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KR100351389B1 - 히루딘유도체및이의제조방법 - Google Patents

히루딘유도체및이의제조방법 Download PDF

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KR100351389B1
KR100351389B1 KR1019950002200A KR19950002200A KR100351389B1 KR 100351389 B1 KR100351389 B1 KR 100351389B1 KR 1019950002200 A KR1019950002200 A KR 1019950002200A KR 19950002200 A KR19950002200 A KR 19950002200A KR 100351389 B1 KR100351389 B1 KR 100351389B1
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도미니크트리피에
막스로포트
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Abstract

히루딘 유도체는 이 분자의 일부를 아미노 유도체를 사용하여 선택적인 효소적 치환에 의해 제조할 수 있다. 히루딘 유도체는 항응혈 효과를 갖는 약제를 제조하는데 적합하다.

Description

히루딘 유도체 및 이의 제조방법
본 발명은 히루딘 유도체, 이의 분자 일부를 아민 유도체를 사용하여 선택적인 효소적 치환에 의해 히루딘 유도체를 제조하는 방법 및 히루딘 유도체의 약제로서의 용도에 관한 것이다.
히루딘은 65개의 아미노산 잔기로 이루어지고 거머리[히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)]의 타액선으로부터 분리할 수 있는 단백질이다. 이는 트롬빈의 선택적 억제제로서 응혈 억제 효과를 갖는다[참조: Pharmazie 36, 633-660(1981)]. 단쇄 폴리펩티드는 강하게 포개진 압축된 단백질 3차 구조로서 1 내지 49 위치의 아미노산 사이의 도메인을 안정화시키는 3개의 디설파이드 브릿지를 함유한다. 선형의 C 말단 아미노산 서열 55 내지 65는 트롬빈과의 결합을 위한 앵커(anchor) 서열을 나타낸다. 천연 히루딘은 위치 63의 티로신 잔기의 페놀성 OH 그룹상에 설페이트 라디칼을 함유함으로써 산성 아미노산 잔기의 집합체에 의해 이미 야기된, 이러한 서열 영역의 산성 특성을 강화시킨다. 설페이트 그룹을 제거하면 해리상수 KD값이 증가하는데, 히루딘/트롬빈 상호작용의 경우에는 60pmol 내지20fmol 범위이다.
화학적 및 효소적으로 제조된 히루딘 유도체는 EP 제0 493 588호(니트로 그룹, 할로겐 치환) 및 DE 제4 224 213호(C-말단, 효소적 아미드화)에서 발견할 수 있다. N 말단의 유리 아미노 그룹 또는 리실 측쇄와 사카라이드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 접합체는 US 제4 179 337호 및 제4 847 325호에 나타나 있다.
장시간-작용하는 약제로서 사용하기 위한 히루딘의 통상적인 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 히루딘에 함유된 아미노산의 작용성 그룹과 폴리에틸렌 글리콜 잔기(PEG)를 화화적으로 커플링시켜 제조한다(참조: EP 제0 345 616호). 이러한 상황하에서, 잔기는 원칙적으로 히루딘 분자내의 수개의 작용성 부위에 결합할 수 있기 때문에 규정된 화합물이 생성되지 않는다.
히루딘은 아미노산인 리신, 티로신 및 페닐알라닌을 분자내에 각각 3개, 2개 및 1개의 위치에 함유한다. 단백질내의 이러한 위치는 보통 트립신 또는 키모트립신과 같은 세린 프로테아제에 의해 분리된다. 그러므로, 이미 공지된 효소적 반합성법[참조: The Peptides, S. Udenfriend and J. Meienhofer (Eds.), vol. 9, Acad. Press, NY. 1987, 103-165]은 히루딘에 적용될 수 없는 것으로 여겨진다. 전문가의 지식에 근거하면, 히루딘의 불활성 분해 생성물이 우선적으로 생성될 수 있는 것으로 예상된다.
특정한 반응 조건하에서, 신규한 화합물을 생성시키는 선택적 펩티드 전이(transpeptidation)가 히루딘과 키모트립신, 트립신 또는 필적할만한 효소(예를 들면, 리실 엔도펩티다제)와의 효소적 반합성 반응에서 일어나는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 하기 일반식(I) 또는 (II)의 화합물에 관한 것이다.
A0-A1-A2-(히루딘 3-36)-(Y), (히루딘 37-65) (I)
A0-A1-A2-(히루딘 3-63)-(Y) (II)
상기식에서,
Y는 아민 유도체이고,
A1 및 A2는 서로 독립적으로 아미노산 잔기이며,
A0은 아미노산 잔기 또는 수소원자이다.
일반식(I) 및 (II)에 사용된 명명법은 문헌[참조: D. Tripier, Folia Haematol. (Leipzig) 115, 30-35 (1988)]을 참조한다.
일반식(I)에서 콤마는 기초가 되는 히루딘의 아미노산 서열 중 위치 36과 37 사이가 끊어져 있고 화합물이 디설파이드 브릿지에 의해 결합되는 2개의 히루딘 단편을 함유하는 것을 나타낸다. 아민 유도체 Y는 아미드 결합에 의해 기초가 되는 히루딘의 본래 서열 중 위치 36의 아미노산에 결합된다.
일반식(II)는 아미드 결합에 의해 기초가 되는 히루딘의 본래 서열 중 위치 63의 아미노산에 결합된 아민 유도체 Y를 함유하는 화합물을 나타낸다.
아민 유도체 Y는 바람직하게는 하기 일반식(IIIa) 또는 (IIIb)의 화합물이다.
H2N-R-X (111a)
A-R1-X (111b)
상기식에서,
A는 a) 아미노산 잔기 또는
b) 2 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이고,
R은 a) 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
b) 1) 페닐,
2) 인돌릴,
3) 이미다졸릴 또는
4) 하이드록실에 의해 1회 이상 치환된 페닐에 의해 서로 독립적으로 1회 이상 치환된 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
c) 페닐 또는
d) 나프틸이며,
R1은 a) 수소원자,
b) 공유결합,
c) 글루코즈, 프럭토즈, 만노즈, 갈락토즈, 리보즈, 리불로즈 또는 크실로즈와 같은 당,
d) 2 내지 10개의 당을 함유하는 폴리사카라이드 또는
e) -[0-(CH2)m]n-(여기서, m은 정수 2, 3, 4 또는 5이고 n은 정수 1 내지 100이다)이고,
X는 a) 수소원자,
b) -OR2,
c) -SR2,
d) -NHR2,
e) -COOR2또는
f) A[여기서, R2는 1) 수소원자,
2) 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
3) 3.1 페닐,
3.2 인돌릴,
3.3 이미다졸릴 또는
3.4 하이드록실에 의해 1회 이상 치환된 페닐에 의해
1회 이상 치환된 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
4) 페닐 또는
5) 나프틸이다]이다.
일반식(IIIa) 또는 (IIIb)의 아민 유도체 Y는 A가 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이고,
R이 1) 페닐,
2) 인돌릴,
3) 이미다졸릴 또는
4) 4-하이드록시페닐에 의해 치환된 에틸이며,
R1이 -[0-(CH2)m]n-(여기서, m은 숫자 2이고 n은 정수 20 내지 50이다)이고,
X가 a) 수소원자,
b) -OR2,
c) -NHR2또는
d) -COOR2[여기서, R2는 1) 수소원자,
2) (C1-C5)-알킬 또는
3) 페닐이다]인 것이 바람직하다.
일반식(IIIa) 또는 (IIIb)의 아민 유도체 Y는 A가 그룹 Thr 또는 Arg으로부터의 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이고,
R1이 a) 수소원자,
b) 공유결합,
c) 글루코즈 또는
d) 분자량이 100 내지 3,000g/mol인 폴리에틸렌 글리콜이며,
X가 a) 수소원자 또는
b) -OR2(여기서, R2는 3급 부틸이다)인 것이 특히 바람직하다.
분자량이 1,500g/mol인 -[0-(CH2)m]n-라디칼이 특히 바람직하다.
아미노산은 천연 또는 비천연, 유전적으로 코드화할 수 있거나 할 수 없는 L- 또는 D-아미노산을 의미하는 것으로 이해한다.
L- 또는 D-아미노산의 예로는 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 오르니틴, 시트룰린, 아르기닌, 리신, 아스파라긴, 아스파트산, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 티록신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 트립토판 및 히스티딘이 있다. 글리신 및 γ-아미노부티르산도 아미노산의 추가 예이다.
본 발명은 또한 아민 유도체와 히루딘을 프로테아제, 특히 세린 프로테아제, 바람직하게는 키모트립신, 트립신, 트립신-유사 효소 또는 리실 엔도펩티다제의 존재하에 반응시켜 일반식(I) 및 (II)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
사용할 수 있는 히루딘의 예는 EP 제142 860호, 제158 564호, 제158 986호, 제168 342호, 제171 024호, 제193 175호, 제209 061호 및 제227 938호, DE 제34 45 517호 및 제38 05 540.6호; 및 문헌[참조: Chang, FEBS 164, 307 (1983); Tripier, Folia Haematol. (Leipzig) 115, 30-35 (1988)]에 기술되어 있다. 서열목록의 서열확인번호 1은 히루딘 구조의 예를 나타낸다.
적합한 히루딘의 예는 상기한 참조문헌에 기술된 화합물, 특히 EP 제171 024호, 제158 986호 및 제209 061호, 및 DE 제38 05 540.6호에 기술된 화합물로서, 예를 들면,
이들 히루딘은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 펩티드 화학 방법 또는 이와 동등한 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 또는, 언급된 히루딘은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 재조합 DNA법으로 수득할 수 있다.
일반식(I)의 화합물은 트립신 또는 트립신-유사 효소(예: 리실 엔도펩티다제)를 사용하여 히루딘 및 과량의 일반식(IIIa) 또는 (IIIb)의 적합한 아민 유도체로부터 형성된다. 적합한 아민 유도체는 트립신이 사용될 경우 어떠한 유리(즉, 조금도 보호되지 않은) 아르기닌 측쇄 또는 리실 측쇄도 함유하지 않고, 또는 리실 엔도펩티다제가 사용될 경우 어떠한 유리 리실 측쇄도 함유하지 않는 유도체이다. 펩티드 전이는 사용되는 히루딘의 아미노산 서열 중 위치 36의 리신 잔기의 C 말단에서 일어난다. 이 반응에서, 펩티드 결합 Lys-Asn-(36-37)이 개방되고 아민 유도체가 Lys 잔기의 카복실 그룹에 모호하게 결합된다. 이로써 3개의 디설파이드 브릿지에 의해 서로 연결된 "2개의 쇄" 히루딘 유도체가 생성된다. 따라서, 2개의 말단 아미노산 잔기 A0 또는 A1(A0이 없을 경우) 및 Asn 37(기초가 되는 히루딘 아미노산 서열 중 위치 37의 아스파라긴)을 N 말단 아미노산 서열 분석[에드만(Edman) 분해]에 의해 검출함으로써 히루딘 유도체가 2개의 쇄 구조임이 확인된다.
일반식(II)의 화합물은 키모트립신 또는 필적할만한 방식으로 작용하는 효소를 사용하여 히루딘 및 과량의 일반식(IIIa) 또는 (IIIb)의 적합한 아민 유도체로 부터 형성된다. 이 경우, 적합한 아민 유도체는 어떠한 유리 티로실 측쇄도 함유하지 않는 것이다. 펩티드 전이는 사용되는 히루딘의 아미노산 서열 중 위치 63의 티로신 잔기의 C 말단에서 일어난다. 이 반응에서, 기초가 되는 히루딘의 아미노산 서열 중 위치 64 및 65의 아미노산으로 이루어진 디펩티드가 아민 유도체에 의해 대체된다.
아민 유도체는 과량으로 사용한다. 바람직하게는, 히루딘의 양에 대해 50 내지 150배 몰과량의 아민 유도체를 사용한다. 아민 유도체는 바람직하게는 가능한한 고농도로 사용한다. 물 또는 물과 비양성자성 유기 용매(예: 디메틸포름아미드)와의 혼합물이 용매로서 사용된다. 혼합물은 바람직하게는 물을 25용적%(v/v)미만으로 함유한다. 물과 상용성인 유기 용매는 아민 유도체가 물에 거의 용해되지 않을때 사용하는 것이 유리하다. 이런 방식으로, 반응 혼합물이 균일해질 수 있다. 효소의 양은 바람직하게는 사용된 히루딘 양의 5 내지 10중량%에 상응한다. 반응은 바람직하게는 pH 4 내지 6 및 반응 온도 0 내지 40℃, 특히 바람직하게는 0 내지 10℃의 온도에서 수행한다.
사용되는 효소는 생물학적 기원이 상이할 수 있는데, 예를 들면, 트립신은 돼지 또는 소로부터 유래할 수 있다.
아미노산 에스테르 또는 올리고펩티드 에스테르를 아민 유도체로서 사용할 경우, 히루딘의 효소-촉매된 전환으로 상응하는 히루딘 유도체 에스테르가 생성된다. 경우에 따라, 에스테르 그룹을 통상적인 방법으로 제거할 수 있다. 그러나, 크로마토그래피 정제후 중간체의 에스테르 그룹을 제거하는 것만이 유리하다.
본 발명에 따른 히루딘 유도체의 효소-촉매된 반합성은 히루딘 구조를 변경시키는 재조합 방법을 보충하는 방법이다. 특히, D-아미노산과 같은 코드화할 수 없는 아미노산 또는 모든 임의의 아민 유도체를 반합성법을 사용하는 특별한 방법으로 도입시킬 수 있다.
본 발명에 관련된 방법으로, 예를 들면, 서방성 제제로서 의약적으로 사용될 수 있는 일반식(I) 또는 (II)의 규정된 히루딘/폴리에틸렌 글리콜 유도체를 제조할 수 있다. 아미노산 또는 올리고펩티드로 에스테르화시킨 폴리에틸렌 글리콜은 아민 유도체로서 히루딘과 매우 선택적으로 반응함으로써 폴리에틸렌 글리콜 잔기가 규정된 위치에서 1회 결합될 수 있다.
본 발명에 따라 제조되는 기타 히루딘 유도체는, 예를 들면, 이온전기도입과 같은 경피 투여에 치료학적으로 유용할 수 있다. 이온전기도입에 의한 히루딘 유도체의 투여는 본 발명의 추가 대상이다.
본 발명은 또한 일반식(I) 및/또는 (II)의 하나 이상의 화합물을 유효량 함유하는 약제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 일반식(I) 및 (II)의 화합물의 항웅혈 효과를 갖는 약제로서의 용도에 관한 것이다.
재조합하여 수득한 데설페이토-Tyr63 히루딘(서열목록 서열확인번호 : 1)을 사용하는 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명이 이들 실시예에 제한되지는 않는다.
실시예 1 : 히루딘의 제조
히루딘을, 예를 들면, EP 제0324712호에 따라 히루딘을 분비하는 효모 세포에서 합성한다. 이어서, 히루딘을, 다이아이온(RDiaion) HP20(Mitsubishi Chem. Ind., Japan) (EP 제0316650호 참조)을 함유하는 컬럼상에서 크로마토그래피한다. 이어서, 투석 및 트롬빈-세파로즈(Sepharose)상에서 친화력 크로마토그래피한 다음, 최종적으로 역상 HPLC에 의해 정제한다.
실시예 2
재조합하여 수득한 데설페이토-Tyr63 히루딘(서열목록 서열확인번호 : 1) 3g을 물 6ml에 Thr(But)OBut 아세테이트(t-부틸 보호 그룹을 갖는 트레오닌; 제조는 EP 제0056951호 참조) 20g과 함께 용해시키고, 이 용액에 키모트립신(Merck, Darmstadt) 190mg을 가한다. 용액의 pH를 4.5로 조절하고, 반응 혼합물을 4 ℃에서 72시간 동안 저장한다.
이어서, 반응 혼합물을 메탄올 100ml로 회석하고 디메틸 에테르 300ml를 가한다. 수득한 침전물을 원심분리한다. 잔사를 메탄올/디에틸 에테르(1:2 v/v) 혼합물로 다시 한번 세척하고, 원심분리하여 감압하에 건조시켰을 경우에는 에테르로 세척한다.
수율 : 조 생성물 3.6g
조 생성물은 미반응 히루딘, 목적한 히루딘 유도체 및 효소적 분리에 의해 생성된 부산물로 이루어진다. 분석적 HPLC에 의한 조 생성물의 분석은 다음을 나타낸다:
수율 : (히루딘-63)-Thr(But)OBut(64) 39.6%, (히루딘 1-65) 45.9% 및 분해 생성물 6.3%.
조 생성물을, 아세토니트릴/물/트리플루오로아세트산을 사용하여 구배 용출시켜 예비 HPLC 컬럼(5×25cm, 고정상은 역상 C18 물질이다)상에서 크로마토그래피로 분리한다. (히루딘 1-63)-Thr(But)OBut 용출액은 이의 친지성 t-부틸 보호 그룹으로 인해 현저히 지연된 정체 시간으로 용출된다. 순수한 중간체를 함유하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 감압하에 증발시킨 다음 수용액을 동결 건조시킨다.
수율 : (히루딘 1-63)-Thr(But)OBut(64) 963mg(순도: 93.6%).
수득한 히루딘 유도체를 95% 트리플루오로아세트산 20ml에 용해시키고, 이 용액을 실온에서 45분 동안 유지시킨다. 이어서, 빙냉된 디메틸 에테르 100ml를 여기에 가한다. 수득한 침전물을 원심분리하고, 에테르로 3회 세척한 다음 감압하에 건조시킨다.
수율 : (히루딘-63)-Thr64 802mg(서열목록 서열확인번호 2 참조)
생성물의 아미노산 분석은 아미노산 서열로부터 예상한 조성물에 해당한다.
실시예 3
재조합하여 수득한 데설페이토-Tyr63 히루딘(서열목록 서열확인번호: 1) 3g을 실시예 2에서와 같이 Thr(But)-Arg-Arg(표준 방법으로 합성) 41g 및 키모트립신(Merck, Darmstadt) 170mg과 반응시킨다.
반응이 종결되면, 메탄올 300ml 및 디메틸 에테르 150ml를 혼합물에 가한다. 원심분리한 침전물을 메탄올/에테르로 3회 세척한 다음 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시킨다. 수율: 조 생성물 4.8g. 분석적 HPLC(고정상 C18실리카 겔, 용출제: 아세토니트릴/H2O/트리플루오로아세트산)는 다음 조성을 나타낸다: (히루딘 1-63)-Thr(But)(64)-Arg(65)-Arg(66)-OH 65.2%: (히루딘-65) 3.9%; 분리 생성물 18.7%. 생성물의 크로마토그래피 정제 및 분리를 실시예 2에서와 같이 수행한다.
수율 : (히루딘 1-63)-Thr(But)(64)-Arg(65)-Arg(66)-OH 1.55g;
순도 : 90.3%.
트레오닌 측쇄상의 t-부틸 보호 그룹을 실시예 2에서와 같이 공지된 방법으로 제거한다.
수율 : (히루딘 1-63)-Thr(64)-Arg(65)-Arg(66)-OH 1.2g
(서열목록 서열확인번호 3 참조).
생성물의 아미노산 분석은 아미노산 서열로부터 예상한 조성물에 해당한다.
리서스(Rhesus) 원숭이에게 정맥 투여(1mg/kg)한 후 항응혈 효과를 측정할경우, 이 히루딘 유도체는 이의 등전점의 변화에도 불구하고 출발 히루딘의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 나타낸다(시험 조건은 문헌[참조: J. Jurgens, Dtsch. Arch. Klin. Med. 200, 67 (1952)] 참조).
실시예 4
재조합하여 수득한 데설페이토-Tyr63 히루딘(서열목록 서열확인번호 : 1) 3g을 실시예 2에서와 같이 Thr(But)OBut 아세테이트 20g 및 트립신(Merck, Darmstadt) 200mg과 반응시킨다.
반응을 72시간 후 종결시키고, 실시예 2에서와 같이 후처리한다. 수율 : 다음 조성을 갖는 조 생성물 4.2g: (히루딘 1-36)-Thr(But)OBut, (히루딘 37-65) 55%; 미반응 히루딘 31%; 분리 생성물 15%. 크로마토그래피 정제 및 후속적인 분리를 실시예 2에서와 같이 수행한다. 수율: (히루딘 1-36)-Thr(But)OBut, (히루딘 37-65) 1.65g.
트레오닌 잔기의 t-부틸 보호 그룹을 실시예 2에서와 같이 제거한다. 수율 : (히루딘 1-36)-Thr, (히루딘 37-65) 1.3g. 히루딘 유도체 (히루딘 1-36)-Thr의 제1 쇄의 구조는 서열확인번호 4로 나타내고, 히루딘 유도체 (히루딘 37-65)의 제2 쇄의 구조는 서열목록 서열확인번호 5로 나타낸다.
생성물의 아미노산 분석은 아미노산 서열로부터 예상한 조성물에 해당된다. 에드만 서열 분석은 2개의 N 말단 아미노산 잔기 Leu(1) 및 Asn(37)을 나타낸다. 리서스 원숭이에게 정맥 투여한 후 항응혈 효과를 측정할 경우, 이 히루딘 유도체는 놀랍게도 실질적인 구조적 변화에도 불구하고 출발 히루딘의 활성과 실질적으로동일한 활성을 나타낸다.
실시예 5
펩티드 화학의 공지된 방법에 따라, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르와 t-부톡시카보닐트레오닌을, 예를 들면, 하이드록시벤조트리아졸 및 디사이클로헥실 카보디이미드를 사용하여 원-포트(one-pot) 반응으로 반응시켜 H·Thr-0-PEG1500를 제조한다.
재조합하여 수득한 데설페이토-Tyr63 히루딘(서열목록 서열확인번호: 1) 3g을 실시예 2에서와 같이 키모트립신 250mg과 함께 H ·Thr-0-PEG150080g과 반응시킨다. 또한, 가용화제로서 디메틸포름아미드 35ml를 반응 혼합물에 가한다.
반응이 종결되면, 반응 혼합물을 메탄올 200ml로 희석하고, 디메틸 에테르를 가하여 미반응 히루딘 및 PEG-히루딘을 침전시킨다.
원심분리한 조 생성물을, 메탄올/에테르(2:1, v/v)를 포함하는 혼합물로 3회 세척하고 감압하에 건조시킨다. PEG-히루딘 및 히루딘을 예비 HPLC 또는 더욱 바람직하게는 양이온 교환 컬럼(Fractogel-EMD-SO3: Merck, Darmstadt)상에서 크로마토그래피 정제에 의해 실시예 2에서와 같이 분리할 수 있다. 수율 : (히루딘 1-63)-Thr-0-PEG 1.9g, 서열목록 서열확인번호 6 참조.
생성물의 아미노산 분석은 아미노산 서열로부터 예상한 조성물에 해당한다.
PEG 접합체의 존재는 희석된 수용액에서의 키모트립신 분해; 및 후속적인 박층 크로마토그래피를 사용하여 Thr-0-PEG 및 유리 트레오닌과 비교함으로써 증명한다. 이렇게 할 경우, 어떠한 유리 트레오닌도 분석 한계내에서 검출할 수 없다.
실시예 6
재조합하여 수득한 데설페이토-Tyr63 히루딘(서열목록 서열확인번호 : 1) 3g을 D-Glu(OBut)2아세테이트(Sigma, Deisenhofen) 25g과 함께 물 6ml에 용해시키고, 트립신 190mg을 이 용액에 가한다. 용액의 pH를 4.5로 조절하고, 반응 혼합물을 4℃에서 72시간 동안 저장한다.
추가의 공정 및 후처리를 실시예 2와 동일하게 수행한다. 2개의 펩티드 쇄로 이루어진 생성물의 구조에 대해서는 서열목록 서열확인번호 7 및 5의 구성 서열을 참조한다.
실시예 7
재조합하여 수득한 데설페이토-Tyr63 히루딘(서열목록 서열확인번호 : 1) 3g을 D-Glu(OBut)2아세테이트(Sigma, Deisenhofen) 30g과 함께 물 6ml에 용해시키고, 키모트립신 190mg을 이 용액에 가한다. 용액의 pH를 4.5로 조절하고, 반응 혼합물을 4 ℃에서 72시간 동안 저장한다.
추가의 공정 및 후처리를 실시예 2와 동일하게 수행한다.
생성물의 구조는 하나의 쇄(서열목록 서열확인번호 : 8)를 포함한다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인
(A) 명칭 : 훽스트 악티엔게젤샤프트
(B) 스트리트(STREET):
(C) 시 : 프랑크푸르트 암 마인
(D) 국명 : 독일연방공화국
(E) 우편번호 : 65926
(G) 전화번호 : 069-305-6047
(H) 팩스 : 069-35-7175
(I) 텔렉스 : 041234-700 hod
(ii) 출원 명칭 : 히루딘 유도체 및 이의 제조방법
(iii) 서열수 : 8
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC호환
(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25(EPA)
(2) 서열확인번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 65개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(vi) 본래의 공급원 :
(A) 유기체 : 데설페이토-Tyr63 히루딘
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..65
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 : 1 :
(2) 서열확인번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 64개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(vi) 본래의 공급원 :
(A) 유기체 : 히루딘 유도체
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..64
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 : 2 :
(2) 서열확인번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 66개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(vi) 본래의 공급원 :
(A) 유기체 : 히루딘 유도체
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..66
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 : 3 :
(2) 서열확인번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 37개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..37
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 : 4 :
(2) 서열확인번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 29개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..29
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 : 5 :
(2) 서열확인번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 64개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(vi) 본래의 공급원 :
(A) 유기체 : 히루딘 유도체
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..64
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 : 6 :
(2) 서열확인번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 37개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..37
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 : 7 :
(2) 서열확인번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 64개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(vi) 본래의 공급원 :
(A) 유기체 : 히루딘 유도체
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : 단백질
(B) 위치 : 1..64
(xi) 서열 기술 : 서열확인번호 ; 8 :

Claims (9)

  1. 하기 일반식(I) 또는 (II)의 화합물.
    A0-A1-A2-(히루딘 3-36)-(Y), (히루딘 37-65) (I)
    A0-A1-A2-(히루딘 3-63)-(Y) (II)
    상기식에서,
    A1은 아미노산 잔기이고,
    A2는 아미노산 잔기이며,
    A0은 아미노산 잔기 또는 수소원자이고,
    Y는 일반식 H2N-R-X (IIIa) 또는 A-R1-X (IIIb)의 아민 유도체이며,
    A는 a) 아미노산 잔기 또는
    b) 2 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이고,
    R은 a) 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
    b) 1) 페닐,
    2) 인돌릴,
    3) 이미다졸릴 또는
    4) 하이드록실에 의해 1회 이상 치환된 페닐에 의해 서로 독립적으로 1회 이상 치환된 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
    c) 페닐 또는
    d) 나프틸이며,
    R1은 a) 수소원자,
    b) 공유결합,
    c) 글루코즈, 프럭토즈, 만노즈, 갈락토즈, 리보즈, 리불로즈 또는 크실로즈와 같은 당,
    d) 2 내지 10개의 당을 함유하는 폴리사카라이드 또는
    e) -[0-(CH2)m]n-(여기서, m은 정수 2, 3, 4 또는 5이고 n은 정수 1 내지 100이다)이고,
    X는 a) 수소원자,
    b) -OR2,
    c) -SR2,
    d) -NHR2,
    e) -COOR2또는
    f) A[여기서, R2는 1) 수소원자,
    2) 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
    3) 3.1 페닐,
    3.2 인돌릴,
    3.3 이미다졸릴 또는
    3.4 하이드록실에 의해 1회 이상 치환된 페닐에 의해 1회 이상 치환된 직쇄 또는 측쇄의 (C1-C10)-알킬,
    4) 페닐 또는
    5) 나프틸이다]이다.
  2. 제1항에 있어서,
    A가 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이고,
    R이 1) 페닐,
    2) 인돌릴,
    3) 이미다졸릴 또는
    4) 4-하이드록시페닐에 의해 치환된 에틸이며,
    R1이 -[0-(CH2)m]n-(여기서, m은 숫자 2이고 n은 정수 20 내지 50이다)이고,
    X가 a) 수소원자,
    b) -OR2,
    c) -NHR2또는
    d) -COOR2[여기서, R2는 1) 수소원자,
    2) (C1-C5)-알킬 또는
    3) 페닐이다]인 일반식(I) 또는 (II)의 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    A가 그룹 Thr 또는 Arg로부터의 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이고,
    R1이 a) 수소원자,
    b) 공유결합,
    c) 글루코즈 또는
    d) 분자량이 100 내지 3,000g/mol인 폴리에틸렌 글리콜이며,
    X가 a) 수소원자 또는
    b) -OR2(여기서, R2는 3급 부틸이다)인 일반식(I) 또는 (II)의 화합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 분자량 1,500g/mol의 폴리에틸렌 잔기인 일반식(I) 또는 (II)의 화합물.
  5. 제3항에 있어서, R1이 분자량 1,500g/mol의 폴리에틸렌 잔기인 일반식(I) 또는 (II)의 화합물.
  6. 일반식(IIIa) 또는 (IIIb)의 아민 유도체를 프로테아제의 존재하에 히루딘과 반응시켜 제1항 내지 제5항에 청구된 화합물을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 키모트립신, 트립신, 또는 리실 엔도펩티다제와 같은 트립신-유사 효소중에서 선택된 프로테아제를 사용하는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항에 청구된 화합물을 함유하는, 항응혈 효과를 갖는 약제.
  9. 제8항에 있어서, 이온전기도입에 의한 경피 투여용 약제.
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