KR100314142B1 - 재조합사빈1형폴리오바이러스벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 점막면역을 유도할 수 있는 다양한 백신 개발에 사용될 수 있는 벡터 시스템에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 점막면역을 유도할 수 있는 다양한 백신 개발에 사용될 수 있는 벡터 시스템에 관한 것이다.
종래 수혈이나 동성연애, 약물중독자들의 주사기 공동사용 등 피에 의해 전염되는 것으로 알려져 있는 대부분의 바이러스성 질환, 예를 들면 후천성 면역 결핍증(Acquired Immunodeficiency Syndrome: 이하 AIDS로 약함)의 경우, 최근의 역학조사와 연구결과에 따르면 대부분 성적 접촉에 의해서 전염되는 것으로 보고되었다.
AIDS의 경우, 수혈이나 동성연애 등 피에 의한 전염 보다 이성간의 성적 접촉에 의한 전염이 훨씬 능가하고 있는 것으로 보고되었고{Stingl et al., J. Am. Acad. Dermatol., 22, 1210, 1988}, 또한 국내의 경우에도 감염자 527명중 99명이동성연애자인 반면, 대다수인 363명이 이성간의 성적 접촉에 의해 감염된 것으로 보고되어 있다{국립보건원, 감염발생정보지, 1996년 4월호}. 이러한 실례들은 AIDS 바이러스(Human Immunodeficiency virus; HIV-1)가 피를 통하지 않고도 성기 주위의 점막세포를 통해 전염된다는 사실을 명백히 시사해 주고 있다.
AIDS 진행 경로를 보면, HIV-1이 점막부위에 다량 존재하는 랑겔한스 세포나 수지상 돌기세포(dendritic cell; 이하 DC로 약함)에 잘 감염되고, 감염된 세포는 항원전달을 위해 임파절내로 되돌아와(homing property) 임파절에서 대량의 바이러스 증식이 일어나 AIDS로 진행된다고 알려지고 있다. 다시 말하면 HIV-1에 감염된 환자와 성관계를 갖는 경우 비뇨생식기 주위의 점막부위(mucosal area)에 많이 분포된 랑겔한스 세포나 DC 등이 HIV에 감염되고, 이 DC가 임파절로 되돌아와 임파절내 휴지기의 CD4+T-세포를 활성화시키고 HIV를 전파하여 CD4+T-세포의 결핍을 유도하므로 마침내 AIDS로 진행된다는 것이다{Tschachler et al., J. Invest, Dermator, 88, 233, 1987; Langhoff ef al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 88, 7998, 1991; Patterson & Knight, J. gen. Virol., 68, 1177, 1987; Patterson et al., Immunol., 72, 361, 1991; Cameron et al., Science, 257, 383, 1992; Embreston et al., Nature, 362, 369, 1993; Fauci, Science, 262, 1011, 1993; Pantaleo et al., Nature, 362, 355, 1993, Adema et al., Nature, 387, 713, 1997}. 이러한 사실은 Macaque 원숭이의 웅성 생식기나 자성 질에 원숭이 면역결핍바이러스(SIV)를 처리하였을 때 AIDS를 일으켰다는 실험결과로 증명되었다{Miller& Gardner, J. AIDS, 4, 1169, 1991; Miller et al., J. Virol, 63, 4277, 1989}.
이와함께 대부분의 바이러스성 질환이 호흡기, 소화기, 비뇨생식기 등 점막조직을 통해 1차 감염이 일어나므로, 점막면역을 효과적으로 유도할 수 있는 백신이 개발된다면 초기 감염을 차단할 수 있어 전염성 질환을 가장 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
특히, 점막면역은 공통된 점막성 면역체계(common mucosal immune system)를 가지고 있어 어느 한 곳에서 면역이 유도되면 체내 다른 점막부위에도 동일한 면역반응이 유도되므로, 여러 연구진들은 이러한 점막면역 시스템을 이용한 백신 개발을 제안하였다{Kott, Science, 266, 1335, 1994; Cease & Verzofsky, Ann. Rev. Immunol., 12, 923, 1994}.
구체적인 예를 들면, 천연두 바이러스를 벡터로 사용한 백신이 제안되었다. 천연두 바이러스에 백신유전자를 도입하여 제작한 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 원숭이에 감염시켰을 때 세포독성면역(cytotoxic Tlymphocyts)을 유도하였지만, 사람에게 치료목적으로 투여할 경우 바이러스 과다증식에 의한 백시니아증이 우려되어 아직까지 적용하지 못하고 있다. 이에 약독화된 백시니아 바이러스의 사용을 제안하고 있으나, 이 경우 효과적으로 면역을 유도하지 못하였다{Cooney et al., Lancet, 337, 567, 1991; Tartaglia et al., Virol., 188, 217, 1992}.
또, 백시니아 바이러스보다 게놈 크기가 작은 34kbp의 아데노바이러스를 벡터로 사용한 백신도 제안되었다{Natuk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,7777, 1992; Gallichar et al., J, Infect, Dis., 168, 622, 1993}. 그러나, 이 경우 결막염이나 각막염 등의 부작용이 해결해야 할 과제로 남아 있다.
최근에는, 7.43kb의 단쇄 RNA 바이러스인 폴리오바이러스(poliovirus)를 벡터로 사용한 백신 개발이 활발히 진행되고 있다. 이를 이용한 AIDS 백신 개발의 구체적인 사례와 문제점을 정리하면 다음과 같다 :
(1) HIV의 gp41, PND(principle neutralizing domain), gp120 등의 백신유전자 일부(epitope)를 폴리오바이러스의 최외각 단백인 VP1 유전자의 일부와 치환하는 방법으로, 에피토프(epitope)의 특성에 따라 항체 생산을 유도할 수 있지만 {Breke et al., Nature, 332, 81, 1988; Evans et al., Nature, 385, 1989; Dedieu et al., J Virol., 66, 3161, 1992; Rose et al., J. gen. Virol., 75, 969, 1994}, 삽입되는 백신유전자의 크기가 아미노산 25개 이상인 경우, 감염세포에서 폴리오바이러스가 제대로 조합(assembly)되지 못하여 자손 바이러스(progeny virus)를 생산하지 못한다는 문제점이 있었다.
(2) 폴리오바이러스의 VP1이나 VP3 혹은 전체 외각단백 유전자를 제거하고 여기에 HIV-1의 gag나 pol 유전자를 도입하여 제작한 재조합 플라스미드를 폴리오바이러스 캡시드(capsid)를 발현하는 백시니아 바이러스와 공동-형질감염(co-transfection)시키는 방법으로, 백신 단백의 발현과 함께 폴리오바이러스가 조합(encapsidation)되는 것을 확인하였다{Porter et al., J. Virol., 67, 3712, 1993; ibid, 69, 1548, 1995}. 그러나, 자손 바이러스 스스로는 외각 단백을 합성할 수 없어 증식력을 갖지 못하므로 점막 면역을 유도하려면 서브유니트(subunit)백신처럼 많은 양을 투여해야 하는 문제점을 가지고 있다.
(3) 폴리오바이러스 자체의 3C 프로테아제가 폴리오바이러스 서브게놈(subgenome) 사이의 아미노산 서열을 인식하여 글루타민-글리신(Q-G) 연결부위를 절단하는 성질을 가지고 있으며{Hanecak et al., Proc Nat;. Acad. Sci. USA 79, 3793, 1982}, Q-G 사이의 절단은 프로테아제가 포함된 폴리오바이러스의 긴 단랑체 단백질의 단일 분자내에서(intramolecule) 일어나고{Palmeuberg and Reuckert, J. Virol., 41, 244, 1982; Hanecak et al., Cell 37, 1063, 1984}, 이러한 성질이 피코르나바이러스(picornavirus) 그룹에서는 보편적으로 나타나는 현상이며 {Palmenberg et al., J. virol. 32, 770, 1979, Palmenberg and Reuckert, J. Virol., 41, 244, 1982}, Q-G 사이가 프로테아제에 의해 효과적으로 절단되기 위해서는 Q-G 앞 4번째 아미노산이 알라닌(A)이어야 한다(AXXQG)는 사실이 발표되고 실험을 통해 여러번 확인되었다{Nicklinson et al., Biotechnology 4, 33, 1986; Pallai et al., J. Biol. Chem., 264, 9738, 1989; Cordingley et al., J. Virol., 63, 5037, 1989; Orr et al., J. Gen Virol., 70, 2931, 1989; Petithory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11510, 1991; Blair and Semler, J, Virol. 65, 6111, 1991}. 이러한 사실을 이용하여, Mattion 등{J. Virol. 68, 3925, 1994}은 폴리오바이러스의 백신주 중 하나인 Sabin 3의 N-말단(N-terminal)에 다중 클로닝부위와 3C-프로테아제 절단부위를 삽입하여 벡터로 제조하고, 여기에 로터바이러스(rotavirus) VP7을 발현하는 키메릭 폴리오바이러스를 생산하였으며, Andino 등 {Science, 265, 1448, 1994}은 야생종인 마호니(Mahoney) 폴리오바이러스의 N-말단에 다중 클로닝 부위와 3C-프로테아제 절단부위를 삽입하여 마호니 벡터(MoV-1.4)를 제작하고, 여기에 HIV-1의 여러 유전자들을 도입하여 키메릭 폴리오바이러스를 생산하였다. Andino의 실험결과에 따르면, 재조합 바이러스중 HIV-1의 nef 유전자를 클로닝한 키메릭 폴리오바이러스를 원숭이 직장에 주입한 결과 2주후에 점막면역이 효과적으로 유도되었음을 발표하였다. 그러나, 마호니 주(株)는 영장류의 소화기관을 통해 감염된 다음, 신경세포에서 증식하여 중추신경계(CNS; central nervous system)를 손상시켜 경련성 소아마비(paralytic poliomyelitis)를 일으키는 맹독성 바이러스이기 때문에, 이를 이용하여 재조합 바이러스를 생산하더라도 바로 사람에게 사용할 수는 없는 실정이다. 또한, Andino의 발표 이후에 Mueller와 Wimmer{J. Virol., 72, 20∼31, 1998}는 Andino의 마호니 벡터에 형광발현단백(green fluorescence protein)을 코딩하는 유전자(gfp; 252aa)와 Andino 등이 사용하였던 HIV-1 gag 동일 유전자를 도입하여 얻은 재조합 바이러스의 경우 기존 Andino의 보고{Science, 265, 1448, 1994}와는 달리 한번만 계대하여도 도입된 유전자가 거의 소실되고 6회 계대후에는 RT-PCR로 초기 클로닝한 전장(full-length)이 거의 발견되지 않음을 확인하고, 마호니 벡터의 유전적 안정성이 매우 낮음을 보고하였다.
(4) Andino 등은 1996년 동일한 벡터를 이용하여 B형 간염바이러스의 preS유전자(118aa , 54aa)와 코어(core) 유전자(155aa)를 발현하는 마호니 재조합 바이러스를 생산하였다{Yim et al., Virology, 218, 61, 1996}. 이 키메릭 바이러스들은 적어도 6차 계대시까지 도입된 유전자가 안정하게 유지된다고 발표하였으나, 실재이들 논문의 본문에는 preS 유전자의 118aa를 발현하는 재조합 바이러스도 RT-PCR 실험결과 5차 계대시부터 도입된 유전자의 유실이 발견되었다고 보고하였다. 뿐만 아니라 도입된 유전자가 55aa로 매우 작음에도 불구하고 증식력이 야생형에 비해 현저히 낮은 것으로 나타난 실험결과는 키메릭 바이러스의 증식력이 도입된 유전자의 크기에 반비례 할 것이라는 가정을 뒤엎고 있다. 이러한 결과들은 재조합 바이러스의 생화학적 성질이 외부유전자의 크기에만 국한되는 것이 아니라 사용되는 폴리오바이러스 벡터의 특성과 도입된 유전자의 성질에 의해 결정된다고 볼 수 있다.
(5) Andino 등은 마호니 벡터의 문제점을 인정하면서, 다시 마호니 cDNA의 P1/P2 연결부위에 다중 클로닝 부위와 2A-프로테아제 절단 부위를 도입하여 새로운 마호니 벡터(MoV-2.1)를 개발하였고{Tang et al., J, Virol., 71, 7841-50, 1997}, 여기에 SIV gag 유전자(p17, p27) 혹은 env 유전자(gp130, gp41)를 클로닝하여 재조합 바이러스를 생산하였다. 이 경우 재조합 바이러스의 증식력은 야생형과 유사하였으며 도입된 외부 유전자도 잘 발현되는 것으로 보고되었다. 그러나 3회 계대배양만으로도 재조합 바이러스의 99% 이상이 도입된 유전자를 유실하였다. 이들은 이러한 유전자 결손이 다중 클로닝 부위의 반복되는 유전자서열(repeated sequsnce)에 의한 동형재조합(homologous recombination) 때문이라고 보고, 이러한 반복되는 유전자 서열에 인위적으로 침묵돌연변이(silent mutation)를 유도하여 유사도(homology)를 37%로 낮추어 재조합 바이러스{(Sp27(MoV -2.11)}를 생산하였다. 그 결과, 돌연변이를 유도하지 않는 재조합 바이러스{Sp27(MoV-2.1)}는 한번 계대시 플라크의 20∼30%가 도입한 유전자를 유지하였으나, 3회 계대후에는 도입된 유전자를 발현하는 플라크가 전혀 나타나지 않는 반면, 돌연변이로 염기서열의 유사도를 낮춘 재조합 바이러스{Sp27(MoV-2 11)}는 1차 계대시 90% 이상의 플라크에서 도입된 gag 유전자를 발현하였으며, 3회의 계대배양후에도 플라크의 30∼50%가 도입된 SIV 유전자 단백을 발현하고 있음을 보였다. 그러나 이들이 새로이 개발한 마호너벡터(MoV-2.1)에 진전이 있다고 하여도, 이들 역시 1차 계대시 90%이상의 자손바이러스가 도입된 백신유전자를 발현하던 것이 2차 계대시 50∼70%, 3차 계대시 30∼50%로 현격히 줄어드는 것이 확인되었으므로, 이후 몇번의 계대배양을 더 거치면 전체 자손바이러스 중 재조합 바이러스는 극히 일부에 불과할 것이며, 그나마 계대를 계속한다면 모두 사라지고 말 것이다. 그러므로 이러한 벡터를 백신개발을 위한 폴리오바이러스 벡터의 대표적인 모델로 제시할 수는 없다.
종래 기술들이 갖고 있는 상술한 문제점을 감안하면, 점막면역 유도용 백신개발에 있어서, ① 벡터로 사용되는 바이러스가 인체에 무해하고; ② 재조합 바이러스가 증식력에 있어 야생형과 유사한 자손 바이러스를 생산할 수 있으며, ③ 도입된 외부 유전자가 안정하게 유지될 수 있는(유전적 안정성) 새로운 벡터가 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기한 조건들을 충족하는 새로운 벡터 개발을 위하여 예의 연구하여 왔으며, 소아마비 예방 백신으로 가장 널리 사용되고 있는 사빈(Sabin) 1형 폴리오바이러스를 백신개발을 위한 벡터로 개발하고자 시도하였다. 사빈 1형 폴리오바이러스의 경우 향신경성(neurotropism)이 제거된 약독화주로서 아직까지 한번도 그 부작용이 보고된 예가 없는 안전한 백신 주(株)임에 착안하여 이를 벡터 제작에 사용하였다.
본 발명자들은 사빈 1형 cDNA의 N-말단에 다중 클로닝 부위와 3C-프로테아제 절단부위를 도입하여 벡터 pTZ-PVS-3m을 제작하였으며, 이 벡터로부터 유도된 재조합 바이러스의 증식력을 조사한 결과 야생형 사빈 1에 비해 증식력이 1∼10배 정도 낮게 나타났으나, 이 벡터에 다양한 백신유전자를 도입하여 얻은 키메릭 폴리오바이러스가 증식시에 도입된 유전자를 매우 효과적으로 발현하였으며, 12회 계대까지 도입된 유전자에 이상이 없고 발현도 정상적으로 유지됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 점막면역을 효과적으로 유도할 수 있는 다양한 백신 개발에 사용될 수 있는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스벡터의 다중 클로닝 부위내에 백신 유전자가 도입되어 이루어진 키메릭 폴리오바이러스벡터를 제공하는 것이다.
또, 본 발명의 다른 목적은 상기한 키메릭 폴리오바이러스벡터를 이용하여 백신으로 사용될 수 있는 키메릭 폴리오바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기한 목적들 및 그외의 목적들은 하기하는 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m의 제작 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m과 pTZ-PVS-4m에 있어서, 사빈 1형 폴리오바이러스 cDNA에의 다중 클로닝 부위와 3C-프로테아제 절단부위의 도입부위를 보여주는 모식도이다.
도 3은 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스의 자손 바이러스(progeny virus) 생산(증식력)을 확인시켜 주는 사진이다 :
A : 야생형 cDNA에 의한 RNA 전사체의 형질감염에 의해 생성된 플라크,
B : 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m에 의한 RNA 전사체의 형질감염에 의해 생성된 플라크,
C : 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-4m에 의한 RNA 전사체의 형질감염에 의해 생성된 플라크.
도 4는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 HIV-1 p24 유전자를 도입하여 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24를 얻는 과정 및 HIV-1 p24 단백의 발현을 보여주는 모식도이다.
도 5는 재조합 폴리오바이러스의 증식력을 비교하기 위한 oue-step 성장곡선으로서, 각 감염 세포의 배양 상등액을 수획하여 TCID50및 플라크 분석법에 의해 바이러스 농도를 정량한 결과이다.
도 6은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24에 의해 감염된 HeLa세포에서의 HIV-1 p24 단백의 발현양상을 웨스턴 블롯법에 의해 분석한 결과이다 :
레인 1 : HIV-1/tat-(tat 유전자가 결손된 HIV-1; 미국 Dana-Farber 암 연구소에서 공급받음),
레인 2 : 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형에 감염된 세포 파쇄물,
레인 3 : PVS-3m/p24에 감염된 세포 파쇄물,
레인 4 : PVS-3m/p24에 감염된 세포 배양 상등액.
도 7은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24에 의해 발현된 HIV-1 p24 단백의 항원성 유지를 확인하기 위한 방사선면역침전 분석 결과이다 :
레인 1 : 감염되지 않은 세포 파쇄물,
레인 2 : 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형에 감염된 세포 파쇄물,
레인 3 : PVS-3m/p24에 감염된 세포 파쇄물.
도 8은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 유전적 안정성을 조사하기 위하여 12회 계대까지의 HIV-1 p24 유전자의 보전상태를 조사한 결과이다 :
레인 1 : 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 2 : 재조합 폴리오바이러스 PVS-3m에 감염된 HeLa세포로부터 추출한RNA의 PCR 증폭물,
레인 3 : PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 4 : 2회 계대 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 5 : 4회 계대 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 6 : 8회 계대 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 7 : 12회 계대 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물.
도 9는 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 유전적 안정성을 조사하기 위하여 12회 계대까지의 HIV-1 p24 단백의 발현양상을 웨스턴 블롯법에 의해 분석한 결과이다 :
레인 1 : HIV-1,
레인 2 : HeLa세포 파쇄물,
레인 3 : 사빈 1형 야생형 폴리오바이러스에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 4 : 1회 계대한 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 5 : 3회 계대한 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 6 : 6회 계대한 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 7 : 9회 계대한 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 8 : 12회 계대한 PVS-3m/p24에 감염된 HeLa세포 파쇄물.
도 10은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 HIV-1 외막 당단백 유전자 env(125aa)를 도입시켜 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env을 얻는 과정 및 HIV-1 외막 당단백의 발현을 보여주는 모식도이다.
도 11은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 유전적 안정성을 조사하기 위하여 12회 계대까지의 HIV-1 외막 당단백 유전자 env(125aa)의 보전상태를 조사한 결과이다 :
레인 1 : 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 2 : 재조합 폴리오바이러스 PVS-3m에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 3 : 3회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 4 : 6회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 5 : 9회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 6 : 12회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물.
도 12는 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 유전적 안정성을 조사하기 위하여 12회 계대까지의 HIV-1 외막 당단백의 발현양상을 웨스턴 블롯법에 의해 분석한 결과이다 :
레인 1 : HeLa세포 파쇄물,
레인 2 : 재조합 폴리오바이러스 PVS-3m에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 3 : 3회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 4 : 6회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 5 : 9회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레일 6 : 12회 계대한 PVS-3m/env에 감염된 HeLa세포 파쇄물.
도 13은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 HCV 코어 유전자를 도입하여 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc를 얻는 과정 및 HCV 코어 단백의 발현을 보여주는 모식도이다.
도 14는 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 증식력을 비교하기 위하여 조사한 one-step 성장곡선으로서, 각 감염 세포의 배양 상등액을 수획하여 TCID50 및 플라크 분석법에 의해 바이러스 양을 정량한 결과이다.
도 15는 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc에 의해 감염된 HeLa세포에서의 HCV 코어 단백의 발현양상을 웨스턴 블롯법에 의해 분석한 결과이다 :
레인 1 : 세포 파쇄물,
레인 2 : 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형에 감염된 세포 파쇄물,
레인 3 : PVS-3m/HCVc에 감염된 세포 파쇄물,
레인 4 : PVS-3m/HCVc 펠렛(pellet),
레인 5 : 바이러스-프리 배양 상등액 농축물,
레인 6 : PVS-3m/HCVc에 감염된 세포 파쇄물의 불용성 침전물,
레인 7 : PVS-3m/HCVc에 감염된 세포 파쇄물의 용해성 상등액.
도 16은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 유전적 안정성을 조사하기 위하여 12회 계대까지의 HCV 코어 유전자의 보전상태를 조사한 결과이다 :
레인 1 : 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 2 : 재조합 폴리오바이러스 PVS-3m에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 3 : 3회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 4 : 6회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 5 : 9회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물,
레인 6 : 12회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포로부터 추출한 RNA의 PCR 증폭물.
도 17은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 유전적 안정성을 조사하기 위하여 12회 계대까지의 HCV 코어 단백의 발현양상을 웨스턴 블롯법에 의해 분석한 결과이다 :
레인 1 : 1회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 2 : 3회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 3 : 6회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 4 : 9회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포 파쇄물,
레인 5 : 12회 계대 PVS-3m/HCVc에 감염된 HeLa세포 파쇄물.
도 18a ∼도 18c는 사빈 1형 폴리오바이러스의 전체 염기서열이다.
사빈 1형 폴리오바이러스는 1962년 Sabin과 동료들에 의해 개발된 것으로, 야생형인 마호니 주를 원숭이 신장세포에서 계속적으로 시험관내 계대배양하여 향신경성이 사라진 것들 중에서 면역원성이 가장 강한 것을 선별한 것이다. 야생주인 마호니 주와 염기서열을 비교하면(도 18), 반복되는 계대배양으로 57개의 염기가 변화하였고, 이중 21개는 아미노산 변화를 유도하였으며, 이들 코딩-변화 변이는 모두 외막 단백 중 VP1의 N-말단 half 영역에 몰려 있다{Kitamura et al., Naure, 291, 547-553, 1981; Nomoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5793-7, 1982}. 사빈 1형은 야생형 마호니 주에 비해 증식력이 2∼3 log 정도 떨어지며, 소장 등의 소화기관에는 감염되나 향신경성이 없이 중추신경계에는 감염되지 않기 때문에 소아마비를 일으키지 않는다. 또한 강한 점막 및 전신면역반응을 유도하기 때문에 야생형 마호니 주에 대해 효과적인 백신 주(株)로 사용되어 왔다{Ogra et al., Rev. Inf. Diseases 2, 352-369, 1980}.
본 발명에서는, 외부 백신유전자를 쉽게 클로닝하고, 동시에 키메릭 폴리오 바이러스가 감염세포에서 증식하면서 발현된 백신 단백을 절단할 수 있도록, 폴리오바이러스 cDNA의 N-말단의 첫 번째와 두 번째 아미노산 사이에, 3가지 제한효소(SstⅡ, HpaⅠ, EagⅠ )에 대한 다중 클로닝 부위(multiple cloning site)와 3C-프로테아제 절단부위(3C-protease cuttiug site)를 부위 특이적 삽입방법(site-specific insertion)으로 도입하여 재조합 벡터 pTZ-PCV-3m을 제작하였다(도 1).
재조합 플라스미드 pTZ-PCV-3m은, 시험관내 전사(in vitro transcription)하여 얻은 RNA 전사체를 단층세포로 배양된 HeLa세포에 형질감염시켰을 때, 사빈 1형폴리오바이러스의 cDNA에 다중 클로닝 부위와 3C-프로테아제 절단부위의 도입부위를 달리하는 다른 재조합 플라스미드들에 비해 플라크 형성능이 가장 우수하였으며(도 3), TCID50및 플라크 분석법(Plaque assay)에 의해 바이러스를 정량(virus titer)하여 얻은 one-step 성장곡선(one-step growth curve)에 따르면, 재조합 바이러스 PCV-3m의 증식력은 야생형 사빈 1에 비하여 최대 1 log 정도 낮게 나타났으며 다른 재조합 바이러스들과 비교하면 가장 높았다(도 5).
본 발명에서는, 재조합 벡터 pTZ-PCV-3m의 다중 클로닝 부위에, HIV-1 p24 유전자(169aa), HIV-1 env(125aa) 및 HCV cors 유전자(100aa)를 도입하여 각각 키메릭 폴리오바이러스 PCV-3m/p24, PCV-3m/env 및 PCV-3m/HCVc를 생산하는데 성공하였다(도 4, 도 10 및 도 13)
이들 키메릭 폴리오바이러스는 증식시 도입된 유전자를 매우 효과적으로 발현하였으며(도 6 및 도 15), 발현된 백신 단백의 항원성도 정상적으로 유지됨을 확인하였다(도 7). 또, 키메릭 바이러스의 유전적 안정성을 조사한 결과, 12회 계대까지 도입된 유전자에 이상이 없었고(도 8, 도 11 및 도 16), 발현도 정상적으로 유지됨을 확인하였다(도 9, 도 12 및 도 17).
이상의 결과들을 토대로, 재조합 플라스미드 pTZ-PCV-3m을 여러 전염성 질환에 대한 백신 개발의 벡터로 널리 사용될 수 있을 것으로 기대되어, 1997년 8월 6일자로 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자은행(KCTC)에 KCTC-0365BP로 기탁하였다.
본 발명의 재조합 플라스미드 pTZ-PCV-3m의 다중 클로닝 부위에 도입될 수 있는 외부 백신 유전자는 감염성 바이러스에서 유래된 것일 수 있으며, 예를 들면 HIV 또는 HCV 등의 항원성 유전자일 수 있다. 구체적으로는 HIV-1 p24 유전자, HIV-1 gp120 중의 V3 루프를 포함하는 외막 당단백 유전자 또는 HCV 코어 단백 유전자일 수 있다.
이들 외부 백신 유전자를 도입하여 제조한 키메릭 플라스미드는 동물세포, 예를 들어 HeLa 세포에 형질감염시킨 후, 이 감염된 동물세포를 배양하고, 그 상등액을 취함으로써 키메릭 바이러스를 얻을 수 있고, 이 키메릭 바이러스를 경구투여용 백신으로 사용할 수 있다.
이하, 각종 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
<실시예 1> 재조합 플라스미드 pTZ-PCV-3m의 제작 :
도 1에서와 같이, 플라스미드 PVS(1)IC-(0)T {사빈 1형 폴리오바이러스 cDNA 플라스미드(poliovirus Sabin 1 cDNA plasmid); 동경대 노모토 박사로부터 분주받음}을 제한효소 EcoR I 으로 절단하여 cDNA를 분리한 후, 플라스미드 pTZ-18/R{파마시아 제품}의 EcoR I 위치에 클로닝하여 플라스미드 pTZ-PVS(1)을 제작하였다.
플라스미드 pTZ-PVS(1)을 제한효소 Pst I 으로 절단하여 삽입부위(insert part)를 제거한 후 자가연결시켜 폴리오바이러스 cDNA 중 1∼1813 부위를 가진 플라스미드 pTZ-PVS(1)/5를 제작하였다.
플라스미드 pTZ-PVS(1)/5를 Kunkel 등의 방법{Proc, Natl. Acad. Sci. ,82,488, 1985}에 따라 대장균 CJ236(dut-, ung-, Cmr)에 형질전환시켜 0.25㎍/㎖의 유리딘이 첨가된 LB-amp 클로람페니콜 배지{LB, 40㎍/㎖의 암피실린, 30㎍/㎖ 클로람페니콜}에서 배양하였고, 600nm에서의 흡광도가 약 0.5∼0.6이 되었을 때 M13K07 helper phage{파마시아 제품}를 10moi/bacterium 이상되게 접종한 다음, 카나마이신, 터미딘 및 유리딘이 첨가된 LB-amp 클로람페니콜 배지에서 8시간 배양하여, 우리실잔기가 강화된(uracil-enriched) 단쇄 DNA의 파지미드(phagemid)를 얻었다.
이 파지미드를 PEG/NaCl{20%의 PEG and 2.5M NaCl in DDW)로 침전시켜 페놀/클로로포름으로 ss DNA(단쇄 DNA)를 추출하였다.
추출한 ss DNA 1㎍과 유전자변이용 프라이머 : 5'-GAC AAT TGT ATC ATA ATG CCG CGG GTT AAC CGG CCG GCT TTG TTC CAA GGT GCT CAG GTT TCA TCA-3' 5 pmole을 완충액{2mM MgCl2, 50mM NaCl in 20mM 트리스-HCl : pH7.4} 10㎕에 첨가하여 70℃ 항온수조에 10분간 두었다가 30℃까지 서서히 온도를 낮추면서 재결합(annealing)시켰다. 여기에 10× 합성용 완충액{각 dNTP 5mM, 10mM의 rATP, 100mM의 트리스-Cl : pH7.4, 50mM의 MgCl2, 20mM의 DTT} 1㎕와, T4 DNA 리가제{Bio-Rad} 3 unit 및 DNA 폴리머라제{Bio-Rad} 1 unit를 첨가하여 얼음에서 5분간, 25℃에서 5분간, 최종 37℃에서 90분간 반응시켰다.
PCR 증폭된 DNA를 대장균 MV1190(dut+, ung+, Cmr)에 형질전환시켜, SstⅡ, Hpa Ⅰ, EagⅠ 등의 절단부위가 첨가된 효소로 잘라 확인하였다. 양성 클론의 플라스미드(pTZ-PVS/5)의 PstⅠ 위치에, 플라스미드 pTZ-PVS(1)을 제한효소 PstⅠ으로 절단하여 얻은 cDNA 단편(1814∼7440)을 다시 경합시켜, 폴리오바이러스 cDNA의 N-말단 1/2 아미노산 사이에 다중 클로닝 부위(SstⅡ-HpaⅠ-EagⅠ)와 3C 프로테아제절단부위(AXFQ/G){Dougherty and Semler, Microbiological Rev. 57, 781-822, 1993}가 새롭게 도입된 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m을 제작하였다. 새로이 삽입된 아미노산은 PRVNRPALFG이다.
<비교 실시예 1> 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-m의 제작 :
실시예 1의 방법에서, 유전자변이용 프라이머 : 5'-AT TGT ATC ATA ATG GGT GCT CCG CGG GGG CCC CGG CCG GCT TTG TTC CAA GGA GGA GCA CAG GTT TCA TCA CAG AAA GT-3'를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-m을 제작하였다.
재조합 플라스미드 pTZ-PVS-m은, 폴리오바이러스 cDNA의 N-말단 3/4 아미노산 사이에 리딩 프레임(reading frame)를 유지하면서 다중 클로닝 부위(SstⅡ-ApaⅠ-EagⅠ)와 3C-프로테아제 절단부위가 새롭게 도입된 것이며, 새로이 삽입된 아미노산은 PRGPRPALFQGGA이다. 프로테아제로 절단 후 미리스토일레이션(myristoylation) 부위를 고려하여 바이러스 폴리프로테인의 N-말단이 GG---로 시작되게 설계한 것이다.
<비교실시예 2> 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-2m의 제작 :
실시예 1의 방법에서, 유전자변이용 프라이머 : 5'-AT TGT ATC ATA ATG GGT GCT CCG CGG GGG CCC CGG CCG GCT TTG TTC CAA GGA GCA CAG GTT TCA TCA CAG AAAGT-3'를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-2m을 제작하였다.
재조합 플라스미드 pTZ-PVS-2m은 비교실시예 1의 플라스미드 pTZ-PVS-m과 유사하며, 절단 후 바이러스 폴리프로테인의 N-말단에 G 하나가 제거되도록 설계한 것이다.
<비교실시예 3> 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-2m/1의 제작 :
비교 실시예 2의 플라스미드 pTZ-PVS-2m의 5'쪽 1813bp를 포함하는 플라스미드 pTZ-PVS/5-2m를 실시예 1에서와 같이 ss DNA로 만든 다음, 유전자변이용 프라이머 : 5'-ATG GGT GCT CCG CGG GTT AAC CTC GAG GCT TTG TTC CAA GGA-3'를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-2m/1을 제작하였다.
재조합 플라스미드 pTZ-PVS-2m/1은, 비교실시예 1의 플라스미드 pTZ-PVS-m이나 비교실시예 2의 플라스미드 pTZ-PVS-2m에서 다중 클로닝 부위의 G/C 농도를 낮추기 위해 일부가 A/T로 치환되도록 설계한 것으로, 다중 클로닝 부위를 SstⅡ-HpaⅠ-XhoⅠ으로 대치시켰으며, 새로이 삽입된 아미노산은 PRVNLGALFQGA이다.
<비교실시예 4> 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-4m의 제작 :
실시예 1의 방법에서, 유전자변이용 프라이머 : 5'-GCG CTA GCA CAG GGG CCC GTT AAC CTC GAG AAG GCA CTT GCG CAA GGA TTA GGT CAG ATG CTT-3'를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-4m을 제작하였다.
재조합 플라스미드 pTZ-PVS-4m은, 폴리오바이러스 cDNA의 VP3/VP1 연결부위에 다중 클로닝 부위(ApaⅠ-HpaⅠ-XhoⅠ)와 3C-프로테아제 절단부위가 새롭게 도입된 것이며, 새로이 삽입된 아미노산은 GPVNLQKALAQ이다(도 2).
<실시예 2> 재조합 폴리오바이러스의 증식력 확인 :
실시예 1 및 비교실시예 1∼4에서 제작한 플라스미드 각각을 제한효소 SalⅠ으로 개환한 다음, 본 발명자의 방법{Bae et al., Nucleic Acid Res., 21, 2703, 1993}으로 시험관내 전사(in vitro transcription)하여 RNA 전사체를 합성하였다.
얻은 RNA 전사체 0.1㎍을 DEAE-덱스트란법{Stratagene Kit 사용방법에 따라}으로, 10%의 우태아혈청(FCS)을 첨가한 DMEM 배지{GIBCO/BRL사 제품}에서 단층(monolayered)으로 배양된 HeLa세포에 형질감염시킨 후, 메틸셀룰로스-DMEM{10% FCS를 보충한 DMEM 배지에 1.2%의 메틸셀룰로스를 첨가한 것} 배지로 갈아준 다음, 37℃, CO2배양기에서 2일간 배양하였다. 2일 후 세포를 0.1%의 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 플라크를 관찰하였다. 형성된 플라크의 수는 표 1에 나타내었으며, 결과의 일부를 도 3에 나타내었다.
표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 형질감염시 pTZ-PVS-3m이 야생형을 제외하고는 자손 바이러스 생산효율이 가장 높음을 알 수 있다. 본 플라스미드 pTZ-PCV-3m은 1997년 8월 6일자로 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자은행(KCTC)에 KCTC-0365BP로 기탁하였다.
<실시예 3> 재조합 폴리오바이러스플라스미드 pTZ-PVS-3m/p24의 제작 및 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 생산 :
Terwilliger 등{Proc. Natl, Acad, Sci., 86, 3857, 1989}의 논문에 발표된 염기서열을 기초로 프라이머 :
를 사용하여, HIV-1 cDNA{HXB2 ; Dr. Sodroski, 미국 Harvard Medical School로 부터 분양받음}를 주형으로 PCR을 실시하여 HIV-1 p24 유전자중 N-말단 169개 아미노산 유전자를 제조한 다음, 실시예 1에서 얻은 플라스미드 pTZ-PVS-3m의 제한효소 SstⅡ/EagⅠ 위치에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m/p24를 제작하였다(도 4 참조).
실시예 2에서와 동일한 방법으로, 제작한 플라스미드 pTZ-PVS-3m/p24를 시험관내 전사(in vitro transcription)하여 얻은 RNA 전사체를 단층으로 자란 HeLa세포에 형질감염시킨 후, 메틸셀룰로스-DMEM 배지에서, 37℃, CO2 배양기에서 2일간 배양하여 세포병변 효과를 확인하였다. 이때 상등액을 취하여 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 공급원으로 사용하였다.
<실시예 4> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 중식력 비교를 위한 one-step 성장곡선 :
HIV-1 p24 단백을 발현하는 키메릭 폴리오바이러스의 증식력을 확인하기 위하여 바이러스의 성장곡선을 조사하였다.
60㎜ 플레이트(4.8×105세포)에 자란 HeLa세포에, 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형(PVS), 재조합 폴리오바이러스 PVS-3m, PVS-4m, 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24 및 PVS-4m/p24 각각을 10 moi로 감염시킨 다음, 바이러스가 세포에 결합되도록 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 후 DMEM 3㎖를 첨가한 다음, 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 감염 후 3시간 간격으로 배양 상등액을 수획하여 냉동-해동(freeze-thawing)을 3회 반복하여 세포를 파쇄하고, HeLa세포 단층배양에서 플라크 분석법(plaque assay)과 TCID50분석법(TCID50assay){Virology a practical approach, p13 ed, by BWJ Mahy. IRL press, 1985}으로 바이러스를 정량(virus titer)하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 야생형(PVS)에 비해 PVS-3m은 1 log 정도 증식력이 떨어졌으나 PVS-3m/p24는 PCV-3m과 비슷한 증식력을 나타내었다. 한편, PVS-4m은 야생형에 비해 2 log 이상 증식력이 떨어졌고 PVS-4m/p24는 거의 증식력이 없는 것으로 확인되었다.
<실시예 5> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 증식시 p24 단백의 발현분석 :
실시예 4의 키메릭 폴리바이러스 PVS-3m/p24가 증식시 HIV-1 p24 단백을 발현하는지를 확인하기 위해, 바이러스 PVS-3m/p24를 HeLa세포에 10 moi로 감염시키고 6시간 후에 세포를 수획하여 PBS로 2회 세척한 후, 이를 세포용해 완충액 {80mM의 NaCl, 5mM의 MgCl2, 10mM의 트리스-Cl : pH7.4, 1mM의 DTT, 0.5%의 NP-40}에 재부유시켜 얼음에 5분간 방치후 원침시켜 핵과 세포 파쇄물을 제거하였다. 상등액을 동일 부피의 시료 완충액{50mM의 트리스: pH6.8, 1%의 SDS, 0.1%의 β-머캅토에탄올, 10%의 글리세롤, 0.03%의 브로모페놀 블루}과 섞어 3분간 끓인 다음, 10%의 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분리한 단백질 밴드를 반건조 트랜스블롯터(semi-dry transbloter; Bio-Rad}를 사용하여 니트로셀룰로스 막{Millipore 제품}에 옮겨, AIDS 환자 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
tat 유전자가 결손된 HIV-1의 p24단백은 24 kDa (231aa)이지만, p24 유전자 중에서 클로닝된 부위는 N-말단 169개 아미노산만을 발현하므로 18.7kDa에서 확인할 수 있다. 도 6의 결과에서, 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24가 HIV-1 p24단백을 효과적으로 발현함을 확인할 수 있다.
<실시예 6> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 백신 단백의 항원성 유지 확인 :
실시예 4의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24에 의해 발현된 HIV-1 p24 단백이 정상적인 p24 단백과 동일한 항원성을 유지하는지를 확인하기 위해 방사선면역침전법(radioimmunoprecipitation)을 실시하였다.
바이러스 PVS-3m/p24를 HeLa세포에 10 moi로 감염시킨 후 DMEM 배지에서 5시간 배양하였다. 배지를 메티오닌과 시스테인이 결핍된 DMEM 배지로 바꿔 1시간동안 배양한 후, 여기에 [35S]-메티오닌과 [35S]-시스테인을 각각 25μCi/㎖로 되도록 첨가한 후 37℃에서 2시간 더 배양하였다. 여기에 L-메티오닌과 L-시스테인을 각각 30㎍/㎖로 되도록 첨가한 후 2시간 더 배양하였다. 트립신을 처리하여 세포를 수획하고 PBS로 2회 세척한 후, 이를 RIPA 세포용해 완충액{50mM의 트리스-Cl : pH7.3, 1%의 트리톤 X-100, 1%의 소듐 데옥시콜레이트, 1%의 SDS} 500㎕에 부유시켜 얼음에 10분간 방치후 원심분리하여 핵과 세포 파쇄물을 제거하였다. 여기에 토끼 항-p24 항혈청 3㎕을 첨가하여 4℃에서 12시간 반응시켰다. 반응용액에 프로테인 A-세파로스(10% protein A-sepharose in PBS) 80㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 다음 원침하여 세파로스 비드를 회수하고, 이를 RIAP 완충액으로 3회 세척하였다. 여기에 1× 시료 완충액 50㎕를 첨가하여 3분간 끓인 다음 원침하여 세파로스 비드를 제거한 후, 10%의 SDS-PAGE에서 전기영동하여 오토레디오그램(autoradiogram)으로 바이러스 증식시 만들어진 p24의 항원성 유지여부를 조사하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7의 결과에서, 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24에 의해 발현된 HIV-1 p24 단백이 정상적인 p24 단백과 동일한 항원성을 유지하고 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 7> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 유전적 안정성 확인 :
실시예 4의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 유전적 안정성을 조사하기 위해, 형질감염에 의해 생산된 자손 바이러스를 계속해서 HeLa세포에서 계대배양하면서 단계별 계대시마다 바이러스를 수획하여 페놀-클로로포름 추출법, 에탄올 침전법에 의해 RNA를 추출한 후, RT-PCR을 실시하여 클로닝된 유전자의 보전상태(integrity)를 조사하였다.
추출한 RNA 10㎍과, cDNA 합성용 프라이머 : Polio-VP1/a (2545-2528)5'-CGT TGC CGC CCC CAC CGT-3' 1㎍을 혼합한 다음, 70℃에서 10분간 변성시킨 후, 즉시 얼음에 옮기고, 여기에 역전사효소 반응용액[50mM의 트리스-HCl: pH8.3, 65mM의 KCl, 3mM의 MgCl2, 10mM의 DTT, 1mM의 dNTP 혼합물, RNAsin 20 units}과 MMLV{Moloney Murine Leukemia virus) 역전사효소(Promega 사 제품) 200 units를 첨가한 후 42℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후에 100℃에서 3분간 배양하여 효소를 실활시켰다.
PCR 증폭은 사빈 1형 프라이머 :
를 사용하여 클로닝된 유전자가 포함된 폴리오바이러스 게놈 영역을 증폭하였다. PCR은 Taq 폴리머라제(Bioneer사 제품)를 사용하여 94℃에서 1분간; 45℃에서 30초간; 72℃에서 45초간; 총 25회 실시하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서, 666bP 밴드는 클로닝된 p24(169aa, 504 bP) 전체와 클로닝 부위전후의 폴리오바이러스 게놈 일부를 포함한 크기를 나타내며, 270bp 밴드는, 재조합 바이러스가 증식하는 동안, 클로닝된 p24에 내부 유전자 일부가 소실(internal deletion)되었음을 나타낸다. 그러나, 도 8의 결과에서 보듯이 키메릭 바이러스의 일부에서 유전자 유실이 일어나고 있음에도 불구하고, 12회 계대까지 666bp 밴드가 약해지거나 사라지지 않는 것으로 보아 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 경우 12회 계대까지 클로닝된 유전자가 안정하게 보전됨을 확인할 수 있다.
또, 계대시 클로닝된 HIV-1 p24 단백의 발현양상을 조사하였다. 각 계대 바이러스를 HeLa세포에 10 moi로 감염시키고 8시간 후에 세포를 수회하여 세포 파쇄물을 SDS-PAGE에서 전기영동한 후, 토끼 항-p24 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 결과로부터 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24의 경우 클로닝된 p24 단백의 발현양상이 12회 계대까지 거의 변화가 없음을 확인할 수 있고, 이로부터 클로닝된 유전자의 염기서열상에도 변화가 없음을 확인할 수 있다.
이상의 실시예들로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 HIV-1 p24 유전자(169aa)를 도입하여 얻은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24는 증식시 도입된 p24 유전자를 매우 효과적으로 발현하였으며, 발현된 p24 단백의 항원성도 유지되었고, 12회 계대까지 도입된 p24 유전자에 이상이 없었으며 발현도 정상적으로 유지되어 키메릭 바이러스의 유전적 안정성이 우수한 것으로 확인되었다. 더욱이, 벡터로 사용된 사빈 1형 폴리오바이러스는향신경성이 제거된 약독화주로서 아직까지 한번도 그 부작용이 보도된 바없이 안전하게 사용되고 있는 소화마비 예방 백신 주(株)임을 감안하면, 본 발명에 의해 제공되는 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/p24는 경구투여용 백신으로 사용할 경우 AIDS에 대하여 CTL 반응을 효과적으로 유도할 수 있는 점막면역용 백신으로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에서는, 최근 HIV-1 백신 개발에 있어서 표적이 되고 있는 HIV-1의 외막 당단백인 gp120 중의 V3 영역에 대해서도 본 발명의 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m이 백신 벡터로서 유용한지를 평가하기 위하여, HIV-1 gp120 중의 V3 루프를 포함하는 125개의 아미노산을 코딩하는 유전자(env125)를 본 발명의 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 도입하여 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 생산 및 env 단백의 발현을 확인하였으며, 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 유전적 안정성을 확인하였다.
<실시예 8> 재조합 폴리오바이러스플라스미드 pTZ-PVS-3m/env의 제작 및 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 생산 :
도 10에서 보는 바와 같이, HIV-1의 외막 당단백 gp120 중의 V3 루프를 포함한 125개 아미노산(251-375)에 대한 cDNA 단편(375bP)를 PCR로 증폭하여 실시예 1에서 얻은 플라스미드 pTZ-PVS-3m에 클로닝하였다.
PCR 단편의 5'-말단과 3'-말단에 제한효소(SstⅡ, EagⅠ) 인식부위를 가지도록 설계된 PCR 프라이머 :
를 사용하였으며, HIV-1 env 유전자의 주형으로는 HXB2 cDNA(미국 Dana Farber 암 연구소에서 분양받음}를 사용하였다.
PCR 증폭물을 제한효소 SstⅡ/EagⅠ으로 처리한 후, 실시예 1에서 얻은 플라스미드 pTZ-PVS-3m의 SstⅡ/EagⅠ 위치에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m/env를 제작하였다.
실시예 2에서와 동일한 방법으로, 제작한 플라스미드 pTZ-PVS-3m/env를 시험관내 전사하여 얻은 RNA 전사체를 단층으로 자란 HeLa세포(3×105)에 형질감염시킨 후, 메틸셀룰로스-DMEM 배지에서, 37℃, CO2배양기에서 2일간 배양하여 세포병변효과를 확인하였다. 이때 상등액을 취하여 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 공급원으로 사용하였다.
<실시예 9> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 증식력 비교를 위한 one-step 성장곡선 :
HIV-1 env 단백을 발현하는 키메릭 폴리오바이러스의 증식력을 확인하기 위하여 실시예 4에서와 동일한 방법으로 바이러스의 성장곡선을 조사하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2의 수치들은 동일 실험을 4회 반복하여 얻은 평균치이다.
표 2에서 보는 바와 같이, 재조합 바이러스 PVS-3m/env의 증식력은 야생형에 비해 최고 1 log 정도 떨어지는 것으로 확인되었다.
<실시예 10> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 백신 단백의 발현양상 분석 :
실시예 8의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env가 증식시 HIV-1 env 단백을 발현하는지를 확인하기 위해, 바이러스 PVS-3m/env를 HeLa세포에 10 moi로 감염시키고 8시간 후에 세포를 수획하여 세포 파쇄물을 SDS-PAGE에서 전기영동한 후, AIDS 환자 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 감염된 세포내에서 재조합 env 단백(125aa, 15kDa)이 잘 발현됨을 확인할 수 있었다(도 12 참조).
<실시예 11> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 유전적 안정성 확인 :
실시예 8의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 유전적 안정성을 조사하기 위해, 실시예 7에서와 동일한 방법으로 RT-PCR을 실시하여 클로닝된 env 유전자(375bp)의 보전상태를 조사하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11의 결과로부터 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 경우 12회 계대까지 클로닝된 유전자가 안정하게 보전됨을 확인할 수 있다.
또, 계대시 클로닝된 HIV-1 env 단백의 발현양상은, AIDS 환자 혈청을 사용하여 실시예 7에서와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12의 결과로부터 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env의 경우 클로닝된 env(125aa) 단백이 12회 계대까지 감염된 세포에서 일정하게 발현되고 있음을 확인할 수 있다.
이상의 실시예들로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 HIV-1의 외막 당단백 gp120 중의 V3 루프를 포함하는 env 유전자(125aa)를 도입하여 얻은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env도 증식시 도입된 env 유전자를 매우 효과적으로 발현하였으며, 12회 계대까지 도입된 env 유전자에 이상이 없었고 발현도 정상적으로 유지되어 키메릭 바이러스의 유전적 안정성이 우수한 것으로 확인되었다. 더욱이, 벡터로 사용된 사빈 1형 폴리오바이러스는 향신경성이 제거된 약독화주로서 아직까지 한번도 그 부작용이 보도된 바 없이 안전하게 사용되고 있는 소화마비 예방 백신 주(株)임을 감안하면, 본 발명에 의해 제공되는 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/env는 경구투여용 재조합바이러스 백신으로써 AIDS를 일으키는 HIV-1 감염에 대하여 점막면역을 효과적으로 유도할 수 있는 백신으로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이상에서 보는 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m은 다중 클로닝 부위와 3C-프로테아제 인식 부위를 가지고 있어 공지의 HIV-1 백신 유전자를 쉽게 재조합할 수 있으며, 유전적으로 안정되고 경구투여용 백신으로 점막면역을 효과적으로 유도하는 키메릭 폴리오바이러스를 생산할 수 있으므로 AIDS 백신 개발에 있어서 벡터로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에서는, 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m이 AIDS 외에 다른 바이러스성 질환에 대한 백신 개발에서의 벡터로서 사용될 수 있는지를 평가하기 위하여, C형 간염 바이러스(이하 HCV로 약함)의 코어(core) 유전자중 CTL 면역반응을 유도하는 것으로 잘 알려진 에피토프 부위를 포함하는 N-말단부터 100개 아미노산을 코딩하는 유전자를 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 도입하여 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 생산 및 백신 단백의 발현을 확인하였으며, 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 유전적 안정성을 확인하였다.
<실시예 12> 재조합 폴리오바이러스플라스미드 pTZ-PVS-3m/HCVc의 제작 및 키메릭폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 생산 :
도 13에서 보는 바와 같이, HCV의 코어 유전자(구체적으로는 아미노 말단부터 100개의 아미노산만을 갖고 있음)를 PCR로 증폭하여 실시예 1에서 얻은 플라스미드 pTZ-PVS-3m에 클로닝하였다.
PCR 프라이머 :
를 사용하여, pCDNA/Neo-HCVcore 플라스미드{포항공대 성영철 교수로부터 분양받음}를 주형으로 PCR을 수행하여 HCV 코어 단백 아미노 말단으로부터 100개 아미노산을 코딩하는 DNA 단편을 합성하였다.
PCR 증폭물을 제한효소 SstⅡ/EagⅠ으로 처리한 후, 실시예 1에서 얻은 플라스미드 pTZ-PVS-3m의 SstⅡ/EagⅠ 위치에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pTZ-PVS-3m/HCVc를 제작하였다(도 13 참조).
실시예 2에서와 동일한 방법으로, 제작한 플라스미드 pTZ-PVS-3m/HCVc를 시험관내 전사하여 얻은 RNA 전사체를 단층으로 자란 HeLa세포에 형질감염시킨 후, 메틸셀룰로스-DMEM 배지에서, 37℃, CO2 배양기에서 2일간 배양하여 세포병변 효과를 확인하였다. 이때 상등액을 취하여 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 공급원으로 사용하였다.
<실시예 13> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 증식력 비교를 위한 one-step 성장곡선 :
HCV 코어를 발현하는 키메릭 폴리오바이러스의 증식력을 확인하기 위하여, 60㎜ 플레이트(3.5×105세포)에 자란 HeLa세포에 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc를 10 moi로 감염시켜 실시예 4에서와 동일한 방법으로 바이러스의 성장곡선을 조사하였다. 그 결과를 표 3과 도 14에 나타내었다. 표 3의 수치들은 동일 실험을 4회 반복하여 얻은 평균치이다.
표 3 및 도 14에서 보는 바와 같이, 재조합 바이러스 PVS-3m/HCVc의 증식력은 야생형에 비해 감염 12시간에는 최고 10배까지 낮았으나, 각 단계별로 평균하여 보면 전체적으로 야생형에 비해 5배 정도 낮은 것으로 확인되었다. 또, 재조합 바이러스 PVS-3m에 비해서는 평균 3배 정도 증식력이 떨어지는 것으로 나타났다.
<실시예 14> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 RNA 합성능 확인 :
60㎜ 플레이트(3.5×105세포)에 자란 HeLa세포에 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc를 10 moi로 감염시켜 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 후, 액티노마이신 D(actinomycin D) 54㎍/㎖를 첨가한 다음 37℃에서 배양하였다. 1시간 배양후 [3H]-유리딘을 15μCi/㎖로 되게 배지에 첨가하여 37℃, CO2배양기에서 배양하였다. 감염 후 3시간 간격으로 배양 상등액을 수획하여 세포용해 완충액{80mM의 NaCl, 5mM의 MgCl2, 10mM의 트리스: pH8.2, 1mM의 DTT, 10mM의 바나딜 리보뉴클레아제 복합체(vanadyl ribonuclease complex), 0.5%의 NP-40} 0.5㎖에 부유시켜 얼음에 5분간 방치하여 세포를 파쇄하였다. 빙냉상태에서 파쇄액에 20%의 3염화초산액(trichloroacetic acid)을 가하여 30분간 침전시키고, 침전물의 방사능을 신틸레이션 계수기(scintillation counter){Hewlett Packard사 제품}로 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4에서 보는 바와 같이, 감염된 HeLa세포에서 키메릭 바이러스 PVS-3m/HCVc의 RNA 합성능은 야생형이나 재조합 바이러스 PVS-3m과 거의 동일하였으며, 감염 6시간째만 야생형에 비해 5% 정도 낮게 나타났다. 이는 실시예 13에서 키메릭 바이러스의 증식력이 야생형에 비해 5배 정도 낮은 이유가 세포내에서 일어나는 RNA 합성 정도의 차이 때문이 아니라 키메릭 바이러스의 단백질 합성과정이 대조군에 비해 지연되기 때문이었음을 시사해 준다.
결론적으로, 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 증식력은 사빈 1형 폴리오바이러스 야생형에 대해 5배 정도 떨어지나 RNA 합성능이 야생형이나 재조합 바이러스 PVS-3m에 비해 별차이가 없으므로, 증식력의 차이는 백신으로서의 효과에는 크게 영향을 미치지 않을 것으로 기대된다.
<실시예 15> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 백신 단백의 발현양상 분석 :
실시예 12의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc가 증식시 HCV 코어 단백을 발현하는지를 확인하기 위해, 바이러스 PVS-3m/HCVc를, 10%의 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 단층으로 배양된 HeLa세포에 1시간동안 형질감염시키고 감염되지 않은 바이러스를 제거한 다음, 감염된 세포를 37℃, CO2배양기에서 24시간 배양하였다. 상등액을 제거하고 세포를 수회하여 세포 파쇄물을 SDS-PAGE에서 전기영동한 후, HCV 코어 단백에 대한 토끼 항혈청{한림대 황순봉 박사로부터 공급받음}을 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15의 레인 3에서 보는 바와 같이 감염된 세포내에서 재조합 HCV 코어 단백(100aa, 12kDa)이 잘 발현됨을 확인할 수 있다.
그러나, 원하는 12kDa 위치 외에 여러 곳에서 항혈청과 반응하는 단백질 밴드가 나타나는데, 이는 HCV 코어의 N-말단 소수성 단백 부위가 세포구조물이나 세포막과 결합하여 SDS-PAGE 전기영동조건에서 분리되지 않았기 때문인 것으로 판단된다. 이를 확인하기 위하여, 재조합 바이러스 펠렛(pellet)(레인 4), 바이러스-프리 배양 상등액 농축물(레인 5), 감염된 세포를 1%의 NP-40을 첨가하여 파쇄한 후 이를 비용해성 침전물(레인 6)과 용해성 상등액(레인 7)으로 분리한 후, 동일한 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 15에서 보는 바와 같이, 오직 재조합 바이러스로 감염된 세포의 침전물에서와 상등액에서만 HCV 코어 단백에 대한 항혈청과 반응하는 항원 밴드가 관찰되었다. 특히 감염세포의 파쇄 침전물에서 원하는 12kDa의 HCV 코어 밴드가 분명하게 나타난 점을 보면, 감염된 세포에서 항혈청과 반응하는 여러 밴드들은 항혈청의 비특이 반응에 의한 것이라기 보다는 재조합 폴리오바이러스의 감염 증식시 발현된 HCV 코어 단백이 폴리오바이러스 구조 단백에서 잘려나와 세포 구조물(cell organell)이나 막단백과 결합된 형태로 항혈청과반응하여 나타난 밴드로 생각된다. 이는 HCV가 세포질이 아닌 소포체의 루멘에서 조합(assembly)이 일어나고, 주로 막-경계 베시클(membrane-bound vesicle)로 발견된다는 보고와도 일치하는 결과이다{Dubission et al., 1994}. 그러나, 이러한 HCV 코어-세포구조물 복합체들이 재조합 바이러스의 증식에만 영향을 미치지 않는다면 이러한 복합체가 오히려 재조합 폴리오바이러스의 HCV 코어 단백에 대한 세포성 및 체액성 면역유도능에 훨씬 효과적일 것으로 기대된다.
<실시예 16> 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 유전적 안정성 확인 :
실시예 12의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 유전적 안정성을 조사하기 위해, 실시예 7에서와 동일한 방법으로 RT-PCR을 실시하여 클로닝된 HCV 코어 유전자의 보전상태를 조사하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 12회 계대까지 클로닝된 HCV 코어 유전자를 포함하는 459bP의 PCR 밴드가 강하게 나타났으며, 뚜렷한 유전자 결손이나 변형이 관찰되지 않았다. 이는 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc가 계대시 클로닝된 부위의 유전적 안정성을 유지하고 있음을 시사해 준다.
또, 계대시 클로닝된 HCV 코어 단백의 발현양상은, HCV 코어 단백에 대한 단클론 항체{Bio-genesis, Sandown, NH, USA}를 사용하여 실시예 7에서와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17의 결과로부터 본 발명의 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc의 경우 클로닝된 12kDa(100aa)의 HCV 코어 단백이 12회 계대까지 감염된 세포에서 일정하게 발현되고 있음을 확인할 수 있다.
이상의 실시예들로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m의 다중 클로닝 부위에 HCV 코어 유전자(100aa)를 도입하여 얻은 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc도 증식시 도입된 HCV 코어 유전자를 매우 효과적으로 발현하였으며, 12회 계대까지 도입된 HCV 코어 유전자에 이상이 없었고 발현도 정상적으로 유지되어 키메릭 바이러스의 유전적 안정성이 우수한 것으로 확인되었다. 더욱이, 벡터로 사용된 사빈 1형 폴리오바이러스는 향신경성이 제거된 약독화주로서 아직까지 한번도 그 부작용이 보도된 바 없이 안전하게 사용되고 있는 소화마비예방 백신 주(株)임을 감안하면, 본 발명에 의해 제공되는 키메릭 폴리오바이러스 PVS-3m/HCVc는 경구투여용 재조합바이러스 백신으로서 C형 간염에 대하여 CTL 반응을 효과적으로 유도할 수 있는 점막면역용 백신으로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이상에서 보는 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터 pTZ-PVS-3m은 다중 클로닝 부위와 3C-프로테아제 인식 부위를 가지고 있어 다양한 백신 유전자를 쉽게 재조합할 수 있으며, 유전적으로 안정되고 경구투여용 백신으로 점막면역을 효과적으로 유도하는 키메릭 폴리오바이러스를 생산할 수 있으므로 각종 바이러스성 질환에 대한 백신 개발에 있어서 벡터로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (16)
- 폴리오바이러스 cDNA의 N-말단에 다중 클로닝 부위와 3C 프로테아제 절단부위를 포함하는 서열이 삽입되는 것으로 구성되는 폴리오 바이러스 벡터에 있어서, 상기 폴리오바이러스는 사빈 1(Sabin 1)형이며, 상기 다중 클로닝 부위와 3C 프로테아제 절단 부위를 포함하는 서열은 5' -CCG CGG GTT AAC CGG CCG GCT TTG TTC CAA-3'임을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스벡터.
- 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 pTZ-PVS-3m(KCTC-0365BP)임을 특징으로 하는 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스벡터.
- 제 2항의 재조합 사빈 1형 폴리오바이러스벡터의 다중 클로닝 부위내에 백신 유전자가 도입되어 이루어진 키메릭 폴리오바이러스벡터.
- 제 3항에 있어서, 상기 백신 유전자가 감염성 바이러스에서 유래된 것임을 특징으로 하는 키메릭 폴리오바이러스벡터.
- 제 3항에 있어서, 상기 감염성 바이러스가 HIV-1임을 특징으로 하는 키메릭 폴리오바이러스벡터.
- 제 4항에 있어서, 상기 감염성 바이러스가 C형 간염 바이러스임을 특징으로 하는 키메릭 폴리오바이러스벡터.
- 제 3항에 있어서, 상기 백신 유전자가 HIV-1 p24 유전자임을 특징으로 하는 키메릭 폴리오바이러스벡터.
- 제 3항에 있어서, 상기 백신 유전자가 HIV-1 gp120 중의 V3 루프를 포함하는 외막 당단백 유전자임을 특징으로 하는 키메릭 폴리오바이러스벡터.
- 제 3항에 있어서, 상기 백신 유전자가 HCV 코어(core) 유전자임을 특징으로 하는 키메릭 폴리오바이러스벡터.
- 제 3항의 키메릭 폴리오바이러스벡터의 RNA 전사체를 숙주세포에 형질감염시키고, 감염된 숙주세포에 의해 생산되는 키메릭 폴리오바이러스.
- 제 4항의 키메릭 폴리오바이러스플라스미드의 RNA 전사체를 숙주세포에 형질감염시키고, 감염된 숙주세포에 의해 생산되는 키메릭 폴리오바이러스.
- 제 5항의 키메릭 포리오바이러스벡터의 RNA 전사체를 숙주세포에 형질감염시키고, 감염된 숙주세포에 의해 생산되는 키메릭 폴리오바이러스.
- 제 6항의 키메릭 폴리오바이러스벡터의 RNA 전사체를 숙주세포에 형질감염시키고, 감염된 숙주세포에 의해 생산되는 키메릭 폴리오바이러스.
- 제 7항의 키메릭 폴리오바이러스벡터의 RNA 전사체를 숙주세포에 형질감염시키고, 감염된 숙주세포에 의해 생산되는 키메릭 폴리오바이러스.
- 제 8항의 키메릭 폴리오바이러스벡터의 RNA 전사체를 숙주세포에 형질감염시키고, 감염된 숙주세포에 의해 생산되는 키메릭 폴리오바이러스.
- 제 9항의 키메릭 폴리오바이러스벡터의 RNA 전사체를 숙주세포에 형질감염시키고, 감염된 숙주세포에 의해 생산되는 키메릭 폴리오바이러스.
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