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KR100302100B1 - 고무입자-결합 단백질(ｓｒｐｐ)을 발현하는 재조합 미생물 - Google Patents

고무입자-결합 단백질(ｓｒｐｐ)을 발현하는 재조합 미생물 Download PDF

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KR100302100B1
KR100302100B1 KR1019990015862A KR19990015862A KR100302100B1 KR 100302100 B1 KR100302100 B1 KR 100302100B1 KR 1019990015862 A KR1019990015862 A KR 1019990015862A KR 19990015862 A KR19990015862 A KR 19990015862A KR 100302100 B1 KR100302100 B1 KR 100302100B1
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South Korea
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srpp
rubber
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protein
rubber particle
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한경환
강훈승
오수경
초우켕씨
파리다유소프
엥훙잇
Original Assignee
박찬구
금호석유화학 주식회사
롱옹엥
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Abstract

본 발명은 고무나무(H. brasiliensis) 라텍스로부터 유래된, 작은 고무나무 입자에 결합하는 고무입자-결합 단백질(small rubber particle-associated protein, 'SRPP')을 코딩하는 유전자, 전기 유전자로부터 유추되는 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP), 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터와 이로 형질전환된 재조합 미생물, 및 재조합 SRPP를 이용한 고무의 생합성방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 미생물로부터 발현되는 재조합 SRPP는 고무입자의 존재시 고무합성을 촉진시키므로, 전기 재조합 SRPP를 생물학적 방법에 의한 고무생산에 활용할 수 있을 것이다.

Description

고무입자-결합 단백질(ＳＲＰＰ)을 발현하는 재조합 미생물{Recombinant Microorganisms Expressing Small Rubber Particle-Associated Protein}
본 발명은 고무입자-결합 단백질을 발현하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고무나무(H. brasiliensis)의 라텍스로부터 유래된, 작은 고무나무 입자에 결합하는 고무입자-결합 단백질(small rubber particle-associated protein, 'SRPP')을 코딩하는 유전자, 전기 유전자로부터 유추되는 재조합 SRPP, 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터와 이로 형질전환된 재조합 미생물, 및 재조합 SRPP를 이용한 고무의 생합성방법에 관한 것이다.
고무(rubber, cis-1,4-polyisoprene)는 일종의 이소프레노이드(isoprenoid) 중합체로서, 약 2,000 종의 식물에서 다양한 양과 질의 고무가 생산되지만, 그의 생리학적인 기능은 알려져 있지 않다(참조: Backhaus, R. A., Rubber formation in plants: a mini-review, Israel Journal of Botany, 34:283-293, 1985). 고무는 튼튼한 타이어 뿐만 아니라, 신축성, 유연성 및 탄력성이 요구되는 기타 산업용 자재의 재료로 사용되어 왔다. 고무나무(Hevea brasiliensis)는 다량으로 양질의 고무를 생산할 뿐만 아니라 생산된 고무를 회수하기도 용이하기 때문에, 유일한 상업적인 천연 고무 원료로서 선호되어 왔다. 그러나, 고무에 대한 수요의 증가와 더불어 고무나무의 식수면적의 감소 및 고무에 대한 치명적인 라텍스(latex) 알러지로 인하여, 고무 생합성에 관한 연구에 대한 관심과 고무 대체물의 개발에 대한 필요성이 증가되어 왔다.
고무나무에서 고무의 생합성은 고무나무의 점액질에 접해있는 분화된 도관인 유액균사(lactifer)의 세포질(cytoplasm)인 라텍스 중에 부유되어 있는 고무입자의 표면에서 일어난다. 고무나무의 수액을 받는 동안, 유액균사 내의 높은 압력은 라텍스를 밀어내는데, 전기 라텍스는 30 내지 50%(w/w)의 시스-1,4-폴리이소프렌 (cis-1,4-polyisoprene)을 포함하고 있다. 전기 라텍스를 원심분리하면, 고무입자를 포함하는 상층, 물질대사 활성분획인 중간층(일명 'C-세럼'이라고도 불리움), 및 '루토이드(lutoid)'라 불리우는 소포체를 포함하는 하층의 세 분획으로 분리된다.
고무나무의 라텍스로부터 200개 이상의 고무 생합성과 관련된 발현 서열 표지(expressed sequence tag)가 규명되었는 바, 쿠쉬(Kush) 등은 라텍스에서 몇몇 고무합성-관련 유전자들이 발현됨을 밝힐 수 있었다(참조: Kush, A. et al., Laticifer-specific gene expression of Hevea brasiliensis(rubber tree), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 87:1787-1790, 1990). 특히, 고무의 신장 인자(rubber elongation factor, REF)는 고무합성에 관여하는 효소로서 유액균사에서 높은 수준으로 발현된다(참조: Dennis, M. S. and Light, D. R., Rubber elongation factor from Hevea brasiliensis: Identification, characterization, and role in rubber biosynthesis, J. Biol. Chem., 264:18608-17, 1989; Goyvaerts, E. et al., Cloning and sequencing of the cDNA encoding the rubber elongation factor of Hevea brasiliensis, Plant Physiol., 97:317-321, 1991). 전사된 유전자를 매우 활발히 단백질로 해독하기 위한 기구(machinery)로서, 투피(Tupy) 등은 유액세포 내에 리보좀과 폴리좀이 존재함을 보고한 바 있다(참조: Tupy et al., Ribosomal and polyadenylated RNA content of rubber tree latex, association with sucrose level and latex pH, Plant Science, 55:137-144, 1988). 또한, 아로키아라(Arokiaraj) 등은 아그로박테리움-매개 형질전환법에 의하여 도입된 베타-글루크로니다제(β-glucuronidase) 리포터 유전자가 형질전이된 고무 식물체의 라텍스에서 발현됨을 관찰하였다(참조: Arokiaraj et al., CaMV 35S promoter directs β-glucuronidase expression in the laticiferous system of transgenic Hevea brasiliensis(rubber tree), Plant Cell Reports, 17:621-625, 1998).
한편, 고무나무의 라텍스에서 발현되는 유전자들은 그들이 코딩하는 단백질에 따라 세 부류로 구분될 수 있는데, 첫째 부류는 히베인(hevein), 키티네이즈(chitinase), β-1,3-글루카네이즈(glucanase) 및 히버(HEVER)와 같은 방어-관련 단백질들(defense-related proteins)을 코딩하는 유전자이고(참조: Broekaert et al., Wound-induced accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree(Hevea brasiliensis), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 87:7633-7637, 1990; Martin, M. N., The latex of Hevea brasiliensis contains high levels of chitinases and chitinases/lysozymes, Plant Physiology, 95:469-476, 1991; Chye, M. L. and Cheung, K. Y., Beta-1,3-Glucanase is highly-expressed in laticifers of Hevea brasiliensis, Plant Mol. Biol., 29:397-402, 1995; Sivasubramaniam, S. et al., Characterisation of HEVER, a novel stress-induced gene from Hevea brasiliensis, Plant Mol. Biol., 29:173-8, 1995); 둘째 부류는 REF, HMGCoA 환원효소 및 파네실 다이포스페이트(farnesyl diphosphate) 합성효소와 같은 고무합성-관련 단백질들을 코딩하는 유전자이며(참조: Goyvaerts, E. et al., Cloning and sequencing of the cDNA encoding the rubber elongation factor of Hevea brasiliensis, Plant Physiol., 97:317-321, 1991; Chye, M. L. et al., Three genes encode 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hevea brasiliensis: hmg1 and hmg3 are differentially expressed, Plant Mol. Biol., 19:473-484, 1992; Adiwilaga, K. and Kush, A., Cloning and characterization of cDNA encoding farnesyl diphosphate synthase from rubber tree(Hevea brasiliensis), Plant Mol. Biol.,30:935-946, 1996); 셋째 부류는 Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5 및 Hev b 7과 같은 라텍스 알러젠을 코딩하는 유전자이다(참조: Yeang, H. Y. et al., The 14.6 kd rubber elongation factor(Hev b 1) and 24 kd(Hev b 3) rubber particle proteins are recognized by IgE from patients with spina bifida and latex allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 98:628-639, 1996; Akasawa, A. et al., A novel acidic allergen, Hev b 5, in latex. Purification, cloning and characterization, J. Biol. Chem., 271:25389-93, 1996; Slater, J. E. et al., Identification, cloning, and sequence of a major allergen(Hev b 5) from natural rubber latex(Hevea brasiliensis), J. Biol. Chem., 271:25394-9, 1996; Sowka, S. et al., cDNA cloning of the 43-kDa latex allergen Hev b 7 with sequence similarity to patatins and its expression in the yeast Pichia pastoris, Eur. J. Biochem., 255:213-9, 1998).
고무입자는 실험실적 조건에서 고무를 합성하는 데 있어 필수적인 요소로서(참조: Lynen, F., Biochemical problems of rubber biosynthesis, J. Rub. Res. Inst. Malaya, 21:389-406, 1969), 지금까지 이루어진 표지된 이소펜티닐 피로포스페이트(isopentenyl pyrophosphate, IPP)를 사용한 실험실적 고무합성 시험 결과들은 모두 고무입자가 고무합성에 반드시 필요함을 보여주었다. 데니스(Dennis)와 라이트(Light)는 일종의 고무입자-결합 단백질(rubber particle-associated protein, RPP)인 REF가 실험실적 조건에서의 고무 신장에 필요함을 밝힌 바 있다(참조: Dennis, M. S. and Light, D. R., Rubber elongation factor from Heveabrasiliensis: Identification, characterization, and role in rubber biosynthesis, J. Biol. Chem., 264:18608-17, 1989). 엥(Yeang) 등은 지름이 10㎛ 이하인 작은 고무입자에 강하게 결합되어 있는 24kDa RPP(small rubber particle-associated protein, SRPP) 즉, Hev b 3가 라텍스 알러젠임을 규명하였다(참조: Yeang, H. Y. et al., The 14.6 kd rubber elongation factor(Hev b 1) and 24 kd(Hev b 3) rubber particle proteins are recognized by IgE from patients with spina bifida and latex allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 98:628-639, 1996; Yeang, H. Y. et al., Amino acid sequence similarity of Hev b 3 to two previously reported 27- and 23-kDa latex proteins allergenic to spina bifida patients, Allergy, 53:513-519, 1998). 또한, 팬(Pan) 등은 고무 생산 식물의 일종인 과율고무나무(guayule)에서 가장 풍부하게 존재하는 53kDa RPP가 알렌(allene) 옥사이드 합성효소로 알려진 사이토크롬 P450임을 규명하였는 바(참조: Pan, Z. et al., The major protein of guayule rubber particles is a cytochrome P450, J. Biol. Chem., 270:8487-8494, 1995), 전기 53kDa RPP가 고무 생합성에 필수적인 것으로 알려져 있다(참조: 미국특허 제 5,633,433호).
상술한 사실들로 미루어 볼 때, 고무입자의 표면에 고무 중합효소가 위치하고 있을 가능성이 높은데, 전기 고무 중합효소는 사이토솔(cytosol)로부터 친수성 기질을 획득하면서 고무입자의 내부로 소수성 중합체를 중합하여 나간다. REF와 SRPP는 주요 RPP로서 고무 생합성 기구(machinery)의 필수적인 구성요소일 수 있다.
SRPP는 이분척추(spina bifida) 환자에서 알러지 반응을 유발하며, 일부 아미노산 서열만이 밝혀져 있을 뿐(참조: Yeang, H. Y. et al., The 14.6 kd rubber elongation factor(Hev b 1) and 24 kd(Hev b 3) rubber particle proteins are recognized by IgE from patients with spina bifida and latex allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 98:628-639, 1996; Yeang, H. Y. et al., Amino acid sequence similarity of Hev b 3 to two previously reported 27- and 23-kDa latex proteins allergenic to spina bifida patients, Allergy, 53:513-519, 1998), 유전자는 아직까지 클로닝되지 않았다. 따라서, SRPP의 기능 및 특성에 대한 연구 및 산업적인 응용 가능성을 위하여, 유전자를 클로닝하고 분석하여야 할 필요성이 절실하였다.
이에, 본 발명자들은 SRPP 유전자를 클로닝하고 SRPP의 고무합성과 관련된 기능을 밝히고자 예의 연구노력한 결과, 고무나무(H. brasiliensis)의 라텍스로부터 전체 길이의 SRPP cDNA를 클로닝하여, 그의 특성과 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하는 한편, 전기 cDNA를 포함하는 발현벡터 및 이로 형질전환된 재조합 미생물을 제조한 데 이어, 전기 재조합 미생물로부터 발현시켜 수득된 재조합 SRPP가 고무합성을 촉진시킴을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 SRPP cDNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 cDNA로부터 유추되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 cDNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 재조합 SRPP를 이용하여 고무를 생합성하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 SRPP cDNA의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 나타내는 그림이다.
도 2는 SRPP의 하이드로퍼시(hydropathy) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 SRPP와 다른 고무합성 관련 단백질들의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 그림이다.
도 4a는 재조합 발현벡터 pGEX-SRPP의 유전자 지도이다.
도 4b는 재조합 발현벡터 pRSET-SRPP의 유전자 지도이다.
도 5a는 GST-SRPP 융합단백질을 발현하는 재조합 대장균(E.coli) XL-1 Blue/pGEX-SRPP(KCTC 0595BP)의 세포추출액을 전기영동한 SDS-PAGE 결과이다.
도 5b는 재조합 SRPP를 발현하는 재조합 대장균(E.coli) XL-1 Blue/pRSET-SRPP(KCTC 0596BP)의 세포추출액을 전기영동한 SDS-PAGE 결과이다.
도 6a는 재조합 SRPP 농도에 따라 고무입자 내로 혼입되는 [14C] IPP가 증가됨을 보여주는 그래프이다.
도 6b는 항-SRPP 항체 농도에 따라 고무입자 내로 혼입되는 [14C] IPP가 감소함을 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 고무나무(H. brasiliensis)의 라텍스 cDNA 라이브러리로부터, 지름이 10㎛ 이하인 작은 고무입자에 강하게 결합되어 있으며, Hev b 3 단백질로도 알려져 있는 24kDa 단백질 즉, SRPP(small rubber particle-associated protein)를 코딩하는 cDNA 전장을 분리하고 특성을 규명하는 한편, 전기 cDNA로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하였다. SRPP cDNA는 총 910bp로, 83bp 5'-UTR(untranslated region), 615bp 유전자 개방 해독틀(open reading frame, 'ORF'), 및 18bp 폴리(A) 테일을 포함하는 212bp 3'-UTR로 구성되어 있으며, 794bp 위치에서 시작하는 추정적인 폴리아데닐화 신호(AATAA)를 가지고 있다. 한편, 전기 cDNA로부터 유추되는 SRPP 단백질은 총 204 개의 아미노산으로 구성되며 계산상 분자량은 약 22.4kDa이다. SRPP 단백질은 산성(pI=4.8)을 띠는 소수성 단백질로서, 세포질 내에 위치한다. SRPP는 REF(GenBank Accession No. P15252)와 72%, 불가리스(P. vulgaris)의 스트레스-연관 단백질(stress-related protein)(PvSRP, GenBank Accession No. 1326163)과 68%, 그리고 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) F1N21.4(GenBank Accession No. 2670320)와 48%의 서열상동성을 보인다. SRPP, REF 및 PvSRP의 아미노산 서열은 38 내지 65번째 아미노산에 해당하는 부위에 보존영역(conserved region)을 가지고 있으나, 전기 보존영역은 지금까지 알려진 어떠한 기능적 영역과도 일치하지 않는다.
본 발명에 의하여 제공되는 재조합 발현벡터 pGEX-SRPP와 pRSET-SRPP는 전기 910bp SRPP cDNA를 각각 pGEX 벡터의 EcoRI-XhoI 부위와 pRSET 벡터의 BamHI-PvuII 위치에 각각 삽입하여 제조된다. 전기 pGEX-SRPP에서는 글루타치온 S-트랜스퍼라아제('GST')와 SRPP의 융합단백질이 IPTG에 의하여 유도되는tac프로모터의 조절 하에 발현되며, 전기 pRSET-SRPP에서는 SRPP만이 단독으로 T7 프로모터의 조절 하에 발현된다. 본 발명자들은 전기 pGEX-SRPP와 pRSET-SRPP로 대장균(E. coli) XL-1 Blue를 형질전환시킨 다음, 이들을 각각 대장균(E. coli) 'XL1-Blue/pGEX-SRPP'와 'XL1-Blue/pRSET-SRPP'라 명명하고, 1999년 3월 30일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB)에 기탁번호 'KCTC 0595BP'와 'KCTC 0596BP'로 기탁하였다.
재조합 SRPP는 일반적인 재조합 단백질의 제조방법에 따라 전기 재조합대장균 XL1-Blue/pGEX-SRPP 또는 XL1-Blue/pRSET-SRPP를 앰피실린을 포함하는 LB 배지에서 IPTG로 단백질 발현을 유도하면서 배양한 다음, 세포균질액을 제조하고, 이를 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 이와 같이 수득한 재조합 SRPP를 고무입자를 포함하는 고무합성 반응완충액에 가하고 반응시킴으로써, 실험실적 조건에서 고무를 용이하게 생산할 수 있다.
구체적으로, 반응완충액에 고무나무 라텍스 또는 세척된 고무입자(washed rubber particle, WRP)와 재조합 SRPP를 첨가하고, 20 내지 37℃에서 2 내지 12시간동안 반응시킴으로써 고무를 생합성시킬 수 있으며, 이때, 반응완충액은 단백질의 분해를 억제시키는 당업계 통상의 단백질 반응용 완충액을 사용할 수 있으며, 재조합 SRPP의 첨가에 따라 고무의 생합성 양이 증가되므로, 재조합 SRPP의 첨가량 또는 반응완충액 내에의 바람직한 혼합비는 중요하지 않으나, 전체적인 효율을 고려할 때, 되도록 고농도의 재조합 SRPP를 첨가시키는 것이 경제적이다. 또한, 재조합 SRPP는 서열번호 2에 제시한 cDNA를 포함하는 발현벡터에 의하여 발현시킬 수 있으며, 발현벡터는 식물체 발현용 발현벡터, 세균 발현용 발현벡터, 효모 발현용 발현벡터 또는 진균 발현용 발현벡터로 작제할 수 있다. 이에 따라, 전기 cDNA를 포함하는 발현벡터는 숙주로서 식물체, 세균, 효모 또는 진균에 도입되어 발현되어질 수 있으며, 다른 단백질과 융합된 융합단백질 또는 재조합 SRPP만의 비융합단백질의 형태로 발현될 수 있다. 고무합성 반응시에도 마찬가지로, 융합단백질 또는 비융합단백질 형태의 재조합 SRPP를 사용할 수 있으며, 상술한 바와 같이 순수하게 분리 정제된 재조합 SRPP를 반드시 사용해야 할 필요없이 숙주의 세포균질물로부터원심분리에 의하여 수득한 상등액을 바로 반응에 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 고무나무 라텍스 cDNA 라이브러리의 제조
실시예 1-1: RNA의 분리 및 라텍스 cDNA 라이브러리의 제조
말레이시아 국립고무연구소(Selangor, Malaysia)로부터 입수한 성숙 고무 식물체(H. brasiliensis, RRIM600)로부터 라텍스와 잎을 수득하였다. 라텍스는 고무나무로부터 수득시 상온 또는 0℃에서 동량의 2X RNA 추출 완충용액(0.1M Tris·HCl/0.3M LiCl/0.01M EDTA/10% SDS, pH 9.5)과 지속적으로 혼합하였다. 이와 같이 수득한 라텍스 시료는 액체질소에 보관하였다.
전기 라텍스 시료로부터 Qiagen RNeasy Plant Minikit(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)를 사용하여 쿠쉬(Kush) 등의 방법에 따라 RNA를 추출한 다음(참조: Kush, A. et al., Laticifer-specific gene expression of Hevea brasiliensis(rubber tree), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 87:1787-1790,1990), Oligotex-dTTMmRNA kit(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)를 사용하여 폴리(A)+ RNA를 분리하였다. 이어서, Uni-ZAP II 파아지 벡터(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 포함하는 cDNA 라이브러리 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 전기 폴리(A)+ RNA로부터 라텍스 cDNA 라이브러리를 구축하였다. 결과적으로 약 5 x 107개의 재조합 파아지들을 포함하는 라텍스 cDNA 라이브러리가 구축되었다.
실시예 1-2: cDNA 라이브러리 스크리닝
라텍스 cDNA로부터 잎 cDNA를 제외한 서브트랙티드(subtracted) cDNA 라이브러리를 사용한 예비 실험에서, 유추된 아미노산 서열이 이미 부분적으로 알려진 바 있는 SRPP 즉, Hev b 3의 아미노산 서열과 일치하는 발현된 서열표지(expressed sequence tag, 'EST')를 발견하였다. 전기 EST 클론의 서열을 참조하여 SRPP 유전자의 +185로부터 +211까지의 염기서열에 해당하는 5'-caaggacatatctggtccattaaaacc-3'의 SRPP 프라이머(참조: 서열번호 1)를 제작하였다. 이어서, 전기 SRPP 프라이머와 T7 프라이머를 각각 상류(upstream) 프라이머와 하류(downstream) 프라이머로 사용하여, 전기 실시예 1-1로부터 수득한 라텍스 cDNA 라이브러리로부터 SRPP cDNA를 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하였다. 이때, PCR은 5분간의 예열 단계를 거친 후, 94℃ 30초, 50℃ 30초 및 72℃ 2분을 한 주기로 하여 총 30회 반복수행되었으며, 72℃에서 10분간 최종 신장(extension)반응을 거쳤다. PCR 반응으로부터 수득한 500bp 크기의 SRPP 유전자 절편을 프로브로 사용하여, 1/100로 희석된 전기 라텍스 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 그 결과로, 스크리닝에서 총 10개의 클론이 양성반응을 보였으며, EcoRI 제한효소 처리에 이은 아가로오스 젤 전기영동 결과, 이들 각각은 약 0.8 내지 1.0kb 크기의 삽입 DNA를 가지고 있는 것이 확인되었다. 그 중 약 1.0kb DNA 절편을 포함하고 있는 클론을 선택하여 이로부터 삽입 DNA를 용이하게 서브클로닝하고자, 전기 실시예 1-1에서 사용한 cDNA 라이브러리 키트의 제조자(Stratagene, La Jolla, CA, USA)가 공급하는 방법에 따라 생체내 조건에서의 절단(in vivoexcision)을 수행하여, Uni-ZAP II 파아지 벡터로부터 약 1.0kb 크기의 삽입 DNA를 포함하는 파아지미드(phagemid)가 절단(excision)되어 나오도록 하였다. 이와 같이 수득한 파아지미드를 'pSRPP'라 명명하였다.
실시예 1-3: cDNA 클론의 서열분석
전기 pSRPP에 들어있는 cDNA 절편의 염기서열을 분석하고자, pSRPP로부터 유래되었으며 대장균(E.coli) 숙주 XL-1 Blue/pSRPP에 들어있는 플라스미드를 샘브룩 (Sambrook) 등의 알칼리 용혈 방법에 따라 위자드 플라스미드 분리키트(Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Kit, Promega, USA)를 이용하여 수득하였다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular cloning, A laboratory manual, 2nd edition: Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이어서, 형광물질로 표지된 M13프라이머와 역(reverse) 프라이머를 포함하는 ALFexpress AutoRead Sequencing Kit(Pharmacia Biotech, Sweden)를 사용하여, 서열분석 반응을 수행한 다음, ALF 자동염기서열분석기(Perkin Elmer, USA)로 염기서열을 결정하였다. 그 결과, pSRPP에 삽입되어 있는 DNA 절편의 정확한 크기는 910bp(참조: 서열번호 2)로, 83bp 5'-UTR(untranslated region), 615bp 유전자 개방 해독틀(open reading frame, 'ORF'), 및 18bp 폴리(A) 테일을 포함하는 212bp 3'-UTR로 구성되어 있으며, 794bp 위치에서 시작하는 추정적인 폴리아데닐화 신호(AATAA)를 가지고 있음이 밝혀졌다(참조: 도 1).
전기 서열번호 2의 염기서열로부터 유추되는 단백질(참조: 서열번호 3)은 총 204 개의 아미노산으로 구성되며 계산상 약 22.4kDa의 분자량을 가질 것으로 예상된다(참조: 도 1). 또한, 전기 단백질은 REF(pI=5.04)와 유사하게 산성(pI=4.8)을 띠며, 유추된 아미노산 서열의 하이드로퍼시 분석 결과는 SRPP가 소수성 단백질임을 제시하였다(참조: 도 2). TMpred 알고리즘을 사용한 막통과부위 분석을 통하여 SRPP가 지질이중막을 가로지를 만큼 큰 막 통과 나선부위를 가지고 있지 않음을 알 수 있었으며, PSORT 프로그램(K. Nakai, Osaka University, Japan)을 사용한 컴퓨터 분석 결과는 SRPP가 세포질 내에 위치함을 제시하였다(certainty=0.65).
한편, Clustal W 프로그램을 사용하여 SRPP와 다른 단백질들 간의 아미노산 서열 상동성을 분석한 결과, SRPP는 REF(GenBank Accession No. P15252)와 72%, 불가리스(P. vulgaris)의 스트레스-연관 단백질(stress-related protein)(PvSRP, GenBank Accession No. 1326163)과 68%, 그리고 아라비돕시스탈리아나(Arabidopsis thaliana) F1N21.4(GenBank Accession No. 2670320)와 48%의 서열상동성을 보였다. 전기 PvSRP는 방어 기작에 관여하며 스트레스 또는 상처에 의하여 유도되는 것으로 짐작되고 있으며, F1N21.4의 기능에 대해서는 알려진 바가 없다. SRPP, REF 및 PvSRP의 아미노산 서열은 38 내지 65번째 아미노산에 해당하는 부위에 보존영역(conserved region)을 가지고 있으나, 지금까지 알려진 어떠한 기능적 영역과도 일치하지 않았다(참조: 도 3).
실시예 2: 재조합 SRPP의 발현
SRPP 발현벡터를 제조하고자, 전기 실시예 1-3의 pSRPP 플라스미드를 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 처리하여 SRPP cDNA를 잘라내었다. 전기 cDNA 절편을 pGEX 벡터(Pharmacia, Sweden)의 EcoRI-XhoI 부위 또는 pRSET 벡터(Invitrogen, USA)의 BamHI-PvuII 위치에 각각 삽입하여, 재조합 발현벡터 pGEX-SRPP와 pRSET-SRPP를 제조하였다(참조: 도 4a 및 도 4b). 전기 pGEX-SRPP에서는 글루타치온 S-트랜스퍼라아제('GST')와 SRPP의 융합단백질이 IPTG에 의하여 유도되는tac프로모터의 조절 하에 발현되는 반면, 전기 pRSET-SRPP에서는 SRPP만이 단독으로 T7 프로모터의 조절 하에 발현된다. 한편, 전기 pGEX-SRPP와 pRSET-SRPP로 대장균(E. coli) XL-1 Blue를 형질전환시킨 다음, 이들을 각각 대장균(E. coli) 'XL1-Blue/pGEX-SRPP'와 'XL1-Blue/pRSET-SRPP'라 명명하고, 1999년 3월 30일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB)에 기탁번호 'KCTC 0595BP'와 'KCTC 0596BP'로 기탁하였다.
전기 재조합 대장균 XL1-Blue/pGEX-SRPP(KCTC 0595BP)와 XL1-Blue/pRSET-SRPP(KCTC 0596BP) 각각을 50mg/L 앰피실린을 포함하는 LB 배지에서 30℃의 온도 조건으로 정상시기(mid-stationary phase)에 이를 때까지 배양하였다. 그런 다음, IPTG를 0.1mM의 농도로 첨가하고, 4시간 더 배양하였다. 이후의 모든 과정은 4℃에서 수행되었다. 전기 배양액으로부터 세포를 회수하여 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)에 현탁한 다음, 5,000 X g에서 10분간 원심분리하여 세포를 다시 회수하였다. 회수된 세포를 전기와 동일한 완충액 중에서 초음파분쇄기로 파쇄하였다. 이로부터 수득한 세포균질액을 10,000 X g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 램리(Laemmli)의 표준방법에 따라 SDS-PAGE를 실시한 다음(참조: Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 277:680-685, 1970), 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250으로 염색하였다. 이하에서는 전기와 같이 세포균질액으로부터 분리된 상등액을 단순히 '세포추출액'이라 칭하기로 한다.
그 결과, 대장균 XL-1 Blue/pGEX-SRPP(KCTC 0595BP)로부터는 약 48kDa의 GST-SRPP 융합단백질이(참조: 도 5a), 그리고 대장균 XL-1 Blue/pRSET-SRPP(KCTC 0596BP)로부터는 약 24kDa의 재조합 SRPP가 발현됨을 확인하였다(참조: 도 5b). 도 5a 및 도 5b에서, M열은 단백질 분자량 마커를; C열은 단백질 발현이 유도되지 않은 대장균의 세포추출액을; 그리고, I열은 IPTG로 단백질 발현을 유도한 대장균의 세포추출액을 각각 전기영동한 결과를 나타낸다.
실시예 3: 실험실적 조건에서의 고무 생합성 시험
SRPP가 고무 생합성에 관여하는지 여부를 조사하기 위하여, 고무나무 C-세럼(HeveaC-serum) 및 세척된 고무입자(washed rubber particle, 'WRP')를 사용하는 실험실적 조건에서의 고무 생합성 시험을 수행하였다: 먼저, 종래의 방법에 따라 원심분리와 부유(floatation)을 반복하여 WRP를 제조하였다(참조: Cornish, K. and Backhaus, R. A., Rubber transferase activity in rubber particles of guayule, Phytochemistry, 29:3809-3813, 1990; Siler, D. J. and Cornish, K., A protein from Ficus elastica rubber particles is related to proteins from Hevea brasiliensis and Parthenium argentatum, Phytochemistry, 32:1097-1102, 1993). 즉, 고무나무(H. brasiliensis)로부터 추출된 라텍스를 같은 부피의 세척 완충액(100mM Tris-HCl, 5mM MgSO4, 10mM DTT, 0.1mM PMSF)과 혼합한 다음, 40,000 X g에서 2시간 동안 원심분리하였다. 맑은 유액 즉, C-세럼을 취하고 난 다음, 상층에 있는 고무입자를 회수하고, 전기 세척 완충액으로 수회 반복세척하여 WRP를 수득하였다. 이어서, 종래의 공지된 방법에 따라 실험실적 조건에서의 고무입자 생합성 시험을 수행하였다(참조: Cornish and Backhaus, 1990; Siler and Cornish, 1993). 즉, 전기 WRP 10mg과 전기 실시예 2에서 수득한 GST-SRPP 융합단백질을 발현하는 재조합 대장균 XL-1 Blue/pGEX-SRPP(KCTC 0595BP)의 세포로부터 수득된 세포추출액을 반응완충액(100mM Tris-HCl, pH 7.5, 80㎛ [14C]IPP(55mCi mmmol-1), 20㎛ FPP, 1mM MgSO4, 1mM DTT)에 가하여, 총 반응액의 부피를 50㎕로 맞춘 다음, 25℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이때, 대조군으로는 IPTG에 의한 단백질 발현유도를 거치지 않은 대장균 및 GST를 발현하는 pGEX 벡터로 형질전환된 대장균의 세포균질액으로부터 분리된 상등액을 사용하였다. 전기 반응혼합물에 25mM EDTA를 가하여 반응을 종지시키고, 여과법 또는 벤진 추출법으로 고무 내로 혼입된 [14C]IPP의 양을 측정하였다. 여과법을 위해서는 반응이 완료된 반응혼합물을 0.02 또는 0.1㎛ 아노디스크 막(anodisc membrane, Whatman, USA)으로 여과한 다음, 전기 막을 1M HCl과 95% 에탄올로 반복 세척하였다(참조: Cornish, K. and Backhaus, R. A., Rubber transferase activity in rubber particles of guayule, Phytochemistry, 29:3809-3813, 1990). 그런 다음, 세척된 막에 남아있는 방사능을 LSC(liquid scintillation counter, Beckman)로 측정하였다. 한편, 벤젠 추출법을 위해서는 반응이 완료된 반응혼합물을 두 배 부피의 벤젠으로 3회 연속 추출한 다음, 이로부터 수득한 벤젠 추출액을 Ready Solv HP scintillation cocktail(Beckman)과 혼합하고, LSC로 방사능을 측정하였다. 그 결과, 고무 내로 혼입된 [14C]IPP의 양이 SRPP의 농도에 따라 증가함이 확인되었다(참조: 도 6a). 도 6a에서, (■)는 GST-SRPP를 발현하는 재조합 대장균의 세포추출액을 사용한 경우를 나타내고; (◆)는 IPTG 유도를 거치지 않은 재조합 대장균의 세포추출액을 사용한 경우를 나타내며; (▲)는 GST만을 발현하는 재조합 대장균의 세포추출액을 사용한 경우를 나타낸다.
실시예 4: 항-SRPP 항체에 의한 고무합성 저해
SRPP가 고무의 생합성에 관여하는지 여부를 재확인하고자, 본 발명의 재조합 SRPP로 면역된 토끼의 혈청으로부터 다클론 항체를 제조하고, 역시 재조합 SRPP로 면역된 마우스로부터 단일클론 항체를 제조하였다. 그런 다음, 전기 항체들이 C-세럼을 사용한 고무 생합성을 저해하는 정도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 면역되지 않은 혈청을 사용하였다. 고무 생합성 반응 조건은 재조합 대장균의 세포추출액 대신 C-세럼을 5㎕ 첨가하고, 항체 또는 혈청을 도 6b에 표시한 양만큼 추가로 첨가한 점을 제외하고는 전기 실시예 3과 동일하였다(참조: 도 6b). 그 결과, 도 6b에서 보듯이, SRPP 단백질에 의하여 생성된 다클론 및 단일클론 항체는 대조군 혈청에 비하여 고무합성을 상당한 수준으로 저해하였으며, 특히 다클론 항체를 사용한 경우에 저해정도가 더 컸다. 도 6b에서, (◆)와 (●)는 각각 면역되지 않은 토끼와 마우스의 혈청을 사용한 경우를 나타내고; (▲)와 (■)는 각각 단일클론 항체와 다클론 항체를 사용한 경우를 나타낸다. 다클론 항체의 저해정도가 더 큰 것은 SRPP가 REF와 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, 다클론 항체가 SRPP 뿐만 아니라 REF와 교차반응을 일으킨데 기인하는 것으로 사료된다. 전기 실시예 3과 실시예 4의 결과는 SRPP가 고무 생합성에 직접적으로 관여함을 강력하게 제시하고 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 고무나무 라텍스로부터 유래된, 작은 고무나무 입자에 결합하는 고무입자-결합 단백질(small rubber particle-associated protein, 'SRPP')을 코딩하는 유전자, 전기 유전자로부터 유추되는 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP), 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터와 이로 형질전환된 재조합 미생물, 및 재조합 SRPP를 이용한 고무의 생합성방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 미생물로부터 발현되는 재조합 SRPP는 고무입자의 존재시 고무의 생합성을 촉진시키므로, 전기 재조합 SRPP를 생물학적 방법에 의한 고무생산에 활용할 수 있을 것이다.

Claims (10)

  1. 고무나무(H. brasiliensis)의 라텍스에 존재하는 지름 10㎛ 이하의 작은 고무입자에 결합하는 고무입자-결합 단백질(small rubber particle-associated protein, 'SRPP')을 코딩하는 서열번호 2에 개시한 cDNA.
  2. 제 1항의 cDNA로부터 유추되는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP).
  3. 서열번호 2의 cDNA를 포함하며 도 4a의 유전자 지도를 가지는 것을 특징으로 하는, 글루타치온 S-트랜스퍼라아제와 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)의 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 pGEX-SRPP.
  4. 서열번호 2의 cDNA를 포함하며 도 4b의 유전자 지도를 가지는 것을 특징으로 하는, 재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)을 발현하는 재조합 발현벡터 pRSET-SRPP.
  5. 제 3항의 재조합 발현벡터 pGEX-SRPP로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli) XL-1 Blue/pGEX-SRPP(KCTC 0595BP).
  6. 제 4항의 재조합 발현벡터 pRSET-SRPP로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli) XL-1 Blue/pRSET-SRPP(KCTC 0596BP).
  7. 고무나무 라텍스 또는 세척된 고무입자(washed rubber particle, WRP)와 재조합 고무입자-결합 단백질(small rubber particle-associated protein, 'SRPP')을 단백질 반응용 완충액에 첨가하고, 20 내지 37℃에서 2 내지 12시간동안 반응시켜 고무를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 고무입자-결합 단백질을 이용한 고무의 생합성방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)은 제 1항의 cDNA 서열을 포함하는 발현벡터에 의하여 형질전환된 숙주로부터 발현되는 것을 특징으로 하는
    재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)을 이용한 고무의 생합성방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)은 융합단백질 또는 비융합단백질인 것을 특징으로 하는
    재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)을 이용한 고무의 생합성방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    숙주는 식물체, 세균, 효모 또는 진균인 것을 특징으로 하는
    재조합 고무입자-결합 단백질(SRPP)을 이용한 고무의 생합성방법.
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