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KR100316205B1 - 평활근세포의증식을조절하기위한c-myc의안티센스억제 - Google Patents

평활근세포의증식을조절하기위한c-myc의안티센스억제 Download PDF

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KR100316205B1
KR100316205B1 KR1019950702808A KR19950702808A KR100316205B1 KR 100316205 B1 KR100316205 B1 KR 100316205B1 KR 1019950702808 A KR1019950702808 A KR 1019950702808A KR 19950702808 A KR19950702808 A KR 19950702808A KR 100316205 B1 KR100316205 B1 KR 100316205B1
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KR
South Korea
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oligonucleotides
myc
seq
antisense
smc
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KR1019950702808A
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Inventor
앤드류잘뤼스키
이시
Original Assignee
아브람 엠. 골드핑거
토마스 제퍼슨 대학교
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Publication date
Application filed by 아브람 엠. 골드핑거, 토마스 제퍼슨 대학교 filed Critical 아브람 엠. 골드핑거
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Abstract

본 발명은 평활근 세포의 증식을 조절하는데 유용한 안티센스 치료요법을 제공한다. 또한 재협착증을 치료 및 방지하는 방법도 제공된다.

Description

평활근 세포의 증식을 조절하기 위한 c-myc의 안티센스 억제
발명의 분야
본 발명은 c-myc 프로토-온코진에 대하여 특정된 안티센스 치료요법에 의한 평활근 세포의 증식조절에 관한 것이다.
발명의 배경
관상동맥 혈관형성술(coronary angioplasty)은 90% 이상의 환자에서 비외과적인 맥관재생(revascularization)을 성공적으로 유발시킨다. 1990년도에 미국에서는 300,000건 이상의 관상동맥 혈관형성술이 수행되었다. 그러나, 이러한 관상동맥 혈관형성술의 주요한 한계점은 수술후 처음 6달 이내에 30 내지 40% 비율로 일어나는 재협착증(restenosis)이다.
혈관의 평활근세포(SMC)는 관상동맥 혈관형성술 후의 아테롬성동맥경화증(atherosclerosis) 및 재협착증 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 상기 세포들의 존재는 상기 병변의 두가지 타입 모두에서 확인되었고, 기본적으로 SMC의 수축성 표현형으로부터 합성 표현형으로의 변화에 기인한다, 이 현저한 특성은 SMC 증식, 메디아로부터 동맥내막(intima)으로의 이동, 및 세포외부 매트릭스의 합성과 관련이 있으며, 상기 특징들은 모두 신생 동맥내막 형성(동맥의 협소화)을 유발한다. 그 과정이 수십년간에 걸쳐 진행되는 아테롬성동맥경화증과는 달리, 혈관의 재협착증은 수개월간에 걸쳐 초기환자 혈관의 신생 동맥내막 형성에 의해 상당한 협소화로 이르는 벌룬(balloon) 상해에 대한 급성반응을 나타낸다. 그러므로, 재협착증를 조절하는데는 SMC의 성장 억제가 필요하다는 것이 명백해진다.
재협착증 방지에 대한 집중적인 실험 및 임상적인 연구조사가 과거 십여년동안 행해졌다. 여러 가지 중재수단들, 예컨대 항-혈소판, 항-응고, 항-염증 및 혈관확장 치료요법들은 실험적인 벌룬 상해후에 신생 동맥내막 증식의 심각성을 적합하게 감소시키는 것으로 나타났다[Powell et al., Science 1989, 245, 186-188; Castellot, J. et al., J. Cell Physiol. 1985, 124, 21-38; Fox et al., Science 1988, 241, 453-456].
최근에 이르러, 재협착증을 제한하기 위하여 새로운 의료장치(예컨대,스텐즈, 아테렉토미(atherectomy), 레이저, 로타블레이터 등)를 적용하려는 시도들이 이루어졌다. 그러나, 예비적인 데이터는 상기 중재수단들이 제한된 역할만을 수행한다는 것을 보여주었는데, 왜냐하면 이런 기계적인 중재수단들이 관상동맥 혈관형성술의 일차적인 결과를 개선시키는 한편으로, 기계적치료기법들은 치료과정과 관련된 혈관 벽 상해를 확대시키고, 그로인해 SMC증식 및 재흡착증 비율을 감소시킬 수 없기 때문이다. 더욱이, 기계적인 중재수단은 최적의 관상동맥 구조를 가지고 있는 환자들의 소그룹에만 적용될 수 있다.
또한 재협착증 방지를 위해 항-분열촉진(antimitogenic) 치료요법의 적용이 제안되어졌다. 예컨대, 혈관형성술 후의 재협착증 문제를 조절하기 위하여 농축된 헤파린이 항증식제로 시험되었다[Wolinsky and Thung, JACC 1990, 15(2), 475-481]. ｒ-인터페론은 재협착증의 치료를 위한 또 다른 잠재적으로 유용한 치료제인 것으로 확인되었다[WO 90/03189; 1990년 4월 5일 공개]. 그러나, 전신적인 투여에 의해 제공되는 항증식제의 단위용량은 원하는 효과를 달성하기에는 충분하지 않은 것 같다. 그러므로, 시험되었던 제제들은 보다 복잡한 임상적인 상황에서 유익한 효과를 나타내기에는 충분히 강력하지 않다.
세포 및 분자생물학의 최근의 진전으로 인하여 세포외부의 환경(예컨대, 성장인자들)으로부터 세포 핵으로의 신호전달에 의한 SMC 증식의 분자적 메카니즘을 통찰하게 되었다. 여러 유전자들은 SMC의 표현형 조절과정중에 일시적으로 활성화된다[Gabbiani et al., J Clin Invest 1984, 73, 148-152; Walker et al., Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83, 7311-7315; Miano et al., Am J Pathol 1990, 137, 761-765: Maiesky et al., Circulalion Research 1992, 71, 759-768]. 이들 발견은 SMC 성장에서 비정상적인 유전자 발현의 역할을 규명하고, 혈관 재협착증과 같은 후천성 심장혈관 장애에 대한 분자기초적 접근방법에 있어서의 잠재적인 치료표적을 선택하는데 대한 관심을 자극하였다. 최근에 슈파이어와 엡스타인은 증식중인 세포의 핵항원 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 고농도로 사용한 쥐 평활근 세포에 있어서의 성장 억제현상을 보고하였다[Speir and Epstein, Circulation 1992, 86, 538-547].
핵 프른토-온코진 산물은 세포증식과 밀접히 관련되고, 매우 보존되어 있는 인단백질(phosphoprotein)이다. 분열촉진 자극후 핵 프로토-온코진 mRNA의 일시적인 증가는 세포가 G1 상에 들어가 G1에서 S 상으로 전이하는데 필요한 것으로 밝혀졌다. 배양된 SMC 연구에서 c-fos, c-myc, 및 c-myb 프로토-온코진들이 다양한 분열촉진 자극후 곧 활성화됨이 증명되어 졌다[Kindy et al., J Biol Chem 1986, 261, 12865-l2868; Brown et al., JBiol Chem 1992, 267, 4625-4630]. 또한, 프로토-온코진 발현은 시험관내 연구와 유사한 패턴으로 벌룬 디뉴데이션(denudation)후 혈관 벽에서도 유도되어졌다[Miano et al., Am J Pathol 1990, 137, 761-765]. 상기의 관찰 및 신호전달경로의 과잉(redundancy)를 핵 프로토-온코진 활성화가 바로 많은 다양한 분열촉진 신호가 집중되는 최종의 공통적일 경로이여, 잠재적인 치료표적이 되는 가능성을 증가시켰다. 콜린스 등은 c-myc에 상보적인 안티센스올리고뉴클레오티드가 결장 카시노마(carcinoma) 세포들의 콜로니 형성을 억제한다는 것을 밝혔다[Collins et al., J. Clin. Invest. 1992, 89, 1523-1527].다른 그룹들은 프로토-온코진 c-myb에 초점을 맞추었고, c-myb의 억제가 평활근 세포의 증식을 억제한다는 것을 발견하였다. 최근에 사이몬과 로젠버그는 쥐의 평활근 세포에서 c-myb 안티센스 올리고뉴클레오티드의 성장-억제 효과를 발표하였다[Simon and Rosenberg. Circulation Research 1992,70, 835-843].
현재 안티센스 기법은 특이적 유전자산물의 레벨을 저하시키는 효과적인 수단으로 부상하고 있다. 이 기법은 이들 "안티센스" 서열이 유전자 또는 관련된 표적 폴리뉴클레오티드와 교합결합(hybridization)하여, 왓슨-크릭 또는 후그스틴 결합을 토대로, 안정한 듀플렉스 또는 트리플렉스를 각각 형성한다는 발견에 기초한다. 특이적으로 결합된 안티센스 화합물은 그런 다음 각각의 표적을 효소적 분해에 대해 더 민감하게 만들거나, 번역 또는 프로세싱을 차단하거나, 또는 그렇지 않으면 표적 폴리뉴클레오티드의 기능을 차단 또는 억제하게 된다. 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우, 안티센스분자는 특이적 RNA 전사물에 교합결합하여 정상적인 RNA 프로세싱, 안정성, 및 번역을 파괴하고, 그로써 표적 유전자의 발현을 막는다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하거나 표적 mRNA에 상보적인 안티센스 서열을 세포내에서 생성할 수 있는 발현 작제물을 도입하는 것은 시험관내 및 생체내에서 특정한 유전자들의 번역을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 예컨대, 홀트등은 그것이 사람 전골수세포(promyelocytic) 백혈병 HL-60세포에서 표적 mRNA와 듀플렉스를 형성하여 c-myc단백질을 선택적으로 감소시킴을 발견하였다[Holt et al., Mol. Cell Biol. 1988, 8, 963-973].
그러므로, 어떠한 혈관상(vascular bed)에서의 재협착증과 관련된 평활근 세포의 증식을 조절하는 방법이 매우 요망된다, 그러한 방법은 관상동맥 및 말초혈 협착증(측, 차단)을 포함하며 광범위한 혈관장애를 가지고 있는 환자들에게 적용할 수 있어야 한다. 나아가, 상기 방법은 높은 효율을 가져야 한다. 그러한 방법이 본 발명에 의해 제공된다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, 평활근 세포들의 증식을 조절하기 위하여 평활근세포들을 c-myc에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시킨다.
본 발명의 바람직할 한 구체예에 따르면, c-myc를 코딩하는 mRNA의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 평활근 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 평활근 세포의 증식 조절방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에 따르면, c-myc를 코딩하는 mRNA의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 치료적으로 유효한 양으로 재협착증에 걸린 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 재협착증 환자의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서는 c-myc를 코딩하는 mRNA의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티트를 치료적으로 유효량으로 재협착증에 걸리기 쉬운 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 재협착증 경향이 있는 상기 환자들의 혈관 재협착증을 방지하는 방법이 제공된다.
[도면의 간단한 설명]
제 1도는 6%의 폴리아크릴아미드 변성 겔상에서 전기영동된 정지상태 및 증식상태의 사람 SMC의 c-myc mRNA의 오토라디오그램이다.
제 2도는 10μM의 c-myc 안티센스(검은색 원형), 센스(검은색 삼각형), 및 미스매치된(흰색 원형) 올리고뉴클레오티드와 함께 배양된 사람 SMC의 성장곡선을 나타내는 개략도이다. 대조군(흰색 삼각형)를 올리고뉴클레오티드를 첨가하지 않고 배양하였다.
제 3도는 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가 후 사람 SMC의 용량-의존성 성장 억제를 나타내는 개략도이다. 결과는 평균 ± SD로 표시한다.
제 4도는 c-myc 안데센스 올리고뉴클레오티드의 성장-억제 효과에 대한 과잉의 센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타내는 개략도이다. 제 1일째의 % 억제를 3회 한세트로 계산하였다. 데이터는 평균 士 SD로 표시한다.
제 5도는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 사람 SMC로부터추출한 c-myc mRNA의 겔 오토라디오그램으로, 6%의 폴리아크릴아미드 변성 겔에서 전기영동하였다. C : 대조군(올리고뉴클레오티드 무처리), S : c-myc 센스 올리고뉴클레오티드(10μM), A : c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드(10μM).
제 6도는 사람 SMC에서 올리고뉴클레오티드의 세포내 축적을 나타내는 개략도이다. 올리고뉴클레오티드의 세포내 함량은 세포에 결합된 방사능을 신틸레이션 카운터로 측정함으로써 얻었다.
제 7도는 4 기압하에서 다공성 벌룬 카테테르를 통하여 환상동맥내로 올리고머를 주입(1mg/혈관)한 후 돼지 혈장내에서의35S-표지된 올리고머의 체내약물속도론(pharmacokinetics)을 나타내는 개략도이다. 동물은 올리고뉴클레오티드를 주입한 후 30분, 1일, 3일 및 7일에 회생시켰다.
제 8도는 제 7도에서와 같이 돼지의 관상동맥에서의35S-표지된 올리고머의 체내약물속도론을 나타내는 개략도이다.
제 9A도 및 제 9B도는 혈관형성술 후 1개월 후의 돼지 관상동맥 단면사진이다. c-myc 센스 올리고머(서열번호 2)는 혈관형성술 직후 벽내(intramural) 주입(4기압하에서 27초 동안에 걸쳐 2㎖)에 의해 제공되었다. 신생 동맥내막의 두께가 현저함을 알 수 있다.(화살표).
제 10A도 및 제 10B도는 동물이 센스 올리고뉴클레오티드 대신에 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열번호 1)를 투여받은 것을 제외하면 제 9A도 및 제 9B도와 유사한 사진이다. 신생 동맥내막의 현저한 감소를 알 수 있다.
제 11도는 센스-처리된(흰색 원형) 및 안티센스-처리된(검은색 원형)돼지에서 인위적으로 유발한 관상동맥 상해정도(상해 스코어)의 함수로써 플로팅한 신생 동맥내막의 면적을 나타내는 개략도이다. 회귀곡선은 신생 동맥내막과 상해 스코어간의 관계를 나타내는 것이며, 기울기의 현저한 감소(p<0.01)는 안티센스-처리된 동물에서의 신생 동맥내막 형성이 감소함을 의미한다.
제 12도는 사람 SMC에서 c-myc mRNA를 표적화하는 다양한 안티센스 서열의 성장-억제 효과를 나타내는 개략도이다. 제 3일째의 % 억제를 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열번호 1 및 6 내지 12에 대해서 8 및 16 μM에서 평가하고, 센스, 미스매치된(mis), 및 스크램블된 센스(scr) 올리고뉴클레오티드에 대해서도 평가하였다.
[발명의 상세한 설명]
안티센스 올리고뉴클레오티드는 여러가지 사람 질병을 치료하기 위한 치료제로서 커다란 가능성을 가지고 있다. 개념적으로는, 효소의 활성부위와 상호작용하는 분자를 디자인하기보다는 염기 짝짓기에 의해 RNA분자와 같은 일차구조와 상호작용하는 화합물을 디자인하는 것이 더 용이하다. 올리고뉴클레오티드는, 왓슨-크릭 또는 후그스틴 염기 짝짓기에 의해, DNA, 프리-mRNA, 또는 성숙한 mRNA의 상보적인 서열에 특이적으로 결합(교합결합)하여, DNA로부터 단백질로의 유전정보 흐름을 막는다. 자신들의 표적서열에 대해 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 성질로 인해 이들은 예상외로 다용도로 쓰인다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 4가지 단량체 단위로 이루어진 긴 사슬이기 때문에, 어떤 표적 서열에 대한 안티센스올리고뉴클레오티드를 쉽게 합성할 수 있다. 많은 최근의 연구조사들이 표적 단백질에 대한 연구용 생화학적 도구로써 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활용성을 증명하였다[Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. 1989, 81,1539-1544; Zon, G., Pharmaceutical Res. 1988, 5, 539-549]. 안정성이 증가된 뉴클레아제 내성 올리고뉴클레오티드의 합성 및 올리고뉴클레오티드 화학에 있어서의 최근의 진보로 인해, 현재 신규한 형태의 치료제로 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용을 고려하고 있다.
재협착증의 발생을 방지 또는 치료하기 위한 현재의 방법들은 재협착증을 치료 또는 방지하는 데에 단지 제한적 효력만을 나타낼 뿐이다. 평활근 세포의 증식 조절에 관한 본 발명은 지금까지 만족시키지 못했던 요구들을 충족시켜준다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “올리고뉴클레오티드”는 뉴클레오티드들이 결합되어 형성된 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 더욱이, 용어 “올리고뉴클레오티드”는 천연 올리고뉴클레오리드이거나 천연 소단위체 또는 올리고뉴클레오티드에 특이한 성질을 부여하여 생물학적 시스템에서보다 더 안정하거나 또는 표적 서열에 보다 더 강하게 결합하도록 디자인된 소단위 유도체들로부터 합성되는 합성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 상기 용어는 세포 또는 핵 및 다른 세포구획으로의 전달을 증가시키기위한 다른 화합물에 이들을 화학적으로 결합하는 것과 같은 변형된 올리고뉴클레오티드들도 포함한다. 나아가, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 안정성을 제공하도록 뉴클레오티드간 결합이 변형된 것도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명은 포스포로티오에이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포항할 수 있다. 그러므로, 용어 “올리고뉴클레오티드”는 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드의 비변형 올리고머들 뿐만 아니라, 하나 또는 그 이상의 퓨린 또는 피리미딘 부분, 당 부분 또는 뉴클레오티드간 결합이 화학적으로 변형된 올리고머들을 포함한다.
전술한 일반성을 제한함이 없이, 본 명세서에서 사용되는 용어 “올리고뉴클레오티드”는 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 그것들의 α-아노머 형태, 폴리아미드 해산, 또는 왓슨-크릭형 염기 짝짓기나 후그스틴형 염기 짝짓기 등과 같은 단량체-대-단량체(monomer-to-monomer) 상호작용의 규칙적인 패턴에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있는 것 등을 포함하여, 천연 또는 변형 단량체들의 선형 올리고머들을 포함한다.통상적으로, 단량체들은 포스포디에스테르 결합 또는 이와 유사한 결합에 의해 결합되어 크기가 수개의 단량체 유니트, 예컨대 3-4, 내지 수백개의 단량체 유니트에 달하는 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 포스포디에스테르 결합과 유사한 결합으로는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등이 있으며, 이하 더욱 상세히 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오시드”는 2'-데옥시 및 2'-히드록실 형태, 예컨대 문헌[Komberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed.,Freeman, San Francisco, 1992]에 기재되어 있는 것들을 포함하며 천연 뉴클레오시드를 말한다. 뉴클레오시드와 관련하여 “유도체”란, 예컨대 일반적으로 문헌[Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980]에 기재되어 있는바와 같이 변형된 염기 부분 및/또는 변형된 당 부분을 지닌 합성뉴클레오시드를 포함한다. 그러한 유도체들로는 결함 특성, 예컨대 듀플렉스 또는 트리플렉스의 안정성 또는 특이성 등을 증가시키기 위해 디자인된 합성 뉴클레오시드들이 있다.
“c-myc에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드”또는 “c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드”는 (i) c-myc 프로토-온코진의 일부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있거나, 또는 (ii) c-myc 프로토-온코진의 mRNA 전사물의 일부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티트이다.
듀플렉스 또는 트리플렉스 형성과 관련하여 "안정성"이란 대체로 얼마나 강하게 안티센스 올리고뉴클레오티드가 그것의 의도된 표적서열과 결합하는가를 의미한다; 보다 정확하게는, 상기 용어는 생리적인 조건에서 듀플렉스 또는 트리플렉스 형성의 자유에너지를 의미한다. 예컨대, 하기된 바와 같은 표준조건에서의 융해온도는 듀플렉스 및/또는 트리플렉스 안정성의 편리한 척도이다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기된 표준조건에서 최소한 50℃의 융해온도를 갖는 것으로 선택한다; 그러므로, 생리적 조건 및 바람직한 농도에서는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그것의 표적이 해리되기보다는 듀플렉스 또는 트리플렉스를 형성하는 쪽이 실질적으로 우세해질 것이다. 어떤 구체예에서, 안정한 듀플렉스 또는 트리플렉스는 염기쌍간 및/또는 트리플렉스의 경우에는 염기 트리플렛간의 미스매치를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그것들의 표적 폴리뉴클레오티드와 완전하게 매치된 듀플렉스 및/또는 트리플렉스를 형성한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고 세포내 및 세포외 분해를 방지하기 위하여 변형시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적서열에 대한 그것이 친화력을 증가시키고, 그것들이 약제학적으로 활성형태로 포유동물에게 투여될 때 적절한 세포 및 세포구획으로의 운반을 증가시키기 위하여 변형시키는 것이 보다 바람직하다.
표적 폴리뉴클레오티드는 1본쇄 또는 2본쇄의 DNA 또는 RNA일 수 있다; 그러나, 1본대의 DNA 또는 RNA 표적이 바람직하다. 본 발명의 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드가 목표로 삼는 표적은 c-myc 프로토-온코진의 대립유전자들을 포함한다. 문헌에는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열이 주어질 때 안티센스 올리고뉴클레오티드를 위한 특정 서열을 선택하는 실질적인 지침이 있다[예컨대, Peyman and Ulmann, Chemical Reviews, 90:543-584, 1990; Crooke, Ann. Rev. Pharmacal. Toxicol., 32:320-376(1992); and Zamecnik and Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci., 75:280-284(1974)]. 바람직하게는 c-myc안데센스 화합물의 서열은 G-C함량이 최소한 60%가 되도록 선택한다. 바람직한 프로토-온코진 mRNA 표적은 5' 캡 부위, tRNA 프라이머 결합 부위, 개시코돈 부위, mRNA 도너 스플라이스 부위, 및 mRNA 어셉터 스플라이스 부위를 포함한다[예컨대, Goodchild et al.,미국 특허 제 4,806,463호].
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭형 염기 짝짓기, 후그스틴 또는 역 후그스틴 형의 염기 짝짓기 등과 같은 규칙적인 패턴의 단량체-대-뉴클레오시드 상호작용에 의하여 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있는어떠한 중합체 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 안티센스 화합물들은 또한 특이성, 뉴클레아제 내성, 전달성, 또는 효과와 관련된 다른 성질들을 증가시키기 위하여 중합체의 기본 반복 단위체 일부분 또는 그것과는 분리된 펜던트 그룹 또는 부분들, 예컨대 콜레스테롤 부분, 아크리딘과 같은 듀플렉스 인터킬레이터, 폴리-L-라이신 및 포스포로티오에이트 등과 같은 뉴클레아제-내성의 결합기를 갖는 "말단부-캡핑"등을 포함할수 있다.
예컨대, 증가된 지질 용해도 및/또는 뉴클레아제 소화에 대한 내성은 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 결합의 인산염 산소를 알킬기 또는 알콕시기로 대체시켜 알킬포스포네이트 올리고뉴클레오시드 또는 알킬포스포트리에스테르 올리고뉴클레오티드를 형성함으로써 유발되는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 비-이온성 올리고뉴클레오티드는 상보적인 핵산서열과 안정한 복합체를 형성하는 능력을 보유하고 있는 반면, 뉴클레아제 가수분해에 대한 증가된 내성 및/또는 증가된 세포흡수를 특징으로 한다. 특히 알킬포스포네이트는 뉴클레아제 절단에 대해 안정하고 지질에 용해될 수 있다. 알킬포스포네이트 올리고 뉴클레오시드의 제조는 미국 특허 제 4,469,863호(Tso등)에 개시되어 있다.
바람직하게는, 뉴클레아제-내성의 뉴클레오시드간 결합을 제공함으로써 본 발명의 안티센스 화합물에 뉴클레아제 내성을 부여한다. 많은 그러한 결합들은 해당 기술분야에 공지되어 있다.[예컨대, 포스포로티오에이트 : Zon and Geiser, Anti-Cancer Drug Design, 6:539-568 (1991); Stec et al., 미국특허 제 5,151,510호; Hirschbein, 미국 특허 제 5,166,387호; Bergot, 미국특허 제 5,183,885호; 포스포로디티오에이트 : Marshall et al., Science, 259:1564-1570(1993); Caruthers and Nielsen, 국제출원 PCT/US89/02293;포스포르아미데이트, 예컨대 -OP(=0)(NR1R2)-O- (식에서, R1및 R2는 수소 또는 C1-C3알킬이다); Jager et al., Biochemistry, 27:7237-7246(1988); Froehler et al., 국제출원 PCT/US90/03138; 펩티드 핵산 . Nielsen et al., Anti-Cancer Drug Design, 8:53-63(1993): 국제출원 PCT/EP92/01220; 메틸포스포네이트 : Miller et al., 미국 특허 제 4,507,433호; Ts'o et al., 미국 특허제 4,469,863호; Miller et al., 미국 특허 제 4,757,055; 및 다양한 타입의 P-키랄 결합, 특히 포스포르티오에이즈 : Stec et al., 유럽 특허출원 제 506,242호(1992) 및 Lesnikowski, Bioorganic Chemistry, 21:127-155(1993)].추가의 뉴클레아제 내성 결합으로는 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 알킬포스포트리에스테르, 예컨대 메틸- 및 에틸-포스포트리에스테르, 카보네이트, 예컨대 카르복시메될 에스테르, 카바메이트, 모르폴리노카바메이트, 3'-티오포름아세탈, 실릴, 예컨대 디알킬(C1-C6)- 또는 디페닐실릴, 술파메이트 에스테르 등이 있다. 그러한 결합 및 그것들을 올리고뉴클레오티드에 도입하는 방법들은 많은 참고문헌에 기재되어 있다[예컨대, Peyman and Ulmann, Chemical Reviews, 90:543-58491990); Milligan et al., J. Med. Chem., 36;1923-1937(1993); Matteucci et al., 국제출원 PCT/US91/06855].
뉴클레아제 소화에 대한 내성은 또한 5' 및 3' 양 말단에서 뉴클레오티드간결합을 데이글 등의 방법에 따라 포스포로아미다이트로 변형시킴으로써 부여할 수 있다[Dagle et al., Nucl. Acids Res., 18, 4751-4757(1990)].
바람직하게는, 포스포디에스테르 결합의 인산 유도체, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 또는 메틸포스포네이트 등을 본 발명의 화합물에 사용한다. 보다 바람직하게는, 포스프로티오에이트는 뉴클레아제 내성 결합으로서 사용한다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 결합에 산소대신 황을 함유한다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 하전된 인산 유도체의 물 용해도를 보유하는 한편, 실질적인 뉴클레아제 내성을 지닌채 듀플렉스 형성에 대한 효과적인 교합결합의 성질을 겸한다. 전하는 수용체를 통한 세포흡수의 성질을 부여하는 것으로 여겨진다[Loke et al., Proc Natl. Acad, Sci., 86, 3474-3478(1989)].
바람직한 결합기외의 본 발명의 화합물은 추가의 변형, 예컨대 붕소처리된 염기[Spielvogel et al., 미국 특허 제 5,130,302호]; 콜레스테롤 부분[Shea et al., Nucleic Acids Research, 18:3777-3783(1990) 또는 Letsingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:6553-6556(1989)]; 및 피리미딘의 5-프로피닐 변형체[Froehler et al., Tetrahedron Lett., 33:5307-5310(1992)]를 포함할수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 해당 기술분야에서 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해서도 합성할 수 있다. 본 발명에서 올리고뉴클레오티드는 화학합성법,예컨대 아세토니트릴 중에서 테트라에틸티우람 디술파이드를사용하는 황화법에 의한 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 제조될 수 있다[예컨대, Vu and Hirschbein, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 30005-30008].본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 시험관내 및 생체내 전사 시스템, 예컨대 T7 중합효소 또는 발현벡터를 사용하여 합성할 수 있다. 시험관내 및 생체내 전사 시스템을 사용하여 합성된 올리고뉴클레오티드들은 해당 기술분야에 공지되어 있는 화학적 방법에 의해 변형할 수 있다. 그러한 변형 방법의 실례로는 리포솜내의 캡슐화 또는 스테로이드, 항체 및 세포수용체 리간드와의 화학적 결합 등이 있다.
트리플렉스 형성이 요구되는 구체예에서는, 표적서열의 선택에 제한이 따른다. 일반적으로, 후그스틴 타입의 결합에 의한 제 3가닥 결합은 2본쇄 표적의 호모피리미딘-호모퓨린 트랙을 따라 가장 안정하다. 보통, 염기트리플렛은 T-A*T 또는 C-G*C 모티프("-"는 왓슨-크릭 짝짓기를 나타내고, "*"는 후그스틴 타입의 결함을 나타냄)에서 형성된다; 그러나, 다른 모티프들도 또한 가능하다. 예컨대, 후그스틴 염기 짝짓기는 본쇄들의 조건과 조성에 따라 제 3가닥(후그스틴 가닥) 및 제 3가닥이 결합하는 듀플렉스의 풍부한 가닥간의 평행 및 역평행 배향이 가능하게 한다. 특정한 구체예에서 원하는대로 트리플렉스 안정성을 최대화, 또는 그렇지 않을 경우 조절하기 위하여 적절한 서열, 배향, 조건, 뉴클레오시드 타입(예컨대, 리보오스 또는 데옥시리보오스 뉴클레오시드에 관계없이), 염기 변형(예컨대 메틸화된 시토신)을 선택하기 위한 광범위한 지침이 여러 문헌에 기재되어 있다[예컨대,Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:9397-9401(1991); Roberts et al.,Science, 258:1463-1466(1992); Distefano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:1179-1183(1993); Mergny et al., Biochemistry, 30:9791-9798(1992); Cheng et al,, J. Am. Chem. Soc., 114:4465-4474(1992); Beal and Dervan, Nucleic Acids Research, 20:2773-2776(1992); Beal and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 114:4976-4982; Giovannangeli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:8631-8635(1992); Moser and Dervan, Science, 238:645-650(1987); McShan et al., J. Biol. Chem., 261:5712-5721(1992); Yoon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:3840-3844(1992); 및 Blumm et al., Nucleic Acids Research, 20:1777-1784(1992)].
올리고뉴클레오티드 부분의 길이는, 많은 참고문헌에서 설명된 바와 같이, 특이적 결합이 다른 임의의 위치가 아닌 바로 원하는 표적 폴리뉴클레오티드에서만 일어나도록 할만큼 충분히 길다[예컨대, Rosenberg et al., 국제출원 PCT/US92/05305; 또는 Szpstak et al., Meth Enzymol., 68:419-429(1979)]. 길이의 상한 범위는 커다란 올리고머의 합성과 정제에 따르는 불편함 및 비용, 더 짧은 올리고뉴클레오티즈보다는 더 긴 올리고뉴클레오티드의 미스매치에 대한 더 큰 허용성, 결합 또는 특이성의 증가를 위한 변형의 존재여부, 듀플렉스 또는 트리플렉스 결합의 요구성 등을 포함한 여러 인자들을 고려하여 결정한다.
올리고뉴클레오리드의 길이는 5 내지 200개의 뉴클레오티드가 바람직하다. 보다 바람직한 길이는 올리고뉴클레오티드가 10 내지 50개의 뉴클레오티드를 갖는 것이여, 가장 바람직한 것은 올리고뉴클레오티드가 15 내지 25개의 뉴클레오티드를갖는 것이다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 번역개시 영역과 특이적으로 교합결합할 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 5'AACGTTGAGGGGCAT 3'(서열변호 1)를 갖는다. 이 올리고뉴클레오티드는 번역개시 코돈에서 시작하여 그곳으로부터 하향으로 연장되는 c-myc mRNA절편에 상보적이다. 번역개시 코돈은 c-myc mRNA의 뉴클레오티드 559-562를 포함한다. 뉴클레오티드 559-1875를 포함하는 코딩 영역의 양 옆에는 5' 비코딩 영역과, 뉴클레오티드 2121까지 연장되는 3' 비코딩 영역이 있다.
일반적으로, 본 발명의 실시에 사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 선택된 부분에 완전히 상보적인 서열을 가질것이다. 그러나, 특히 올리고머가 클수록 절대적인 상보성은 필요하지 않다.그러므로, 본 명세서에서 표적 올리고뉴클레오티드에 대해 "상보적인 올리고뉴클레오티드 서열"은 반드시 표적 절편에 100%의 상보성을 가지는 서열을 의미하지는 않는다. 일반적으로, 표적(예컨대, c-myc mRNA)과 안정한 이중나선을 형성할 수 있도록 충분한 상보성을 지닌, 즉 교합결합이 가능한, 올리고뉴클레오티드는 어떠한 것이라도 적합하다. 안정한 듀플렉스 형성은 교합결합하는 올리고뉴클레오티드의 서열과 길이 그리고 표적 폴리뉴클레오티드와의 상보성 정도에 좌우된다. 일반적으로, 교합결합하는 올리고머의 길이가 클수록 더 많은 미스매치가 가능할 것이다. 당업자라면 형성된 듀플렉스의 융해점 및 그로 인한 열 안정성을 토대로하여, 어떠한 주어진 안티센스올리고머와 표적 서열간에 허용될 수 있는 미스매치 정도를 쉽게 측정할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 교합결합체(hybrid)의 열 안정성은 융해곡선, 또는 가닥 해리곡선에 의해 측정된다. 50%의 가닥이 해리되는 온도를 융해온도(Tm)라 하며, 이는 안정성의 편리한 척도를 제공한다. 전형적으로 Tm측정은 표적 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 약 1.0 내지 2.0μM 의 농도로 중성 PH의 식염수 용액중에서 수행한다. 전형적인 조건은 다음과 같다 : 10mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0) 또는 10mM Tris-HCI 완충용액(pH 7.0) 중의 150mM NaCl 및 10mM MgCI2. 융해곡선에 대한 데이터는 안티센스 올리고뉴클레오티드/표적폴리뉴클레오티드 복합체 샘플을 실온에서 약 85-90℃까지 가열함으로써 누적된다. 샘플 온도가 증가함에 따라 260nm에서의 흡광도는, 예컨대 캐리(Carry, Australia) 모델 1E또는 휴렛-팩커드(Hewlett-Packard Palo Alto, CA)모델 HP 8459 UV/VIS 분광광도계 및 모델 HP 89100A 온도조절기, 또는 이와 유사한 기구를 사용하여 1℃ 간격으로 모니터한다. 이러한 기법은 상이한 길이 및 조성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 결합강도를 측정하고 비교하기 위한 편리한 수단을 제공한다.
한 구체예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 c-myc 유전자로부터 유래하는 mRNA와 교합결합할 수 있도록 디자인한다. 그러한 교합결합은, 만약 일어날 경우, 세포에서 mRNA의 정상적인 역할을 방해하여 세포내 mRNA의 기능변화를 유발할 것이다. 방해받을 수 있는 mRNA기능들로는 단백질 번역을 위한 부위로의 mRNA 이동, mRNA로부터 단백질로의 번역, 하나 이상의 mRNA를 생성하는 RNA 스플라이싱, 및 심지어는 RNA만으로 수행가능한 독립적인 촉매활성과 같은 생명유지에 필요한기능들을 포함한다. RNA기능을 그렇게 방해하는 전체적인 효과는 c-myc유전자의 발현을 조절한다는 것이다. c-myc유전자 발현을 조절함으로써 평활근 세포의 증식은 조절되거나 또는 억제된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 재협착증과 관련된 평활근 세포 증식이 표적화될 수 있다. 따라서, 평활근 세포는 동맥, 정맥 및 모세혈관의 평활근세포와 같은 혈관 평활근 세포가 바람직하다.
치료 또는 예방용으로, 본 발명에 따른 올리고 뉴클레오티드가 투여된다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 이외에 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 계면활성제 등을 포함할 수 있는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에 있어서는, 올리고뉴클레오티드는예컨대, 항-혈소판, 항-응고, 및 혈관확장 치료제와 같이 재협착증을 제한 또는 제거하는데 효과적인 것으로 알려진 다른 치료제들과 조합하여 투여할수 있다. 용액은 또한 디스파아제(disparse), 트립신, 콜라게나제, 파파인, 펩신, 또는 키모트립신과 같은 단백질 가수분해 효소를 함유할 수 있다. 단백질 가수분해 효소 외에 리파제도 사용할 수 있다. 용액은 자극성이 적은 계면활성제인 NP-40, 트리톤 X-100, 데옥시콜레이트, SDS 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 안티센스 화합물들은, 예컨대 나트륨 또는 마그네슘 등의 알칼리 토류, 암모늄 또는 NX4 +(여기서, X는 C1-C4알킬) 등을 포함하여, 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 다른 염은, 예컨대 아세트산, 락트산,타르타르산, 말산, 아세티온산, 락토비온산, 및 숙신산 등의 유기 카르복실산; 예컨대 메탄술폰산, 에탄술폰산, 및 벤젠술폰산 등의 유기 술폰산; 예컨대 염산, 황산, 인산, 및 술팜산 등의 무기산을 포함한다. 히드록실 기를 갖는 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은, 예컨대 Na+, NH4 +등과 같은 적당한 양이온과 결합한 상태인 상기 화합물들의 음이온을 포함한다.
약제학적 조성물은 국소 또는 전신투여 필요성 및 치료할 면적에 따라 여러 가지 방식으로 투여할 수 있다. 투여는 해당 기술분야에서 정맥내주사와 같은 공지된 방법들에 의하며 또는 환부를 직접 치료하기 위한 카테테르의 사용에 의하여 이루어질 수 있다. 혈관내 장치 및 그것의 사용방법은 해당 기술분야에 공지되어 있다.
관련된 외상을 입은 혈관에 카테테르에 의한 국소적인 투여는 전달의 한 형태이다. c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드는 루멘(lumen), 예컨대 문헌[Wolinsky and Thung, JACC 15:475-481(1990)]에 기재되어 있는 다공성 벌룬내부로부터 카테테르를 통해, 또는 안티센스 화합물의 서방성(slow release)을 보조하는 물질, 예컨대 문헌[Simons et al., Nature, 359:67-70(1992)]에 기재되어 있는 플루로닉 겔 시스템을 가지고 외막(adventitia, 즉 혈관벽의 가장 바깥층)을 통해 손상부위 근처에 투여된다. 국소적 전달을 위한 다른 서방성 기법은, 예컨대 결합제 또는 문헌[Wilinsky et al., Trends in Cardiovascular Med., 3:163-170(1993)]에 기재된 겔을 사용하여, 안티센스 화합물로 스텐트를 코팅하는 것을 포함한다. 표적 손상부위에 투여되는 용량은 1㎍ 내지 100mg 범위, 보다 바람직하게는 1㎍ 내지 5mg범위이다. 바람직한 전달시간은 약 30초 내지 약 60분, 보다 바람직하게는 약 30초 내지 약 1-2분이다[예컨대, Zalewski et al., pp.79-87 in Goldberg, editor, Coronary Angioplasty(Davis, Philadelphia, 1988)].
전신적인 정맥내 투여가 또한 고려된다. 어떠한 이론에 제한됨이 없이 신체의 특정 기관은 이전에 예상되었던 것보다 더 긴 시간에 걸쳐, 순환계로 복귀될 올리고뉴클레오티드에 대한 저장소를 제공할 수 있을 것으로 여겨진다. 그러한 저장 기관, 특히 신장 및 간은 투여후 72시간까지 혈관에 축적되는 올리고뉴클레오티드의 공급원일 수 있다.
투여 횟수는 치료될 질환의 심각성 및 반응성에 좌우되지만, 보통 수일에서 수개월에 걸친 치료 기간 동안 또는 치료가 달성될 때까지 또는 질병 상태가 호전될 때까지 1일 1회 또는 그 이상일 것이다. 당업자는 쉽게 최적의 음량, 투여 방법 및 반복 속도를 결정할 수 있다.
하기 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.
실시예 1 : 세포 배양
정기적인 비파스(bypass) 수술을 받는 환자의 복재정맥(saphenousvein)으로부터 사람 SMC를 얻었다. 세포는 체외이식조직(explant) 방법에 의해 분리하였다. 체외이식조직을 열 비활성화된 20% 소 태아 혈청(FBS), 100IU/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 및 2mM/㎖의 글루타민이 첨가된 덜베코 변형 이글스 배지(DMEM)(20% FBS-DMEM)를 함유하고 있는 조직배양 접시위에 놓았다. 배양을 37℃에서 5% CO2로 가습된 배양기안에서 계속시켰다. 세포들은 혈관 SMC의 전형적인 형태학적 특징들, 즉, 스핀들 형태 및 인덕-및-계곡 패턴을 나타냈다. 혈관 SMC의 확인은 추가로 인사이투(in situ) 평활근 알파-액틴 염색에 의해 확인하였다.
실시예 2 : 올리고뉴클레오티드의 합성
15량체의 안티센스, 센스 및 미스매치된 올리고뉴클레오티드들을 어플라이드 바이오시스템스 모델 394 고처리량 DNA 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 합성하였다. 생체내 연구를 위한 더 많은양의 상기 올리고뉴클레오티드들은 어플라이드 바이오시스템스 변형 390Z대규모 DNA 합성기로 합성하였다. 올리고뉴클레오티드들을 동결건조시키고, PBS중에 재현탁한 후, 분광법에 의하여 정량하였다. 사람 c-myc유전자의 번역개시 영역으로부터의 변형된(포스포로티오에이트) 올리고뉴클레오티드를 이 연구에 사용하였다. 서열은 다음과 같았다 : 센스 올리고뉴클레오티드(5' ATGCCCCTCAACGTT 3' ; 서열번호 2) ; 안티센스 올리고뉴클레오티드(5' AACGTTGAGGGGCAT 3' ; 서열번호 1), 및 미스매치된 올리고뉴클레오티드(5' TACGGGGTTGAGCAA 3' ; 서열번호 3).
실시예 3 : 성장 검정
20% FBS-DMEM중의 사람 SMC의 초기 계대(2 및 4)를 24-웰 플레이트의 각 웰당 10,000 세포의 밀도로 시드하였다. 플레이팅 후 24시간후에, 원래의 배지를 성장 정지 배지(0.5% FBS-DMEM)로 교체하고 48시간 동안 방치하였다. 그런 다음 세포 성장을 20%의 FBS-DMEM을 첨가함으로써 동조시켰다. 올리고뉴클레오티드를 자극전24시간 전에, 자극 및 다른 언급이 없는 한 그 후에는 매 48시간마다 첨가하였다. 지시된 시점에서, SMC를 트립신으로 처리하고, 쿨터 계수기(Coulter Counter)로 계수하였다. 억제 정도는 다음과 같이 계산하였다 :
% 억제 = 1-(안티센스-처리된 세포의 순 성장/센스-처리된 세포의 순 성장) ×100
사람 SMC의 순 성장은 실험의 지시된 시점에서의 세포 수로부터 출발 세포 수(세포들이 Go 상태를 벗어나는 시점에서의)를 뺌으로써 얻었다. 각 실험을 3회를 한 세트로 하여 수행하였다. 데이터를 평균 ± SD로서 나타낸다.
실시예 4 : 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수
SMC를 20%의 FBS-DMEM이 첨가된 100mm 플레이트에서 성장시켰다. 48시간 동안 성장을 정지(0.5% FBS-DMEM)시킨 다음, SMC를 20%의 FBS-DMEM으로 동조시켰다. 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 측정하기 위하여, SMC를 2μM의32P-말단 표지된 올리고뉴클레오티드와 함께 (5×106cpm/㎍) 1, 3, 6, 16, 24 및 36 시간 동안 배양하였다. 배양후, 세포를 FBS 및 0.2M 글리신(pH 2.8)으로 세척하여 막에 결합된 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 올리고뉴클레오티드의 세포내 흡수를 나타내는 세포-결합된 방사능을 신틸레이션 카운터(Scintillation counter)로 측정하였다. 사람SMC에 의한 올리고뉴클레오티드의 흡수는 pmol/105세포로서 평가하였다.
실시예 5 : 역 전사 및 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)
사람 SMC에서의 c-myc mRNA를 측정하기 위하여 변형된 RT-PCR기법을 사용하였다. 총 RNA를 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출 방법을 사용하여 단일 단계 과정으로 단리하였다. 게놈 DNA 증폭과 cDNA 증폭을 구별하기 위하여, c-myc의 게놈 서열상에 있는 최소한 하나의 인트론을 포함하도록 프라이머 쌍을 디자인하였다. 프라이머들을 상술할 바와 같이 합성하였고, 프라이머 서열은 다음과 같다 :
프라이머 A, 5' TGGTGCTCCATGAGGAGACA 3'(서열번호 4),
프라이머 B, 5' GTGTTTCAACTGTTCTCGTC 3'(서열번호 5). 프라이머들의 5' 말단을 5' DNA 말단 표지화 프로토콜(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)에 따라 50μCi의 (ｒ-32P)-ATP로 표지하였다. 2㎍의 총 RNA를 200 유니트의 슈퍼스크립트 역전사효소를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. cDNA의 PCR 증폭은 GeneAmp RNA PCR 프로토콜(Perkin-Elmer Corp., Hayward, CA)을 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 일정액의 cDNA를 20μM의 프라이머와 5 유니트의 Taq 중합효소를 함유하고 있는 반응 혼합물에 첨가하였다. 증폭은 DNA 열 사이클러(Perkin-Elmer Cetus)를 사용하여 30주기동안 수행하였다. 사이클 프로필은 변성을 위해 94℃에서 1분, 아닐링을 위해 60℃에서 2분, 그리고 프라이머연장을 위해 72℃에서 2분으로 구성되었다. RT-PCR 생성물을 6% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시키고 코닥 필름에 노출시켰다.
실시예 6 : 사람 SMC에서의 c-myc 프로토-온코진 발현
사람 SMC에서의 c-myc 프로토-온코진의 발현 수준을 평가하기 위하여, 정지 상태(48시간 동안 성장이 정지된) 및 증식중인(혈청 자극 후 2, 4,및 24시간 후의)세포에서 c-myc mRNA를 측정하였다, RT-PCR를 특이한 c-myc 프라이머들을 사용하여 실시예 5에서 설명한 바와같이 수행하였다. 제 1도는 정지 상태 및 증식중인 세포로부터 추출한 증폭된 mRNA의 방사선 사진이다. 제 1도에서 알 수 있는 바와같이, 정지 상태의 사람 SMC는 저 수준의 c-myc mRNA를 발현하였다. 그러나 증식하고 있는 SMC에서는 대조적으로, c-myc mRNA 수준이 세포 성장 자극 후 2 및 4시간후에 증가하였다. c-myc mRNA 는 24시간째에는 감소하였지만, 여전히 정지 상태에서보다는 더 높은 수준을 유지하였다.
실시예 7 : SMC 증식의 억제
사람 SMC를 실시예 3에서 설명한 바와같이 c-myc 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드와 함께 배양하였다. 실험을 3회 한 세트로 수행하고 경우가 따를 때에는 3회 반복하여 유사한 유사한 결과를 얻었다. 그 결과를 평균 ± SD로서 나타낸다. 제 2도에서 알 수 있는 바와같이, 사람 SMC와 c-myc 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 함께 배양하는 것은 상당한 성장 억제 효과를 나타내는 반면, 센스 또는 미스매치된 올리고뉴클레오티드들은 세포 성장에 아무런 영향을 나타내지 못하였다. 상당한 억제는 올리고뉴클레오티드에 연속적으로 노출시켰을 때(p<0.001) 최소한 4일 동안 계속되었다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 성장-억제 효과와는 대조적으로, 변형되지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 40μM의 용량에서도 SMC성장에 영향을 나타내지 못하였다.
실시에 3에 따라 수행한 성장 검정은 또한 예상했던 바와 같이, c-myc 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 항증식 효과가 제 3도에서 알 수있는 바와같이, 1 내지 10μM의 용량 범위내에서는 용량-의존성임을 보여주었다. 또한, 예비 처리없이, 사람 SMC를 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티즈(10μM)와 함께 8 및 24시간 동안 배양하면 각각 58±13% 및 70±14%의 비교할만한 성장 억제를 나타냈다.
돼지의 SMC에서의 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드의 성장 억제효과를 측정하기 위하여 유사한 연구조사를 수행하였다. 대조군 또는 센스-처리된 돼지의 SMC와 비교할 때 c-myc 안티센스 처리(12μM)후에 90%를 초과하는 성장 억제가 관찰되었다. 모든 성장 실험에서, 처리된 SMC는 정상적인 형태를 나타냈고 시험된 용량 범위내에서 세포 사멸은 보이지 않았다.
세포 성장에 미치는 c-myc 안티센스 처리의 잠재적인 장기간 효과를 평가하기 위하여, 배양 8시간 후에 올리고뉴클레오티드를 제거하고 사람 SMC를 7일 동안 계대배양하었다. 그런 다음 1일, 2일, 4일 및 6일후에 세포수를 계수하였다. 안티센스-처리된 SMC 및 대조군 SMC의 성장 속도는 동일하였다. 이것은 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리후의 정상적인 SMC생육성을 증명한다.
본 발명자들은 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드의 항증식 효과가 과잉량의 센스 올리고뉴클레오티드를 SMC 배양물에 첨가함으로써 제거될것으로 예상하였다. 제 4도에서 알 수 있는 바와 같이, 센스 대 안티센스 올리고뉴클레오티드의 비율을 증가시키는 것은 완전하게 성장 억제를 제거시켰다. 이것은 2개의 올리고뉴클레오티드들 사이의 헤테로듀플렉스 형성에 기인하며 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열-특이적 성장 억제를 나타낸다고 할 수 있다.
실시예 8 : c-myc 발현의 억제
안티센스 올리고뉴클레오티드의 항증식 효과가 c-myc 발현의 감소에 기인하는 것인제를 측정하기 위하여, 실시예 5에서 설명한 바와같이 안티센스 및 센스-처리된 세포에서 c-myc mRNA를 측정하였다. 제 5도는 c-myc 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(10μM)가 증식중인 사람 SMC에서 표적 mRNA를 감소시킨 한편, 센스-처리된 세포는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 세포에서의 그것과 비교할 때 c-myc mRNA의 수준에 변화되지 않았다.
실시예 9 : 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수 및 세포내 동력학
사람 SMC에서의 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수의 동력학을 제 6도에 도시한다. 세포들을 세포 자극시에 2μM의32P-표지된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드와 함께 배양하였다. 지시된 시점에서, 세포들을 PBS 및 0.2M 글리신(pH 2.8)으로 세척하였다. SMC 결함된 방사능은 배양을 시작한지 1시간 후에 검출가능하였고 16시간이 될 때까지 빠른 속도로 증가하였다. 정지 상태 및 증식중인 세포들간의32P-말단 표지된 올리고뉴클레오티드들의 세포 흡수에 차이는 없었다. FITC-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한 형광활성의 세포 분류기(fluorescent activated cell sorter)에서도 유사한 결과를 얻었다.
세포 결합된 방사능이 무상(intact) 올리고뉴클레오티드를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라,32P표지를 지닌 분해된 올리고뉴클레오티드 또는 세포내 거대분자로통합될32P도 나타낼 수 있기 때문에, 사람 SMC에서의 무상 올리고뉴클레오티드의 축적을 측정하였다. 무상 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도는 24시간동안에 걸쳐 증가하였고 유사한 양의 분해되지 않은 올리고뉴클레오티드는 SMC내에 최소한 다음 12시간 동안(즉, 노출 후 36시간) 남아있었다. 그러므로, 더 짧은 세포내 반감기에도 불구하고, 혈청에서의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 안정성 및 빠른 세포 흡수는 사람 SMC내에서의 그것들의 지속적인 수준을 가능하게 하였다.
실시예 10 : 관상동맥에서 올리고머의 체내약물속도론
생체내에서의 올리고머의 장기벽내의 전달의 호율 및 체내약물속도론을 측정하기 위하여, c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드를35S로 표지하였다. 실시예 11에서 설명되는 바와같이, 국소적인 벌룬 상해 후, 동량의 표지된 올리고뉴클레오티드를, 상해 부위에서 4 기압하에서 다공성 벌룬 카테테르를 통하며 돼지의 관상동맥에 주입하였다(1mg/혈관). 동물들을 올리고뉴클레오티드 투여후 30분, 1일, 3일 및 7일 후에 희생시켰다, 처리된 관상동맥을 절제시켜서 균질화(homogenization)하였다(중량 75-100mg/혈관). 샘플중의 방사능을 신틸레이션 카운터로 카운트하였다. 올리고뉴클레오티드의 양은 공지량의35S-표지된 올리고뉴클레오티드로 제작된 표준에 따라 정량하였다. 그 결과를 제 7도(혈장 올리고머) 및 제 8도(관상동맥 올리고머)에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드드의 기관 분포는 하기 표에서 투여후 시간의 함수로서 나타낸다:
[표 1]
올리고뉴클레오티드 기관 농도 (㎍/g 조직)
제 7도는 올리고뉴클레오티드의 혈장내 수준을 나타낸다. 혈장으로부터 올리고머는 빠른 속도로 제거되며, 혈장의 제거 반감기는 약 20분이다. 혈장에서 올리고뉴클레오티드의 농도가 국소 투여후 24시간째에는 바탕 값수준으로 감소하긴 하지만, 혈장에서의 올리고뉴클레오티드 농도의 증가가 72시간째에 관찰되었다. 증가된 올리고뉴클레오티드 수준은 추가로 96시간동안 유지되었다. 올리고뉴클레오티드들은 신속하게 혈장으로부터 제거되고 간, 신장 및 심장 근육에 축적되는 것으로 여겨진다. 상기 기관들은 더 긴시간에 걸쳐 순환계로 복귀되는 올리고뉴클레오티드에 대한 저장소를 제공하였다.
제 8도는 국소적인 벌룬 손상의 관상동맥 부위에서 올리고뉴클레오티드의 체내약물속도론를 나타내는 개략도이다. 대조 혈관 (올리고머 없음)은 상기 표 1에서 나타난 바와 같이 모든 시점에서 방사능을 보이지 않았다. 약 0.2%의 올리고머가 국소적인 벌룬 손상의 관상동맥 부위에 축적되었다. 물론 카테테르를 통한 올리고머의 전달은 주입 후 30분에 다양한 기관 및원위 동맥(remote arteries)과 비교할 때 투여 부위에서 올리고뉴클레오티드의 더 높은 농도(2-64배 증가)를 제공하였다.올리고뉴클레오티드의 농도는 주입 후 72시간째에 동맥 벽에서 증가된다. 물론, 벌룬 상해 영역으로부터 떨어져 있는 원위의 상해되지 않은 관상동맥은 모든 시점에서 표지된 올리고머의 축적을 보이지 않았다. 이것에 대한 가능한 설명은 혈관 벽 상해가 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 증가시킬 수 있는 염증 반응 및 세포 증식을 유도한다는 것이다. "저장" 기관으로부터 순환계로 복귀되는 올리고뉴클레오티드들를 동맥 벽의 상해 부위로의 재분포에 대한 공급원일 수 있다.
놀랍게도, 혈장으로부터 제거되어 저장기관으로 과량의 올리고뉴클레오티드가 축적된 결과(즉, 올리고뉴클레오티드는 동맥 벽안으로 직접 주입되지는 않는다), 치료적으로 충분한 동맥내 올리고뉴클레오티드의 농도는 저장기관으로부터 순환하는 혈장으로의 올리고뉴클레오티드의 계속적인 방출에 의하여 유지될 수 있는데, 이는 상해 부위에서 혈장으로의 흡수에 의해 증강된다.
돼지 모델의 체내약물속도록적 데이터는 혈관 벽내 올리고뉴클레오티드의 지속적인 수준이 국소적인 카테테르 전달에 의해 이루어짐을 시사한다. 상기 데이터는 또한 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 재협착증의 전신적인 치료에 대한 가능성을 나타내는데, 왜냐하면, 놀랍게도, 순환하는 혈장중의 매우 낮은 농도가 상해 부위에서 치료적으로 효과적인 농도를 제공한 수 있기 때문이다.
치료 효율의 가능성은 놀랍게도 하기의 생체내 동물 연구에 의해서도 시사된다. 상기 설명된 시험관내 연구(실시에 7)는 10μM의 올리고뉴클레오티드 농도에서, 4일 동안 SMC와 계속 접촉되었을 때 SMC 성장의 단지부분적인 억제를 이루었를뿐이다. 그럼에도 불구하고, 생체내에서 20㎍/g혈관의 능도(약 6μM)에서 일시적인국소적인 올리고뉴를레오티드 적용은 저장 기관으로부터 흡수 후 표준 돼지 재협착증 모델에서 신생 동맥내막 형성의 실질적인 감소를 초래하였다.
실시예 11 : 동물연구 - c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 재협착증의 억제
재협착증을 억제하는 c-myc 안티센스 화합물의 효력을 시험하기 위하여, 재협착증 돼지 표준 모델에서 관상동맥 혈관형성술 부위에 종래의 프로토콜을 사용하여 c-myc-특이적 안티센스(서열번호 1) 및 위약(placebo) (서열번호 2) 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트를 투여하는 실험을 하였다[예컨대, Karas et al., J. Am. Coll. Card. 20:467-474 (1992) : 및 Schwartz et al., Circulation 82:2190-2200 (1990)]. 가축용 잡종 돼지들(Sus scrofa)에게 연구전에 경구용 아스피린(650mg)을 투여하였다. 일반적인 마취는 케타민(12mg/kg) 및 크실라진(8mg/kg)의 근육내 주입으로 이루어진다. 추가의 마취제 투여는 실험전반에 걸쳐 정맥내로 제공하였다. 우측 내부의경동맥을 수술로 노출시킨 후, 해파린(10,000U)을 돼지 정액내로 투여하였다. 8프렌치 SAL 1 가이딩 카테테르(Medtronic lnterventional Vascular, Inc., Danvers, MA)를 사용하여 관상동맥의 소공(ostia)을 형광경 유도하에서 카뉼레이팅(cannulating)하였다. c-myc 안티센스 및 위약 올리고뉴를레오티드를 전달하기 전에 특대의 혈관형성술 벌룬을 사용하며 10 기압에서 팽창시키고 30초동안 유지하는 것을 연속 3회 실시함으로써 동맥 벽의 내막층및 중간층을 손상시켰다. 혈관형성술 벌룬을 제거한 직후, 관상동맥으로의 벽내 주입(2㎖)을 별도의 다공성 벌룬을 사용하여 수행하였다. c-myc 안티센스(13 복제물) 또는 위약(12 복제물) 올리고머를 4 기압하에서 주입하고 평균 27초내에 전달을 완료하였다. 올리고머의 투여량은 상해된 관상동맥당 1mg이었다. 올리고머의 투여와 관련된 부작용은 없었다. 투여후 1달 후에, 동물들을 희생시키고, 최대의 신생 동맥내막 면적(NA max), 신생 동맥내막두께(NT max), 및 상해 부위에 잔류하는 루멘(RL)를 모포메트리(morphometry)에 의하여 측정하였다. 그 결과 (평균 ± SEM)를 하기 표 및 제 9도 내지 제 11도에 나타낸다.
[표 2]
제 9A도(중간 정도의 상해) 및 제 9B도(심각한 상해)는 상해 후 한달 경과된 예시적인 대조군(즉, 센스 올리고머를 주입받은) 관상동맥의 단면 사진이다. 조직학적 상해 스코어는 다음과 같이 등급을 정했다 : 등급 I : 내부 탄성 라미나의 구멍 뚫린 손상 , 신생 동맥내막은 내부 탄성 라미나의 루미나 측에만 존재한다 ; 등급 II : 내부 탄성 라미나의 양쪽에서 볼 수 있는 신생 동맥내막을 가지고 있는 내부 탄성 라미나의 갭 ; 등급 III : 메디아의 2/3가 신생 동맥내막으로 대체된 파괴된 내부 탄성 라미나 : 등급 IV : 동맥혈관 외막(adventitia)으로 연장된 신생 동맥내막을 가지고 있는 파괴된 내부탄성 라미나. 중간 정도의 상해는 상해 스코어 등급 I 및 II를 토대로 하고, 심각한 상해는 등급 III 및 IV로 표시된다. 상당한 신생 동맥내막 두께가 제 9A도 및 제 9B도에서 관찰된다(화살표).
제 10A도(중간 정도의 상해) 및 제 10B도(심각한 상해)는 예시적인 안티센스-처리된 관상동맥의 단면 사진이다. 신생 동맥내막의 감소가 현저하다. 최대의 신생 동맥내막 면적을 상해 정도의 함수로서 분석하였을 때(제 11도), 신생 동맥내막과 상해-스코어의 관계(즉, 상해의 심각성)를 나타내는 회귀곡선은 기울기에서 상당한 차이를 보인다(p<0.001). 제 11도에서 알 수 있는 바와같이, 안티센스 올리고머는 특히 더 진전된 상해인 경우, 신생 동맥내막 형성을 상당히 감소시켰다.
요약하면, 상기 결과들은, 동맥 벽의 벌룬-유발 상해 후에 c-myc 안티센스 올리고머를 카테테르를 통해 국소적으로 투여하는 것이 관상동맥 혈관계의 신생 동맥내막 형성을 상당히 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 12 : 성장 검정 - 추가의 c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드
c-myc mRNA의 번역개시 영역으로부터 떨어져 있는 영역들을 표적으로 삼는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 성장 억제 효과를 다음과 같이 조사하였다. 사람 SMC를 5,000/㎠로 플레이트하고 0.5% FBS에 48시간 동안 넣어 두었다. 그런 다음 세포를 20% FBS로 자극하고, c-myc mRNA의 다양한 표적 서열에 상보적인 다음의 포스포로티오에이트 올리고머들중 하나(8μM 또는 16μM)를 세포 자극시 첨가하였다 :
5' AAAGTGCCCG CCCGCTGCTG 3'(서열번호 6), 5' 비-코딩 영역의 358-377 뉴클레오티드를 표적화 ;
5' GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT 3'(서열번호 7), 5' 비-코딩 영역의 400-419 뉴클레오티드를 표적화 ;
5' CCAGTGCAAA GTGCCCGCCC 3'(서열번호 8), 5' 비-코딩 영역의 365-384 뉴클레오티드를 표적화 ;
5' GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA 3'(서열번호 9), 코딩 영역의 1709-1728 뉴클레오티드를 표적화 ;
5' TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 3'(서열번호 10), 코딩 영역의 1264-1283 뉴클레오티드를 표적화 ;
5' CGGATCTCCC TTCCCAGGAC 3'(서열변호 11), 5' 비-코딩 영역의 242-262 뉴클레오티드를 표적화 ;
5' CGTTCTTTTT TCCCGCCAAG 3'(서열번호 12), 5' 비-코딩 영역의 80-89 뉴클레오티드를 표적화.
번역개시 영역을 표적화하는 5' AACGTTGAGG GGCAT 3'(서열번호 1)은 양성 대조군으로서 사용하였다. 다음 올리고머들은 음성 대조군으로서 사용하였다. 번역개시 영역 센스 올리고머(서열번호 2) ; 서열번호 1과 4개의 미스매치에 의해 다른 미스매치된 올리고머 5' AACGTGGATT GGCAG3'(서열변호 13) ; 및 스크램블된 센스 올리고머 5' GAACGGAGAC GGTTT 3'(서열번호 14), 세포들을 올리고머와 함께 또는 올리고머 없이 3일 동안 배양하고 세포 수를 쿨터 계수기로 계수하였다. 성장 및 억제를 진술한 바와 같이 측정하였다.
그 결과를 제 12도에 도시한다. 다양한 성장 억제 정도를 얻었다. c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열번호 7 및 10은 번역개시 영역을 표적화하는 올리고머인 서열번호 1 과 비교할 때 사람 SMC에서 유사한 성장 억제 정도를 제공하였다. 센스, 미스매치된 및 스크램블된 센스 올리고머들은 성장 억제를 제공하지 못하였다. 제 12도에 도시된 결과는 3회 관찰의 평균으로서 표시된다. 실험을 2회 반복하였다. 유사한 결과를 얻었다.
합성, 제조 및 분석 방법에 관련하여 인용된 모든 참고문헌들을 참고로서 본 명세서에 편입한다.
본 발명은 그 사상 또는 본질적인 특징으로부터 벗어남이 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있으며, 따라서 발명의 범주에 대해서는 전술한 설명보다는 오히려 하기의 특허청구의 범위를 참고하여야 할 것이다.
서열 목록
(1) 일반적인 정보:
(i) 출원인: 토마스 제퍼슨 유니버시티
(ii) 발명의 명칭: 평활근 세포의 증식을 조절하기 위한 c-myc 의 안티센스 억제
(iii) 서열의 수: 14
(iv) 연락처:
(A) 수신인: 시델, 곤다, 라보르그나 앤드 모나코, 피. 씨.
(B) 거리: 슈트 1800 투 펜 센터
(C) 시: 필라델피아
(D) 주: 펜실바니아
(E) 나라: 미합중국
(F)우편 번호: 19102
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 타입: 디스켓, 3.5 인치 720 kb
(B) 컴퓨터: IBM PS/2
(C) 운영 시스템: MS/DOS
(D) 소프트웨어: 워드퍼펙트 5.1
(vi) 현 출원 데이타:
(A) 출원 번호: n/a
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 정보:
(A) 이름: 다니엘 에이. 모나코
(B)등록 변호: 30,480
(C) 참조/서류 번호: 8321-9
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (215) 568-8383
(B) FAX: (215) 568-5549
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Claims (1)

  1. c-myc RNA에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 사람 평활근 세포의 증식을 조절하여 사람의 재협착증을 치료하기 위한 약제 조성물로서, 올리고뉴클레오티드가 서열번호 7 또는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 약제 조성물.
KR1019950702808A 1993-01-07 1994-01-07 평활근세포의증식을조절하기위한c-myc의안티센스억제 KR100316205B1 (ko)

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