정화시킨다.

본 발명의 방법에 있어서, 탄수화물-함유 성분은 유기 시아닐화제를 사용하여 활성화된다. 유기 시아닐화제는 CDAP가 바람직한데, 이는 탄수화물-함유 성분과 반응할 때 시아네이트의 전자친화도를 증가시키며, 시아노기를 탄수화물의 히드록실기로 이동시켜 추가적인 반응 즉, 단백질에 직접 및 간접 콘쥬게이션이 일어나게한다. 활성화 반응은 중성 pH 또는 부드러운 기본 상태(즉, 약 8 내지 약 10의 pH)에서 수행될 수 있으며, 이는 폴리사카라이드 및 활성 중간체의 안정성 및 완전성을 향상시킨다.

CDAP는 매우 안정적이며 상대적으로 안전하므로 유리하다. CDAP는 시아노기의 전자친화도가 증가하면 시안화 반응이 부드러운 조건에서도 이루어질 수 있는 수용성 유기 시아닐화제이다. 게다가, CDAP는 매우 다양한 폴리사카라이드를 활성화시키는데 사용할 수 있으며, 이것은 디아민 또는 디히드라지드로 작용될 수 있다. CDAP 시안화 반응의 높은 활성화 및 부드러운 조건은 단지 한 번의 반응(one-pot reaction)으로 단백질을 폴리사카라이드에 직접 콘쥬게이션할 수 있게 하며, 이로 인하여 스페이서 분자(spacer molecule)가 없어도 폴리사카라이드 및 단백질 성분에 항체 반응을 유도하는 콘쥬게이트 백신의 제조를 간단화한다. CDAP 사용의 간단함은 다양한 조건에서 단백질-폴리사카라이드 콘쥬게이트 백신의 제조를 촉진하여, 콘쥬게이트 백신의 면역유전학에서의 중요한 변수의 연구를 가능하게 한다. 게다가, CDAP-활성 폴리사카라이드는 다양한 기타의 유용한 면역원성 제제, 즉 바이오틴화 폴리사카라이드 및 Hδ ^a/1과 같은 항체와 연결된 덱스트란의 제조에 사용될 수 있다.

활성화는 pH 약 6 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 9 내지 약 10에서 수행된다. pH는 제조되는 특별한 구조체에 적합하도록 다양한 방법(즉, 버퍼의 사용, NaOH의 첨가 등)을 통하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 활성화는 종래에는 알려지지 않은 여러 종류의 적당한 하나 이상의 비친핵성 버퍼를 사용하여 다양한 용매의 존재하에서 수행될 수 있다. 적당한 용매에는 식염수(saline), 물 및 일부의 유기 용매가 포함된다. 비친핵성 버퍼의 예로서는 트리에틸 아민(TEA), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진-에탄 술포닉산(HEPES), 포스페이트, 카르보네이트 및 보레이트이다. 트리에틸 아민(TEA)이 버퍼로서 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, CDAP는 건조 아세토니트릴 또는 최대 75mg/㎖의 물에 100mg/㎖의 농도로 스톡 용액(stock solution)에 용해된다. 사용되는 탄수화물-함유 성분의 특성과 요구되는 활성화의 정도에 따라 CDAP의 양을 다양하게 선택할 수 있다.

바람직한 실시예에 있어서, 탄수화물-함유 성분의 농도는 1 내지 20mg/㎖, 보다 바람직하게는 1 내지 15mg/㎖이다. 이러한 활성화 반응은 최대 약 100mg/㎖의 탄수화물-함유 성분의 농도로 성공적으로 수행될 수 있다.

바람직하게는, 단백질을 직접 콘쥬게이션하기 위한 탄수화물-함유 성분에 대한 CDAP의 비는 탄수화물-함유 성분 100kDa당 CDAP 약 100:1 내지 약 500:1몰이다. 다른 하나의 바람직한 실시예에 있어서, 단백질을 스페이서를 사용하여 간접 콘쥬게이션하기 위한 탄수화물-함유 성분에 대한 CDAP의 비는 탄수화물-함유 성분 100kDa당 CDAP 약 10:1 내지 약 500:1몰이다. 성분들의 특성 및 사용되는 조건에 따라 상이한 성분비가 선택될 수 있다.

반응하지 않은 CDAP 및 디메틸아미노피리딘과 같은 반응 부산물은 적당한 정제 기술, 바람직하게는 산조건하에서 투석, 한외여과 또는 SM4 비드(BioRad)와 같은 적당한 생처리 비드(bioprocessing bead)로 흡수하는 방법을 사용하여 단백질을 유도 또는 커플링 하기 전에 제거될 수 있다. 또한, 정제되고 활성화된 폴리사카라이드는 침전 즉, 차가운 에탄올을 사용하여 제조될 수 있다.

바람직한 실시예에 있어서, CDAP를 사용하여 활성화된 탄수화물-함유 성분은 면역원성 구조체를 제조하기 위하여 제2 성분에 직접 콘쥬게이션된다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에 있어서, 활성화된 탄수화물-함유 성분은 적당한 이기능성 또는 이성기능성 제제와 공유적으로 결합한다. 이러한 작용 제제의 예로서는 에틸렌 디아민, 1,6-헥산 디아민, 아디픽 디히드라지드, 시스타민, 리진, 글루타민산, 티올 히드라지드, 및 필요에 따라서 적당히 보호된 티올 아민이 포함된다. Wong 등, "Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking,"CRC Press(1991) 참조. 그 후 제2 성분은 이미 말단기가 탄수화물-함유 성분과 공유적으로 결합된 작용 제제와 공유적으로 결합한다.

커플링 반응을 위한 바람직한 pH의 범위는 약 7 내지 약 9이며, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 8.5이다. 덱스트란과 같은 폴리사카라이드를 콘쥬게이션하기 위하여, pH는 약 7.4 내지 약 8인 것이 바람직하다. 제2 성분이 히드라지드와 같은 친핵체를 형성하기 위하여 유도될 경우, 커플링 반응을 위한 pH는 약 8 이하인 것이 바람직하며, 약 7 이하인 것이 보다 바람직하다.

바람직한 일 실시예에 있어서, 폴리사카라이드는 CDAP를 사용하여 약 1:1 내지 약 3:1 즉, 1:1의 비로 단백질에 콘쥬게이트된다. 최적화된 결과를 위하여 높은 폴리사카라이드의 농도는 피해야 한다. 바람직한 구조체는Pseumococcal폴리사카라이드에 콘쥬게이트된 파상풍 및Haemophilus influenzaePRP에 콘쥬게이트된 파상풍 구조체이다. 본 발명에 따라서 제조되는 다른 바람직한 콘쥬게이트로서는 TT-PRP, Pn14-TT, Pn23-TT, 말라리아-유도 펩티드-Pn14, DT-Pn14, Pn6-TT, Pn19-TT, 및 펩티드-TT-Pn을 포함할 수 있다.

바람직한 실시예에 있어서, 트리에틸아민(TEA)은 시안화 반응을 촉진하는데 사용되며, 이것은 중간체 Von Braun 컴플렉스의 형성을 통하여 진행된다 TEA는 Von Braun 컴플렉스를 형성할 수 있는 다른 삼차 아민에 의하여 대체될 수 있다. J. Von Braun,Chem. Ber.,33:1438 (1900).

어떤 콘쥬게이션 반응을 위하여, 글리신, 아미노 에탄올 또는 기타의 아미노-포함 제제가 반응을 중지하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 중지 제제는 콘쥬게이트의 순수 포함량(net charge)을 변경하기 위한 하나의 방법으로도 사용될 수 있다.

또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 매개체 또는 전달 비히클(delivery vehicle)과 함께 면역원성 구조체로 제조되는 백신에 관한 것이다. 이러한 백신은 환자에 투여되어 치료할 수 있을 만큼의 적당한 양의 비히클과 함께 치료적으로 적당한 양의 면역원성 구조체를 포함할 것이다. 이러한 백신은 명반(alum) 또는 기타의 애쥬번트를 포함할 수 있다.

제약학적으로 허용 가능한 매개체 도는 비히클이 예로서는 물 및 오일과 같은 스테릴 액체(sterile liquid), 여기에는 땅콩유, 대두유, 광물유, 참깨유 등과 같은 광물성, 동물성, 식물성 및 합성 오일이 포함된다. 식염수는 제약학적 조성물이 정맥내로 투여될 경우 가장 적합하게 사용되는 비히클이다. 수용성 덱스트로즈(dextrose) 및 글리세롤 용액도 특별하게 주사 용액으로 사용될 경우 액체 비히클로 사용될 수 있다. 적당한 제약학적 비히클은 E.W. Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences에 개시되어 있으며, 여기에 특별히 인용 참증으로 사용되었다.

본 발명에 따라서 제조될 수 있는 백신을 하기한 차트에 나타내었으나, 이러한 예에만 한정되지는 않는다.

차트

디프테리아 백신

백일해(아단위) 백신

파상풍 백신

H. influenzaeb형(폴리리보스(polyribose) 포스페이트)

S. pneuminiae, 모든 혈청형

E. coli, 엔도톡신 또는 J5 항원(LPS, 리피드 A, 및 Gentabiose)

E. coli, O 폴리사카라이드(혈청 특이성)

클렙시엘라(Klebsiella), 폴리사카라이드(혈청 특이성)

S. aureus, 5 및 8형(혈청 특이성 및 보통의 보호 항원)

S. epidermidis, 혈청 폴리사카라이드 I, II, 및 III(및 보통의 보호 항원)

N. meningitidis, 혈청 특이성 또는 단백질 항원

소아마비 백신

유행성 이하선염, 홍역, 풍진 백신

호흡성 합포체 바이러스

광견병

A, B, C, 및 기타의 간염

인간 면역결핍 바이러스 I 및 II(GP120, GP41, GP160, p24, 기타)

단순 포진 1 및 2

CMV(cytomegalo 바이러스)

EBV(Epstein-Barr 바이러스)

수두/Zoster

말라리아

결핵

Candida albicans, 기타의 칸디다

주폐포자층(pneumocystis carinii)

미코플라즈마

인플루엔자 바이러스 A 및 B

아데노바이러스(adenovirus)

Group A 연쇄구균

Group B 연쇄구균, 혈청, Ia, Ib, II 및 III

Pseudomonas aeroginosa(혈청 특이성)

라이노바이러스(rhinovirus)

Parainfluenzae, 1, 2 및 3형

코로나바이러스(coronaviruses)

살모넬라(salmonella)

시겔라(shigella)

로타바이러스(rotavirus)

엔테로바이러스(enteroviruses)

트라코마 클라미디아 및 폐렴(TWAR)

Cryptococcus neoformans

또한, 본 발명은 면역적으로 자극 가능할 만큼의 양(immunostimulatory amount)의 백신을 투여하여 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. "환자"는 이러한 치료 방법에 의하여 혜택을 보는 닭과 같은 동물뿐만 아니라 포유류, 특히 인간, 말, 소, 개 및 고양이를 의미한다. "면역적으로 자극 가능할 만큼의 양"이란 환자의 면역 반응을 자극하여 질병을 예방, 회복 또는 개선할 수 있는 만큼의 백신의 양을 의미한다. 본 발명의 백신은 적당한 경로를 통하여 투여될 수 있지만 정맥내 주사, 근육내 주사, 비강내 주사 또는 피하 주사의 형태로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명은 박테리아, 바이러스, 기생충, 균류, 또는 화학 물질에 의해 유발되는 감염을 치료하기 위해 환자를 바람직한 백신으로 면역시켜 백신에 대한 항체를 생성시켜 환자를 치료하기 위한 면역치료적 약품의 제조 방법에 관한 것이다. 항체가 동정될 수도 있고 또는 모노클로날 항체를 형성하기 위한 골수종 세포와 융합하기 위하여 B 세포가 얻어질 수도 있다. 모노클로날 항체의 제조는 당해 분야에서 일반적으로 알려져 있다(Kohler 등,Nature, 256:495 (1975), 본 명세서에서 특별히 인용함). 여기에서 사용된 "면역치료적 약품"은 환자를 수동적으로 치료하기 위하여 사용되는 특정한 면역원에 대한 항체 조성물을 의미한다. 플라스마 도우너(plasma donor)는 백신과 함께 투여되어 백신에 포함된 면역원에 대한 항체를 생성하는 물질이다.

실시예 1

스페이서를 갖는 성분을 포함하는 탄수화물의 유도

물질:

CDAP, 피리딘, 헥산디아민, 소디움보레이트, HEPES 및 트리에틸아민(triethylamine: TEA)을 알드리히사(Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)로부터 구입하였다. 2000kDa의 평균 분자량을 갖는 탄수화물-함유 성분, T2000 덱스트란은 파마시아(Pharmacia, Piscataway, New Jersey)로부터 구입하였다.

100mg/㎖의 CDAP 건조 아세토니트릴 스톡용액은 -20℃에 저장하고 사용할 때에는 얼음 위에 두었다. T2000 덱스트란은 식염수와 0.02%의 아지드에서 10.5mg/㎖의 농도로 제조하였다. 트리에틸아민 스톡 수용액은 0.2M의 농도로 제조하였으며, 사용할 때에는 얼음 위에 두었다.

헥산디아민은 0.1M의 소디움보레이트내에서 0.5M의 농도로 제조하였다.

아미노기는 트리니트로벤젠 설포네이트(trinitrobenzene sulfonate: TNBS)를사용하여 결정하였으며, 흡광계수는 366nm에서 11,000m^-1이었다(Franci et al.,J. Imm. Methods.,86:155 (1986)). 탄수화물은 몬시그니 등(M. Monsigny et al.Anal. Chem.,175:525 (1988))의 방법에 의하여 표준물질로 T2000 덱스트란을 이용하여 분석하였다.

조절 반응:

하기한 실험들은 본 발명의 유도 반응에 사용된 성분의 중요성을 논증한다. 그 결과는 최종 컨쥬게이트내의 아미노기가 탄수화물에 공유결합되어 있으며, 그들의 존재가 최종 생성물로 가는 제제의 인공물 또는 "중간물(carryover)"로 인한 것이 아니라는 것을 보여준다.

반응은 얼음 위에서 실시하였다. 시험실시를 위하여 제제를 생략하거나 치환하는 것은 표 2에 나타내었다.

모든 제제를 사용하는 과정에서(표 2의 1째줄), CDAP를 볼텍스시킨 덱스트린 용액 300㎕(3.1mg)에 첨가하고, 얼음통으로 회수하였다. 30초 후에, TEA를 볼텍스시킨 상기 용액에 첨가하였다. CDAP를 첨가한 후 2분 후에 디아민 200㎕를 첨가하고, 상기 용액을 얼음 위에서 1시간 더 방치하였다. 시료는 하룻밤동안 투석시키고 밀렉스 지브이 필터(Millex GV filter)로 여과시키고, 1×15cm의 P6DG 칼럼(BioRad)으로 탈염하였다.

하기의 표 2에서 나타낸 바와 같이, 아미노기를 덱스트란, CDAP, TEA 및 헥산디아민의 존재하에서 덱스트란으로 최적으로 투입하였다. 표 2의 데이터는 아미노기가 최종 생성물로 가는 컨쥬게이션되지 않은 제제의 중간물로 인한 것이 아니라는 것을 보여준다. 이들 결과가 TEA가 유도를 위하여 필요한 것은 아니라는 것을 보여준다고 할지라도, TEA가 존재하지 않을 때에 (다중에 다루겠지만, 아마도 낮은 pH로 인하여) 유도를 덜 일으킨다는 것을 보여준다.

헥산 1,6-디아민에 의한 T2000 덱스트란의 유도:

이 실험은 CDAP가 아미노기를 양쪽에 고/저비율로 도입하여 탄수화물을 유도시키기 위하여 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 텍스트란 T2000은 탄수화물 모델로 사용되었다. 덱스트란은 글루코스 모노머로 제조된 폴리머이다.

많은 컨쥬게이트 백신의 제조에서 첫 번째 단계는 스페이서의 첨가이다(Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,"Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48-114 (1989)). 이 일련의 실험은 표 3에 정리하였으며, 이 표는 폴리사카라이드에 첨가할 수 있는 스페이서의 용이성을 강조하였다.

이 실험은 두 온도에서 실시하였다. 표 3의 1∼7째줄 및 11째줄에 기재되어있는 실험에서 사용한 모든 제제는 냉각된 것이며, 8∼10째줄에 기재되어 있는 실험에서 사용한 것은 상온의 것이다. 과정 및 제제는 상기 표 2의 실험에 기재되어 있는 것을 사용하였으며, 제제량은 표 3에 기재되어 있는 대로 첨가하였다. 11째줄의 실험에서 디아민은 0.15M의 HEPAS에 첨가하였다. 반응은 보다 낮은 pH에서는 약간 덜 효율적이었다. 또 다른 양태에서는, 헥산디아민을 0.1M의 보레이트, pH 9에서 제조하였다.

효율은 사용한 CDAP의 몰당 투입된 스페이서기의 몰수로 정의되어 퍼센트로 나타낸다. 마지막 칼럼(유도된 %)은 스페이서로 변형된 덱스트란의 글루코스 모노머 유니트의 퍼센트이다.

그 결과는 표 4에 나타내었으며, 이것은 투입된 아미노기의 총수(곧, 첨가한 스페이서 제제) 대 덱스트란 유니트의 몰당 첨가된 CDAP의 몰수를 나타낸다. 이 데이터가 투입된 NH₂대 CDAP 몰/덱스트란 몰의 값으로 변환될 때, 이것은 1보다 작은 CDAP:글루코스 비가 높은 수준의 NH₂투입에 대하여 효율적이라는 것이 명백해진다. 그리하여, 덱스트란 폴리사카라이드의 최소의 변형은 높은 NH₂-기 투입을 위해 필요하다.

더욱이, 활성 시아네이트 에스테르의 미정의 양이 스페이서를 첨가하지 않고 가수분해되기 때문에, CDAP/글루코스의 비는 상기 폴리머의 변형도를 지나치게 어림친 값이다. 그리하여, 실제 변형도는 CDAP/글루코스 비의 계산치보다 작다.

최소 테스트 제제량에서의 스페이서기의 투입도(1째줄)인 3.1%는 컨쥬게이트백신의 합성에 사용된 것과 비교할만하다(Chu et al.,Inf. & Imn.,40:245(1983): Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,"Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48-114(1989)).

표와 도면은 CDAP와 첨가한 스페이서 제제와의 반응의 고효율을 보여준다. 더욱이 반응 조건의 최적화는 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, CDAP를 사용함으로써 가능해진 스페이서기의 폴리사카라이드로의 매우 높은 수준의 투입에 대해서도 나타나있다. 첨가한 CDAP의 최고의 양(7째줄)에서 글루코스 유니트의 약 1/5이 스페이서로 인하여 변형되었다(20%). 시아노겐 브로마이드로 인한 스페이서의 이 투입도를 얻은 것은 가능하지 않다(Kagedal & Akerstrom,Acta Chemica Scan.,25:1855 (1971)).

반응이 진행되는 동안, 상기 덱스트란 폴리사카라이드의 확실한 침전은 일어나지 않았다. 반대로, 상기 폴리사카라이드의 응집 및 침전은 시아노겐 브로마이드법과 문제를 일으킬 수 있다(Kagedal & Akerstrom,Acta Chemica Scan.,25:1855(1971)).

이들 반응은 적은 부피(<1㎖)로 실시되었으며, 그리하여 많은 실험이 간편하게 진행되었다. 이것은 중요한 탄수화물 및 단백질을 낭비하지 않고 과정을 최적화할 때 중요한 점이다. 그리하여 적은 부피의 제제로 실시되어 다른 정보를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 당업자가 상업적인 용도를 위한 모든 스케일로서 대량으로 본 발명을 용이하게 실시할 수 있다. 이와 반대로, 시아노겐 브로마이드의 매우 적은양을 가지고 간편하게 실시하는 것은 어려운데, 이것은 시아노겐 브로마이드의 낮은 수용성, 불확실한 효능 및 독성 때문이다.

더욱이, 표 3의 8∼10째줄과 1∼7 및 11째줄을 비교하여 볼 때, 아미노기의 덱스트란으로의 투입도는 커플링 반응이 0℃ 또는 상온에서 실시될 때 거의 동일한 것으로 보인다.

CDAP를 이용한 컨쥬게이션 반응의 효율의 논증 및 방사성 물질이 라벨된 단백질을 이용한 컨쥬게이션의 입증

CDAP를 이용한 컨쥬게이션 반응은 단백질 농도를 측정하기 위해서 일반적으로 사용된 파장인 280nm에서 약간의 흡광을 일으키기 때문에, 방사성 물질이 라벨된(radiolabeled) 단백질은 덱스트란에 직접 컨쥬게이션되어 있다. 이것은 단백질의 농도 결정이 그 특이활성도로부터 독립적이라는 것을 보여준다. 단백질의 수율 및 회수율이 결정되었다.

BSA는 브룬스윅에 의하여 기재되어 있는 것과 같이 N-하이드록시석신이미드(³H-2,3)-프로피오네이트(Amersham)로 약간 방사성 물질이 라벨되어 있다(Brunswick et al.,Journal of Immunol.,140:3364 (1988)). 방사성 물질이 라벨된 BSA는 PBS+0.02%의 아지드로 완전히 투석하고, S100HR 칼럼(Pharmacia)위에서 겔여과 크로마토그래피를 실시하여 응집체를 제거하고, YM30 필터(Amicon)를 사용하여 한외여과(ultrafiltratioon)를 실시하여 농축하였다. BSA의 농도는 21mg/㎖이었으며, 이 값은 280nm에서의 흡광계수(44,000M^-1)로부터 결정되었다. 액체섬광계수법(liquid scintillation counting)에 의하여 결정된 스톡용액의 특이활성도는 5.48×10¹²cpm/mole이었다.

다른 제제들은 다음과 같다: T2000 덱스트란(약 2000kDa, Pharmacia)은 물에서 10.5mg/㎖의 농도로 용해시켰다. CDAP는 건조 아세토니트릴에서 100mg/㎖의 농도로 제조하였으며, 트리에탄올아민(TEA)은 물에서 0.2M로 준비하였다. 글리신(pH 5.0)은 물에서 1M로 제조하였다.

프로토콜: 제제는 얼음 위에 방치되었으며, 모든 반응은 얼음 위에서 진행되었다. 반응 혼합물은 첨가할 때마다 볼텍스시켰다. CDAP의 25㎕을 덱스트란 0.5㎖(5.25mg)에 첨가하였고, 30초 후에 25㎕의 TEA를 첨가하였다. 총 2.5분 후에 5.25mg의 방사성 물질이 라벨된 BSA를 첨가하였다. 30분 후에, 글리신 용액 100㎕을 첨가하여 반응을 중지(quench)시키고, 4℃에서 하룻밤동안 방치하였다. 그 중 0.6㎖ 수적을 스핀-엑스 멤브레인(Spin-X membrane, COSTAR)을 이용하여 여과하였다. 여과 전후의 시료의 방사능을 비교한 것은 여과액에서 방사능 100%가 본질적으로 회복되었다는 것을 보여준다. 여과액의 500㎕를 식염수와 0.02% 아지드로 평형화를 이룬 1×57cm S400SF 젤여과컬럼(Pharmacia)에 적용시키고, 0.2㎖/분의 속도로 용출시켰다. 0.89㎖의 분획들을 모으고 분석하였다. 몬시그니법(Monsigny et al.)에 의하여 480nm에서의 흡광도를 이용하여 덱스트란 농도를 결정하였다. 각각의 튜브로부터 얻은 50-㎕ 수적의 방사능을 액체섬광법에 의하여 결정하고,³H-BSA 농도를 그 특정활성을 이용하여 계산하였다. 칼럼 용출액에서 컨쥬게이션되지 않은BSA의 위치는 독립적인 칼럼 용출로 결정하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, cpm으로 표시된 BSA의 많은 부분은 OD480으로 표시된 덱스트란과 동일한 위치에 나타나는 고분자량의 형태이다. 컨쥬게이션되지 않은 단백질을 나타내는 적은 여분의 BSA 피크가 나타난다. 표 4는 정제 데이터이다.

칼럼은 덱스트란-BSA 컨쥬게이트를 컨쥬게이션되지 않은 단백질로부터 깨끗하게 분리하지 못한다. 이것은 고분자량의 폴리머가 흔히 젤여과컬럼에서 테일링(tailing)을 일으키기 때문에 이례적인 것이 아니다. 더욱이, T2000 덱스트란은 분획화되지 않았기 때문에, 크기별 스펙트럼을 가지고 있다. 자유 및 결합된 BSA가 오버랩되는 범위에서 컨쥬게이션된 BSA의 양을 측정하기 위하여, 덱스트란에 결합된 BSA의 일정비가 예상된다. 컨쥬게이션된 총 BSA, 상기 BSA에 곱한 값:덱스트란비×덱스트란의 총 몰은 2,55mg으로 결정되었다. 이것은 상기 단백질의 87%가 컨쥬게이트 형태로 전환되었다는 것을 의미한다.

이 BSA-덱스트란 실험의 결과는 표 5(1째줄)에 나타내었으며, 다른 양의 CDAP 및 TEA를 사용한 실험도 나타내었다(2∼4째줄). TEA 및 CDAP의 양 모두 직접적인 컨쥬게이션을 거쳐 높은 폴리사카라이드에 대한 단백질의 비를 가지도록 한다. 그 방법은 적은 양으로 간편하게 실험하는 것이 가능하므로 제제의 최적의 양을 용이하게 결정할 수 있다.

직접적인 컨쥬게이션 반응은 카보디이미드(carbodiimide) 또는 헤테로리게이션 커플링법(heteroligation coupling method)과는 달리 상기 컨쥬게이션된 단백질을 변형하지 않으며, 엄격한 조건을 사용하지도 않는다. 그리하여 컨쥬게이션되지 않은 단백질을 이후에 사용하기 위하여 회수할 수 있다. 많은 단백질 항원이 중요하기 때문에, 이것은 직접적인 컨쥬게이션법의 주요한 장점이다.

실시예 2A

PT-Pn14 컨쥬게이트의 제조

본 실험의 목적은 (1) 저분자량 형태에서 고분자량 형태로의 변환은 단백질이 탄수화물에 직접 컨쥬게이트한 결과임을 입증하기 위한 것과, (2) 어느 특정 조건하에서 단백질의 컨쥬게이션에 필요한 시아닐화제의 최소량을 결정하는 것과, (3) 본 발명에 의한 방법을 사용하여 임상적으로 적절한 컨쥬게이트가 만들어 질 수 있다는 것을 입증하기 위한 것이다.

백일해 톡소이드(PT: pertussis toxoid)(from Mass Public Health Biol. Labs, Boston, MA)를 0.5몰의 염화나트륨, 0.02몰의 인산나트륨, pH 8.8에 0.289mg/ml의 농도로 용해시켰다. 0.1몰의 소디움보레이트, pH 9.1 또는 0.75몰의 HEPES, pH 7.5를 PT 1ml당 0.1ml 가하였다.Pheumococcal-14형(Pn14)(ATTC lot 83909)를 0.02% 아자이드와 함께 0.15몰의 식염수에 5mg/ml 농도로 용해시켰다. 트리에틸아민(TEA)을 0.2몰의 농도로 물에 녹였다. CDAP를 아세토니트릴에 100mg/ml 또는 10mg/ml 농도로 용해시켰다(용해 후 -20℃에 저장함). 글리세린을 1.0몰, pH 5.0으로 조합하였다. 글리세린/염산 대신에 아미노에타놀 또는 다른 아미노제가 대체될 수 있다.

실험예 1 - 직접 컨쥬게이션으로 유용한 백신 구조체의 합성: PT-Pn14

각각의 튜브에 250㎍의 Pn14(50μl)가 얼음 위에 담겨 있다. 0 시점(時點)에서 표에 나타낸 바와 같이 여러 가지 양의 CDAP가 첨가되었고, 30초 후에 25μl의 TEA가 첨가되었다. 2분 후 1ml의 PT가 첨가되고, 1시간 후에 100μl의 글리세린 용액이 첨가되었다.

시료들은 4℃로 철야유지시켰다. 다음날 시료는 Costar 0.45 마이크론 스핀 필터로 여과되고, 0.2몰 염화칼륨의 HPLC TSK-겔 여과 칼럼에 주입되었다. % HMW는 컨쥬게이션되지 않은 부분을 나타내는 OD280 피크에 대한 고분자량 OD280 배위 피크의 면적으로서, (보이드 부피 피크의 % 면적)/(보이드 부피의 % 면적 + 컨쥬게이션되지 않은 성분 피크의 % 면적)으로 정의된다. HPLC 가동으로부터 얻어지는 %면적은 다음과 같았다.

상기 PT 제어는 HMW가 22%이므로 반응조건에 의해 적은 양의 PT의 응집이 야기될 수 있다. 이 데이터는 또한 상기 CDAP를 폴리사카라이드(Ps) 비율로 변화함으로써 최종 컨쥬게이트에서 탄수화물에 대한 단백질의 비율을 제어할 수 있음을 나타낸다.

실험예 2 - PT에 대한 모노사카라이드의 컨쥬게이션

이 계열에서 모노머인 10mg/ml 글루코스의 용액 150μl가 Pn14 폴리사카라이드를 대체하였다. 상기 PT가 보레이트 대신에 HEPES(pH 7.5, 0.075몰) 버퍼에 채워진 것 외에는 실험 1과 유사한 조건이 사용되었다. 또한 25μl 대신에 20μl의 TEA가 사용되었다. 이러한 조건하에서 다음의 결과를 얻었다.

번호 2와 3은 CDAP가 PT 자체를 폴리머화하지 않음을 나타내며, 따라서 PT가 고분자량 형태로 전환하는 것은 그것이 고분자량 폴리사카라이드에 결합하기 때문이며 단백질의 폴리머화에 기인하는 것이 아니다. PT의 분자량이 약간 증가하였기 때문에 글루코스가 PT에 컨쥬게이션 되었다는 사실이 HPLC에 의한 분석으로부터 명백하였다.

실험예 3 - 스페이서를 통한 유용한 백신 구조체의 합성: PT-Pn14

헥산디아민으로부터 유도된 Pn14는 다음과 같이 만들어졌다. 10μl의 CDAP(아세토니트릴에서 100mg/ml)가 첨가되었다 (폴리사카라이드 10kDa당 193몰의 CDAP). 30초 후에 20μl의 TEA(0.2몰)가 첨가되었다. 총 2.5분이 경과후에 0.1몰 소디움보레이트(pH 9.1) 내에 300μl의 0.5몰 헥산디아민이 첨가되었다. 1시간후 상기 용액은 물속으로 투석되고, 여과된 후, P6DG(BioRad) 칼럼에서 식염수 속으로 탈염되었다. 보이드 부피는 모여져서 센트리콘(Centricon) 30 장치(Amicon)로 농축되었다. 상기와 같이 획득된 생성물은 Pn14 폴리사카라이드 100 kDa당 33개의 아미노기를 갖는 것으로 측정되었다.

PT는 헤테로리게이션 화학(heteroligation chemistry)(Brunswick 외)을 이용하여 아미노-Pn14에 컨쥬게이션 되었다. 50μl의 0.75몰 HEPES 버퍼(pH 7.5)가 0.44ml의 아미노-Pn14에 첨가되었다. 그것은 0.1몰 요도아세틸 프로피오네이트 N-하이드록시-석신이미드(SIAP) 10μl로써 요도아세틸화 되었다. PT는 20배 과다한 몰농도의 SATA로써 티올화되었다(Calbiochem, La Jolla, CA). 상기 용액은 각각 식염수 속으로 탈염되었고, 혼합되고 0.75몰 HEPES를 함유하는 버퍼 1/9부피와 01mM EDTA와 0.5몰 하이드록실아민이 첨가되었다. 최종적인 부피는 1.1ml 이었다. 하루밤 배양 후 상기 용액은 1시간 동안 머캅토에타놀에서 0.2mM의 농도로 되고, 이어서 10분동안 요도아세트아미드에서 10mM의 농도로 된 후 S400SF 겔 여과칼럼(Pharmacia)에서 분획화(fractionation)되었다 (도 6 참조). 보이드 부피 피크는 모아져서 PM10 멤브레인(Amicon) 위에서 가압여과에 의해 농축되었다. 약 50%의 PT가 컨쥬게이션 형태로 회수되었다. 최종적인 컨쥬게이트는 Pn14 폴리사카라이드 100kDa 당 0.7몰의 PT를 함유하였다. 상기 컨쥬게이트 내의 단백질의 농도는 PT를 표준으로 사용하여 Bradford 분석법(BioRad)에 의해 측정되었다. 폴리사카라이드의 농도는 Pn14를 표준으로 사용하여 Monsigny 외의 방법에 의해 측정되었다.

실시예 2B

CTEA를 사용한 단백질의 Pn14에 대한 직접 컨쥬게이션:

CTEA는 Kohn 외에 의한Anal. Biochem,115:375(1981)에 설명된 바와 같이CDAP보다 부반응이 적다는 장점을 제공하며 더 순수한 생성물을 얻을 수 있게 한다. CTEA의 단점은 수분에 민감하며, 밀폐된 용기내에서 평량되어야 하고, 스톡 용액으로서 쉽게 제조될 수 없다는 점이다.

1ml의Pneumococcal14형 폴리사카라이드(Pn14) (식염수 내에 5mg/ml)를 0℃로 유지한다. CTEA(Milwaukee, WI 소재 Aldrich Chemical사 제품)을 건조 질소에 저장한다. 2mg의 CTEA를 밀폐된 평량용기 내에서 평량하고 격렬히 교반시키고 냉각된 Pn14를 가한다. 상기액을 교반하면서 20ml의 TEA(0.2M 수용액)를 가한다. 60초 후에 상기 교반된 용액에 5mg의 PT(1.5 ml/ml)를 가한다. 30분 후에 200μl의 1M 글리세린(pH 5.0)을 가하여 상기 반응을 중지킨다. 한시간이 더 지난 후, 상기 용액을 여과하고, S400SF 겔 여과 칼럼을 통과시키고, 식염수로 평형화시킨다. 보이드 부피 피크는 모아지고 무균 여과된다. 이와 같이 하여 1:1 컨쥬게이트가 제조된다.

CTEA를 사용하여Pneumococcal14형 폴리사카라이드에 스페이서 제제를 첨가함:

1ml의 Pn14(식염수 내에 5mg/ml)를 0℃로 유지한다. CTEA(WI주 Milwaukee 소재 Aldrich Chemical 제품을 사용할 수 있음)는 건조 질소 중에 저장된다. 1mg의 CTEA를 밀폐된 평량 용기 속에서 평량하고 냉각되고 격렬히 혼합된 Pn14에 가한다. 교반하면서 즉시 20μl를 TEA(0.2M 수용액)에 가하고, 60초 후에 0.1M 보레이트(pH 9) 중의 0.5M 헥산디아민 300μl를 교반하면서 가한다. 1시간 후에 상기 용액을 식염수 속으로 남김없이 투석하고 무균 여과한다. 100 kDa Pn14 당 187몰의 CTEA의비율이 사용되므로 100 kDa Pn14 당 약 18 아민을 갖는 컨쥬게이트가 만들어진다.

실시예 3

Haemophilus Influenzae폴리사카라이드(PRP)에 대한 백일해 톡소이드의 직접 컨쥬게이션

평균 분자량 350kDa인 PRP는 매서츄세츠 공중보건 미생물 연구소(Massachusetts Public Health Biological Laboratory)로부터 얻어졌다. 백일해 톡소이드도 동일 공급원에서 얻었다. 15μl의 CDAP(100mg/ml)를 얼음위의 PRP 100μl에 첨가했다. 30초 후에 30μl의 TEA를 가했다. 이것은 PRP 100kDa 당 319몰의 CDAP를 나타낸다. 추가로 2분이 경과 후 0.75ml의 백일해 톡소이드(1.1mg)를 가했다. 40분 후 1M 글리세린(pH 5.0) 200μl를 가하여 반응을 중지시켰다. 추가로 1시간 경과 후에 상기 용액을 식염수로 평형화 된 S400SF 겔 여과 칼럼을 통과하도록 하였다(도7 참조). 보이드 부피는 모아지고 무균 여과되었다. 생성물은 전체 수율 68%로서 PRP 100kDa 당 1.1 PT를 갖는 것으로 측정되었다.

Inf. & Imm.,40:245(1983)를 참조하면 Chu 외에 의해 제조된 백신은 PRP 100kDa 당 377몰의 시아노겐(cyanogen) 브로마이드를 사용하였고, 50% 미만의 수율로 PRP 100kDa 당 1.4 내지 2.1 PT의 비율을 갖는다. 따라서 본 발명에 의한 상기 직접 컨쥬게이션 방법은 유사한 컨쥬게이트를 얻으면서도 적은 작업량과 높은 수율, 그리고 독성 제제를 사용하지 않는다.

PRP 컨쥬게이트의 제조에 대하여 공개된 많은 프로토콜은 스페이서를 사용하여 유도된 PRP로 시작하기 때문에 CDAP도 역시 PRP에 스페이서를 부가하기 위해 사용되었다 (참조: Chu 외, Schneerson 외,J. Exp. Med.,152:361(1980); Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,"Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & P.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48-114(1989)). 사용된 조건은 상기한 설명과 같으나, 백일해 톡소이드 대신에 0.1M 보레이트 중의 0.1M 헥산디아민 100μl를 가하였다. 생성물은 식염수 속으로 투석되었다. 그것은 PRP 100kDa 당 102 아미노기를 갖는 것으로 측정되었다. 이것은 발표된 공정에서 사용된 것보다 높은 비율이므로 더욱 적은 CDAP가 사용될 수 있었다.

실시예 4

CDAP 화학을 사용하여 제조된 백신으로서 유용한 면역원성 구조체

요약하면, 가메트-스페시픽(gamete-specific) 단백질 pfs25로부터의 말라리아 유도 단백질 p28 (CNIGKPNVQDDQNK)는 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid: TT)에 컨쥬게이션되었다. p28은 말라리아 전염 차단 항체를 유도하는 것으로 나타났다. CDAP는 p28-TT를Pneumococcal14형(Pn14) 폴리사카라이드에 커플링하는데 사용된다.

FDA가 승인한 테타누스 톡소이드는 HEPES 버퍼으로 철야 투석되고 30배 과다 몰의 요도아세틸화제(SIAP)와 반응하도록 하였다. 3시간 후에 반응물은 Macrosep 30(Filtron Technology)을 사용하여 한외여과(ultrafiltration)에 의해 여과되고 0.15M, pH 7.5인 순수한 HEPES 버퍼으로 세척하였다. 티타늄 라벨된 p28이 고체로서 약하게 저어주면서 유도된 TT에 첨가되었다. 4℃에서 철야 반응한 후 잔존하는 활성관능기를 보호하기 위하여 상기 혼합물을 0.2mM 머캅토에타놀로 처리하고HEPES 버퍼로 평형화된 P6DG 칼럼으로 탈염시켰다. 펩타이드의 특수한 활성으로부터 상기 생성물은 TT 1몰당 20몰의 P28 펩타이드를 함유하는 것으로 측정되었다. 상기 컨쥬게이트는 식염수 속으로 투석되고 무균 여과되었다.

CDAP를 사용한 직접 컨쥬게이션:

Pn14(American Tissue Type Collection으로부터 얻음)는 고분자량을 갖는다(약 10⁶dalton). P28-TT는 다음과 같이 Pn14에 직접 컨쥬게이션되었다.

CDAP (아세토니트릴을 용매로 한 100mg/ml 스톡 용액으로부터 10μl)가 Pn14(150μl 식염수 내 1.1mg)에 첨가되었다. 30초 후 20μldml 트리에틸아민(0.2M)이 첨가되었다. 2분 후 0.55mg의 P28-TT(0.8ml 식염수 내)가 첨가되고, 1시간 경과후, 200μl의 0.1M 글리세린(pH 5)을 사용하여 1시간 동안 반응을 중지시켰다. 이어서, 상기 컨쥬게이트는 식염수로 평형화 된 S400SF 겔 여과 칼럼으로 통과시키고 컨쥬게이트를 함유하는 보이드 부피는 수집되었다. 도 9는 사실상 모든 p28-TT 가 컨쥬게이션 형태로 보이드 부피 내에 있음을 나타낸다.

면역원성 구조체의 면역반응성:

5 DBA/2 쥐 집단을 식염수를 용매로 한 10㎍의 P28-TT 또는 (p28-TT)-Pn14 컨쥬게이트를 정맥주사하여 면역시키고 3주일 배양시킨 후 ELISA(효소 결합 면역흡수제 분석법)를 사용하여 재조합 pfs25 단백질에 대한 반응성을 혈청 분석하였다. 펩타이드 p28은 pfs25의 유도체이다. 또하나의 쥐 집단은 애쥬번트인 명반(alum)(Imject, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)을 사용하여 침전된 동일한 항원으로 면역되었다.

관련된 출원에서와 일치하는 것으로서, 표 7은 오직 고분자량 컨쥬게이트가 좋은 항단백질(antiprotein) 적정값을 유도한다는 것을 나타낸다.

상기 표는 CDAP 방법이 유용한 백신 구조체를 만드는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 유용한 컨쥬게이트가 제조될 수 있는 사례를 예시한다.

실시예 5

CDAP를 사용하여 제조된 생물학적 활성 다가(多價) 단백질구조체

단백질을 직접 폴리사카라이드에 결합하기 위해 CDAP를 사용하여 제조된 컨쥬게이트는 다가 생성물(관련 출원에서 개시된 바와 같이 면역성을 높여주는 것)을 제공한다는 사실과, 상기 공정은 생물학적 활성을 유지하기에 충분히 온화하다는 사실을 입증하기 위해서 덱스트란(dextran)을 갖는 단세포형 항체의 여러 가지 컨쥬게이트가 제조되었다. 이러한 실험은 B 림프구(lymphocyte) 위에 멤브레인 IgD를 크로스링크하고 분열증식(proliferation)을 유도하는 anti-IgD 항체와 함께 단세포형 항체 Hδ ^a/l를 사용하였다 (Brunswick 외, Journal of Immunol.,140:3364(1988)).

Brunswick 외에 의해 설명된 바와 같이 Hδ ^a/l의 다중복제를 2000 kDa 덱스트란(Hδ ^a/l-AECM dextran)과 같은 고분자량 폴리머에 컨쥬게이션시킴으로써 B-셀 분열증식을 100배 낮은 농도에서 유도하였고, 컨쥬게이션되지 않은 Hδ ^a/l 보다 고위의 분열증식을 유도하였다. Brunswick 외에서는 컨쥬게이트를 만들어 내기 위해서 단순하고 직접적이지만 다단계이고 여러날 소요되는 공정이 필요하였다. 아미노에칠 카복시메칠 덱스트란(AECM dextran)이 Brunswick 외에서 개시된 바와 같이 처음 제조되었고, 뒤이어 상기 Hδ ^a/l를 탄수화물에 결합하기 위해 헤테로리게이션 화학이 사용되었다.

Hδ ^a/l-덱스트란은 이하에 설명되는 바와 같이 CDAP를 사용하는 직접 컨쥬게이션 방식과, 스페이서 및 CDAP를 사용하는 간접 컨쥬게이션 방식 양자에 의해 제조된다.

직접 컨쥬게이션 방식: 0.3ml 식염수에 녹아 있는 3.2mg의 T2000 덱스트란(Pharmacia)의 볼텍스된(vortexed) 용액에 15μl의 CDAP(아세토니트릴을 용매로 한 스톡 용액 100mg/ml로부터)를 첨가하였다. 30초 후에 0.2M TEA 15μl를 볼텍스 상태에서 가하었다. 추가 2분이 경과 후 6mg의 Hδ ^a/l(0.05M 소디움보레이트 362μl와 0.075M 소금 중에)를 약한 볼텍스 상태에서 가하였다. 15분 후에 상기 반응혼합물은 0.1M, pH 5.0 글리세린 100μl를 첨가하여 반응을 중지시키고 식염수로 평형화된 S400SF 겔 여과 칼럼(1x59 cm)을 통과시켰다. 상기 칼럼 측정치가 도 9에 예시되어 있다. 보이드 부피 피크가 수집되고 Millex GV 여과기로 무균 처리되었다. 제조된 생성물은 Hδ ^a/l-(CDAP)-덱스트란으로 불리운다. 상기 공정은 약 3시간이 소요되었다.

스페이서: 위에서와 같이 CDAP를 사용하여 덱스트란을 활성화시켰다(31.5mg의 T2000 덱스트란을 3ml의 식염수와 25μl의 CDAP에 가한 뒤 25μl의 TEA, 1몰 CDAP/0.06몰의 글루코스 모노머를 가한다). 0.5몰 1,6-디아미노헥산 3ml를 0.1몰 소디움보레이트에 가하였다. 상기 용액은 물 속으로 남김없이 투석되었고, 이어서 S400HR 겔 여과 칼럼 위에서 분획화되었다. 보이드 부피는 수집, 농축되었다. 이 아미노-덱스트란은 2000 kDa 덱스트란 당 147 아미노기를 갖는 것으로 측정되었다. 생성물은 NH₂-(CDAP)-덱스트란으로 불리운다. 투석을 포함하여 이 공정은 2일이 소요되었다. 대조적으로, AECM-덱스트란은 Brunswick 외의 방법을 사용하여 제조하는 데 통상적으로 약 1주일이 소요된다.

Hδ ^a/l은 Brunswick 외에서 기술된 헤테로리게이션 기술을 이용하여 AECM-덱스트란 및 NH₂-(CDAP)-덱스트란에 컨쥬게이션되었다. 상기 컨쥬게이트는 각각 Hδ ^a/l-AECM- 덱스트란 및 Hδ ^a/l-NH₂-(CDAP)-덱스트란으로 불리운다. AECM-덱스트란을 사용하는 컨쥬게이션은 2일이 소요되었다.

Brunswick 외에 의해 개시된 바와 같이 10,000 cells/well을 사용하여 B-셀 분열증식 분석을 실행하였다. 표 8은 상기 분석 결과를 제공하며, 특히 삼중수소화 티미딘(tritiated thymidine)이 B 셀로 결합되는 것을 min./well 당 계수(count)로 나타내고 있다.

Brunswick 외에서 보고된 바와 같이 Hδ ^a/l 만으로는 상기한 농도에서 아무결합을 일으키지 못한다. 10-100㎍/ml Hδ ^a/l에서의 최대 결합은 약 3000cpm이다.

상기 데이터는 CDAP를 스페이서와 함께 또는 스페이서 없이 사용하여 제조된 컨쥬게이트는 분열증식을 유도하는 능력면에 있어서 필수적으로 Hδ ^a/l-AECM- 덱스트란과 동등하다. 오직 다가의 항체만이 적은 양으로 고위의 분열증식을 유도하므로, 모든 컨쥬게이트는 다가라야 한다. 따라서 CDAP를 사용한 직접 컨쥬게이션은 항체의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는다. 직접 컨쥬게이션 공정은 스페이서를사용하여 제조된 컨쥬게이트보다 현저히 빠르게 제조되었다. 그 뿐아니라 스페이서를 첨가하고 CDAP를 사용한 컨쥬게이션은 AECM 덱스트란의 제조보다 훨씬 빨랐다.

이와 같이, 본 실험은 (1) CDAP를 사용한 다가 구조체의 수율이 높다는 것과, (2) 컨쥬게이트 특히 직접 컨쥬게이트의 제조가 용이하고 신속하다는 것을 예시한다.

CDAP와 2-관능기 반응물을 사용한 컨쥬게이션은 48시간 이내가 소요되었고 직접 컨쥬게이션은 3시간 이내가 소요되었다.

실시예 6

다른 지시가 없으면, 본 실험에서 프로토콜은 일반적으로 다음과 같다. 트리에틸아민(TEA), 아세토니트릴, 술폰산(H₂SO₄), 레소르시놀, 헥산 디아민, 소디움보레이트 및 HEPES는 Aldrich로부터 구입하였고 제제 등급이거나 그 이상이다. N-시아노-4-디메틸아미노피리디니움 테트라플루오로보레이트(CDAP)는 Sigma나 Research Organics(Cleveland, Ohio)로부터 구입하였다. 트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)는 Kodak Chemicals로부터 구입하였고, Millex 필터는 Milipore Corp로부터 구입하였다.

덱스트란 T2000은 Pharmacia에서,Pneumococcal14형 폴리사카라이드는 ATTC(Rockville, Maryland)에서 구입하였다. 아미노 에틸 카바밀 덱스트란은 Brunswick 등이 기술한대로 제조하였다. 모노머의 BSA(소 혈청 알부민)은 식염수와 아지드로 평형화된 2.6cm×97cm의 S100HR 칼럼(Pharmacia)으로 겔 여과하여 낮은엔도톡신(endotoxin) Cohen 분획 V BSA(Sigma catalogue ＃A9306)로부터 제조하였다. 생성물은 0.5% 이하의 다이머를 가지고 0.1% 이하의 더 높은 분자량의 물질을 가진다는 것을 HPLC 분석으로 확인하였다. BSA는 모노머 상태를 확인하기 위해서 주기적으로 HPLC로 점검하였다. BSA에 대해서 44,000M^-1의 흡광계수를 사용하였다.

CDAP에 의한 폴리사카라이드의 활성화는 다음 방법과 같다. CDAP는 아세토니트릴을 용매로하여 100mg/㎖로 만들고 -20℃에서 한달동안 저장하였다. 물을 용매로한 폴리사카라이드의 볼텍스한 용액에 CDAP를 피펫으로 천천히 첨가하고, 30초 후에 사용한 CDAP의 양과 같은 양의 0.2M TEA를 첨가하였다. 2.5분에 0.1M 소디움 보레이트(pH 9.3)를 용매로 사용하여 만든 0.5M 헥산 디아민의 1/5의 부피를 첨가하였다. 반응은 4℃에서 하룻밤동안 진행하였다. 반응 생성물은 식염수로 평형화된 P6DG나 P6 카트리지(BioRad)에서 탈염되고, 식염수로 투석되었다. 몇 개의 샘플은 Centricon 30 장치(Amicon)를 사용하여 농축하고 유리된 디아민이 제거된 것을 확인하기 위하여 다시 탈염되었다. 이 일반적인 방법에 대한 변화는 아래 나타낸 것과 같다. 헥산 디아민을 사용해 유도된 양은 일차 아민에 대해 TNBS 분석을 사용하여 결정하였다. 흡광도는 흡광계수 11,000M^-1(Franci 등)를 사용하여 366nm에서 측정하였다. 디아민대신 에탄올아민을 사용해서 유도된 CDAP-활성화된 덱스트란은 이 분석에서 TNBS에 음성인 것으로 나타났다. 폴리사카라이드 농도는 Monsigny 등에 의해서 서술된 방법으로 결정하였다. 다른 지시가 없으면 결과는 폴리사카라이드의 100kDa에 대한 아민의 몰로 나타내었다.

티오-에테르 결합을 통한 아미노-덱스트란에 대한 단백질 컨쥬게이션은 Lees 등이Vaccine, 12(3):1160, 1994에서 설명한대로 행하였다. 단백질은 아민을 사용한 유도에 대해 앞에서 설명한 것처럼 CDAP로 폴리머를 활성화함으로써 폴리사카라이드에 직접 컨쥬게이션되었다. CDAP가 투입되고 21/2분 후에 단백질(10mg/㎖, 0.15M HEPES 용매, pH 7.5)을 천천히 볼텍스한 용액에 빠르게 첨가하였다. 식염수로 평형화된 S300HR이나 S400HR 칼럼(Pharmacia)에서 겔 여과하기 적어도 한시간전에 pH 7.5의 0.75M HEPES를 용매로 사용한 0.5M ethanolamine 약 1/5 부피로 반응을 중지시켰다. 보이드 부피로부터 나온 피크 튜브는 BSA를 표준으로 사용하여 Bradford 방법(BioRad 제제)으로 단백질에 대해 분석하였다. 폴리사카라이드의 농도는 덱스트란을 표준으로 사용하여 Monsigny 등의 방법으로 결정하였다. 다른 지시가 없으면 아래에 사용하는 것처럼 결과는 폴리사카라이드의 mg에 대하여 단백질의 mg으로 표시한다.

CDAP를 사용한 폴리사카라이드의 활성화:

폴리사카라이드의 CDPA 활성화가 이전에 보고된 방법보다 더 빠르고 더 온화하고 더 편리하고 안전한 조건아래에서 컨쥬게이트 백신의 제조에 사용될 수 있는지를 결정하기 위하여 실험을 행하였다. 프로토타입 폴리사카라이드로서, 높은 분자량의 덱스트란(T2000 덱스트란, Pharmacia)은 다양한 실험 조건하에서 CDAP를 사용하여 활성화되었다.

100mg/㎖의 스톡 용액으로부터 CDPA의 부피를 물을 용매로한 T2000 덱스트란 용액에 천천히 피펫으로 첨가하였다(도 4에서 처럼 1.6mg/㎖ 또는 도 10에서 처럼10mg/㎖). 30초에 CDAP의 양과 같은 양의 0.2M TEA를 첨가하고, 120초 후에 소디움 보레이트(pH9.3)를 용매로 사용한 과량의 헥산 디아민을 빨리 첨가하였다. 컨쥬게이트되지 않은 제제를 제거하기 위하여 P6DG 칼럼에서 탈염하고 완전히 투석한 후에 폴리사카라이드의 높은 정도를 발견하였다(도 4 및 도 10). 각각 CDPA, 덱스트란 또는 디아민이 없이 같은 방법을 행하였을 때 TNBS 분석후에 아민이 발견되지 않았다. 더욱이 헥산 디아민 대신에 모노아민(에탄올아민)과 반응한 CDAP-활성화된 덱스트란은 TNBS에서 음성을 나타내었다. 모든 낮은 분자량의 물질이 제거된 것을 확인하기 위하여 유도된 폴리사카라이드를 한외여과로 농축하고 P6DG 칼럼에서 두번째 탈염시켰다. 아민의 비율은 이 조작 후에 변하지 않았다.

유도된 정도는 CDAP의 양에 따라 좌우되었다. 도 4 및 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이 CDAP 대 덱스트란 비율이 증가하면 폴리사카라이드에 치환된 아미노 그룹의 절대적인 수가 증가하였다. 같은 CDAP 대 덱스트란의 몰비에 대해 유도된 정도는 폴리사카라이드의 농도에 따라 좌우되었다. 따라서 1.6mg/㎖의 덱스트란에서 CDAP의 몰에 대해 치환된 아민의 몰에 근거하여 효율이 0.7 내지 2.4% 범위인 반면, 10mg/㎖의 덱스트란에서는 CDAP의 몰에 대해 0.2몰만큼의 아민이 치환되었다(20% 효율).

이 이분자 반응의 효율을 높이기 위해서 한정된 양의 CDAP를 사용하였을 때 폴리사카라이드의 농도를 1에서 50mg/㎖로 증가시켰다(도 11). 높은 폴리사카라이드 농도를 사용했을때 CDAP 각 몰을 사용할 때마다 0.4몰 이상의 아민을 가하였다. CDAP 활성화를 사용하여 얻은 치환의 높은 정도와는 다르게 CNBr 활성화는 보통 약1 내지 2%의 최대 효율을 보였다.

TEA가 없을 때 디아민과의 유도는 현저하게 감소하였다. TEA 같은 3차 아민이 존재하는지 결정하는 것은 CDPA로 가용성의 폴리사카라이드를 활성화하는데 필수적이고, TEA를 사용한 활성화의 효율을 무기 버퍼나 NaOH를 사용했을때와 비교하였다.

CDAP 용액 100㎕(100 mg/㎖, 아세토니트릴 용매)를 상온에서 2㎖의 T2000 덱스트란(10mg/㎖, 물 용매)의 교반중인 용액에 천천히 첨가하였다. 30초후에, pH를 9정도로 유지시키기 위해 1N NaOH를 천천히 첨가하였다. 11/2 분후에 pH 8.0의 0.5M HEPES를 용매로 사용한 20mg/㎖의 BSA 1㎖를 첨가하였다. 4℃에서 18시간동안 반응을 진행시킨후에 pH 7.5의 0.75M HEPES가 용매인 0.5M 에탄올아민 100㎕를 가함으로써 반응을 중지시켰다. 분석을 위해서 생성물 300㎕를 식염수와 아지드로 평형화된 1cm×50cm S400HR 칼럼에서 겔 여과하였다. 보이드 부피 피크 튜브를 BioRad 분석을 사용하여 단백질에 대해, 레소르시놀 분석을 사용하여 폴리사카라이드에 대해서 분석하여 덱스트란의 mg에 대해 BSA 0.45mg을 발견하였다.

아래 표 9에서 여러 가지 버퍼를 사용했을때의 유도 결과를 보였다. 실제로 치환이 잘되도록 pH를 9정도로 올리기 위해 1N NaOH을 조심스럽게 첨가하였다.

다른 폴리사카라이드가 활성화 pH에 더 의존적이기는 하지만, 덱스트란을 사용했을 때 pH 범위 8 내지 10에서 유도된 정도에는 큰 차이가 없었다. 상기한 바와 같이 TEA를 생략하고 pH를 높이지 않으면, 덱스트란은 여전히 활성화되지만 더 낮은 정도로 유도된다. 따라서 CDAP 활성화나 커플링은 TEA나 버퍼의 존재에 좌우되지 않는다. 다른 적당한 방법을 pH를 높이기 위해서 사용하여 반응 혼합물이 충분히 알칼리가 될 수도 있다.

표 10는 CDAP를 사용한 활성화의 반응 속도론을 보여준다. 실험에서 30초에 CDAP 100㎕(100mg/㎖, 아세토니트릴 용매)를 1㎖ 덱스트란(20mg/㎖)에 첨가하였고, pH 8.8의 0.1M 소디움 보레이트 1㎖를 첨가하였다. 2분후 0.75M HEPES를 용매로 사용한 헥산 디아민 0.5㎖를 첨가하였다. 표시된 시간에 수적을 식염수로 평형화된 P6 카트리지에서 탈염하였고, 분석전에 식염수로 완전하게 투석하였다. 폴리사카라이드와 CDAP의 높은 농도에서 용액은 겔이 되었다. 따라서 10 내지 20mg/㎖의 폴리사카라이드 용액을 사용하는 것이 더 편리하다.

표 10에서 보이는 바와 같이 유도 반응은 빠르고 15분안에 끝났다. 3시간이나 24시간이 지나도 유도된 정도는 증가하지 않았다.

재현성을 시험하기 위해서Pneumococcal폴리사카라이드 14형(Pn 14)를 CDAP로 활성화하고 헥산 디아민으로 유도하였다. 교반중인 용액 Pn14 1㎖(10mg/㎖, 물 용매)를 CDAP 30㎕(100mg/㎖, 아세토니트릴 용매)(0.3mg CDAP/mg Pn14)에 첨가하였다. 30초후에 TEA 30㎕(0.2M, 물 용매)을 첨가하고 2분에 헥산 디아민 0.5㎖(0.5M, 0.75M HEPES 용매, pH 7.6)을 첨가하였다. 11/2 시간에 생성물을 P6 카트리지로 탈염하고 한외여과에 의해 농축시키고 다시 탈염하였다. 그리고나서 TNBS로 아민에 대해, 레소르시놀/술폰산으로 Pn14에 대해 분석하였다. 표 11에서 보이는 것처럼 사용한 CDAP의 몰에 대해 검출된 아민의 몰에 기초한 효율은 13-15%이었고, 이것은 1년의 주기로 시행된 세 번의 실험에서 얻었다.

표에 나타난 결과는 CDAP 시약의 냉장고에서의 안정성, 재현성, 높은 효율을 나타낸다. 반대로 CNBr 용액은 안정하지 않아서 CNBr-활성화 방법은 재현하기 어렵고 약 2%의 효율을 갖는다.

CDAP-활성화된 Ps에 대한 단백질의 직접적인 컨쥬게이션:

아민의 유도처럼, 폴리사카라이드에 대한 단백질의 컨쥬게이션의 양은 폴리사카라이드를 활성화하기 위해 사용한 CDAP의 양에 따라 좌우되었다. 도 12에서 보는 것과 같이 덱스트란 10mg/㎖의 농도에서 CDAP 대 덱스트란 비율은 생성물의 BSA 대 덱스트란 비율에 따라 선형적으로 증가하였다. 단백질 및/또는 폴리사카라이드 농도가 증가하면 BSA 대 덱스트란의 비슷한 비율이 낮은 CDAP 대 덱스트란 비율에서 또한 관찰될 수 있다.

덱스트란이 존재하지 않을 때 시행하여 겔 여과에 의해 분석한 대조 반응으로부터 CDAP 자체가 BSA(단백질)를 응집하거나 폴리머화하지 않는다는 것을 알 수 있었다. CDAP-처리된 샘플(0.5㎖ 물 + 25㎕ CDAP @ 100mg/㎖, 아세토니트릴 용매 + 50㎕ 0.2M TEA + 0.5㎖ BSA @ 10mg/㎖, 0.5M HEPES 용매, pH 8.0)과 대조 샘플(0.575㎖ 물 + 0.5㎖ BSA(모노머) @ 10mg/㎖, 0.5M HEPES 용매, pH 8.0)을 제조하였다. 샘플은 하룻밤동안 반응시키고 HEPES가 용매인 0.5M 에탄올아민 100㎕로 반응을 중지시켰다. 1시간동안 중지시키고난 후 0.75㎖/minute에 샘플을 식염수와 아지드에서 S400 1cm×50cm 칼럼에 부었다. 칼럼위의 OD280은 모아지고 BSA 피크에 선행하는 튜브위의 OD280의 총계로 나누어졌다. CDAP-처리된 샘플은 0.6% 폴리머화된 BSA를 보였고, 대조 샘플은 0.7%의 폴리머화된 BSA를 보였다. 따라서, 높은 분자량의 단백질은 자가 폴리머화나 응집때문이 아니라는 것을 알 수 있었다.

게다가 표준 조건하에서 CDAP는 폴리사카라이드와 크로스링크하지 않는다. 이것은 70kDa의 덱스트란이 활성화되고 에탄올아민과 반응하고 겔 여과 칼럼에 부어지는 다음의 HPLC 실험으로 확인되었다.

특별히, 2.5mg의 T70 덱스트란(10mg/㎖)을 20㎕의 CDAP(100mg/㎖)와 결합시켰다. 30초에 0.2M TEA 20 또는 60㎕를 첨가하고 2분에 pH 7.6의 0.75M HEPES가 용매인 0.5M 에탄올아민 100㎕을 첨가하였다. 1시간후에 0.2M NaCl에서 샘플을 G4000 PWXL(Tosohaas)이나 SEC3000(Beckman)에 붓고 굴절률에 의해 감지하였다(각 칼럼에 대해 보이드 부피는 약 5분이었고, 용출 염(eluting salt)은 약 10분이었다). 더 높은 분자량으로 이동했다는 증거는 관찰되지 않았다.

다음의 비교 실험에서 보듯이 CDAP가 폴리사카라이드와 크로스링크하는 것을 막기위해서 극단적인 조건을 피했다. T2000 덱스트란(100mg/㎖, 물 용매) 1㎖를 CDAP(100mg/㎖) 176㎕와 결합시켰다. 30초후에 0.2M TEA 176㎖를 첨가하여 2분이내에 겔이 되었다.

최적의 활성화시간을 찾고 CDAP-활성화된 폴리사카라이드의 안정성을 조사하기 위해서 CDAP와 TEA를 첨가하고 5-300초 후에 단백질(BSA)을 첨가하였다. 그리고나서 생성물의 BSA 대 덱스트란의 비율을 결정하였다. 도 13에 나타난 결과들로부터 최적의 활성화시간이 약 2분이고 활성화된 폴리사카라이드는 이 시간동안 안정하다는 것을 알 수 있었다. 만약 단백질이 1시간에 첨가된다면 반응 수율은 약 1/3 떨어졌을 것이다.

CDAP와 폴리사카라이드의 수용액 혼합물은 도 14에서 보이는 것처럼 안정하였다. CDAP(100mg/㎖) 60㎕를 1㎖의 물에 첨가하고, 도 14에서 보이듯이 10-300초의 시간범위동안 다양한 시간에 이 CDAP 용액의 100㎕ 수적을 폴리사카라이드(덱스트란 20mg/㎖) 100㎕와 결합시키고, 0.2M TEA 용액 15㎕와 결합시켰다. TEA와 결합시키고 2분후에 BSA(30mg/㎖) 100㎕를 첨가하였다.

최종의 단백질 대 폴리사카라이드의 비율은 첨가시간의 전체적인 범위동안 큰 변화를 나타내지 않았다. 도 14에 보인 결과들은 CDAP가 산 용액에서 안정하다는 것과 물에서 CDAP 용액이 산성으로 변한다는 관찰과 일치한다. 따라서 반응 용액이 같은 날 사용된다면 물은 유기 용매를 대치할 수 있다. 선택적으로 CDAP는 폴리사카라이드 용액에 고체로 첨가할 수 있다. 실험시 사용하는 CDAP양이 작을때는 고체 제제보다 용액을 사용하여 실험하는 것이 더 편리하다. 게다가 CDAP의 아세토니트릴 용액을 빨리 첨가하면 때때로 폴리사카라이드의 침전이 생기는 반면에 CDAP 수용액을 사용하면 침전이 생기지 않는다. CDAP의 스톡 수용액은 75mg/㎖의 농도까지 제조할 수 있다.

도 15로부터 폴리사카라이드에 대한 단백질의 컨쥬게이션이 상대적으로 빠르고 3시간 내에 80%의 최대 컨쥬게이션이 얻어진다는 것을 알 수 있다. 더 빠른 커플링이 단백질 농도, 폴리사카라이드 농도 및/또는 CDAP 농도 증가에 따라 얻어질 수 있다.

도 16에서 나타내었듯이 반응용액의 pH는 폴리사카라이드 활성화동안 CDAP로 폴리사카라이드를 활성화하는데 또다른 중요한 파라미터이다. 활성화 단계중에 pH는 7.0에서 8.3으로 증가하였고, 커플링 효율의 뚜렷한 증가로부터 알 수 있는 바와 같이 폴리사카라이드 활성화가 증가되었다. 컨쥬게이트의 BSA 대 덱스트란 비율은 pH가 7.0에서 8.3으로 증가할 때 4배 증가하였다. 8.3 이상의 pH에서는 비율의 증가가 거의 없었다. CDAP 활성화의 pH 의존성은, 물에서 CDAP 용액의 pH가 처음에는 중성에 가깝다가 점점 산성으로 되기 때문에 TEA가 없을 때 이미 관찰했던 유도의 낮은 정도를 설명한다.

아민에 의한 폴리사카라이드의 유도에 관하여 앞에서 살폈듯이, 3차 아민 버퍼는 단백질의 직접적인 컨쥬게이션을 위한 폴리사카라이드의 활성화동안 필수적이지 않다. 따라서 폴리사카라이드에 대한 단백질의 직접적 컨쥬게이션이 일어날 수 있다. 즉, 활성화 단계동안 pH를 올리기 위해서 pH stat이나 자동 적정기(titrator)를 사용할 수 있다. 이것은 백신 컨쥬게이트를 제조하는데 유용하다.

도 17은 단백질이 활성화된 폴리사카라이드에 커플링하는 동안 반응용액의 pH가 단백질과 CDAP가 직접적인 컨쥬게이션하는데 중요한 파라미터임을 설명한다. 도 17의 결과를 보이는 실험에서, 낮은 단백질 대 폴리사카라이드 비율일때 몇가지버퍼를 넓은 pH 범위에서 시험하였다. 프로토콜은 아래와 같다.

T2000 덱스트란(10mg/㎖, 물 용매) 4㎖를 CDAP 용액(금방 제조한 100mg/㎖, 아세토니트릴 용매) (0.33mg CDAP/mg dex) 133㎕에 첨가하였다. 30초후에 TEA(0.2M 스톡 용액으로부터) 266㎕를 첨가하였고, pH는 최고 9.6까지 도달하였다. 21/2분후에 1M NaAc(소디움 보레이트) 60㎕를 사용하여 pH를 5.0으로 조정하였다. 활성화된 덱스트란 400㎕를 BSA(15mg/㎖)(0.8mg BSA/mg dex) 200㎕와 이온 세기를 조절하지 않은 버퍼(1M NaAC, pH 4.7, 5.7; 0.5M HEPES, pH 6.94, 7.43, 8.15; 0.1M NaPO₄, pH 8.0, 8.67; 50mM 소디움 보레이트, pH 9.0, 9.6) 100㎕를 함유한 튜브에 옮겼다. 옮기고 1시간 후에 tube의 용액 350㎕를 0.75M HEPES(pH 7.5)를 용매로 하여 금방 제조한 0.5M 에탄올아민 100㎕와 합쳤다. 20시간 후에 에탄올아민 100㎕를 나머지 용액에 첨가하였다. 반응은 최소한 2시간 동안 중지되었고, 생성물은 식염수와 아지드로 평형화된 S300HR이나 S40HR 칼럼에 부어졌다. 피크 보이드 부피 튜브는 BioRad 분석을 사용하여 BSA에 대해, 레소르시놀 분석을 사용하여 폴리사카라이드에 대해 분석하였다.

도 17에서 나타난 바와 같이 대부분의 단백질은 폴리사카라이드와 pH가 7.4만큼 낮을 때 커플링하고, 상당한 양이 pH가 6.9만큼 낮을 때 커플링하고, 작지만 상당한 양이 pH가 5.7만큼 낮을 때 커플링하였다. 이 실험 조건에서 pH 약 8이 최적을 나타내었다. 결과로부터 커플링단계의 pH가 중요하다는 것을 알 수 있긴하지만, 넓은 pH 범위에서 커플링이 일어날 수 있다. 커플링 반응이 pH 5에서 비효율적이지만, 중지는 pH 약 7 내지 8에서 되어야 한다.

단백질 대 폴리사카라이드의 비율, 폴리사카라이드의 농도 및/또는 사용하는 CDAP의 양을 증가함으로써 낮은 pH에서도 커플링의 정도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어 pH 7에서도 제제나 단백질을 더 사용함으로써 높은 수율을 얻을 수 있다. 따라서 직접적인 단백질 커플링은 CDAP를 사용해서 폴리사카라이드를 활성화할 때 중성부근의 pH에서 얻어질 수 있다.

도 17은 인산염이 또한 커플링반응을 억제하는 것을 나타내는데 이는 아마도 이온 상호작용이나 인산염의 약간의 친핵성때문일 것이다. 그러나 커플링동안 CDAP의 양이나 pH를 높이는 것은 컨쥬게이션 비율과 수율을 증가시킬 것이다. CDAP 활성화동안 인산염이 존재하면 디아민이 첨가는 억제된다.

다음 실험에서 보이는 것처럼 PRP와 Pn6의 인산염은 억제를 일으킬 수 있다. CDAP(100mg/㎖, 아세토니트릴 용매) 20㎕를 Pn6(Pneumococcal6형, 폴리리피톨 인산염 폴리사카라이드)(10mg/㎖, 물 용매) 2mg의 볼텍스된 용액에 첨가하였다. 30초후에 버퍼(0.1M 소디움 보레이트 100㎕나 0.2M TEA 40㎕)를 첨가하였다. 2분에 pH 8의 0.5M HEPES이 용매인 BSA(20mg/㎖) 100㎕를 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤동안 항온시킨후 반응을 pH 7.5의 0.75M HEPES를 용매로 사용한 0.5M 에탄올아민 100㎕로 중지시키고, 식염수와 0.02% 아지드로 평형화시킨 S40HR 칼럼(Pharmacia)에서 겔 여과하였다. 피크 보이드 부피 튜브를 단백질과 폴리사카라이드에 대해서 분석하였다. 비교를 위한 4번째 시도에서 덱스트란을 같은 방법으로 유도하였다. 결과들은 아래 표 12에 나타내었다.

TEA 버퍼를 사용한 Pn6에서(시도 1) 수율은 매우 낮았다. 소디움 보레이트를 사용하여 pH가 증가함에 따라(시도 2, 3) 수율은 증가하였다. 같은 조건일때 덱스트란은 훨씬 높은 수율을 나타내었다(시도 4). 따라서 Pn6같은 인산염에 기초한 폴리사카라이드는 컨쥬게이트를 좋은 수율로 준비하기 위해 pH 및/또는 CDAP 비율을 조절해야 한다.

다음의 실험은 CDAP 활성화에 의해 생성된 이소우레아(isourea) 결합이 안정하고 강한 것을 보여준다. 이 실험에서 ε-TNP-리신은 CDAP를 통해 덱스트란과 커플링하였다. 샘플 1-5는 다음과 같이 만들었다.

샘플은 4번째 것만 제외하고 어두운 곳에서 밤새도록 반응시켰다. 그리고 나서 샘플은 10mM 소디움 보레이트에서 P6 카트리지 위에 1.0㎖/minute에 탈염되었다. 분획은 OD366에서 읽고 보이드 분획의 피크 튜브가 분석되었다. 결과들은 아래 표 13에서 나타내었다.

각각의 샘플에 대하여 TNP 대 덱스트란 비율은 변하지 않았고, 이는 이소우레아 결합이 시험 조건에서 안정하다는 것을 나타내었다.

컨쥬게이트의 생물학적 활성도:

폴리사카라이드의 CDAP 활성이 항체 반응을 유도하는 능력에 해로운 효과가 있는지 알아보기 위해서 비트로에서(in vitro) 생물학적 활성도를 시험하였다. BSA는 CDAP-활성화된Pneumococccal폴리사카라이드 14형에 직접 컨쥬게이션되어 있거나 헥산 디아민으로 유도되어 요오드아세틸레이션(iodoacetylation)하고 티올화된 단백질과 반응하는(Lees 등)Pneumococcal폴리사카라이드 14형에 커플링되어 있다. 각각의 컨쥬게이트는 mg BSA/mg Pn14의 비율을 가지고 있다. 타고난 DBA/2 쥐는 유리되었거나 폴리사카라이드의 컨쥬게이트로서 애쥬번트가 없을 때 BSA 50㎍으로 피하에 면역되어 있다. 14와 28일 후에 혈청을 모으고 항-BSA와 항-Pn14 항체 적정값은 ELISA에 의해 결정되었다.

컨쥬게이션되지 않은 BSA나 컨쥬게이션되지 않은 Pn14는 감지할수있는 1차 반응을 일으키지 않았다. 반대로 BSA-Pn14 컨쥬게이트는 단백질이 스페이서를 사용해 간접적인 컨쥬게이션에 의해 커플링하였나 또는 직접적인 컨쥬게이션에 의해 커플링하였나와 관게없이 단백질과 폴리사카라이드의 성분에 대해서 상당한 항체 반응을 일으켰다. 스페이서나 CDAP-활성화된 덱스트란에 직접적인 커플링을 사용하여 제조된 BSA-덱스트란에 의해 면역된 쥐는 컨쥬게이트가 다른 화학적인 방법을 사용하여 제조되었을 때 얻어진 것들에 비교할만한 적정값을 주었다. 게다가 CDAP 활성화를 사용하여 제조된 TT-PRP 컨쥬게이트는 컨쥬게이트에 의해 면역된 쥐에서, CNBr 활성화를 사용해 제조된 TT-PRP 컨쥬게이트로 면역된 쥐에서 보여진 것과 비교될만한 항-PRP 반응을 보였다. 더욱이 CDAP-활성화된 Pn14에 직접 컨쥬게이션된 파상풍은 높은 항 파상풍과 항-Pn14 항체 반응을 가졌고, opsonic 분석은 이들 항체가 방어적임을 나타내었다.

실시예 7

CDAP-활성화 폴리사카라이드에 히드라지드-유도 단백질의 커플링(아미노 기상에 유도된 단백질)

제한된 수의 BSA상 아민을 히드라지드로 다음과 같이 유도하였다. 20mg BSA(75mM HEPES, pH 5에 24mg/ml)를 20배 몰라 초과 SPDP(Prochem)와 반응시켰다. 8시간후, 1M 소디움 아세테이트(pH 5) 200μl을 첨가하고 1M DTT 25μl를 첨가하여티올을 비보호화하였다. 상기 용액을 2 P-6 카트리지상에서 연속적으로 탈염시키고, 10mM 소디움 아세테이트, 0.1M NaCl 및 2mM EDTA(pH 5)로 평형화하고, 보이드 부피 단백질을 Centricon 30 장치로 1.05ml 부피까지로 농축시켰다. Ellman 시약을 사용하여 BSA당 3.2 자유 티올이 있는 것으로 판정되었다. 티올-BSA 5mg을 보관하여 나머지는 1M HEPES(pH 6) 50μl를 첨가하여 pH 6으로 만들었다. 디메틸포름아미드내의 0.1M E-말레이미도카프로익 에시드 히드라지드-HCl(말레이미드-히드라지드 이성기능성 시약: EMCH, Prochem, Rockford, Illinois) 100μl을 첨가하였다. 밤샘 반응후, 단백질을 탈염화하고 다시 농축하였다. 단백질 농도는 흡광도로 측정하였다. 자유 히드라지드 기의 존재를 확인하기 위하여 TNBS 분석을 사용하였다(천연 단백질에 존재하지 않는 540nm에서 흡광이 있었다).

BSA당 오직 4.2 티올만이 있기 때문에, 최종 산물은 이론적으로는 자유 히드라지드 수를 넘을 수 없었다. BSA는 총 60 아미노 기를 갖는다: 따라서 BSA는 최소한 변형시켰다. 이 물질을 BSA-S-Hz라 표기한다.

BSA-S-Hz 또는 모노머 BSA(비교: 9100HR 칼럼상에서 겔 여과에 의해 제조)를 CDAP-활성 덱스트란과 다음과 같은 방법으로 반응시켰다. T2000 텍스트란 400μl(H₂O내에 10mg/ml)을 CDAP 15μl(아세토니트릴내에 100mg/ml)을 첨가하여 활성화하고 30초후 0.2M TEA 30μl를 첨가하였다. 2.5분후, 1M 소디움 아세테이트(pH 5)200μl를 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 5로 하였다. 300μl의 CDAP-활성화된 덱스트란을 2mg의 BSA-S-Hz 또는 모노머 BSA(10mM 아세테이트 버퍼내에 22.3Mg/ml에서 90μl)에 첨가하였다. 최종 pH는 5.1이었다. 밤샘 반응후, 상기 샘플은 0.75M HEPES(pH 7.5)내의 0.5M 에탄올아민으로 중지하고 S300HR 칼럼(1x50cm, 식염수와 아지드로 평형화)상에서 겔 여과하여 분획화하였다. 단백질 및 폴리사카라이드 분석은 pH 5에서 모노머 BSA가 컨쥬게이트 산물을 생성하지 못하였으나 BSA-S-Hz가 단위 mg 덱스트란당 0.51mg BSA를 갖는 컨쥬게이트를 생성하였음을 나타냈다.

CDAP-활성 뉴모코칼 14형(Pn14)에 대한 히드라지드 유도 디프테리아 톡소이드(DT)의 컨쥬게이션

카르복실 기상에 유도된 DT: 카르복실기상에 DT를 ADH로 다음과 같이 하여 유도하였다. 0.5M 1-메틸이미다졸(pH 6)내의 DT 6.95mg에 동일 버퍼내의 0.5M 아디픽 디히드라지드(ADH)를 첨가하고 교반하면서 15mg의 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드(EDC)를 첨가하였다. 밤샘 배양후, 단백질을 2 P-6 카트리지상에서 일련으로 탈염화하고, 10mN 소디움 아세테이트 버퍼(pH 5)로 평형화하고 Centricon 50 장치로 17.1mg/ml까지 농축하였다. TNBS 분석은 히드라지의 존재를 나타내었다. 이 물질은 DT/EDC/Hz로 표기하였다.

뉴모코칼 14 형(Pneumococcal type14: SmithKline Beecham으로부터 입수)을 S400HR 칼럼(2.6x100cm, 0.1M 포태슘 포스페이트, pH 7.2로 평형화)상에서 겔 여과하여 분획화하였다. 최고 및 최하 분자량 분획을 분리하고 중간 부분을 농축 및 식염수내 투석을 시켰다. 이 물질은 Pn14(M)으로 표기하였다.

250μl의 Pn14(M)(10.1mg/ml)을 15μl의 CDAP(아세토니트릴내의 100mg/ml)를 첨가하고 30초후 0.2M TEA 30μl를 첨가하였다. 2.5분후 150μl의 1 M 소디움 아세테이트(pH 5)를 첨가하여 pH를 감소시키고 150μl의 DT/EDC/Hz(2.5mg)을 첨가하였다. 밤샘 반응후, 상기 반응 혼합물을 100μl의 0.75M HEPES(pH 7.5)내의 0.5M 에탄올아민으로 중지하고, S300HR 칼럼(1x50cm, 식염수로 평형화)상에 겔 여과하였다. 분석은 DT가 커플링 되었음을 나타냈다.

아민 기상에 유도된 DT: DT를 BSA-S-Hz에서와 유사한 방법으로 유도하였다. 5mg의 DT(13.9mg/ml)을 20배 몰라 초과 SPDP로 반응시키고, 탈염화하고 Centricon 30 장치로 농축하고, 50mM DTT로 pH 5에서 1시간 동안 처리하고 탈염 및 농축을 다시 하였다. Ellman 시약으로의 분석은 자유 티올 기의 존재를 나타내었다. 티올화된 톡소이드는 과초과의 EMCH와 반응시키고 다시 탈염화하고 농축하였다. TNBS 분석은 히드라지드의 존재를 나타내었다. 이 물질은 DT-S-Hz로 표기하였다.

DT-S-Hz를 다음과 같이 크기 분획된 Pn14와 커플링하였다. 4mg의 1.6M NaCl내의 Pn14(M)을 20μl CDAP(아세토니트릴내의 100mg/ml)로 활성화시키고 30초후 40μl 0.2M TEA를 첨가하였다. 2.5분후, 50μl의 1M 소디움 아세테이트(pH 5)를 첨가하였다. 3.9mg의 DT-S-Hz(77mM 소디움 아세테이드내, pH 5)을 첨가하고; pH 미터를 사용하여 최종 pH를 5.1로 판정하였다. 4℃에서 밤샘 반응후, 100μl의 0.75M HEPES내의 0.5M 에탄올아민으로 반응을 중지시키고 S400HR 칼럼(1x50cm, 식염수와 아지드로 평형화)으로 겔 여과하였다. 분석은 DT가 커플링되었음을 나타내었다.

낮은 pH에서 히드라지드 대 아민의 반응

CDAP-활성화된 폴리사카라이드를 5mg의 CDAP(아세토니트릴내 100mg/ml)를5mg의 Pn14(H₂O내의 10mg/ml)에 첨가하여 제조하였다. 30초후 300μl의 0.2M TEA를 첨가하였다. 2분 30초후, pH는 100μl NaAc, pH 5의 첨가에 의해 약 5로 저하하였다. 상기 CDAP 활성화된 폴리사카라이드는 약 pH 5에서 0.2M ADH 또는 헥산 디아민에 첨가되었다. 밤샘 반응후, 상기 용액을 아세테이트 버퍼(pH 5)에서 탈염화하고 TNBS를 사용하여 아민 또는 히드라진 분석을 실시하였다. 히드라지드를 포함하는 용액에서만이 TNBS 양성이었다. 이 샘플을 Centricon 50 장치상에서 농축하고 P6 카트리지상에서 2차 탈염하였다. 히드라지드 대 덱스트란 비율이 변하지 않아 오깆 미반응 시약만이 제거되었음을 나타내었다. 헥산 디아민 샘플이 TNBS 음성이라는 사실은 유도화가 일어나지 않았음을 나타낸다.

대조구로서, CDAP-활성화된 덱스트란을 0.75 M HEPES(pH 7.5)내의 헥산 디아민 또는 ADH와 반응시켰다. 두 샘플 모두 TNBS 양성이었다.

요약:

CDAP를 이용하는 본 발명의 방법은 다양한 임상 관련 폴리사카라이드를 활성하기 위해 사용될 수 있는 재생 가능한 방법으로, 이중 일부는 높은 pH에 민감하다. 활성화는 신속하여 높은 pH에서 소모되는 시간이 최소화된다. 상기 방법은 고 면역원성 단백질-폴리사카라이드 컨쥬게이트이며, 이는 쥐에서 애쥬번트 없는 경우에도 단백질과 폴리사카라이드 성분 둘 다에 대한 인간 항체를 자극할 수 있다.

폴리사카라이드 활성의 정도에 큰 영향을 주는 것으로 알려진 변수들은 CDAP와 폴리사카라이드의 농도 및 pH이다. 컨쥬게이션을 위한 바람직한 pH는 약 7 내지약 9이며, 보다 바람직하게는 약 7.4 내지 약 8.0이고, 이 범위에서는 대부분의 폴리사카라이드가 안정하다. 다른 pH 범위, 예를 들면, 약 7 내지 약 10은 다른 폴리사카라이드에 보다 적합할 수 있다.

폴리사카라이드 및/또는 CDAP 농도를 조절함으로써, 유도 효율은 CNBr에 알려진 1-2%와 비교할 때 50%까지 증가될 수 있다. 또한 바람직한 조건하에서는 100kDa 폴리사카라이드당 50 NH₂기 이상의 산물을 달성할 수 있다. 본 발명의 방법은 이미 CDAP로 연구하였던 앞선 연구자들이 개시한 바와 같이 3차 아민의 존재에 의존하지 않는다. 폴리사카라이드의 활성화는 신속하다. 유사하게 활성화된 폴리사카라이드에 대한 단백질의 컨쥬게이션은 신속하다.

본 발명은 재생성, 신속한 반응성, 그리고 가장 좋은 것으로 단백질:폴리사카라이드 비율 조절의 용이성의 장점을 제공한다. 예를 들면, 다양한 단백질 대 폴리사카라이드 비율의 컨쥬게이트를 CDAP의 농도 및/또는 폴리사카라이드 농도 및/또는 단백질 농도를 변화함으로써 달성할 수 있다. 이는 컨쥬게이트에 대한 항체 반응의 크기의 영향에서 단백질:폴리사카라이드의 역할뿐만 아니라 주어진 단백질:폴리사카라이드 비율에서 삼차원적 구조의 역할을 연구하는 방법을 제공할 수 있다.

CDAP를 사용하여 제조된 단백질-폴리사카라이드 컨쥬게이트의 면역원성은 성분 안된 요소에 의해 인식되는 반응보다 월등히 크다. 또한, 생산된 항체는 컨쥬게이트 안된 단백질과 반응성이 있고, 이 반응은 컨쥬게이트 단백질뿐만 아니라 컨쥬게이트 안된 단백질을 사용하여 향상시킬 수 있다. 이는 컨쥬게이션시 단백질의 어떠한 화학적 변화도 천연 단백질에 대한 반응성을 갖는 항체를 자극하는 능력 및 컨쥬게이션 되지 않은 단백질의 반응성을 갖는 B 세포를 자극하는 능력에 치명적인 효과가 없다는 것을 보여준다.

그리고 CDAP-활성화된 폴리사카라이드는 항-Ig 항체의 컨쥬게이션 제조에 사용될 수 있다. 항-Ig-덱스트란 컨쥬게이트는 컨쥬게이션 되지 않은 Ig에 비하여 약 100- 내지 1000-배 큰 B 세포 활성을 유도한다. CDAP-활성화된 덱스트란에 직접 컨쥬게이션을 사용하여 제조된 항-Ig-덱스트란 컨쥬게이트는 AECM 텍스트란에 다른 헤테로리게이션 커플링을 사용하여 제조된 컨쥬게이트만큼 B-세포 자극 시약 효과가 있다.

CDAP는 ELIS 및 ELISA 스폿 항원용 바이오티닐화된 폴리사카라이드 및 모델 Ti-2 항원용 TNP-폴리사카라이드(예를 들면, TNP-dex, TNP-Ficoll)와 같은 다양한 면역원성 시약 제조에 유용하다.

따라서 본 발명의 방법, 즉 폴리사카라이드를 기초로 한 컨쥬게이트와 같은 면역원성 구조체를 생산하기 위하여 CDAP를 채용한 방법은 면역원성 구조체를 제조하기 위한 현재의 가능성 있는 기술로서 많은 장점을 제공한다. 본 방법 및 본 발명에 따른 실시예의 변형을 본 발명의 범위 및 정신에서 벗어나지 않게 만드는 것은 본 발명이 속하는 분야의 기술자에게는 용이하다. 그러므로 본 발명은 상세한 설명 및 도면 그리고 후술한 청구항들에 의해 한정될 수 없다.

Claims

(a) 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 및 다른 사카라이드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 탄수화물-함유 제1 성분을 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디니움 테트라플루오로보레이트, N-시아노트리에틸-암모니움 테트라플루오로보레이트 및 p-니트로페닐시아네이트로 이루어진 군에서 선택되는 유기 시안화제로 활성화시켜 활성화된 탄수화물을 형성하는 단계;

(b) 단백질, 펩티드, 및 합텐으로 이루어진 군에서 선택되는 제2 성분을 티올 또는 히드라지드 친핵체로 유도하는 단계; 및

(c) 상기 활성화된 탄수화물을 직접적 또는 간접적으로 상기 유도된 제2 성분에 커플링하여 면역 반응을 자극할 수 있는 면역원성 구조체를 형성하는 단계

를 포함하는 면역원성 구조체의 생산 방법.
제1항에 있어서,

상기 유기 시안화제가 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디니움 테트라플루오로보레이트인 방법.
제2항에 있어서,

상기 제1 및 제2 성분이 수용성인 방법.
제2항에 있어서,

상기 활성화 단계를 pH 8 내지 10에서 실시하고, 상기 커플링 단계를 pH 7 내지 9에서 실시하는 방법.
제2항에 있어서,

상기 활성화 단계를 트리에틸 아민의 존재하에서 실시하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 커플링 단계는 상기 제1 성분을 이기능성(bifunctional) 또는 이성이기능성 스페이서(heterobifunctional spacer) 제제에 공유 결합하고, 상기 유도된 제2 성분을 상기 스페이서 제제에 공유 결합함에 의해 간접적으로 실시하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 스페이서 제제가 에틸렌 디아민, 1,6-헥산 디아민, 아디픽 디히드라지드, 시스타민, 글리신, 및 리신으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,

상기 제1 성분은 폴리사카라이드이고 상기 제2 성분은 단백질인 방법.
제8항에 있어서,

상기 폴리사카라이드가 덱스트란,Pneumococcal폴리사카라이드,Haemophilus influenza폴리사카라이드, 그룹 A Streptococcus 폴리사카라이드, 그룹 B Streptococcus 폴리사카라이드 및 N.meningitidis폴리사카라이드로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,

상기 제1 성분이 수용성 바이러스성 또는 박테리아성 폴리사카라이드인 방법.
제1항에 있어서,

상기 제2 성분이 수용성 단백질인 방법.
제1항에 있어서,

상기 제2 성분이 소 혈청 알부민, 백일해 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 말라리아 유도 펩티드, 항체, 톡소이드, 및 지질단백질으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,

상기 면역원성 구조체가백일해 톡소이드- Pneumococcal 폴리사카라이드, 백일해 톡소이드-폴리리보실 리비톨 폴리사카라이드, 파상풍 톡소이드- Pneumococcal 폴리사카라이드, 항체-덱스트란, 및 펩티드-파상풍 톡소이드- Pneumococcal 폴리사카라이드로 이루어진 군에서 선택되는 컨쥬게이트인 방법.
제1항에 있어서,

상기 친핵체가 히드라지드인 방법.
제1항에 있어서,

상기 커플링 단계를pH 8 이하에서 실시하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 커플링 단계를8 미만의 pH에서 실시하는 방법.
대상물에 투여시 면역 반응을 생산하는 조성물로서, 상기 조성물은,

(a) 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 및 다른 사카라이드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 탄수화물-함유 제1 성분을 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디니움 테트라플루오로보레이트, N-시아노트리에틸-암모니움 테트라플루오로보레이트 및 p-니트로페닐시아네이트로 이루어진 군에서 선택되는 유기 시안화제로 활성화시켜 활성화된 탄수화물을 형성하는 단계;

(b) 단백질, 펩티드, 및 합텐으로 이루어진 군에서 선택되는 제2 성분을 티올 또는 히드라지드 친핵체로 유도하는 단계; 및

(c) 상기 활성화된 탄수화물을 직접적 또는 간접적으로 상기 유도된 제2 성분에 커플링하여 면역 반응을 자극할 수 있는 면역원성 구조체를 형성하는 단계

를 포함하는 방법에 의하여 생산되는 조성물.
제17항에 있어서,

상기 유기 시안화제가 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디니움 테트라플루오로보레이트인 조성물.
제18항에 있어서,

상기 활성화 단계가 트리에틸 아민의 존재하에서 실시되는 조성물.
제18항에 있어서,

상기 제1 성분은 폴리사카라이드이고 상기 제2 성분은 단백질인 조성물.
제20항에 있어서,

상기 폴리사카라이드가 덱스트란,Pneumococcal폴리사카라이드,Haemophilus influenza폴리사카라이드, 그룹 A Streptococcus 폴리사카라이드, 그룹 B Streptococcus 폴리사카라이드, 및N. meningitidis폴리사카라이드로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
제18항에 있어서,

상기 제2 성분이 소 혈청 알부민, 백일해 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 말라리아 유도 펩티드, 항체, 톡소이드, 및 지질단백질로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
제18항에 있어서,

상기 면역원성 구조체가백일해 톡소이드- Pneumococcal 폴리사카라이드, 백일해 톡소이드-폴리리보실 리비톨 폴리사카라이드, 파상풍 톡소이드- Pneumococcal 폴리사카라이드, 항체-덱스트란 및 펩티드-파상풍 톡소이드- Pneumococcal 폴리사카라이드로 이루어진 군에서 선택되는 컨쥬게이트인 조성물.
제17항에 있어서,

상기 친핵체는 히드라지드인 조성물.
제17항에 있어서,

상기 커플링 단계를pH 8 이하에서 실시하는 조성물.