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KR100295558B1 - Among the primary immune cells, the monoclonal antibody 3-6-A (dendritic cell), which specifically acts on the surface of dendritic cells - Google Patents

Among the primary immune cells, the monoclonal antibody 3-6-A (dendritic cell), which specifically acts on the surface of dendritic cells Download PDF

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KR100295558B1
KR100295558B1 KR1019980024502A KR19980024502A KR100295558B1 KR 100295558 B1 KR100295558 B1 KR 100295558B1 KR 1019980024502 A KR1019980024502 A KR 1019980024502A KR 19980024502 A KR19980024502 A KR 19980024502A KR 100295558 B1 KR100295558 B1 KR 100295558B1
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Abstract

본 발명은 DMα 단백질의 막 바깥쪽 영역(extracellular region)과 반응하는 단클론 항체 3-6-A에 관한 것이다.The present invention relates to the monoclonal antibody 3-6-A which reacts with the extracellular region of the DMa protein.

Description

1차 면역세포들 중 덴드리틱 세포(dendritic cell) 표면에 특이하게 작용하는 단클론 항체 3-6-AAmong the primary immune cells, the monoclonal antibody 3-6-A, which specifically acts on the surface of dendritic cells

본 발명은 DMα 단백질의 막 바깥쪽 영역(extracellular region)과 반응하는 단클론 항체 3-6-A에 관한 것이다.The present invention relates to the monoclonal antibody 3-6-A which reacts with the extracellular region of the DMa protein.

덴드리틱 세포(dendritic cell : DC)는 혈액내의 백혈구(peripheral blood leukocytes : PBL) 중의 1% 이하로 존재하지만, 음세포작용(pinocytosis)이나 병원균의 감염 등으로 외부항원에 노출되면 항원을 흡수하여 단백질을 분해한 후 펩티드를 MHC class Ⅱ 분자에 실어 세포표면에 표출하는데, 이러한 항원표출기능(antigen presentation)이 단핵세포(monocyte)나 대식세포(macrophage) 보다 훨씬 강력하다{Pierreet al.,Nature388:787 (1997)}. DC가 외부 항원에 감작 (sensitization)되면 DC 특유의 C-C 케모카인(chemokine)을 분비하며, 림프절(lymph node)로 돌아가 비활성상태(naive)의 T 세포를 활성화시켜 {Ademaet al.,Nature387:713 (1997); Ingulli Eet al.,J. Exp. Med.185:2133 (1997)}, 항원에 대한 강력한 세포성 면역을 유도한다 {Steinman R.M.Annu. Rev. Immunolo.9:271 (1991)}. 이와 더불어, DC는 T 세포의 양성 및 음성 선별 과정에도 중요하게 관여하는 것으로 보고되고 있으며 (Carlos A.Immunol. Today18), T 세포의 림프절로 되돌아 오는 기작에 DC가 분비하는 케모카인이 작용한다는 실험결과도 보고되었다 {Ademaet al.,Nature387:713 (1997); Ingulliet al., Exp. Med.185:2133 (1997)}.Dendritic cells (DCs) are present in less than 1% of peripheral blood leukocytes (PBLs) in the blood, but when they are exposed to external antigens, such as by pinocytosis or pathogen infection, they absorb the antigen After digesting the protein, the peptide is expressed on the surface of the cell by loading it on MHC class II molecules. Such antigen presentation is much stronger than monocyte or macrophage (Pierre et al ., Nature 388: 787 (1997). When DC is sensitized to external antigens, it secretes DC-specific CC chemokines and returns to the lymph node to activate naive T cells {Adema et al ., Nature 387: 713 (1997); Ingulli E et al ., J. Exp. Med. 185: 2133 (1997)), leading to strong cellular immunity to antigens {Steinman RM Annu. Rev. Immunolo. 9: 271 (1991). In addition, DCs have been reported to be important in the process of positive and negative selection of T cells (Carlos A. Immunol. Today 18), demonstrating that chemokines secreted by DCs act on the mechanism of returning to the lymph nodes of T cells Results have also been reported {Adema et al ., Nature 387: 713 (1997); Ingulli et al., Exp. Med. 185: 2133 (1997).

또한, 인터류킨(IL)-12 등의 시토킨(cytokine)이나, 암세포에 특이하게 작용하는 CTL을 유도하여 암 발생 및 암세포 증식을 억제하는 기능이 있음이 밝혀졌으며{Gabrilovichet al.,Cell Immunol.170:111-9 (1996); Vezzioet al.,Int. Immunol.8:19963-70 (1996); Younget al.,J. Exp. Med.183:7-11 (1996)}, 최근에는 DC의 이러한 성질을 이용하여 DC를 이용한 암의 면역치료법이 집중적으로 연구되고 있다{Gilboaet al., Cancer Immunol. Immunother., 46:82~87 (1998); Nestleet al., Nat. Med.,4:328 (1998); Songet al., J. Exp. Med.,186:1247 (1997)}.In addition, it has been shown that cytokine such as interleukin (IL) -12 or CTL that specifically acts on cancer cells is induced to inhibit cancer development and cancer cell proliferation (Gabrilovich et al ., Cell Immunol. 170: 111-9 (1996); Vezzio et al ., Int. Immunol. 8: 19963-70 (1996); Young et al ., J. Exp. Med. 183: 7-11 (1996)). Recently, immunotherapy of cancer using DC has been intensively studied using this property of DC {Gilboa et al., Cancer Immunol. Immunother ., 46: 82-87 (1998); Nestle et al., Nat. Med., 4: 328 (1998); Song et al., J. Exp. Med., 186: 1247 (1997).

또, DC가 후천성 면역결핍증(AIDS)의 진전에도 핵심적으로 작용한다고 알려져 있다 {Fauci, Science, 262:1011 (1993); Pantaleoet al., Nature, 362:355 (1993); Embretsonet al., Nature, 362:359 (1993); Hayneset al., Science, 271:324 (1996)}. 이들의 연구결과에 따르면, HIV-1 바이러스에 감염된 환자는 보통 3~15년 동안의 무증상 감염기를 거치는데, 이 기간동안에 환자의 혈액내에서는 바이러스가 거의 발견되지 않으나, 림프절에는 DC 주변에 대량의 바이러스와 감염된 CD4+ T 세포가 발견된다고 보고하고 있다. 이러한 보고에 대하여 일부에서는, HIV-1 감염후 1차 바이러스혈증(viremia)시에 대량의 바이러스에 의해 DC가 감염되고 이들이 림프절로 되돌아와 주위의 비활성 상태의 T 세포를 활성화시키면서, 이들 중 CD4+ T 세포에 바이러스를 전파하여 CD4+ T 세포의 파괴를 초래하고, 결과적으로 혈액에 공급할 CD4+ T 세포의 양이 결핍되어 혈액내의 CD4+ T 세포의 숫자가 결핍되면서 면역결핍현상이 나타나는 것으로 해석하고 있다{Blauveltet al.,Clin. Invest.100:2043 (1997); McCloskeyet al.,J. Immunol. 158:1014 (1997)}. 실제, 주 등{Jooet al.,J. Kor. Soc. Microbiol., 30:77 (1995)}의 결과에 따르면, DC 또는 대식세포 없이 CD4+ T 세포는 HIV-1에 거의 감염되지 않으며, 이 경우 DC가 대식세포 보다 월등히 효과적으로 HIV-1을 CD4+ T 세포에 전달하는 것으로 나타났다. 이러한 연구결과들은 DC가 AIDS 발병기작에 중요하게 작용하고 있음을 구체적으로 보여주는 예들이다.It is also known that DCs play a key role in the progression of AIDS (Fauci, Science, 262: 1011 (1993); Pantaleo et al ., Nature, 362: 355 (1993); Embretson et al ., Nature, 362: 359 (1993); Haynes et al ., Science, 271: 324 (1996)}. According to the results of these studies, patients infected with the HIV-1 virus usually undergo asymptomatic infection for 3 to 15 years during which the virus is rarely found in the blood of the patient, Virus and infected CD4 + T cells are found. In some of these reports, DCs are infected by a large amount of virus at the time of primary viremia after HIV-1 infection, and they are returned to the lymph nodes and activate the surrounding inactive T cells, while CD4 + T It is interpreted that the CD4 + T cells are destroyed due to the deficiency of the CD4 + T cells in the blood due to the deficiency of the CD4 + T cells to be supplied to the blood as a result of propagating the virus to the cells, resulting in destruction of the CD4 + T cells {Blauvelt et al ., Clin. Invest. 100: 2043 (1997); McCloskey et al ., J. Immunol . 158: 1014 (1997). Actual, state, etc. {Joo et al ., J. Kor. Soc. Microbiol. , 30: 77 (1995)}, CD4 + T cells are infected with little or no HIV-1, either DC or macrophages, and DCs deliver HIV-1 more efficiently to CD4 + T cells than macrophages Respectively. These results are examples showing that DC plays an important role in the pathogenesis of AIDS.

이와 같이 DC의 다양한 기능과 중요성이 밝혀지면서 DC을 이용한 연구에 많은 관심이 집중되고 있다.As the various functions and importance of DC are revealed, much attention has been paid to DC research.

그러나, 아직까지 DC에 대한 특이 표면항원이 밝혀지지 않았고, 게다가 공지된 각종 세포 특이 표면항원이 DC에서는 거의 발현되지 않아, 혈액에서 DC만을 순수하게 분리하는 것이 쉽지 않은 관계로, 중요성이 크게 부각됨에도 불구하고 현재로서는 DC에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있지않은 실정이다.However, since specific surface antigens for DCs have not yet been identified, and various known cell-specific surface antigens are hardly expressed in DCs, it is not easy to purely separate DCs from the blood, However, at present, research on DC is not actively conducted.

현재 가장 널리 이용되고 있는 분리방법으로는 음성 선별법(negative selection){Freudenthalet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.87:7698 (1990)}이 있다. 이 방법에서는, 피콜 농도구배(ficoll gradient), 로셋팅(rosetting), 메트리자마이드 농도구배(metrizamide gradient), 접착 패닝(adhesive panning), 항체 패닝(antibody panning) 등의 복잡한 과정을 통해, 혈액으로부터 혈장을 제거하고 남은 세포침전물(buffy coat)이나 혈액에서 백혈구 세포만을 모은 류코팩(leukopak)에서, T 세포, B 세포, 단핵세포/대식세포 등의 면역세포들을 차례로 제거하고 최종적으로 남은 DC를 분리한다. 그러나, 과정이 까다롭고 복잡하며 많은 시간이 소요되는 관계로 일반화하기가 매우 어려운 실정이다.Currently the most widely used separation methods are negative selection {Freudenthal et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 7698 (1990). In this method, a complex process such as ficoll gradient, rosetting, metrizamide gradient, adhesive panning, antibody panning, etc., In the leukopak, which collects only leukocytes from blood buffy coat or blood after removing plasma, immune cells such as T cells, B cells, mononuclear cells / macrophages are sequentially removed, and the remaining DC is separated do. However, the process is difficult, complex, and time-consuming to generalize.

이 방법외에, 골수 간세포(stem cell){CD34+, CD11+ 등) 또는 혈액 전구세포(precursor cell)를 분리하여 시험관내(in vitro)에서 GM-CSF/IL-4 등의 시토킨을 처리하여 분화를 유도하여 DC로 분화시키는 방법이 있다{Benderet al.,J. Immunol. Methods196:121-135 (1996)}. 그러나, 이 방법은 많은 비용이 소요되어 이 또한 일반화하기가 매우 어려운 실정이다.In addition to this method, bone marrow stem cells (CD34 +, CD11 +, etc.) or blood precursor cells are isolated and treated with cytokines such as GM-CSF / IL-4 in vitro to differentiate Inducing and differentiating into DC (Bender et al ., J. Immunol. Methods 196: 121-135 (1996). However, this method is costly and very difficult to generalize.

이러한 한계를 극복하기 위해서는 DC에 대한 특이 표면항원(specific surface marker)을 밝히는 것이 우선되어야 하며, 이에 대한 단클론 항체를 생산하는 경우 DC에 대한 양성 선별법(positive selection)을 확립할 수 있을 것으로 기대된다.In order to overcome these limitations, it is expected that specific surface markers for DC should be prioritized, and positive selection for DC should be established when producing monoclonal antibodies thereto.

이러한 취지에서 지금까지 몇몇 DC 특이 표면항원이 보고된 바 있다. 그러나, 각각 나름대로 한계가 있어 DC를 PBL 중에서 순수하게 양성 선별하는데에 사용하기는 어려운 실정이다.In this regard, several DC-specific surface antigens have been reported so far. However, each of them has limitations, and it is difficult to use DC for positive selection in PBL.

일례를 들면, HB15 분자(CD83)에 대한 단클론 항체는 활성화된 DC에만 반응하며, 비활성 상태의 DC에는 반응하지 않았다. 또한, CD83은 활성화 된 DC에 발현된다고 보고되어 있지만, 활성화된 단핵세포/대식세포에서도 상당량 발현되어, DC 특이항원으로 부적절한 것으로 판정되었고, 주로 시험관내에서 시토킨에 의해 분화된 DC를 확인하는 용도로 사용되고 있다{Fearnleyet al., Blood,89:3708 (1997); Zhouet al., J. Immunol.,154:3821 (1995)}. 또한, 본 발명자들의 실험 결과에 따르면, 비록 활성화된 DC라도 CD83의 발현량이 다른 세포 표면항원에 비해 충분치 않은 것으로 나타났다.For example, monoclonal antibodies to the HB15 molecule (CD83) react only with activated DCs and not with DCs that are inactive. In addition, although CD83 has been reported to be expressed on activated DCs, it has also been shown to be significantly expressed in activated mononuclear cells / macrophages, being inappropriate as a DC-specific antigen and mainly used for the identification of DCs differentiated by cytokines in vitro (Fearnley et al., Blood, 89: 3708 (1997); Zhou et al., J. Immunol., 154: 3821 (1995)}. In addition, according to the results of experiments conducted by the present inventors, even when activated DCs were expressed, the expression level of CD83 was not sufficient compared with other cell surface antigens.

이외에도, CD11c 또는 CD1a가 DC 특이항원으로 발표되었다{Gaoet al.,Immunology91:135 (1997); Lardonet al.,Immunology91:553 (1997); Ruedlet al.,Immunol.266:1801 (1996)}. 그러나, DC에서 뿐만 아니라 CD11c는 대식세포, 과립구 및 NK 세포에서, CD1a는 흉선세포(thymocytes) 및 랑게르한스세포(Langerhan's cell)에서도 발현되어 특이성에 있어서 문제가 있다. 본 발명자들의 실험 결과에서도, CD11c는 DC에서 발현되는 양은 충분하나, B 세포나 단핵세포에서도 다량 발현되어 특이성에 문제가 있으며, CD1a는 비활성 상태의 DC에서는 거의 발현되지 않기 때문에 DC의 표지항원으로 사용하기에는 부적합한 것으로 평가되었다.In addition, CD11c or CD1a has been published as a DC specific antigen {Gao et al ., Immunology 91: 135 (1997); Lardon et al ., Immunology 91: 553 (1997); Ruedl et al ., Immunol. 266: 1801 (1996). However, as well as in DC, CD11c is expressed in macrophages, granulocytes and NK cells, and CD1a is also expressed in thymocytes and Langerhans cells, which is problematic in its specificity. As a result of the experiments conducted by the present inventors, CD11c is expressed in DC but is expressed in a large amount in B cells or mononuclear cells, so that there is a problem in specificity. CD1a is rarely expressed in inactive DC, It was evaluated to be unsuitable for the following.

이에, 본 발명자들은 DC cDNA 라이브러리를 탐색하여 DC-특이 표면항원을 찾던 중, 차등 혼성화법(differential hybridization)으로 HLA-DMα/b 유전자(이하 DM으로 약함)가 PBL중 DC에만 특이하게 발현된다는 사실을 발견하고{Baeet al.,Mol. Cells, 5:569 (1995)}, 이를 기초로 하여 DM 단백질에 대한 단클론 항체 3-6-A 제작에 성공하게 되었으며, 이 단클론 항체 3-6-A의 DC 표면항원에의 특이성 및 반응력을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.Thus, the inventors searched the DC cDNA library for DC-specific surface antigens and found that HLA-DMα / b gene (hereinafter, weakly as DM) was specifically expressed in DC of PBL by differential hybridization (Bae et al ., Mol. Cells , 5: 569 (1995)). Based on this, we have succeeded in producing the mAb 3-6-A to the DM protein and confirmed the specificity and reactivity of this mAb 3-6-A to the DC surface antigen Thereby completing the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 PBL 중의 DC만을 특이하게 인식하는 단클론 항체 3-6-A를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide monoclonal antibody 3-6-A that specifically recognizes only DCs in PBLs.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기한 단클론 항체 3-6-A를 생산하는 하이브리도마 세포 KHB-DM을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a hybridoma cell KHB-DM which produces the aforementioned monoclonal antibody 3-6-A.

도 1은 본 발명에 따른 단클론 항체 3-6-A를 얻는 과정을 개략적으로 보여주는 반응흐름도이다.FIG. 1 is a reaction flow diagram schematically showing the process of obtaining the monoclonal antibody 3-6-A according to the present invention.

도 2는 실시예 3에서, 재조합 DMα가 형질전환된 대장균에서 정상적으로 발현됨을 보여주는 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과이다.Fig. 2 shows results of SDS-PAGE electrophoresis analysis showing that recombinant DMa is normally expressed in Escherichia coli transformed in Example 3. Fig.

컬럼 1 : 단백질 크기 마커,Column 1: Protein size marker,

컬럼 2 : pRSET/A 벡터만 형질전환된 대장균 BL21(DE3),Column 2: pRSET / A vector only transformed E. coli BL21 (DE3),

컬럼 3 : 재조합 DMα를 발현하는 대장균 BL21(DE3),Column 3: E. coli BL21 (DE3) expressing recombinant DMa,

컬럼 4 : 컬럼 3의 파쇄물을 Ni+-NTA수지(QIAGEN)로 순수분리한 시료.Column 4: A sample of column 3 separated pure with Ni + -NTA resin (QIAGEN).

도 3은 실시예 4에서, 배큘로바이러스 시스템에서 형질감염된 High-5 세포에 의해 형성된 양성 플라그를 보여주는 사진이다.3 is a photograph showing a positive plaque formed by High-5 cells transfected in a baculovirus system in Example 4. Fig.

도 4는 실시예 8에서, 재조합 DMα가 배큘로바이러스 시스템에서 정상적으로 발현됨을 보여주는 웨스턴 블럿 실험 결과이다.4 is a Western blot experiment showing that recombinant DMa is normally expressed in a baculovirus system in Example 8. Fig.

컬럼 M : 단백질 크기 마커,Column M: Protein size marker,

컬럼 1 : 감염되지 않은 High-5 세포,Column 1: High-5 cells not infected,

컬럼 2 : 야생 배큘로바이러스 Bac-N-Blue가 감염된 High-5 세포,Column 2: High-5 cells infected with the wild baculovirus Bac-N-Blue,

컬럼 3 : 재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα가 감염된 High-5 세포,Column 3: High-5 cells infected with recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DMa,

컬럼 4 : 실시예 3의 재조합 DMα를 발현하는 대장균 BL21(DE3).Column 4: E. coli BL21 (DE3) expressing the recombinant DMa of Example 3.

도 5는 실시예 9에서, 재조합 DMα에 대한 마우스 항혈청의 Raji 세포에서 발현되는 정상 DMα와 반응성을 보여주는 웨스턴 블럿 실험 결과이다.Figure 5 is a Western blot experiment showing the reactivity with normal DMa expressed in Raji cells of mouse antiserum against recombinant DMa in Example 9.

컬럼 1 : 대조군으로서, Jurkat 세포 파쇄물,Column 1: As a control, Jurkat cell lysate,

컬럼 2 : Raji 세포,Column 2: Raji cells,

컬럼 3 : γ-인터페론을 처리한 Raji 세포.Column 3: Raji cells treated with? -Interferon.

도 6은 실시예 12에서, 단클론 항체 3-6-A의 세포에서 발현되는 DMα와의 반응성을 보여주는 웨스턴 블럿 실험 결과이다.6 is a Western blot experiment showing the reactivity with DMa expressed in cells of monoclonal antibody 3-6-A in Example 12. Fig.

컬럼 1 : 음성대조군으로서, DMα를 발현하지 않는 대장균 BL21(DE3),Column 1: As a negative control, Escherichia coli BL21 (DE3), which does not express DMa,

컬럼 2 : DMα를 발현하는 대장균 BL21(DE3),Column 2: Escherichia coli BL21 (DE3) expressing DMa,

컬럼 3 : DMα를 발현하는 High-5 세포,Column 3: High-5 cells expressing DMa,

컬럼 4 : Raji 세포,Column 4: Raji cells,

컬럼 5 : DC 시료.Column 5: DC sample.

도 7은 실시예 15에서, 단클론 항체 3-6-A로 PBL 세포들을 염색시킨 결과를 보여주는 형광현미경 사진이다.FIG. 7 is a fluorescence microscope photograph showing the result of staining PBL cells with the monoclonal antibody 3-6-A in Example 15. FIG.

패널 A : T 세포, 패널 B : B 세포,Panel A: T cells, Panel B: B cells,

패널 C : 단핵 및 대식세포, 패널 D : DC,Panel C: Mononuclear and macrophages, panel D: DC,

패널 E : 유기용매로 고정시킨 Raji 세포,Panel E: Raji cells fixed with organic solvent,

패널 F : 고정시키지 않은 Raji 세포.Panel F: Raji cells not immobilized.

도 8은 실시예 16에서, DC에 특이하게 반응하는 것으로 알려진 상품화된 단클론 항체들과, 본 발명의 단클론 항체 3-6-A의 DC 특이성을 비교하는 형광현미경 사진이다.8 is a fluorescence microscope image of Example 16, comparing the DC specificity of monoclonal antibody 3-6-A of the present invention with commercialized monoclonal antibodies known to react specifically to DC.

컬럼 1 : T 세포, 컬럼 2 : B 세포,Column 1: T cells, column 2: B cells,

컬럼 3 : 단핵세포, 컬럼 4 : DCColumn 3: Mononuclear cells, Column 4: DC

도 9는 실시예 17에서, DC에 특이하게 반응하는 것으로 알려진 상품화된 단클론 항체들과, 본 발명의 단클론 항체 3-6-A의 DC 반응력을 비교하는 도트 면역블럿 실험 결과이다.9 is a dot immunoblot experiment result comparing the DC reaction force of the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention with commercialized monoclonal antibodies known to react specifically to DC in Example 17. Fig.

반점 1 : CD1a에 대한 단클론 항체Spot 1: Monoclonal antibody against CD1a

반점 2 : CD11c에 대한 단클론 항체Spot 2: Monoclonal antibody against CD11c

반점 3 : CD83에 대한 단클론 항체Spot 3: Monoclonal antibody to CD83

반점 4 : F-actin에 대한 단클론 항체Spot 4: Monoclonal antibody against F-actin

반점 5 : 단클론 항체 3-6-ASpot 5: Monoclonal antibody 3-6-A

도 10은 실시예 18에서, 단클론 항체 3-6-A와, 인간의 1차 면역세포들과의 반응성을 현광표지 세포분리기(FACS)로 분석한 결과이다.FIG. 10 shows the results of analysis of reactivity between monoclonal antibody 3-6-A and human primary immunocytes by a light-sensitive marker cell separator (FACS) in Example 18. FIG.

패널 A : 실시예 1의 방법으로 바로 분리한 세포들,Panel A: Cells immediately separated by the method of Example 1,

패널 B : 실시예 1의 PBL을 1주일간 배양한 후 순수분리한 세포들.Panel B: PBLs of Example 1 were cultured for 1 week, and then the cells were purified.

컬럼 1 : T 세포, 컬럼 2 : 단핵 혹은 대식세포,Column 1: T cells, column 2: mononuclear or macrophages,

컬럼 3 : B 세포, 컬럼 4 : DCColumn 3: B cells, column 4: DC

본 발명자들은 PBL중 DC에만 특이하게 발현하는 DM 단백질에 대한 단클론 항체를 얻기 위하여, DM 단백질을 대장균에서 발현시켜 BALB/c 마우스에 면역시켜서 DM 단백질에 대한 단클론 항체를 얻었다.The present inventors obtained a monoclonal antibody against the DM protein by expressing the DM protein in E. coli and immunizing the BALB / c mouse in order to obtain a monoclonal antibody against the DM protein that specifically expresses DC in the PBL.

그러나, 얻은 단클론 항체는 그 어떤 것도 DC 또는 Raji 세포에서 발현되는 정상적인 DMα를 인식하지 못하였다 {Kimet al.,Mol. Cells,6:684 (1996)}.However, none of the monoclonal antibodies obtained recognized normal DMa expressed in DC or Raji cells {Kim et al ., Mol. Cells, 6: 684 (1996).

이에 대하여 DM의 아미노산 서열을 분석한 결과, 사람과 마우스 사이에 75%이상의 유사도가 있는 것으로 나타났다. 이는 DM을 BALB/c 마우스에 면역시켜 단클론 항체를 얻기가 쉽지 않음을 시사해 준다. 또한, Kim 등{Kimet al.,Mol. Cells, 6:684 (1996)}은 DMα를 대장균에서 발현시켰기 때문에, DM 단백질이 글리코실화되지 못하였거나, 봉입체(inclusion body)로 발현된 재조합 DM 단백질 추출과정에서 단백질의 구조가 변성되어, 생산된 단클론 항체가 DC에서 발현되는 정상적인 DMα를 인식하지 못하는 것으로 판단된다.In contrast, the amino acid sequence of DM was analyzed and it was found that there was more than 75% similarity between human and mouse. This suggests that it is not easy to obtain monoclonal antibodies by immunizing DM with BALB / c mice. In addition, Kim et al . {Kim et al ., Mol. Cells , 6: 684 (1996)) showed that the DM protein was not glycosylated because of the expression of DMa in E. coli, or the protein structure was denatured during the extraction of the recombinant DM protein expressed as an inclusion body, It is judged that the monoclonal antibody does not recognize normal DM? Expressed in DC.

이러한 문제점을 보완하기 위하여, 본 발명에서는 배큘로바이러스 시스템을 이용하여 재조합 DMα 단백질을 얻었고, 이들은 Raji 세포 또는 DC에서 발현되는 정상적인 DMα의 항원성을 유지하고 있음을 확인하고, 이를 이용하여 단클론 항체3-6-A를 제조하였다.In order to overcome this problem, recombinant DMα protein was obtained using the baculovirus system in the present invention. These recombinant DMα proteins were confirmed to maintain normal DMα antigen expression in Raji cells or DCs, and monoclonal antibody 3 -6-A. ≪ / RTI >

본 발명에 따른 단클론 항체 3-6-A를 얻는 과정을 단계별로 정리하면 다음과 같다 :The process of obtaining the monoclonal antibody 3-6-A according to the present invention can be summarized as follows:

(1) DMα 유전자의 막 바깥쪽 영역(extracellular region)(핵산서열 122-731)을 코딩하는 609bp의 DNA 단편을, 배큘로바이러스 시스템 전이 벡터 pBlueBacHis2A에 클로닝하여,재조합 플라스미드 pBlueBacHis2A-DMα를 제조하는 단계;(1) preparing a recombinant plasmid pBlueBacHis2A-DMa by cloning a DNA fragment of 609 bp encoding the extracellular region (nucleic acid sequence 122-731) of the DMa gene into the baculovirus system transfer vector pBlueBacHis2A; ;

(2) 재조합 플라스미드 pBlueBacHis2A-DMα를, 배큘로바이러스 전장(full-length) DNA Bac-N-Blue(Invitrogen사)와 함께, High-5 세포(Invitrogen사)에 공동-형질감염시켜,재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα를 제조하는 단계;(2) The recombinant plasmid pBlueBacHis2A-DMα, with virus full-length (full-length) DNA Bac-N-Blue (Invitrogen) into baculovirus, Co in High-5 cells (Invitrogen Corporation) by transfection, the recombinant baculoviruses Preparing the virus Bac-N-Blue-DMa ;

(3) 재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα를, High-5 세포에 대량 감염시켜 세포 추출물을 얻고, Ni+-NTA 컬럼(QIAGEN사 제품)으로재조합 DMα 단백질을 정제하는 단계;(3) step of the bulk infection with the recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DMα, in High-5 cells to obtain a cell extract, a purified recombinant protein DMα the Ni + -NTA column (QIAGEN Inc.);

(4) 재조합 DMα 단백질을 BALB/c 마우스에 면역시켜 비장세포(splenocyte)를 얻고, 이를 마우스 골수종양세포(myeloma Sp2/0 세포)와 융합시켜,단클론 항체 3-6-A를 생산하는 하이브리도마 세포 KHB-DM을 얻는 단계, (4) Hybrid to produce monoclonal antibody 3-6-A by immunizing a recombinant DMa protein with BALB / c mouse to obtain splenocytes and fusing it with mouse myeloma Sp2 / 0 cells A step of obtaining a donor cell KHB-DM,

(5) 하이브리도마 세포 KHB-DM을 배양하여단클론 항체 3-6-A를 생산하는 단계.(5) Culturing Hybridoma Cells KHB-DM to Produce Monoclonal Antibody 3-6-A

이상의 (4)단계에서 얻은, 단클론 항체 3-6-A를 생산하는 하이브리도마 세포 KHB-DM은 1998년 5월 29일자로 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁번호 KCTC-0485BP로 기탁하였다.The hybridoma cell KHB-DM, which produced the monoclonal antibody 3-6-A obtained in the above step (4), was deposited at KCTC-0485BP at the GenBank in the Institute of Biotechnology, Korea Advanced Institute of Science and Technology Respectively.

본 발명의 단클론 항체 3-6-A에 대하여 단클론 항체 이소타이핑 킷트를 이용하여 H사슬의 이소타입과 L사슬을 분석한 결과, H사슬은 IgG1이고, L사슬은 κ임이 확인되었다.Analysis of isotype and L chain of H chain using monoclonal antibody isotyping kit for monoclonal antibody 3-6-A of the present invention revealed that the H chain was IgG1 and the L chain was κ.

본 발명의 단클론 항체 3-6-A는 DC 및 Raji 세포에서 발현되는 정상적인 DMα에 대하여 강한 반응성을 나타내었고, 1차 면역 세포들 중에서 오직 DC에만 특이하게 반응하고, DC의 세포질 뿐만 아니라 세포 표면도 매우 강하게 염색시켰다. 이는, DMα가 1차 면역 세포들 중에서 오직 DC에서만 특이하게 발현되고, 세포질 뿐만 아니라 세포 표면에도 상당량 발현됨을 확인시켜주는 것이다.The monoclonal antibody 3-6-A of the present invention showed a strong reactivity to normal DMa expressed in DC and Raji cells, and reacted specifically to only DC among the primary immune cells, and not only the cytoplasm of DC but also the cell surface Strongly stained. This confirms that DMa is specifically expressed only in DC among the primary immune cells, and that it is expressed not only in the cytoplasm but also on the cell surface.

이러한 사실은 DM 단백질이 세포내에만 존재한다는 기존의 보고{Karlssonet al., Science,266:1569 (1994); Sandersonet al., Science,266:1566 (1994)}와 분명한 차이를 보이고 있다. 그러나, 기존의 보고들은 거의 Raji 세포나 그외의 세포주들에서 조사한 것으로, DC에서의 DM 단백질의 발현양상은 본 발명에 의해 처음으로 개시된 것이다. 한편, 본 발명자들의 실험에서도 Raji 세포의 경우 DM 분자는 세포내에서는 다량 발현되었으나 세포 표면에서는 나타나지 않았다.This fact suggests that DM proteins exist only in cells {Karlsson et al., Science, 266: 1569 (1994); Sanderson et al., Science, 266: 1566 (1994). However, existing reports have been searched almost exclusively in Raji cells or other cell lines, and the expression pattern of DM protein in DC has been disclosed for the first time by the present invention. On the other hand, in the experiments of the present inventors, in the case of Raji cells, DM molecules were expressed in large amounts in the cells but not on the cell surface.

DM 분자가 DC에만 특이하게 표면에 다량 발현된다는 사실은, DM 분자가 세포질내 성분으로서 HLA-class Ⅱ 분자에 의한 항원표출시 샤프론(chaperone) 단백질로서 작용한다는 기존의 보고와는 달리, 샤프론 기능 외에도 다른 기능이 있음을 시사해주며, 무엇보다도 DM 단백질을 DC 표면 특이항원으로 이용할 수 있음을 강하게 시사해 준다.The fact that DM molecules are highly expressed on the surface specifically for DC differs from the previous reports that DM molecules act as chaperone proteins in the expression of HLA-class Ⅱ molecules as intracellular components, besides the chaperone function Suggesting different functions and, above all, strongly suggesting that DM proteins can be used as DC surface-specific antigens.

본 발명의 단클론 항체 3-6-A는 PBL 중 DC 표면에 발현되는 DM 분자를 탐색하고, DC에서 DM 분자의 기능을 연구하는데 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 PBL 세포들 중에서 DC를 양성 선별하는데 사용될 수 있다. DC는 면역반응에 중요하게 작용하며, 특히 최근 암에 대한 면역치료법 개발을 위해 핵심적으로 연구되는 세포이므로, 용이한 순수 분리법의 개발이 무엇보다도 시급하다. 본 발명에 의한 단클론 항체 3-6-A를 이용한 양성 선별법이 확립되면 이러한 연구에 매우 유용하게 사용될 것이며, 면역치료법에도 유용하게 사용될 것이다.The monoclonal antibody 3-6-A of the present invention can be used to search for DM molecules expressed on the DC surface of PBLs and to study the function of DM molecules in DCs, as well as to select positive DCs among PBL cells have. DC plays an important role in the immune response. In particular, since it is a key cell for the development of immunotherapy for cancer in recent years, development of an easy pure separation method is urgent. Once the positive selection method using the monoclonal antibody 3-6-A according to the present invention has been established, it will be very useful for such studies and will be useful for immunotherapy.

이하에서는 본 발명의 실시예들을 통하여 본 발명의 단클론 항체 3-6-A를 제조하는 단계별 공정을 구체적으로 설명하고, 각종 면역실험을 통하여 DC에 대한 특이성 및 반응성을 확인한다.Hereinafter, the step of preparing the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention will be described in detail through examples of the present invention, and specificity and reactivity to DCs will be confirmed through various immunoassays.

<실시예 1>DC 및 다른 1차 면역세포의 순수 분리 : EXAMPLE 1 Pure Isolation of DC and Other Primary Immune Cells:

자원자의 혈액으로부터 혈장을 제거하고 남은 혈구세포 침전물(Buffy coat)이나 혈액에서 백혈구 세포만을 모은 류코팩(leukopak)을 적십자 혈액원에서 공급받아, 기존의 보고된 방법(Baeet al.,Mol. Cells, 5, 569, 1995)에 따라 DC을 순수 분리하였다.Removing the plasma from the volunteers, the blood remaining after blood cells precipitate (Buffy coat) or when supplied with current Nose (leukopak) collecting only the white blood cells in the blood from the Red Cross Blood Center, the existing reporting methods (Bae et al., Mol. Cells, 5, 569, 1995).

<실시예 2>DC의 mRNA 추출, DMα에 대한 cDNA 단편 합성 : Example 2 Extraction of DC mRNA, Synthesis of cDNA fragment for DMa:

실시예 1에서 분리한 DC에서 기존의 보고된 방법(Baeet al.,Mol. Cells, 5, 569, 1995)에 따라 mRNA를 추출하였다.MRNA was extracted from the DCs isolated in Example 1 according to the previously reported method (Bae et al ., Mol. Cells , 5, 569, 1995).

추출한 mRNA를 올리고-d(T) 프라이머 1㎍와 혼합하고, 역전사 반응 용액 (RNase 억제물 0.5㎕, 5×1차 염색반응 완충액 4㎕, 0.1mM의 DTT 2㎕, 10mM의 dNTP 1㎕)에서 37℃에서 2분간 보관한 후, AMV-역전사효소(Reverse transcriptase) 5 unit를 첨가하여 37℃에서 40분간, 45℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.The extracted mRNA was mixed with 1 쨉 g of oligo-d (T) primer, and the resultant was mixed with the reverse transcription reaction solution (0.5 R of RNase inhibitor, 4 1 of primary staining reaction buffer, 2 쨉 l of 0.1 mM DTT, 1 쨉 l of 10 mM dNTP) After incubation at 37 ° C for 2 minutes, 5 units of AMV-reverse transcriptase was added and cDNA was synthesized by reacting at 37 ° C for 40 minutes and 45 ° C for 30 minutes.

합성된 cDNA를 주형으로 하고, 하기 서열의 DMα에 대한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다 :The synthesized cDNA was used as a template and amplified by PCR using a primer for DMa of the following sequence:

BamHⅠ-DMα 센스 프라이머 Bam HI-DM alpha sense primer 5'-GAT AAG GAT CCG TCC CTG AAG CTC CTA-3'5'-GAT AA G GAT CC G TCC CTG AAG CTC CTA-3 ' 122-137122-137 HindⅢ-DMα 안티센스 프라이머 Hind III-DM alpha antisense primer 5'-GT TCAAAG CTTTCA CTC CAG CAG ATC TGA GGG-3'5'-GT TCA AAG CTT TCA CTC CAG CAG ATC TGA GGG-3 ' 732-712732-712

PCR 반응은, 94℃에서 1분간, 40℃에서 30초간, 72℃에서 45초간으로 5회를 돌린 후, 계속해서 94℃에서 1분간, 72℃에서 1분간으로 25회를 돌려 DMα 유전자의 막 바깥쪽 영역(extracellular region)(핵산서열 122-732)을 코딩하는 609bp의 DNA 단편을 증폭시켰다.The PCR reaction was carried out at 94 ° C for 1 minute, at 40 ° C for 30 seconds, at 72 ° C for 45 seconds, and then at 94 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute, A 609 bp DNA fragment encoding the extracellular region (nucleic acid sequence 122-732) was amplified.

<실시예 3>DMα의 cDNA 클로닝 : &Lt; Example 3 > cDNA cloning of DMa:

실시예 2에서 PCR로 증폭된 DNA 단편을 제한효소BamHⅠ과HindⅢ로 절단하였고, 동일한 제한효소로 처리하여 개환한 pRSET/A(Invitrogen사 제품)에 클로닝하여 플라스미드 pRSET-DMα를 제조하였다.The DNA fragment amplified by PCR in Example 2 was digested with restriction enzymes Bam HI and Hind III and cloned into pRSET / A (manufactured by Invitrogen) transformed with the same restriction enzymes to prepare a plasmid pRSET-DMα.

얻은 플라스미드 pRSET-DMα를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후, LB(Amp)에 도말하였다. 형성된 집락을 조성을 바꾼 M-9 브로스(Amp){1%의 백토트립톤(bactotryptone), Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, NH4Cl, 2M의 글루코스, 0.5%의 티아민, 1M의 MgSO4, 1M의 CaCl2}에서 진탕배양하고, 흡광도 0.5일 때 IPTG를 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 발현을 유도하였다.The resultant plasmid pRSET-DM? Was transformed into E. coli BL21 (DE3), and then plated on LB (Amp). M-9 broth (Amp) {1% of bactotryptone, Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NaCl, NH 4 Cl, 2M glucose, 0.5% thiamine, 1M MgSO 4 , 1M CaCl 2 }, IPTG was added at a final concentration of 1 mM at an absorbance of 0.5, and the expression was induced at 37 ° C for 2 hours.

SDS-PAGE 전기영동 분석 결과, 클로닝된 DMα가 형질전환된 대장균에서 분자량 29kDa에서 정상적으로 발현되었음을 확인하였다(도 2).As a result of SDS-PAGE electrophoresis analysis, it was confirmed that the cloned DMα was normally expressed at a molecular weight of 29 kDa in the transformed E. coli (FIG. 2).

<실시예 4>DMα를 발현하는 재조합 배큘로바이러스의 합성 : Example 4 : Synthesis of recombinant baculovirus expressing DMa:

실시예 2에서 PCR로 증폭된 DNA 단편을 제한효소BamHⅠ과HindⅢ로 절단하였고, 동일한 제한효소로 처리하여 개환한 pBlueBacHis2A(Invitrogen사 제품)에 클로닝하였고, 실시예 3의 방법에 따라 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 양성집락에서 재조합 플라스미드 pBlueBacHis2A-DMα를 제조하였다.The DNA fragment amplified by PCR in Example 2 was digested with restriction enzymes Bam HI and Hind III and cloned into pBlueBacHis2A (Invitrogen) which had been transformed by treating with the same restriction enzymes. Then, E. coli BL21 DE3) to produce a recombinant plasmid pBlueBacHis2A-DM? In a positive colony.

얻은 재조합 플라스미드 pBlueBacHis2A-DMα와, 제한효소Bsu36Ⅰ으로 개환한 배큘로바이러스 전장(full-length) DNA Bac-N-Blue(Invitrogen사 제품)를, 리포펙틴(lipofectin : GIBCO/BRL)을 사용하여 설명서에 따라 High-5 세포(Invitrogen사 제품)에 형질감염시켰다. 약 5~7일간 배양한 다음 상등액을 수거하여 일정한 희석농도로 High-5 세포에 다시 감염시켰다. 이틀간 배양한 후, 1%의 저(低)융점 아가로스(50mg/ml X-gal, 2×TNM-FH 배지와 2%의 저융점 아가로스를 동량으로 혼합한 것)를 덮어 3~5일간 배양하였다. 배양 후 푸른색을 나타내는 양성 플라그를 골라{도 3의 (A)}, 상기 과정을 3회 반복하여 재조합 바이러스에 의해 생성된 플라그{도 3의 (B)}을 순수 분리하였고, 이를 High-5 세포에서 증식시켜 재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα를 얻었다.The obtained recombinant plasmid pBlueBacHis2A-DMa and baculovirus full-length DNA Bac-N-Blue (Invitrogen), which had been transformed with restriction enzyme Bsu 36 I, were introduced into the cell line using lipofectin (GIBCO / BRL) High-5 cells (Invitrogen) were transfected according to the manufacturer's instructions. After incubation for about 5 to 7 days, the supernatant was collected and re-infected with High-5 cells at a constant dilution concentration. After incubation for 2 days, the cells were covered with 1% low melting point agarose (50 mg / ml X-gal, 2 x TNM-FH medium and 2% low melting point agarose mixed in equal amounts) Lt; / RTI &gt; After culturing, a positive plaque showing blue color was selected (FIG. 3A), and the above procedure was repeated three times to purify the plaque generated by the recombinant virus (FIG. 3B) Cells to obtain recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DMa.

<실시예 5>재조합 배큘로바이러스의 DMα 클로닝 확인 : Example 5 Confirmation of DMa Cloning of Recombinant Baculovirus:

실시예 4에서 수획한 재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα 용액을 모아 Invitrogen사의 설명서(Bac-N-Blue 형질감염 킷트)에 따라 재조합 바이러스의 게놈 DNA를 추출하였고, Bac1/Bac2 프라이머(Invitrogen Bac-N-Blue 형질감염 킷트)를 사용하여 PCR을 실시하였다.The recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DMa solution collected in Example 4 was collected and the genomic DNA of the recombinant virus was extracted according to the manual of Invitrogen (Bac-N-Blue transfection kit), and the Bac1 / Bac2 primer Bac-N-Blue transfection kit).

Bac1 프라이머Bac1 primer 5'-TTT ACT GTT TTC GTA ACA GTT TTG-3'5'-TTT ACT GTT TTC GTA ACA GTT TTG-3 ' -44 ~ -21-44 ~ -21 Bac2 프라이머Bac2 primer 5'-CAA CAA CGC ACA GAA TCT AGC-3'5'-CAA CAA CGC ACA GAA TCT AGC-3 ' +794 ~ +774+794 to +774

이상의 실험에서 재조합 배큘로바이러스가 DMα 유전자를 함유하고 있음을 확인하였다.In the above experiment, it was confirmed that the recombinant baculovirus contained DMα gene.

<실시예 6>재조합 배큘로바이러스의 DMα 발현 및 정제 : Example 6 Expression and purification of DMa of recombinant baculovirus:

재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα를 5MOI가 되게 High-5 세포에 감염시키고, 27℃ 항습항온기에서 5일간 배양한 후 감염된 세포를 수획하여 세포내에 발현된 재조합 DMα 단백질을 Ni+-NTA 수지(QIAGEN사 제품)를 이용하여 순수 분리하였다.The recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DMα was infected to High-5 cells to be 5 MOI and incubated for 5 days in a constant temperature humidifier at 27 ° C. The infected cells were harvested and the recombinant DMα protein expressed in the cells was treated with Ni + -NTA Resin (manufactured by QIAGEN).

<실시예 7>BALB/c 마우스에 재조합 DMα를 면역 : Example 7 Immunization of recombinant DMa in BALB / c mice:

실시예 6에서 정제한 DMα 단백질을 동량의 프룬드 보조액(Freund's adjuvant)(Sigma사 제품)과 혼합하여, 5~6주령된 BALB/c 마우스에 마리당 50㎍의 농도로 1차 면역한 후, 3주 간격으로 마리당 25㎍씩 2차 및 3차 면역하였다.The DMα protein purified in Example 6 was mixed with an equal amount of Freund's adjuvant (manufactured by Sigma), and then primary immunized with BALB / c mice at 5 to 6 weeks of age at a concentration of 50 μg per mouse. The mice were immunized twice or three times with 25 μg per mouse per week.

3차 면역 3일 후 각 마우스의 안구정맥에서 혈액을 채취하여 항혈청을 분리하였다.Three days after the third immunization, blood was collected from the eye vein of each mouse to isolate the antiserum.

<실시예 8>항혈청의 재조합 DMα와의 반응성 확인 : Example 8 Confirmation of Reactivity of Antiserum with Recombinant DMa:

재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα가 감염된 High-5 세포를 파쇄하여 제조한 단백질들을 SDS-PAGE로 분리한 후, 전사(transfer)완충액{48mM의 트리스-HCl, 39mM의 글리신, 20%의 메탄올, 1.3mM의 SDS}에 적신 반건조 겔 전사기(blotter)(Bio-Rad사 제품)를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 그런 다음, 막을 블로토(blotto){5%(w/v)의 탈지유, 0.02%의 NaN3in PBS}에 담가 30분간 블로킹(blocking)하고 1×PBS로 3회 세척한 후, 실시예 7에서 분리한 항혈청 5㎕를 PBS 10㎖로 희석시킨 용액에 방치하여 상온에서 30분 이상 반응시켰다.Proteins prepared by disrupting High-5 cells infected with recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DMα were separated by SDS-PAGE, and then transferred to a transfer buffer (48 mM Tris-HCl, 39 mM glycine, 20% Of methanol, 1.3 mM of SDS} using a semi-dry gel transfer blotter (Bio-Rad). The membrane was then immersed in a blotto (5% (w / v) skim milk, 0.02% NaN 3 in PBS), blocked for 30 minutes, washed three times with 1 x PBS, Was allowed to stand in a solution diluted with 10 ml of PBS and allowed to react at room temperature for 30 minutes or longer.

2차 항체로서, 항-마우스-IgG-알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase) (Sigma, Bio-Rad, BRL)를 사용하였으며, 각 단계별로 1×PBS로 3회 세척하였다. 알카리성 포스파타제의 기질로서, 50㎎/㎖의 NBT(Nitro blue tetrazolium : 니트로 블루 테트라졸륨) 66㎕와 50㎎/㎖의 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate : 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트) 33㎕를 AP 완충액(100mM NaCl, 5mM MgCl2, 100mM의 트리스-Cl, pH9.5) 10㎖에 혼합한 것을 사용하였다. 암소에서 반응시켜 막에 밴드가 나타났을 때 정지용액(20mM EDTA, 150mM NaCl in 10mM의 트리스-Cl, pH 8.0)을 첨가하여 반응을 종결시켰다.As secondary antibody, anti-mouse-IgG-alkaline phosphatase (Sigma, Bio-Rad, BRL) was used and each step was washed three times with 1 x PBS. As the substrate of the alkaline phosphatase, 66 ㎕ of NBT (Nitro blue tetrazolium: nitroblue tetrazolium) of 50 mg / ml and 5 brom-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl phosphate) was mixed with 10 ml of AP buffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 100 mM Tris-Cl, pH 9.5) The reaction was terminated by the addition of a stop solution (20 mM EDTA, 150 mM NaCl in 10 mM Tris-Cl, pH 8.0) when bands appeared on the membrane after reaction in the dark.

이상의 웨스턴 블럿 실험을 통해 재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα가 High-5 세포에서 DMα를 정상적으로 발현하고 있음을 확인하였다(도 4의 컬럼 3).The Western blot experiment described above confirmed that the recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DMα normally expresses DMα in High-5 cells (column 3 in FIG. 4).

<실시예 9>항혈청의 세포에서 발현되는 DMα와의 반응성 확인 : <Example 9> Confirmation of reactivity with DMα expressed in antiserum cells:

라지(Raji) 세포와, 3일간 γ-인터페론(Sigma사) 100 unit/㎖로 처리한 라지 세포를 각각 세포수 1×106으로 조정하여, 실시예 7에서 얻은 마우스 항혈청으로 실시예 8에서와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 실시하였다(도 5).Raji cells treated with 100 units / ml of γ-interferon (Sigma) for 3 days were adjusted to a cell number of 1 × 10 6 , respectively. Using the mouse antiserum obtained in Example 7, Western blotting was carried out in the same manner (Fig. 5).

이상의 실험을 통해 배큘로바이러스 시스템에서 발현시켜 얻은 재조합 DMα를 BALB/c 마우스에 면역시켜 얻은 항혈청(실시예 7)은 Raji 세포에서 발현되는 정상적인 DMα와 잘 반응함을 확인하였다.From the above experiments, it was confirmed that the antiserum obtained by immunizing BALB / c mice with recombinant DMa expressed in baculovirus system (Example 7) reacted well with normal DMa expressed in Raji cells.

<실시예 10>단클론 항체 생산을 위한 하이브리도마 세포 제작 : Example 10 Preparation of hybridoma cells for production of monoclonal antibodies:

실시예 7에서 배큘로바이러스 시스템에서 발현시켜 얻은 재조합 DMα로 면역시킨 마우스를 척추탈골로 안락사시킨 후, 비장을 적출하여 비장세포 1.4×107세포를 고함량 글루코스의 DMEM 배지 10㎖에 부유시켰다. 그런 다음, 마우스 골수종양세포 : SP2/0 세포(Sp2/0-Ag14 KTCC CRL1581) 3×106세포와 혼합한 후, 고함량 글루코스의 DMEM 배지로 세척하였고, 얻은 침전물에 50%의 PEG-4000 용액(GIBCO/BRL) 1㎖을 1분 동안 서서히 첨가하여 세포융합을 유도하였다. 고함량 글루코스의 DMEM 배지를 1㎖/분의 속도로 서서히 첨가하여 세포들을 잘 섞었다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 세포 펠렛을 1×DMEM20%5㎖에 분산시켰고, 영양공급세포(feeder cell){Antibody Lab. Manual ed. H. D. Lane, p220, 1989}가 배양되어 있는 플레이트에 웰당 50㎕씩 분주하여 하루동안 배양하였다. 그후 2×HAT 배지를 동량 첨가하여 장기간 배양하면서 융합된 세포만을 선발하였다. 본 실험을 통해 18개의 웰에서 HAT 배지에서 살아남아서 집락을 형성한 하이브리도마 세포를 얻었다.Mice immunized with the recombinant DMa expressed in the baculovirus system in Example 7 were euthanized by spinal dislocation, and the spleen was excised and 1.4 x 10 &lt; 7 &gt; cells of spleen cells were suspended in 10 ml of high-glucose DMEM medium. Then, the cells were mixed with 3 × 10 6 cells of mouse bone marrow tumor cells: SP2 / 0 cells (Sp2 / 0-Ag14 KTCC CRL1581), washed with a DMEM medium containing high glucose, and 50% PEG-4000 Solution (GIBCO / BRL) was added slowly for 1 minute to induce cell fusion. The DMEM medium of high-content glucose was slowly added at a rate of 1 ml / min to mix the cells well. The supernatant was removed by centrifugation, and the cell pellet was dispersed in 5 ml of 1x DMEM 20% , and the cells were treated with a feeder cell (Antibody Lab. Manual ed. HD Lane, p220, 1989) was cultured for one day. Then, the same amount of 2 × HAT medium was added, followed by long-term culture, and only fused cells were selected. In this experiment, hybridoma cells that survived in HAT medium and formed colonies in 18 wells were obtained.

<실시예 11>DMα와 반응하는 단클론 항체 탐색 : Example 11 : Detection of monoclonal antibodies reacting with DMa:

실시예 10에서 수획한 18개 집락을 각각 다량 배양하여, 상청액을 ELISA법, 도트 면역블럿법(dot immunoblot) 및 웨스턴 블럿법으로 분석하였다.The 18 colonies harvested in Example 10 were each mass-cultured, and the supernatant was analyzed by ELISA, dot immunoblot and Western blotting.

실시예 3 및 6에서 제조한 DMα 단백질을 96-웰 플레이트 각각에 최종농도가 0.5㎍/㎖로 되도록 분주하였고, 4℃에서 하루밤 방치하여 코팅한 후, 0.05%의 트윈 20을 인산완충액에 녹인 용액 100㎕를 첨가하여 2회 세척하였다. 1%의 탈지유액(0.02%의 NaN3가 첨가된 3차 증류수에 녹임)을 90㎕/웰로 채우고 37℃에서 1시간 방치한 후, 실시예 7의 항혈청 용액으로 37℃에서 1시간 반응시켰다. 세척 후, 2차 항체(염소-항-마우스-IgG-AP : 1/1000 희석액)를 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 2회 세척 후, 알칼리성 포스파타제 기질용액{p-니트로페닐 포스페이트 1㎎를 10%의 디에탄올아민 완충액(디에탄올아민 97㎖, NaN30.2g(0.02%), MgCl2·6H2O 100㎎(0.01%) in DDW 800㎖/총 1ℓ) 1㎖에 혼합한 것} 50㎕씩을 넣고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 완료후, ELISA 판독기로 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 웨스턴 블럿은 실시예 8에서와 동일한 방법으로 수행하였으며, 도트 면역블럿은 Kim 등(Kimet al.,Mol. Cells,6, 684, 1996)의 방법으로 시행하였다.DMα proteins prepared in Examples 3 and 6 were dispensed into each of the 96-well plates to a final concentration of 0.5 μg / ml, allowed to stand overnight at 4 ° C., coated with 0.05% Tween 20 in phosphate buffer Was added and washed twice. (Melting of the of the 0.02% NaN 3 was added the distilled water), 1% skim latex of the 90㎕ / well of filling which was reacted for 1 hour at After standing for 1 hour at 37 ℃, 37 ℃ the antiserum solution of Example 7. After washing, secondary antibody (chlorine-anti-mouse-IgG-AP: 1/1000 dilution) was added and reacted at 37 ° C for 2 hours. After washing twice, 1 mg of alkaline phosphatase substrate solution { p -nitrophenyl phosphate was added to 10% of diethanolamine buffer (97 ml of diethanolamine, 0.2 g (0.02%) of NaN 3 , 100 mg of MgCl 2 .6H 2 O 0.01% in DDW 800 ml / total 1 L) was added to each well, followed by reaction at 37 캜 for 30 minutes. After completion of the reaction, the absorbance was measured at 405 nm with an ELISA reader. Western blots were performed in the same manner as in Example 8, and dot immunoblots were performed by the method of Kim et al . (Kim et al ., Mol. Cells, 6, 684, 1996).

이상의 실험 결과를 종합하여 표 1에 나타내었다. 표 1에서 단클론 항체와 대장균 및 배큘로바이러스 시스템에서 발현된 재조합 DMα 단백질과의 반응은 ELISA법 및 웨스턴 블럿법으로 조사하였으며, 그외 여러 세포와의 반응성은 도트 면역블럿법 및 웨스턴 블럿법으로 조사하였다.Table 1 summarizes the above experimental results. In Table 1, the reaction of the monoclonal antibody with the recombinant DMα protein expressed in E. coli and the baculovirus system was examined by ELISA and Western blotting, and the reactivity with other cells was examined by dot immunoblotting and Western blotting .

DMα에 대한 단클론 항체의 결합능Binding Ability of Monoclonal Antibody to DMα 항원항체Antigen antibody 재조합 DMα 단백질Recombinant DMα protein 세포cell E. coliE. coli High-5High-5 PBLPBL T 세포T cell B 세포B cells MCMC DCDC RajiRaji DMα pAbDMa pAb ++++++++ ++++++++ ++ -- ±± -- ++++ ++++ 1-1-H1-1-H ++++ -- ±± -- -- -- -- -- 1-3-A1-3-A ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- 1-8-G1-8-G ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- 1-10-A1-10-A ++++++ ++ -- -- -- -- -- -- 1-11-E1-11-E ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- 2-11-G2-11-G ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- 2-12-A2-12-A ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- 3-4-B3-4-B ++++++ -- -- -- -- -- -- -- 3-5-B3-5-B ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- 3-6-A3-6-A ++++++++ ++++++ ++ -- ±± -- ++++++ ++++++ 4-1-C4-1-C ++++ -- -- -- -- -- -- -- 4-2-B4-2-B ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- 5-3-G5-3-G ++++++ -- -- -- -- -- -- -- 5-5-D5-5-D ++++++++ -- -- -- -- -- -- -- (주) 결합능(binding capacity)은 ELISA법, 도트 면역블럿법 및 웨스턴 블럿법으로 측정하였다.- : 결과가 음성대조군과 유사한 경우,+ : ELISA법에서는,표준편차의 5배 이상이 될 때를 기점으로 405㎚에서의 흡광도가 0.2 증가할 때마다 부호의 개수를 추가하였으며, 부호가 4개 이상인 것은 동일하게 "++++"로 표시,웨스턴 블럿법 및 도트 면역블럿법에서는,상대적인 값으로 시그널이 분명하고 반복되는 경우를 표시하였으며, 상대적인 강도의 증가에 따라 부호의 개수를 추가,± : 시그널이 너무 약하거나 결과가 반복되지 않은 경우.The binding capacity was measured by ELISA, dot immunoblotting and Western blotting. -: When the result was similar to the negative control, +: ELISA method was used when the standard deviation was 5 times or more When the absorbance at 405 nm is increased by 0.2 as the starting point, the number of codes is added, and when the number of codes is 4 or more, it is represented by "++++". In the case of the Western blot method and the dot immunoblot method, If the signal is clear and repetitive, the number of signs is added as the relative strength increases. ±: The signal is too weak or the result is not repeated.

이상의 실험 결과에 따르면, 14개의 단클론 항체 모두 대장균에서 발현된 재조합 DMα와는 강한 반응력을 보였으나, High-5 세포에서 발현된 DMα에는 단클론 항체 3-6-A를 제외하고는 거의 반응하지 않았다.These results show that all 14 monoclonal antibodies showed a strong reaction with recombinant DMa expressed in Escherichia coli but did not react with DMa expressed in High-5 cells except monoclonal antibody 3-6-A.

단클론 항체 3-6-A는 웨스턴 블럿 및 도트 면역블럿 실험에서 PBL 중 DC와 강하게 반응하였으며, 또한 웨스턴 블럿 실험에서는 Raji 세포와 강한 반응성을 보였다. 또, 웨스턴 블럿 실험에서 B 세포 분획에서 가끔씩 약한 양성반응을 보이기도 하였는데, 이는 아마도 활성화된 B 세포가 세포내에서 DM을 발현하기 때문인 것으로 생각된다.Monoclonal antibody 3-6-A reacted strongly with DC in PBL in western blot and dot immunoblot experiments and also showed strong reactivity with Raji cells in Western blot experiments. In Western blot experiments, the B cell fraction sometimes showed a weak positive reaction, presumably because the activated B cells expressed DM in the cells.

이러한 결과를 종합하여 14개의 단클론 항체 중 3-6-A를 DMα에 대한 단클론 항체로 선발하였고, 이를 발현하는 하이브리도마 세포 KHB-DM을 1998년 5월 29일자로 한국 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC-0485BP로 기탁하였다.These results are summarized as follows. Among the 14 monoclonal antibodies, 3-6-A was selected as a monoclonal antibody against DMα, and the hybridoma cell KHB-DM expressing it was deposited on May 29, 1998, Deposited under accession number KCTC-0485BP.

<실시예 12>단클론 항체 3-6-A의 세포에서 발현되는 DMα와의 반응성 확인 : Example 12 Confirmation of reactivity with mAb expressed in cells of monoclonal antibody 3-6-A:

단클론 항체 3-6-A를 이용하여, 재조합 DMα, 및 Raji 세포 및 DC에서 정상적으로 발현되는 DMα를 대상으로 웨스턴블럿을 실시하였다(도 6).Using monoclonal antibody 3-6-A, Western blot was performed on recombinant DMa, and DMa normally expressed in Raji cells and DC (Fig. 6).

이상의 실험 결과로부터 단클론 항체 3-6-A가 Raji 세포 및 DC에서 정상적으로 발현되는 34KDa의 DMα와 잘 반응함을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that the mAb 3-6-A reacts well with Raji cells and 34 kDa DMα normally expressed in DCs.

<실시예 13>단글론 항체 3-6-A의 대량 생산 : Example 13 Mass Production of Monoliter Antibody 3-6-A:

하이브리도마 세포 KHB-DM을 2×105세포/㎖로 고함량 글루코스의 DMEM20%배지에서 배양하여 4일후 세포가 최대로 자랐을 때 상등액을 수거하여 단클론 항체 3-6-A 공급원으로 사용하였다. 이때 상등액에 함유된 단클론 항체는 배지 1㎖당 약40㎍ 정도로 추정된다.Hybridoma cells KHB-DM was cultured in DMEM 20% medium containing glucose at a high concentration of 2 × 10 5 cells / ml. After 4 days, when the cells were maximally grown, the supernatant was collected and used as a monoclonal antibody 3-6-A source . At this time, the monoclonal antibody contained in the supernatant is estimated to be about 40 μg per 1 ml of medium.

또한, 대량으로 단클론 항체를 생산하기 위해, BALB/c 마우스의 복강에 프리스테인(pristane) 1㎖을 주사한 다음, 1주후 마우스당 하이브리도마 세포 5×106세포를 주입하였다. 10일후, 복수가 차서 복강이 부풀어 올랐을 때 주사기로 복수를 채취하여(마리당 10㎖ 정도), 1,500rpm에서 10분간 원침시켰다. 얻은 상등액에 0.02%의 NaN3를 첨가한 후 -70℃의 초저온 냉장고에 보관하였다가 필요시 사용하였다. 마우스에서 채취한 복수에서는 1~9㎎/㎖ 정도의 단클론 항체를 수획하였다.In order to produce a large amount of monoclonal antibody, 1 ml of pristane was injected into peritoneal cavity of BALB / c mice, and after 1 week, 5 × 10 6 cells of hybridoma cells were injected per mouse. After 10 days, when the abdominal cavity was swollen due to repercussions, the ascites was collected with a syringe (about 10 ml per flask), and then subjected to centrifugation at 1,500 rpm for 10 minutes. To the supernatant, 0.02% NaN 3 was added and stored in an ultra-low temperature refrigerator at -70 ° C. A monoclonal antibody of about 1 to 9 mg / ml was collected from a mouse.

<실시예 14>단클론 항체 3-6-A의 H사슬은 IgG1이며, L사슬은 κ이다 : &Lt; Example 14 > The H chain of monoclonal antibody 3-6-A is IgG1, and the L chain is kappa:

실시예 11에서 선발한 하이브리도마 세포 KHB-DM이 생산하는 단클론 항체 3-6-A의 이소타입(isotype)을 단클론 항체 이소타이핑 킷트 IsoStripTM(Boehringer Mannheim사 제품)를 이용하여 분석하였다.The isotype of the monoclonal antibody 3-6-A produced by the hybridoma cell KHB-DM selected in Example 11 was analyzed using a monoclonal antibody isotyping kit IsoStrip TM (manufactured by Boehringer Mannheim).

공급회사의 매뉴얼에 따라 이소타입을 조사한 바 H사슬의 이소타입은 IgG1이며, L사슬은 κ임을 알았다.The isotype of the H chain was IgG1, and the L chain was found to be κ according to the supplier's manual.

<실시예 15>단클론 항체 3-6-A는 PBL 세포중 DC만을 특이하게 염색한다 : Example 15 Monoclonal antibody 3-6-A specifically stained only DCs among PBL cells:

현미경용 슬라이드 글라스를 1㎎/㎖의 폴리-L-리신(MW 400,000) 용액으로 15분간 코팅하고, 증류수로 세척하여 코팅 슬라이드로 사용하였다.The slide glass for microscope was coated with 1 mg / ml poly-L-lysine (MW 400,000) solution for 15 minutes and washed with distilled water to use as a coating slide.

Raji 세포(ATCC CCL86)와 실시예 1의 방법으로 분리한 T 세포, B 세포, 단핵세포, DC 각각을 105세포/㎖로 희석하여 코팅 슬라이드에 부착하고, 인산완충액으로 세척한 다음, 세포를 유기용매(50%의 메탄올+50%의 아세톤)에 약 2분간 담구어 세포를 고정시키고, 이를 인산완충액으로 2회 세척한 후, 실시예 13에서 수획한 단클론 항체(배양 상등액) 100㎕를 첨가하고, CO2배양기에서 1시간 방치한 다음, 인산완충액으로 3회 세척하고, 2차 항체로 항-마우스-IgG-FITC를 첨가하여 37℃, CO2배양기에서 30분동안 반응시키고, 인산완충액으로 다시 세척한 다음, 커버 글라스를 덮어 형광현미경(Nikon E-600 Epi-형광현미경)으로 관찰하였다.Raji cells (ATCC CCL86) and T cells, B cells, mononuclear cells, and DCs separated by the method of Example 1 were diluted to 10 5 cells / ml, attached to a coated slide, washed with phosphate buffer, After immersing the cells in an organic solvent (50% methanol + 50% acetone) for about 2 minutes, the cells were washed twice with phosphate buffer, and 100 μl of the monoclonal antibody (culture supernatant) collected in Example 13 was added , And incubated for 1 hour in a CO 2 incubator. Then, the cells were washed three times with phosphate buffer, and anti-mouse-IgG-FITC was added as a secondary antibody. The cells were incubated at 37 ° C for 30 minutes in a CO 2 incubator. After washing, the cover glass was covered and observed with a fluorescence microscope (Nikon E-600 Epi-fluorescence microscope).

이상의 실험결과 도 7에서 보는 바와 같이, DMα는 PBL 중 오직 DC에서만 발현되고(도 7의 D), T 세포, B 세포, 단핵 및 대식세포에서는 발현되지 않는 것을 확인하였으며 (각각 도 7의 A, B, C), 양성 대조군으로 사용한 Raji 세포도 역시 세포내에 다량의 DMα가 발현되고 있음을 확인하였다(도 7의 E). 그러나, Raji 세포의 경우 세포를 유기용매로 고정하지 않았을 경우에는 세포 표면이 단클론 항체 3-6-A로 전혀 염색되지 않음을 발견하였다(도 7의 F). 이러한 결과는 Raji 세포에서 DM 분자가 세포내에서는 다량 발현되나, 세포 표면에는 나타나지 않는다는 기존의 연구발표와 일치한다(Karlssonet al., Science266 : 1569-1573, 1994 ; Sandersonet al., Science266:1566-1569, 1994).As shown in FIG. 7, DMα was expressed only in DC among PBLs (FIG. 7D) and was not expressed in T cells, B cells, mononuclear cells and macrophages (FIGS. 7A, B, C), and Raji cells used as a positive control group also had a large amount of DMα expressed therein (FIG. 7E). However, in the case of Raji cells, it was found that the cell surface was not stained with monoclonal antibody 3-6-A at all when the cells were not immobilized with an organic solvent (Fig. 7F). These results are consistent with previous reports that DM molecules are expressed intensely in cells but not on cell surfaces in Raji cells (Karlsson et al., Science 266: 1569-1573, 1994; Sanderson et al., Science 266 : 1566-1569,1994).

<실시예 16>단클론 항체 3-6-A의 DC 표면항원에의 특이성 확인 : Example 16 Identification of Monoclonal Antibody 3-6-A to DC Surface Antigens:

실시예 1의 방법으로 분리한 T 세포, B 세포, 단핵세포, DC 각각을 105세포/㎖로 인산완충액으로 희석하고, 실시예 13에서 수획한 단클론 항체(배양 상등액) 100㎕를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시켰다. 750g에서 원침하여 상등액을 제거한 후, 인산완충액으로 2회 세척한 다음, 인산완충액 200㎕에 부유시키고, 2차 항체로 항-마우스-IgG-FITC(Sigma사) 10㎕(1㎍)를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시켰다. 원침하여 세포를 인산완충액으로 2회 세척한 다음, 코팅 슬라이드에 부착하여 실시예 15에서 사용한 형광현미경으로 관찰하였다.Each of the T cells, B cells, mononuclear cells, and DCs isolated by the method of Example 1 was diluted with phosphate buffer to 10 5 cells / ml, and 100 μl of the monoclonal antibody (culture supernatant) collected in Example 13 was added thereto to prepare 4 Lt; 0 &gt; C for 30 minutes. The supernatant was decanted from 750 g, washed twice with phosphate buffer, suspended in 200 μl of phosphate buffer, and 10 μl (1 μg) of anti-mouse-IgG-FITC (Sigma) as a secondary antibody was added The reaction was carried out at 4 ° C for 30 minutes. The cells were washed twice with phosphate buffer solution and then attached to a coating slide, and observed with a fluorescence microscope used in Example 15.

도 8에서 컬럼 1, 2, 3, 4는 각각 T 세포, B 세포, 단핵세포 및 DC를, 상품화되어있는 여러 단클론 항체와 본 발명의 단클론 항체 3-6-A로 반응시킨 후, 1차 항체가 형광으로 표지되어 있는(항-CD83-PE) 4개의 시료를 제외하고는 모두 FITC로 표지된 2차 항체로 염색시킨 시료이다.In FIG. 8, columns 1, 2, 3 and 4 respectively show T cells, B cells, mononuclear cells and DCs reacted with several commercially available monoclonal antibodies and the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention, (Anti-CD83-PE) labeled with fluorescence were all stained with secondary antibody labeled with FITC.

도 8의 맨 아래쪽 사진에서 보는 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체 3-6-A는 DC 표면에만 매우 강하게 반응하는 반면, 다른 면역세포들과는 거의 반응하지 않음을 알 수 있으며, DMα가 1차 면역세포들 중에서 오직 DC에서만 특이하게 발현되며, 세포내 뿐만 아니라 세포 표면에서도 상당량 발현된다는 새로운 사실을 발견하게 되었다.8, it can be seen that the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention reacts very strongly only on the DC surface, while it hardly reacts with other immune cells, and DMα acts as a primary immune cell , Which is expressed specifically only in DC, and is expressed in large amounts on the cell surface as well as in the cell.

이와는 달리, DC에 특이하게 반응하는 것으로 알려진 CD11c 또는 CD83에 대한 항체는 특이성이 낮아 DC 뿐만 아니라 B 세포나 단핵세포와도 강하게 반응하며, 특히 활성화된 DC에서만 발현되는 것으로 알려진 CD83의 경우(Zhou L.J.,J Immunol.149, 735, 1992), 이에 대한 단클론 항체(항-CD83; Immunotech Co.)가 비활성 상태의 DC 뿐만 아니라 단핵세포와도 비록 약하기는 하지만 비슷한 정도의 친화력을 보였다. DC에만 특이하게 발현되는 것으로 알려진 F-actin(Yamashiro-Matsumuraet al., J. Biol. Chem., 260, 5087, 1985)은 세포내에만 존재하는 분자로 고정하지 않은 DC는 전혀 인식하지 못하였다.In contrast, antibodies against CD11c or CD83, which are known to specifically react to DCs, respond strongly to B cells or mononuclear cells as well as DCs with low specificity, particularly in the case of CD83, which is known to be expressed only in activated DCs (Zhou LJ , J Immunol., 149, 735, 1992), and the monoclonal antibody (anti-CD83; Immunotech Co.) showed similar affinities to monocytes as well as inactive DCs. F-actin (Yamashiro-Matsumura et al., J. Biol. Chem ., 260, 5087, 1985), which is known to be specifically expressed only in DC, .

이러한 결과로부터 본 발명의 단클론 항체 3-6-A는 기존의 어떤 단클론 항체보다도 DC에 특이성이 높고 친화력이 강한 것을 다시 한번 확인하였다.From these results, it was confirmed once again that the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention has higher specificity for DC and strong affinity than any existing monoclonal antibody.

<실시예 17>단클론 항체 3-6-A의 DC에 대한 반응력 확인 : Example 17 Confirmation of the reactivity of monoclonal antibody 3-6-A against DC:

본 발명의 단클론 항체 3-6-A의 DC에 대한 반응력을, DC와 반응한다고 알려진 기존의 단클론 항체들과 비교하였다.The reactivity of the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention against DC was compared with conventional monoclonal antibodies known to react with DC.

실시예 1의 방법으로 DC를 순수분리하여 기존의 상품화된 단클론 항체들과 본 발명의 단클론 항체 3-6-A로 도트 면역블럿 실험(Kimet al.,Mol. Cells, 6, 684, 1996)을 실시하였다.(Kim et al ., Mol. Cells , 6, 684, 1996) with conventional commercialized monoclonal antibodies and the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention by pure separation of DCs by the method of Example 1, Respectively.

CD1a, CD11c에 대한 단클론 항체(Becton-Dickinson사 제품), CD83에 대한 단클론 항체(Immunotech. Co.), 및 F-actin 분자에 대한 단클론 항체(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program로부터 공급받음)와, 본 발명의 단클론 항체 3-6-A를 각각 1㎍씩, 실시예 1의 방법으로 순수 분리한 105개의 DC와 실시예 15의 방법으로 반응시켰다.Monoclonal antibody (supplied from NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) to monoclonal antibody (Becton-Dickinson) for CD1a, CD11c, monoclonal antibody against CD83 (Immunotech. Each 1 단 of the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention was reacted with 10 5 DCs purely isolated by the method of Example 1 by the method of Example 15.

1차 항체와 반응한 세포를 알칼리성 포스파타제로 표지된 염소-항-마우스-IgG(Progema사 제품)로 실시예 15와 동일하게 반응시킨 다음, 세포를 니트로셀룰로스 막에 전사기(Bio-Rad사 제품)를 사용하여 옮기고, 실시예 8의 방법으로 효소 반응을 진행시켰다.Cells reacted with the primary antibody were reacted in the same manner as in Example 15 with chlorine-anti-mouse-IgG labeled with alkaline phosphatase (manufactured by Progema), and the cells were transferred to a nitrocellulose membrane using a transcription machine ), And the enzyme reaction was carried out by the method of Example 8. [

실시예 16의 실험결과와 동일하게, 단클론 항체 3-6-A가 DC와 가장 강한 반응을 나타내었으며(도 9의 반점 5), 그외 도 9의 반점 1, 2, 3, 4는 대조군으로 각각 CD1a, CD11c, CD83, F-actin에 대한 단클론 항체들을 DC와 반응시킨 것으로서, 단클론 항체 3-6-A 다음으로는 CD11c에 대한 항체가 DC와 강하게 반응하였다(도 9의 반점 2). 그러나, CD83 또는 F-actin에 대한 단클론 항체들은 비활성상태의 DC와는 거의 반응하지 않는 것으로 나타났다.As shown in the experimental results of Example 16, the monoclonal antibody 3-6-A showed the strongest reaction with DC (spot 5 in FIG. 9), and spots 1, 2, 3 and 4 in FIG. The monoclonal antibodies to CD1a, CD11c, CD83, and F-actin were reacted with DC. After monoclonal antibody 3-6-A, antibody against CD11c strongly reacted with DC (spot 2 in FIG. 9). However, monoclonal antibodies against CD83 or F-actin did not react with DC in an inactive state.

<실시예 18>&Lt; Example 18 >

실시예 1의 방법으로 분리한 1차 면역세포들 : T 세포, B 세포, 단핵세포 및 DC와, 단클론 항체 3-6-A를 4℃에서 30분간 반응시켰다. 인산완충액으로 2회 세척한 다음, 2차 항체로 염소-항-마우스-IgG-FITC(Sigma사)를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시키고, 다시 인산완충액으로 2회 세척한 후, 바로 FACStar 플러스(Becton-Dickinson)를 이용하여 분석하였다.Primary immune cells isolated by the method of Example 1: T cells, B cells, mononuclear cells and DC were reacted with monoclonal antibody 3-6-A at 4 ° C for 30 minutes. (Sigma) as a secondary antibody and reacted at 4 ° C for 30 minutes. Then, the cells were washed twice with phosphate buffer, and then treated with FACStar Plus (Becton-Dickinson).

도 10의 패널 A는 실시예 1의 방법으로 바로 분리한 세포들이고, 패널 B는 실시예 1의 PBL을 1주일간 1×107세포/㎖ 정도로 RPMI10%배지에서 배양한 후 실시예 1의 방법으로 순수분리한 각 세포들이다. 컬럼 1, 2, 3, 4는 각각 순수분리된 T세포, 단핵세포, B세포 및 DC를, 상술한 바와 같이 단클론 항체 3-6-A와 FITC로 표지된 2차 항체로 염색하여 FACS로 분석한 결과이다.Panel A of FIG. 10 is cells directly separated by the method of Example 1, Panel B is PBL of Example 1 and cultured in RPMI 10% medium at about 1 × 10 7 cells / ml for 1 week. , Respectively. Columns 1, 2, 3, and 4 were obtained by staining purely isolated T cells, mononuclear cells, B cells, and DC with a secondary antibody labeled with monoclonal antibody 3-6-A and FITC as described above and analyzed by FACS This is a result.

도 10의 컬럼 1, 2에서 보는 바와 같이, T 세포와 단핵(대식)세포는, 1차 분리한 경우 및 1주일간 배양한 후 분리한 경우 모두 단클론 항체 3-6-A와 반응하지 않았다.As shown in columns 1 and 2 of FIG. 10, T cells and mononuclear (macrophage) cells did not react with monoclonal antibody 3-6-A in the case of primary separation and separation after one week of culture.

B 세포는 1차 분리한 경우에는 전혀 반응하지 않았으나, 1주일간 배양한 후 분리한 경우에는 소량이기는 하지만 단클론 항체 3-6-A와 반응하는 세포들이 관찰되었다(도 10의 컬럼 3).B cells were not reacted at all in the first separation, but when they were separated after one week of culture, cells that react with the monoclonal antibody 3-6-A were observed (column 3 in FIG. 10).

순수분리한 DC 분획은 60% 이상의 세포들이 단클론 항체 3-6-A와 강하게 반응하였으며, 1차 분리한 경우 및 1주일간 배양한 후 분리한 경우 모두에서 반응에 별 차이가 없었다(도 10의 컬럼 4).In the pure DC fraction, more than 60% of the cells reacted strongly with the monoclonal antibody 3-6-A, and there was no significant difference in the responses in the case of the first separation and the separation after one week of culture (FIG. 10 4).

이상의 실험을 통해서도 본 발명의 단클론 항체 3-6-A가 DC에 특이하게 반응함을 다시 한번 확인하였다.Again, it was confirmed once again that the monoclonal antibody 3-6-A of the present invention specifically reacted with DC.

<비교실시예 1>&Lt; Comparative Example 1 >

각각의 항혈청(항-DMα-폴리클로날 항체)을 1차 항체로 사용하여 재조합 DMα와 Raji 세포에서 발현되는 DMα를 웨스턴 블럿법으로 조사하였다.DMα expressed in recombinant DMα and Raji cells was examined by Western blotting using each antiserum (anti-DMa-polyclonal antibody) as the primary antibody.

대장균에서 발현된 DMα로 면역시킨 마우스에서 얻은 항혈청은, 대장균에서 발현된 재조합 DMα는 잘 인식하였으나, Raji 세포에서 발현되는 정상적인 DMα 단백질은 제대로 인식하지 못하였다. 반면, 배큘로바이러스 시스템에서 발현된 DMα로 면역시켜 얻은 항혈청은, 재조합 DMα 뿐만 아니라 Raji 세포에서 발현되는 정상적인 DMα와도 잘 반응하였다.The recombinant DMα expressed in Escherichia coli was well recognized, but the normal DMα protein expressed in Raji cells was not recognized properly. On the other hand, the antiserum obtained by immunization with DMα expressed in baculovirus system reacted well with recombinant DMα as well as normal DMα expressed in Raji cells.

이는, 대장균에서 발현되는 재조합 DMα는 정상적인 DMα와 항원성에서 상당한 차이가 있는 반면, 배큘로바이러스 시스템에서 발현되는 재조합 DMα 단백질은 Raji 세포 또는 DC에서 발현되는 정상적인 DMα의 항원성을 유지하고 있음을 시사해 준다. 이러한 이유 때문에 Kim 등(Kimet al.,Mol. Cells,6, 684, 1996)은 대장균에서 발현시킨 DMα 단백질로 정상적인 DMα와 반응하는 단클론 항체를 생산하지 못한 것으로 판단된다.This suggests that recombinant DMa expressed in Escherichia coli has a significant difference in antigenicity from normal DMa, whereas recombinant DMa protein expressed in baculovirus system maintains normal DMa antigenicity expressed in Raji cells or DC Do it. For this reason, Kim et al . (Kim et al ., Mol. Cells, 6, 684, 1996) were found to be unable to produce monoclonal antibodies that normally react with DMα, expressed in Escherichia coli.

본 발명의 단클론 항체 3-6-A는 DC 및 Raji 세포에서 발현되는 정상적인 DMα에 대하여 강한 반응성을 나타내며, 1차 면역 세포들 중에서 오직 DC에만 특이하게 반응하고, 세포질 뿐만 아니라 DC 표면도 매우 강하게 염색시킨다.The monoclonal antibody 3-6-A of the present invention shows strong reactivity to normal DMa expressed in DC and Raji cells, and reacts specifically with only DC among the primary immune cells, and strongly stains not only the cytoplasm but also the DC surface .

본 발명의 단클론 항체 3-6-A는 PBL 중 DC 표면에 발현되는 DM 분자를 탐색하고, DC에서 DM 분자의 기능을 연구하는데 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 PBL 세포들 중에서 DC를 양성 선별하는데 사용될 수 있다.The monoclonal antibody 3-6-A of the present invention can be used to search for DM molecules expressed on the DC surface of PBLs and to study the function of DM molecules in DCs, as well as to select positive DCs among PBL cells have.

Claims (4)

하이브리도마 세포 KHB-DM(KCTC-0485BP)에 의해 생산되는, 1차 면역세포중 덴드리틱 세포(dendritic cell : DC) 표면에 특이하게 작용하는 단클론 항체 3-6-A.A monoclonal antibody 3-6-A, which specifically acts on the surface of a dendritic cell (DC) in primary immunocytes, produced by hybridoma cells KHB-DM (KCTC-0485BP). 단클론 항체 3-6-A를 생산하는 하이브리도마 세포 KHB-DM(KCTC-0485BP).Hybridoma cells KHB-DM (KCTC-0485BP) producing monoclonal antibody 3-6-A. DMα 유전자의 막 바깥쪽 영역(extracellular region)(핵산서열 122-732)을 코딩하는 609bp의 DNA 단편을 함유한, 재조합 플라스미드 pBlueBacHis2A-DMα.The recombinant plasmid pBlueBacHis2A-DM alpha, containing a 609 bp DNA fragment encoding the extracellular region of the DMa gene (nucleic acid sequence 122-732). 제 3항의 재조합 플라스미드 pBlueBacHis2A-DMα와 배큘로바이러스 전장(full-length) DNA Bac-N-Blue를 High-5 세포에 공동-형질감염시켜 얻은 재조합 배큘로바이러스 Bac-N-Blue-DMα.Recombinant baculovirus Bac-N-Blue-DM? Obtained by co-transfecting the recombinant plasmid pBlueBacHis2A-DM? Of claim 3 and baculovirus full-length DNA Bac-N-Blue into High-5 cells.
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