KR100378747B1 - 조류의 다능성 배자생식세포주 및 이의 제조방법 - Google Patents
조류의 다능성 배자생식세포주 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조류의 다능성 배자생식세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, (a) 조류 배자 원시생식기(embryonic gonad)에서 분리된 원시생식세포(primordial germ cell, gPGC)를 세포 성장 인자 및 분화 억제 인자가 포함된 배지에서 배양하여 배자생식세포(embryonic germ cell, EG cell) 콜로니를 수득하는 단계; (b) 기저층(feeder layer)을 사용하여 상기와 동일한 배지에서 EG 세포가 콜로니를 형성할 때까지 배양하는 단계; 및 (c) EG 세포를 회수하고 상기와 동일한 배지에서 계대배양하여 EG 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 방법에 의해 조류의 배자생식세포주를 확립할 수 있으며, 이는 장기간의 계대배양 후에도 다능성을 가지며, 형질전환 닭의 제조, 및 생식세포 분화 및 유전자 각인 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 조류의 다능성(pluripotent) 배자생식세포주(embryonic germ cell, EG cell) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 배간(embryonic stem, ES) 세포주는 포배기 또는 상실기의 배자(embryo)로부터 유래되어 미분화된 다능성(pluripotent)의 세포이다. ES 세포는 발생학적 연구, 전능성(totipotent) 세포의 특성 분석 및 유전자 변형 가축을 생산하기 위한 유전자 표적(gene-targeting) 등에 매우 유용할 것으로 기대되지만, 배간세포를 이용하여 생식선 전이(germ-line transmission)를 확립하는데 성공한 예는 유일하게 마우스에서만 보고되었으며(Evans, M. J. and Kaufman, M. H.,Nature,292, 154-156(1981); Bradley et al.,Nature,309, 255-256(1984)), 마우스 외의 다른 종에서는 생식선 전이에 한계가 있어 형질전환된 가축을 생산하는데 있어서 배간세포를 이용하는 것은 아직까지 현실화되지 않았다(First, N. L. et al.,Reprod. Feril. Dev.,6, 553-562(1994); Wheeler, M. B.,Reprod. Fertil. Dev.,6, 563-568(1994); Giles, J. R. et al.,Mol. Reprod. Dev.,36, 130-138(1993); and Doetschman, T. C. et al.,Dev. Biol.,127, 224-227(1988)).
최근에는, 성 성숙 후 발달하여 정자나 난자의 전구세포인원시생식세포(primordial germ cells, PGCs)가 다능성을 지닌 새로운 배간세포(stem cell)로서 주목받고 있다. 원시생식세포로부터 유래된 배간세포는 배자생식(embryonic germ, EG) 세포라 부른다(Resnick, J. L. et al.,Nature,359, 550-551(1992); and Matsui, Y. et al.,Cell,70, 841-847(1992)). 마우스 원시생식세포는 분열억제처리된 STO 세포를 기저세포로 하고, SCF(Stem cell factor), LIF(leukemia inhibitory factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 세가지의 중요한 성장인자가 첨가된 배지를 이용하여 성공적으로 배양된 바 있다(Godin, J. R. et al.,Mol. Reprod. Dev.,36, 130-138(1991); Dolci, S. et al.,Nature,352, 809-811(1991); Matsui, Y. et al.,Nature,353, 750-752(1991); and Resnick, J. L. et al.,Nature,359, 550-551(1992)). 레스닉(Resnick) 등은 마우스 원시생식세포가 연속 배양 후에도 분열을 계속하여 ES 세포와 유사한 세포의 콜로니를 형성하였다고 보고하였다(Resnick, J. L. et al.,Nature,359, 550-551(1992)). 라보스키(Labosky) 등은 마우스 EG 세포주가 생체내에서 생식선 전이에 요구되는 특성인 다능성을 갖는다고 보고하였다(Labosky, P. A. et al.,Development,120, 3197-3204(1994)).
소 및 돼지 EG 세포에 대해서는, 형태, 알칼리 포스파타제 활성 및 배자체 형성 등에 대한 연구보고가 되어 있을 뿐(Cherny, R. A. et al.,Reprod. Fertil. Dev.,6, 569-575(1994); Shim, H. et al.,Biol. Reprod.,57, 1189-1095(1997); Piedrahita, J. A. et al.,J. Reprod. Fertil.,52, 245-254(1997)), 생식선 전이는 아직 보고된 바가 없다.
파인(Pain) 등은 여러 형태학적인 가능성을 갖는 조류 배간세포는 생체외에서 배반엽(blastoderm) 세포의 장기간 배양에 의해 유래 및 유지된다고 보고하였다(Pain, B. et al.,Development,122, 2339-2348(1996)). 그러나, 원시생식세포로부터 유래된 다능성 EG 세포의 제조는 포유동물 이외의 종에서는 아직 보고된 바가 없다.
조류의 원시생식세포는 외배엽에서 유래되어 배발달단계 4(배양 18 내지 19시간) 내에 생식선 반월(germinal crescent)로 이동하고(Swift, C. H.,Am. J. Anat.,15, 483-516(1914); Hamburger, V. and Hamilton, H. L.,J. Morphol.,88, 49-92(1951); and Eyal-Giladi, H. and Kochav, S.,Dev. Biol.,49, 321-337(1976)), 배발달단계 10 내지 12에서 생식선 반월로부터 혈관으로 이동한 다음(Ando, Y. and Fujimoto, T.,Dev. Growh Differ.,25, 345-32(1983); and Ukeshima, A. et al.,J. Electron. Microsc.,40, 124-128(1991)), 배발달단계 17(배양 2.5일)까지 혈액을 따라 순환하여 최종적으로 원시생식기내에 정착한 후, 정착 및 콜로니화된다(Nieuwkoop, P. D. and Sutasurya, L. A.,In Primordial Germ Cells in the Chrodates, 113-127(1979)). 이 이동경로 및 발달과정은 포유류에서와는 크게 다르다.
알리올리(Allioli) 등은 닭의 원시생식기로부터 분리된 원시생식세포가 체외 배양 조건에서 몇일 동안 분열할 수 있음을 보고하였으며(Allioli, N. et al.,Dev. Biol.,165, 30-37(1994), 장(Chang) 등은 닭의 원시생식기내 원시생식세포(gonadal PGCs, gPGCs)를 원시생식기(germinal ridge stroma cells,GRSCs)로부터 유래된 기저세포층 위에서 5일간 배양하는데 성공하였다(Chang, I. et al.,Cell Biol. Int.,19, 569-676(1995)). 이렇게 배양된 gPGCs는 수용체 배자내로 재주입되었을 때 원시생식기로의 이동능력을 갖는다. 최근 장 등은 체외에서 5일간 배양된 gPGCs를 주입하여 생식선 키메라 닭을 생산하였다(Chang, I. et al.,Cell Biol. Int.,21, 495-499(1997)).
또한, PCT 공개 제 WO 99/06534 호에서는 배발단단계 13 내지 14인 배자의 혈액으로부터 분리된 원시생식세포를 기저세포층을 사용하지 않고, LIF, bFGF, SCF 및 IGF-I이 첨가된 배지에서 배양하여 EG 세포를 확립하는 방법을 제시한 바 있으나, 이 방법에 사용된 혈액 PGCs(배자당 100개)의 양은 gPGCs(배자당 1000개이상) 에 비해 매우 적고 분리가 어려우며, 실제로 기저세포층을 사용하지 않고 배양하였음에도 불구하고 3-4회 계대배양만으로 배양도중 배양기에 부착되어 형태학적으로도 변형되었으므로 이로부터 제조된 EG 세포는 이미 분화된 것으로 추정된다. 또한, 다능성 검증을 위해 상기 EG 세포가 알칼리 포스파타제 활성을 갖는다는 것만 확인하였을 뿐 다른 특성에 대해서는 확인한 바가 없어 실제로 EG 세포를 확립하였다고 볼 수 없을 뿐만 아니라 EG 세포의 특성인 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo) 분화능에 대해서는 전혀 확인한 바가 없으며, 계대배양후에도 EG 세포가 계속적인 분열을 하고 있는지에 대한 검증도 제시하지 않고 있다.
이에 본 발명자들은 외래 유전자 전이 및 유전자 표적을 이용하여 형질전환 가금을 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 조류의 배자 원시생식기(embryonic gonad)에서 분리된 원시생식세포를 기저층으로서 섬유아세포를 사용하는 배지에서 배양하여 다능성을 가지며, 외래 유전자의 세대간 전달이 가능한 EG 세포주를 확립함으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 다능성을 갖는 조류 배자생식세포주(embryonic germ cell, EG cell)를 확립하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다능성을 갖는 조류 배자생식세포주를 제공하는 것이다.
도 1은 닭의 배자 섬유아세포 상에서 3회 계대배양된 닭의 배자생식세포(embryonic germ cell, EG cell) 콜로니의 형태적 특징을 나타낸 사진이다(1a: 스케일, 50㎛ 및 1b: 스케일, 25㎛).
도 2는 4회 계대배양하여 형성된 EG 세포 콜로니에서 PAS 반응을 나타낸 것이다.
도 3은 4회 계대배양하여 형성된 EG 세포 콜로니에서 항-SSEA-1 항체 검색 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 8회 계대배양한 후에 분열 검색 키트를 사용하여 EG 세포 콜로니가 계속적으로 분열하고 있음을 나타낸 결과이다.
도 5a는 8일간 부유배양한 후 닭의 EG 세포로부터 형성된 배자체를 나타낸 것이고, 도 5b 내지 5d는 액틴, α-1-펙토프로테인 및 S100에 대한 항체를 사용한 배자체의 면역조직화학적 분석 결과로서 다양한 조직으로의 분화를 나타낸 것이다.
도 6a는 흑색 깃털을 갖는 전형적인 한국 오골계를 나타내고, 도 6b는 목주변 및 가슴에 부분적인 백색 깃털을 갖는 체세포 키메라 닭을 나타낸다.
도 7은 체세포 및 생식선 키메라화에 대한 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는
(a) 조류 배자 원시생식기(embryonic gonad)에서 분리된 원시생식세포 (primordial germ cell, gPGC)를 세포 성장 인자 및 분화 억제 인자가 포함된 배지에서 배양하여 배자생식(embryonic germ, EG) 세포 콜로니를 수득하는 단계;
(b) 기저층(feeder layer)을 사용하여 상기와 동일한 배지에서 EG 세포가 콜로니를 형성할 때까지 배양하는 단계; 및
(c) EG 세포를 회수하고 상기와 동일한 배지에서 배양하여 EG 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 조류의 배자생식(EG) 세포주의 확립방법을 제공한다.
본 발명의 조류의 배자생식세포주를 확립하는 방법은 조류의 원시 생식세포의 분리로부터 시작된다. 상기 조류는 칠면조, 닭, 메추라기, 꿩 또는 오리일 수있다. 원시생식세포는 배발달단계 14 내지 36(배양 50 시간 내지 10일), 바람직하게는 배발달단계 24 내지 30(배양 4일 내지 6.5일)인 조류의 배자 원시생식기로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 배발단단계 28인 화이트 레그혼의 배자 원시생식기를 분리한 후 원시생식기 조직을 트립신-EDTA에 의해 분해시켜 gPGC를 포함하는 현탁액을 제조한다. 그러나, 배자의 발달단계는 본 발명의 목적을 해치지 않는 한 이에 한정되지 않으며, 조류의 종 또는 원시생식세포를 분리하는 기관, 조직 및 막의 종류에 따라 달라질 수 있다.
분리된 원시생식세포를 세포 성장 인자 및 분화 억제 인자를 포함하는 배지에서 5% CO2존재하에 37 내지 42℃로 EG 세포의 콜로니가 형성될 때까지 배양한다. 상기 배지는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco BRL cat# 10313-021) 또는 기능적으로 이와 동일한 배지가 바람직하다.
본 발명에서 유용한 세포 성장 인자로는 SCF(stem cell factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), IL-11(interleukin-11), IGF-I(insulin-like growth factor-I) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 분화 억제 인자로는 LIF(leukemia inhibitory factor)가 있다. 배양 배지는 또한 포유류의 혈청, 조류의 혈청 또는 피루브산 나트륨, 글루타민, β-머캅토에탄올 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택된 보조성분을 포함할 수 있다.
배양 배지는 0.1 내지 30% FBS(fetal bovine serum), 0.02 내지 20% 닭 혈청, 0.01 내지 100 mM 피루브산 나트륨, 0.02 내지 200 mM 글루타민, 0.55 내지5500 μM β-머캅토에탄올, 0.05 내지 500 ng/㎖ SCF, 0.1 내지 1000 units/㎖ LIF, 0.1 내지 1000 ng/㎖ bFGF, 0.0004 내지 4 ng/㎖ IL-11 및 0.1 내지 1000 ng/㎖ IGF-1이 첨가된 DMEM이 바람직하다.
배지에 형성된 EG 세포 콜로니는 예를 들어, 파이펫팅을 반복하여 각각의 EG 세포로 분리하고, 회수하여 배지, 예를 들어 상기 언급된 배지에 현탁하고, 이어서 EG 세포주의 형태학적 특징을 나타내는 세포의 콜로니가 형성될 때까지 기저층상에서 7 내지 10일 동안 37 내지 42℃에서 배양한다. 기저층으로서는 섬유아세포가 사용될 수 있으며, 분열억제되지 않은 조류의 배자 섬유아세포 또는 조류의 섬유아세포가 바람직하다.
수득된 EG 세포를 상기와 동일한 배지에서 7 내지 10일 간격으로 계대배양하여 배자 생식세포주를 확립한다. 확립된 배자 생식세포주는 반복된 연속 배양에 의해서 4개월 이상 동안 유지할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법을 사용하여 제조된 닭의 EG 세포주를 제공한다.
닭의 EG 세포주 콜로니의 형태는 여러 층으로 구성되어 있고 콜로니의 경계가 뚜렷하다. 닭의 EG 세포는 큰 핵과 상대적으로 소량의 세포질로 구성되며, 마우스 및 돼지의 ES 세포 및 EG 세포의 분리된 형태와 유사하다(Wobus, A. M. et al.,Exp. Cell. Res.,152, 212-2199(1984); Matsui, Y. et al.,Cell,70, 841-847(1992); Resnick, J. L. et al.,Nature,359, 550-551(1992); Shim, H. et al.,Biol Reprod,57, 1089-1095(1997); and, Piedrahita, J. A. et al.,Biol. Reprod.,58, 1321-1329(1998)). 그러나, 닭의 EG 세포의 형태는 마우스 ES 또는EG 세포와는 달리 콜로니 대부분이 균일한 원형의 형태를 가지고, 다른 종에서 관찰되는 현저하게 어두운 핵인이 뚜렷하게 관찰되지 않는다. 조류는 포유류와 생식세포의 생리, 발달 및 분화 면에서 다르므로, 닭의 EG 세포도 마우스 EG 세포와 형태, 세포접착성 및 그외 특징이 다르다.
닭의 EG 세포는 gPGCs 및 미분화된 배간세포의 특징을 유지한다. 닭의 EG 세포는 SSEA-1 항원을 발현하고, 생체외 부유배양에서 다양한 세포 형태로 분화되는 배자체로 성공적으로 발달된다. 또한, 닭을 사용한 실험에서 닭의 EG 세포는 배발달기간 동안 생식선을 포함하는 다양한 조직으로 분열하고 분화하는 것으로 확인되므로, 생체내에서 다능성을 가진다.
본 발명에서 확립된 닭 EG 세포주의 하나를 1999년 9월 22일자로 한국 세포주 연구재단(KCLRF)에 기탁번호 제 KCLRF-BP-00026 호로서 기탁하였다.
체세포 또는 생식선 키메라는 수정란, 바람직하게는 수정란의 배반엽 세포층(germinal cavity) 또는 혈관에 EG 세포를 미세주입함으로써 제조될 수 있다. 더욱 바람직하게는, EG 세포를 배발달단계 X인 배반엽 세포층 또는 배발달단계 13 내지 17인 혈관에 주입한다.
본 발명의 EG 세포에는 전기충격법(electroporation) 및 리포좀(liposome)을 이용하여 원하는 외래 유전자를 전이시키고 이를 항생제가 함유된 배지에서 계대배양함으로써 안정적으로 전이된 EG 세포를 선발할 수 있다.
따라서, 본 발명의 닭의 EG 세포는 형질전환 닭의 제조 및 생식세포 분화 및 유전자 각인 연구에 유용하다.
본 명세서에 사용되는 %는 별도의 언급이 없는 경우 고체/고체는 중량/중량%, 액체/액체는 부피/부피% 그리고 고체/액체는 중량/부피%를 각각 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실 시 예 1 : 원시생식세포의 분리 및 닭의 EG 세포주를 제조하기 위한 배양 조건 확립
(단계 1) 원시생식세포의 분리
서울대학교 농업생명과학대학 부속 실험목장으로부터 수득한 화이트 레그혼(White Leghorn)의 수정란을 37.5℃ 및 상대 습도 60 내지 70%에서 5.5일 동안(배발달단계 28까지) 배양하였다. 배발단단계 28의 수정란으로부터 배자를 추출한 다음, 마그네슘을 제거한 인산완충 생리 식염수(PBS)가 담긴 100mm 페트리 디쉬에서 세척하여 난황 및 혈액을 제거하였다. 배자를 검은 왁스로 코팅된 페트리 디쉬에 옮겨 담고 포셉(forcep)을 이용하여 배자 원시생식기를 분리하였다. 원시생식기 조직을 트립신(0.25%(v/v))-EDTA(0.05%(v/v))로 처리하여 개개의 gPGCs를 분리하였다. 여기에 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA)가 포함된 DMEM을 첨가하여 트립신-EDTA를 불활성화시키고, 원심분리하여 gPGCs를 수확하였다.
(단계 2) 배양조건의 확립
EG 세포배양 배지(즉, DMEM)를 SCF(stem cell factor), LIF(leukemia inhibitory factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자로 보충하였다. SCF, LIF 및 bFGF는 마우스에서 gPGCs의 생존 및 분열에 중요한 성장 인자라고 보고된 바 있다(Resnick, J. L. et al.,Nature,359, 550-551(1992); and Donovan, P. J.,Curr. Top. Dev. Biol.,29, 189-225(1994)). 상기 세가지 성장인자 외에, IL-11(interleukin-11) 및 IGF-I(insulin-like growth factor-I)과 같은 성장 관련 인자를 배지에 첨가하였다. 상기 단계 1에서 수득한 gPGCs를 상기 인자들이 다양한 조합으로 첨가된 배양 배지에 현탁한 다음, EG 세포의 콜로니가 형성될 때까지 5% CO2존재하의 37℃에서 배양하였다.
그 결과, IL-11 및 IGF-I의 첨가없이는 EG 세포의 콜로니화가 관찰되지 않았으므로, IL-11 및 IGF-I가 닭의 EG 세포의 생존 및 분열에 필수적인 요소라는 것을 알 수 있다.
실시예 2 : 닭의 EG 세포의 배양
실시예 1에서 수득된 EG 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 2% 닭 혈청(Gibco, U.S.A.), 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민, 5.5 x 10-5M β-머캅토에탄올, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 units/㎖ 페니실린, 5ng/㎖ hSCF(humanstem cell factor, Sigma, U.S.A.), 10 units/㎖ mLIF(murine leukemia inhibitory factor, Sigma, U.S.A.), 10ng/㎖ 소의 bFGF(basic fibroblast growth factor, Sigma, U.S.A.), 0.04 ng/㎖ h-IL-11(human interleukin-11, Sigma, U.S.A.) 및 10 ng/㎖ h-IGF-I(human insulin-like growth factor-I, Sigma, U.S.A.)가 포함된, DMEM(Gibco, U.S.A.) 배지로 이루어진 EG 세포 배양배지를 포함하는 24웰 배양 플레이트에 접종하고 5% CO2존재하의 37℃의 배양기에서 7 내지 10일 동안 배양하여 원시생식기 유래 기저세포 (germinal ridge stroma cell, GRSC) 층위에 EG 세포 콜로니를 형성시켰다. 닭의 EG 세포 콜로니를 가볍게 파이펫팅하여 GRSC 층으로부터 분리한 다음, 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 수득하였다. 수득된 EG 세포를 DMEM에 현탁하고 분열억제 처리되지 않은 닭 배자 섬유아세포(chicken embryonic fibroblast, CEFs)와 함께 새로운 24-웰 플레이트에 분주하였다. EG 세포 콜로니를 상기와 동일한 조건에서 7 내지 10일 간격으로 계대배양하였다. 상기 콜로니는 10회 이상 계대배양이 가능하였으며 반복배양을 통해 4개월 기간 이상 분열하였다.
도 1a 및 1b는 닭의 배자 섬유아세포 상에서 3회 계대배양한 후의 닭의 EG 세포 콜로니를 나타낸 사진이다(1a: 스케일, 50㎛ 및 1b: 스케일, 25㎛). 닭의 EG 세포의 형태는 마우스 ES 또는 EG 세포와는 조금 다르다. 닭의 EG 세포의 거의 대부분은 균일한 원형의 형태를 가지고, CEF 기저층과 강하게 결합하고 있지 않다. 마우스 ES 또는 EG 세포와 달리, 닭의 EG 세포는 세포간에 강한 결합이 없고, 각각의 세포들을 구분하기가 어렵지 않다. 그러나 콜로니의 형태는 여러 층으로 구성되어 있고 콜로니의 경계가 뚜렷하여 마우스 ES 또는 EG 세포와의 유사한 특징도 가지고 있음을 볼 수 있다. 닭 EG 세포는 핵인은 뚜렷하게 관찰되지 않으나, 큰 핵과 상대적으로 적은 양의 세포질로 구성되어 있다.
실시예 3: EG 세포의 특성 확인
EG 세포가 다능성 세포의 특징들을 가지는지 확인하기 위해, 글리코겐 및 SSEA-1 에피토프의 존재 뿐만 아니라 알칼리 포스파타제 활성 및 생체외 분열 및 분화 능력 등을 다음과 같이 조사하였다.
(1) PAS(Periodic Acid-Shiff's) 염색
실시예 2에서 수득된 4회 연속 계대배양된 EG 세포 콜로니를 1% 글루타르알데히드 용액이 있는 플레이트에 5분 동안 고정화한 다음, 동량의 PBS로 2회 세척하였다. EG 세포 콜로니를 실온의 과요오드산(periodic acid) 용액(Sigma, U.S.A.)에 5분 동안 침지시킨 다음, 동량의 PBS로 세척하였다. 이어서, EG 세포 콜로니를 실온의 Shiff's 용액(Sigma, U.S.A.)에 15분 동안 침지한 다음, 동량의 PBS로 2회 세척하였다. 수득된 EG 세포 콜로니를 광학 현미경으로 관찰하였다.
닭의 EG 세포는 세포질 중의 글리코겐을 염색하는 PAS 반응(Meyer, D. B.,Dev. Biol.,10, 154-190(1964))에 의해 쉽게 확인할 수 있다. 도 2에서 보듯이, 상대적으로 약하기는 하나 4회 계대배양된 EG 세포가 PAS에 의해 염색되었음을 알 수 있었다.
(2) 항 SSEA-1 항체 검색
SSEA-1 에피토프(epitope)는 미분화된 마우스 ES 세포에 특징적으로 나타나므로, 다능성 배간세포를 구별하는 기준으로 사용되어 왔다(Solter, D., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,75, 5565-5569(1978)). 본 발명의 EG 세포가 다능성을 갖는지 확인하기 위해 다음과 같이 SSEA-1 에피토프 발현여부를 조사하였다.
실시예 2에서 수득한 4회 계대배양된 EG 세포 콜로니를 1% 글루타르알데히드 용액이 들어있는 플레이트에 5분 동안 고정화한 다음, 동량의 PBS로 2회 세척하였다. 항 SSEA-1 단일 항체를 포함하는 복수액(MC-480; Solter, D. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,75, 5565-5596(1978), 입수처: Development Studies Hybridoma Bank, Iowa University U.S.A.)을 PBS로 1000배 희석한 다음, EG 세포 콜로니에 첨가하였다. 수득된 EG 세포 콜로니를 아비딘/바이오틴-결합된 알칼리 포스파타제(Vector Lab., U.S.A.)와 반응시킨 다음, BCIP/NBT 알칼리 포스파타제 기질(BCIP/NBT alkaline phosphatase substrate kit IV, Vector Lab., U.S.A.)과 반응시켰다. 여기에 10mM EDTA(pH 8.0)를 첨가하여 반응을 종결시켰다.
도 3에서 보듯이, 4회 연속 계대배양된 모든 EG 세포는 SSEA-1 염색에 대해 양성반응을 나타내었으며, 이는 SSEA-1 에피토프가 닭의 EG 세포에 의해 발현되는 것을 의미하므로 닭의 EG 세포가 다능성을 가짐을 확인하였다.
(3) 분열 분석
실시예 2에서 수득한 8회 연속 계대배양된 EG 세포 콜로니를 브로모데옥시우리딘을 함유하는 37℃ 용액(BrdU, a thymidine analog)에서 1 시간 동안 방치한 후, 동량의 PBS 용액으로 두 번 세척하였다. 수득된 EG 세포 콜로니를 세포 분열분석 키트(Amersham, UK)로 염색한 다음, 상기 (1)의 과정을 반복하여 PAS로 염색하였다. BrdU를 함유하는 EG 세포 콜로니를 임의의 항-BrdU 단일클론성 항체 및 퍼옥시다제/DAB 시스템(Amersham, UK)을 사용하여 검색하였다.
도 4는 8회 연속 계대배양된 EG 세포 콜로니의 분열 분석결과를 나타낸다. 여기에서 보듯이, 8회 계대배양된 EG 세포가 계속 분열하는 것을 알 수 있다.
(4) 알칼리 포스파타제 활성 분석
실시예 2에서 수득한 4회 연속 계대배양된 EG 세포 콜로니의 알칼리 포스파타제 활성을 알카리 포스파타제 기질 키트 IV(Vector Lab., U.S.A.)를 사용하여 측정하였다.
이 결과로부터 EG 세포는 알칼리 포스파타제 활성을 거의 가지지 않으며, 연속되는 배양기간 동안 활성을 회복하지 못함을 알 수 있다.
문헌(Swartz, W. J.,Anat. Rec.,202, 379-385(1982))과 같이 조류 원시생식세포의 알칼리 포스파타제 활성은 배양 초기 2일까지는 관찰되지만 원시생식세포가 원시생식기에 진입한 후에는 관찰되지 않았으며, 이는 gPGCs 및 이로부터 계대배양된 EG 세포의 알칼리 포스파타제 활성이 실제로 거의 없다는 것을 의미한다.
(5) 생체외 분화 및 면역조직화학적 분석
닭의 EG 세포가 배자체(embryoid body)를 형성하는지를 확인하기 위하여, 실시예 2에서 수득한 4회 계대배양된 EG 세포 콜로니를 조심스럽게 교반한 다음, 원심분리하여 개개의 분리된 EG 세포를 수득하였다. EG 세포를 mLIF가 제거된 EG 세포 배양 배지에 현탁한 다음 비-접착성 세균상 페트리 디쉬에 분주하였다. 배지를8일 동안 이틀 마다 갈아주고 세포의 형태를 매일 조사하였다.
도 5a는 8일 된 현탁배양액에서 닭의 EG 세포로부터 형성된 배자체를 나타낸 것이다.
형성된 배자체를 수집한 다음, 96웰 플레이트에 분주하여 배자체가 플레이트에 부착 및 분화하도록 하였다. 그 결과 수득된 세포의 면역조직화학적 분석은 근육-특이적 액틴(Dako, U.S.A.), 내배엽-특이적 α-1-펙토프로테인(Dako, U.S.A.) 및 외배엽-특이적 S100(Dako, U.S.A.)에 대한 항체와 함께 DAKO LSAB 키트 및 아비딘/바이오틴-결합된 퍼옥시다제 시스템(Dako, U.S.A.)을 사용하여 실시하였다.
도 5b 내지 5d는 액틴, α-1-펙토프로테인 및 S100에 대한 항체를 사용한 배자체의 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, EG 세포는 생체외에서 다양한 세포 형태, 예를 들어, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통으로 분화될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 키메라 닭의 제조
갓 낳은 수정란으로부터 수득한 배발달단계 X 및 배발달단계 13-17(Eyal-Giladi, H. et at.,Dev. Biol.,49, 321-337(1976))의 한국 오골계 배자를 수용체로서 사용하였다. 한국 오골계 수정란의 배발달단계 X는 측면부, 배발달단계 13-17은 첨단부에 구멍을 내어 작은 창을 만든 다음, 껍질 막을 제거하였다.
실시예 2에서 수득한 3회 또는 4회 계대배양된 EG 세포를 EG 세포 배양 배지에 103세포/㎕의 농도로 현탁한 다음, 현탁액 2㎕를 마이크로파이펫을 사용하여 수정란의 배발달단계 X는 배반엽 세포층(germinal cavity)에, 배발달단계 13-17은 혈관에 미세주입하였다. CEF가 주입된 수정란을 대조군으로 사용하였다. 각 수정란의 창을 파라핀 필름으로 두 번 봉한 다음, 수정란이 부화할 때까지 첨단부를 아래로 향하도록 놓았다. 부화된 병아리는 3개월 동안 성장후에도 체세포 키메라의 깃털 패턴을 나타내었다.
처리된 45개의 달걀 중 8개의 달걀이 부화되었으며, 이중 3마리의 병아리(37.5%)가 외형상 키메라였다. 키메라 병아리들 중, 두 마리의 부분적 백색 깃털을 갖는 병아리는 3회 연속 계대배양된 EG 세포가 주입된 배자로부터 부화된 것이고, 한 마리는 4회 연속 계대배양된 EG 세포가 주입된 배자로부터 부화된 것이었다. 3 마리의 병아리에서 백색 얼룩 범위는 매우 다양하였다. 대조군 병아리에서는 백색 깃털이 관찰되지 않았다.
도 6a는 흑색 깃털을 갖는 전형적인 한국 오골계를 나타내고, 도 6b는 목주변 및 가슴에 부분적인 백색 깃털을 갖는 체세포 키메라 닭을 나타낸다. 화이트 레그혼의 깃털 색은 우성의 염색 억제 유전자(I/I)로 인해 백색을 나타내며, 한국 오골계는 열성의 염색 유전자(i/i)로 인해 흑색을 나타낸다. 따라서, 상기 결과는 화이트 레그혼의 EG 세포는 한국 오골계의 배자 수용체에서 생체내 분화능을 갖고 있으며, 따라서, EG 세포는 생체내에서 다능성임을 의미한다. 닭의 체세포 키메라화를 확인하기 위해, 부화 도중 죽은 5마리의 병아리의 근육, 심장, 간 및 생식기로부터 페놀추출을 통해 게놈 DNA 샘플을 수득한 다음, 서열번호 1 및 2를 갖는 화이트 레그혼에 특이적인 SCAR(sequence characterized amplified region) 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 실시하였다.
PCR 반응은 50 내지 100ng 게놈 DNA, 0.2 mM의 각 dNTP, 10mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.4 pmol 정방향 프라이머, 0.4 pmol의 역방향 프라이머 및 1 units의 Taq 폴리머라제를 사용하는 25㎕ 반응액에서 수행하였다. 94℃에서 1 분간 변성(denaturation)단계, 60℃에서 1분간 어닐링(annealing) 단계 및 72℃에서 2 분간 신장(extension)단계로 이루어진 PCR 프로그램을 DNA 열순환기(Perkin Elmer Cetus)에서 45회 실시하였다. 제조된 화이트 레그혼의 특이적인 DNA 단편은 약 3 kb였다. 도 7은 체세포 키메라화에 대한 PCR 분석 결과를 나타난 것으로, 제 1 열, 5 열, 9 열, 13 열 및 17 열은 간 DNA를 사용한 PCR 생성물이고, 제 2 열, 6 열, 10 열, 14 열 및 18 열은 근육 DNA를 사용한 PCR 생성물이고, 제 3 열, 7 열, 11 열, 15 열 및 19 열은 심장 DNA를 사용한 PCR 생성물이고, 제 4 열, 8 열, 12 열, 16 열 및 20 열은 생식기 DNA를 사용한 PCR 생성물이고, 제 21 열은 한국 오골계 게놈 DNA이고, 제 22 열은 화이트 레그혼의 게놈 DNA이고, 제 23 열은 DNA가 없는 대조군이다. 여기에서 보듯이, 체세포 키메라화는 개체마다 다르다는 것을 알 수 있다. 5 마리의 병아리중 한 마리는 모든 조직 샘플(간, 심장, 근육 및 생식선)에서 체세포 키메라화를 나타내었다. 주입된 EG 세포는 두 마리의 부화된 병아리의 생식기 및 모든 병아리의 심장에 영향을 주었고, 두 마리의 병아리는 단지 심장에서만 체세포 키메라화를 나타내었다. 이 결과는 닭의 EG 세포는 생식기을 포함하는 다양한 조직에서 생체내 분화할 수 있고 영향을 줄 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 5: 원시생식세포 또는 EG 세포내로의 외래유전자 전이 및 선발
전기충격법(electroporation) 및 리포좀(liposome)을 이용하여 원시생식세포 또는 EG 세포로 외래유전자 전이를 실시하였다. 유전자 전이 효율은 전기충격법이 평균 80%정도, 리포좀 방법이 30%정도로 나타났다. 또한 유전자 전이 후 항생제인 350 ㎍/㎖의 네오마이신(neomycin)을 첨가한 DMEM 배지에서 계속적으로 계대배양하여 외래유전자가 전이된 세포만을 특이적으로 선발할 수 있었다.
이와 같이 본 발명의 방법에 따라 수득된 닭의 EG 세포는 4개월 이상 동안 다능성을 가지며, 형질전환 닭의 제조, 및 생식세포 분화 및 유전자 각인 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (25)
- (a) 조류 배자 생식기(embryonic gonad)에서 분리된 원시생식세포(primordial germ cell, gPGC)를 세포 성장 인자 및 분화 억제 인자가 포함된 배지에서 배양하여 배자생식세포(embryonic germ cell, EG cell) 콜로니를 수득하는 단계;(b) 조류의 섬유아세포 또는 조류의 배자 섬유아세포를 기저세포층(feeder layer)으로 사용하여 상기와 동일한 배지에서 콜로니를 형성할 때까지 수득된 EG 세포를 배양하는 단계; 및(c) EG 세포를 회수하고 상기와 동일한 배지에서 계대배양을 통하여 EG 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 조류의 배자생식(EG) 세포주의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 배자 생식기가 배발달단계 14 내지 36인 조류 배자의 생식기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 배자 생식기가 배발달단계 24 내지 30인 조류 배자의 생식기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 조류가 칠면조, 닭, 메추라기, 꿩 또는 오리인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 (a) 단계에서 원시생식세포의 배양시 기저층으로서 원시생식기 유래 기저세포(germinal ridge stroma cells; GRSCs)층을 사용하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 성장 인자가 SCF(stem cell factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), IL-11(interleukin-11), IGF-I(insulin-like growth factor-I) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 배지가 0.05 내지 500 ng/㎖의 SCF, 0.1 내지 1000 ng/㎖의 bFGF, 0.0004 내지 4 ng/㎖의 IL-11, 0.1 내지 1000 ng/㎖의 IGF-I 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택된 성장 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 분화 억제 인자가 LIF(leukemia inhibitory factor)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서,LIF가 0.1 내지 1000 units/㎖의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 배지가 포유류 혈청 또는 조류 혈청을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 배지가 피루브산 나트륨, 글루타민, β-머캅토에탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택된 보조성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 기저세포층이 분열억제 처리되지 않은 것임을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,상기 기저세포층이 닭의 섬유아세포 또는 닭의 배자 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항의 방법에 의해 제조된 조류 배자생식세포주.
- 제 16 항에 있어서,연속적으로 계대배양할 수 있는 배자생식세포주.
- 제 16 항에 있어서,SSEA-1 항원을 발현하고, 배자체의 형성능을 가지며, 다양한 조직으로 분화될 수 있는 배자생식세포주.
- 제 16 항에 있어서,조류 배자생식세포주가 기탁번호 KCLRF-BP-00026 호인 조류 배자생식세포주.
- 제 16 항의 배자생식세포주를 수정란에 주입하는 것을 특징으로 하는 체세포 키메라 및 생식선 키메라의 제조방법.
- 제 20 항에 있어서,배자생식세포주를 상기 수정란의 배반엽 세포층 또는 혈관에 미세주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서,배자생식세포주를 배발달단계 X인 수정란의 배반엽세포층내로 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서,배자생식세포주를 배발달단계 13 내지 17인 수정란의 혈관에 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 확립된 EG 세포 또는 원시생식세포내로 전기충격법(electroporation) 또는 리포좀을 이용하여 외래 유전자를 전이시키는 방법.
- 외래 유전자를 전이시킨 EG 세포를 항생제가 첨가된 배지에서 계대배양함으로써 안정적으로 외래 유전자가 전이된 세포만을 선발하는 방법.
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