KR100240159B1 - 당단백질 gpiib/iiia와 반응성인 사람화된 면역글로불린 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 NDA 기술로 제조되는 GPII_b/III_a단백질과 특이적으로 반응하는 인간화 면역글로불린 및, 예를 들어, 혈전과 관련된 여러가지 질환을 치료하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

당단백질 GPII_b/III_a와 반응성인 사람화된 면역글로불린

[기술 분야]

본 발명은 일반적으로, 신규한 생물학적 제제의 개발을 위한 보다 특히는, 예를 들어 당단백질 GPII_b/III_a항원에 특이적인 비-면역원성(사람에서) 면역글로불린을 제조하기 위한 재조합 DNA 및 모노클로날 항체 기술의 조합과 시험관내 및 생체내에서 이의 용도에 관한 것이다

[배경 기술]

심장혈관 질환은 선진국에서 사망 및 불구를 유발시키는 질환이다. 동맥경화 또는 동맥의 협소화 및 경화가 심장혈관 질환의 주된 요인이다. 동맥혈전증, 즉 혈병 또는 혈전 생성은 동맥경화증에 걸린 동맥에서, 특히 혈관벽에 형성된 플라그내에 열개가 발생할 때 나타난다. 관상동맥내에서 혈전의 형성은 혈관벽 차단이 계속될 때 급성 심근경색(심장마비)을, 또한 차단이 일시적일 경우에는 불안정한 앙기나(angina)를 일으킨다. 대뇌동맥에서의 혈전은 발작 또는 일시적인 허혈성 쇼크를 일으킨다. 동맥 혈전은 단백질 피브린과 혈소판의 응집물로 구성되어 있다.

당단백질 GPII_b/III_a는 혈소판의 표면상에서 관찰되며 이들의 응집 및 그로인한 혈전 형성에 주된 역할을 한다[참조 : 일반적으로는 본원에서 참고로 인용되고 있는, Phillips et al., Blood, 71, 831(1988)]. GPII_b/III_a복합체는, 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결된 장쇄(분자량=125kDa)와 단쇄(분자량=25kDa)로 이루어진 GPII_b(분자량은 140kDa) 1분자 및 1분자의 GPIII_a(분자량=105kDa)로 구성되어 있으며, 이 복합체는 폴리펩타이드 일 본쇄이다. GPII_b/III_a의 헤테로이량체 구조를 유지하기 위해서는 Ca²⁺이온이 요구되며, 이것은 접착 분자의 인테그린족(integrin family)의 구성원이다. 혈소판이 트롬핀, 아데노신 디포스페이트(ADP) 또는 에피네프린과 같은 생리학적 효능제에 의해 활성화되면, 혈소판의 표면상에 있는 GPII_b/III_a분자의 구조 또는 환경이 변경되어 GPII_b/III_a가 혈청 단백질 피브리노겐에 결합할 수 있게 한다. 이 피브리노겐은 혈소판과 가교 결합하여 응집물을 형성하게 한다. GPII_b/III_a는 또한 접착성 단백질 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 및 비트로넥틴에 대한 수용체이므로, 손상된 혈관의 내피 아래조직상에서 혈소판이 점착 및 확산되는 것에 기여한다.

GPII_b/III_a에 결합하여 피브리노겐과 결합하는 이들의 활성을 차단시키는 다수의 모노클로날 항체가 개발된 바 있다. 이러한 항체에는 마우스 모노클로날 항체 10E5[참조 : Coller et al., J. Clin. Invest., 72, 325(1983)], 마우스 모노클로날 항체 AP-2[참조 : Pidard et al., J.Biol. Chem., 258, 12582(1983)] 및 마우스 모느클로날 항체 7E3[참조 : Coller, J. Clin. Invest., 76, 101(1985), 이는 본원에서 참고로 인용되고 있다] 및 본원에서 기술되고 있는 C4G1이 포함된다. 피브리노겐 결합을 차단함으로써, 이들 항체들은 ADP와 같은 효능제에 반응하여 시험관내에서 혈소판의 응집을 억제한다. 따라서, 항-GPII_b/III_a항체는 추가의 혈소판 응집을 억제시킴으로써 혈전 형성을 억제한다. 실제로, 7E3 항체를 사용한 처리는, 특히 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)와 함께 투여할 경우 개과의 관상동맥 혈전증 모델에서 관상 동맥의 재소통에 기여하는 것으로 밝혀졌다[참조 : Gold et al., Circulation, 77, 670(1988)].

불행하게도, 7E3 또는 C4G1과 같은 비-사람 모노클로날 항체의 사용은 사람의 치료에, 특히 하기 설명하는 바와 같은 반복된 치료 방법에서 모종의 결점을 갖게 된다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체는 사람 체내에서의 반감기가 짧은 경향이 있으며 사람을 대상으로 사용할 때 다른 중요한 면역 글로불린 기능적 특성을 결핍하고 있다.

아마도 보다 결정적으로, 비-사람 모노클로날 항체는 사람 환자에게 주입될 때 면역원성일 수 있는 실질적인 아미노산 서열의 범위를 함유한다. 많은 연구들에서 외래 항체가 주입된 후, 항체에 대해 환자에게서 유발되는 면역 반응은 대단히 강력할 수 있으며, 필수적으로 최초 처리후에는 항체의 치료적 효용성을 제거시킴을 보여주었다. 게다가, 증가추세의 상이한 마우스 또는 다른(사람에 대한) 항원성 모노클로날 항체가 여러가지 질환을 치료하기 위해 개발될 것으로 여겨지기 때문에, 어떠한 상이한 비-사람 항체를 사용한 최초 또는 수회의 처리 및 관련되지 않은 치료요법에 대한 추후의 처리등은 비효능적이거나 또는 심지어, 교차-반응성 때문에, 그 자체로서 위험할 수 있다.

소위 "키메라 항체"(예를 들어 사람 고정 영역에 결합시킨 마우스 가변영역)의 제조는, 중요한 해결되지 않고 있던 면역원성 문제인, 외래 항체에 대한 전술한 반응성을 제거하는데 어느 정도 성공적인 것으로 입증된 바 있다. 일반적으로, 다수의 항원에 대한 것과 같이, 통상적인 사람 모노클로날 항체 제조술을 사용하여 높은 친화도로 GPII_b/III_a항원과 반응하는 사람 면역글로불린을 제조하는 것은 극히 어렵다. 아직까지 혈소판의 응집을 억제할 수 있으면서 치료제로서 혈전증의 치료에 유용한 사람 면역글로불린에 관한 정보는 없다. 마찬가지로, 소위 "사람화" 또는 "재조형한(reshaped)" 항체를 제조하기 위한 재조합 DNA 기술의 활용[참조 : Riechmann et al., Nature, 332, 323(1988) 및 EPO 공개공보 제 0 239 400호, 본원에서 참고로 인용된다]은, 부분적으로는 예측할 수 없는 결합 친화도 때문에 불확실한 결과를 제공한다.

따라서, 실질적으로 사람에게서 비-면역원성이며 치료학적 제형 및 다른 용도에 적합한 방법에 의해 용이하고도 경제적으로 제조되는 GPII_b/III_a항원에 대해 특이적인, 개선된 형태의 사람화된 면역글로불린이 요구된다. 본 발명은 이같은 필요성 및 다른 요구조건을 충족시킨다.

[발명의 기술]

본 발명은, 예를 들어 동맥 혈전증과 관련된 사람 질환의 치료에 유용한 신규한 조성물, 다시 말해서, GPII_b/III_a항원에 특이적으로 결합할 수 있는 사람화된 면역글로불린을 함유하는 조성물을 제공한다. 이 면역글로불린은 2쌍의 경쇄/중쇄 복합체를 포함할 수 있으며, 적어도 하나의 쇄는 사람 주쇄 영역 단편에 기능적으로 결합된 하나 이상의 마우스 상보성 결정영역(CDR : complememtarity determining region)을 포함한다. 예를 들어, 추가의 자연적으로-연관된 마우스 아미노산 잔기가 있거나 또는 없이, 마우스 상보성 결정 영역을 사람 주쇄 영역내로 도입시켜 약 10⁷m^-1보다 강한 친화도 수준에서 GPII_b/III_a항원과 결합할 수 있는 사람화된 면역글로불린을 제조할 수 있다. 이러한 사람화된 면역글로불린은 또한 GPII_b/III_a에 대한 CDR이 제공하는 마우스 모노클로날 항체의 결합을 차단할 수도 있다.

결합 단편 및 이의 다른 유도체를 포함한 본 발명의 면역글로불린은, 형질감염된 세포, 바람직하게는 죽지않는 진핵세포, 예를 들어, 골수종 또는 하이브리도마 세포내에서의 궁극적 발현과 함께, 여러가지 재조합 DNA 기술로 용이하게 제조할 수 있다. 사람화된 면역글로불린 주쇄 영역을 암호화하는 제1서열 및 목적하는 면역글로불린 상보성 결정 영역을 암호화하는 제2서열 세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 합성에 의해 또는 적절한 cDNA 및 게놈성 DNA 단편을 결합시킴에 의해 제조할 수 있다.

사람화된 면역글로불린은 실질적으로 순수한 형태로써 단독으로 또는 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 혈전에 대해 활성인 아스피린과 같은 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이들 화합물 모두는 급성 심근경색, 불안정한 앙기나, 발작 및 기타 혈소판-중재된 질환을 치료하는데 특히 유용할 것이다. 사람화된 면역글로불린 또는 이의 복합체는 약제학적으로 허용되는 용량 형태로 제조될 수 있으며, 이는 투여 방식에 따라 다양할 수 있다.

사람화된 면역글로불린은 또한, 사람 환자에 있어서, 혈전의 존재 및 위치를 진단하거나 또는 표면상에 GPII_b/III_a를 발생시키는 암세포의 특정 타입을 진단해내기 위한 용도로서 표지용 잔기와 함께 활용될 수도 있다. 이로써 제한되는 것은 아니지만, 이와 같은 표지용 잔기로는 라다오파크 염료(radiopaque dye), 방사선 콘트라스트 제제(radiocontrast agent), 형광성 분자, 스핀-표지된 분자, 효소 또는 특히 방사선의학적 또는 자기공명 이미지 기술에 있어 진단용으로 가치있는 다른 표지용 잔기가 포함된다.

[도면의 간단한 설명]

제1도. 중쇄 및 경쇄 가변영역 cDNA의 고정시킨 폴리머라제 쇄반응(PCR)에 대한 모식도. RNA는 뜨거운 페놀 추출법을 사용하여 약 10⁷하이브리도마 세포로부터 제조한다. 요약하면, 세포를 1ml의 RNA 추출용 완충액(50mM 나트륨아세테이트 pH 5.2/1% SDS)중에 재현탁하고 와동(vortex)시키고, 0.5ml의 페놀로, pH 5.2, 65℃에서 15분간 추출하고, 이어서 얼음상에서 15분간 추출한다. 수성상을 수거하고 에탄올로 2회 침전시킨다. 역전사효소(미들랜드 베데스다 소재의 BRL 제조)와 프라이머로서 올리고 dT_12-18(뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아 제조)를 사용하여 총 10㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성한다. 말단 데옥시뉴클레오타이드트랜스퍼라제(BRL 제조)를 사용하여 폴리(dG)테일을 cDNA의 3' 말단에 부착시킨다[참조 : E.Y.Loh et al., Science, 243, 217(1989)]. 가변영역 유전자(V)를 폴리(dG) 테일과 하이브리드화되는 프라이머 mc045(TAATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC) 및 고정 영역 유전자(C)에 하이브리드화되는 프라이머와 함께 앰플리태크(AmpliTaq : Perkin Elmer-Cetus 제조)를 사용하여 증폭시킨다. 경쇄의 경우 사용된 프라이머는 mc046이다(TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGSSGSTGGSTSCSGTTGGTGC). 중쇄의 경우 사용된 프라이머는 mc047이다(TATAGAGCTCAAGCTTAGTGGATAG AC(CAT)GATGGGG(GC)TGT(TC)GTTTTGGC). 괄호안의 성열은 염기 변성(bas e degeneracy)을 나타낸다. 이 변성은 프라이머가 대부분의ｒ쇄에 하이브리드될 수 있도록 하기 위해 도입되었다. 그후 증폭된 단편을 EcoRI과 HindIII로 분해시키고 서열분석을 위해 pUC18 벡터내로 클로닝시킨다.

제2도. cDNA의 서열과 항체 C4G1의 경쇄(제2a도) 및 중쇄(제2b도) 가변영역의 해독된 아미노산 서열. CDR 서열은 밑줄로 나타내었다. 완전한 경쇄 단백질은 21번 아미노산 Asp로 시작되며 완전한 중쇄 단백질은 20번 아미노산 Gln으로 시작하며, 각각에는 시그날 서열이 선행한다.

제3도. 플리스미드 pVg1-dhfr(제3a도) 및 pVk(제3b도)의 개략적인 도면. 플라스미드 pVg1-dhfr은 다음 부분을 함유한다 : amp 및 dhfr 유전자를 함유하는 약 4200개 염기쌍(bp)의 BamHI-EcoRI 단편; 각각 EcoRI 및 XbaI 링커에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹된 사람 사이토메갈로바이러스(CMV; cytomegalovirus) IE1 유전자프로모터 및 인헨서를 함유하는 630-bp 단편[참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는, Boshart et al., Cell, 41, 521(1985)]; 및 215 bp의 선행 인트론과 폴리(A)시그날을 갖는 사람 ｒ-1 고정영역 유전자를 함유하는 2800bp HindIII-PvuII 단편[참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는, Ellison et al., Nucleic Acids Res., 10, 4071(1982)]. 플라스미드 pVk는, ｒ-1 유전자를 대체하는 사람 κ고정 영역 유전자 및 액 335bp의 선행 인트론을 함유하는 1530bp EcoRI-XbaI 단편[참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는, Hieter et al., Cell, 22, 197(1980)] 및 ｒ-1 및 κ고정 영역 유전자를 함유하는 단편은 XbaI 및 BamHI 부위를 생성시킴에 의해 각각 이들의 5' 및 3' 말단에 플랭킹시킨다. 이 플라스미드는 당해 분야에 널리 공지된 방법[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 사용하여 지시된 부분으로부터 작제한다. 예를 들어, pVg1-dhft은, hyg 유전자를 함유하는 HindIII-Bg1II 단편을 dhft 유전자를 함유하며 Bg1II 부위까지 연장된 660bp 단편으로 대체시키고[참조 : Simonsen et al., Nat1. Acal. Sci. USA, 80, 2495(1983)], 면역글로불린 프로모터 및 인헨서를 함유하는 EcoRI-XbaI 단편을 CMV 프로모터 및 인헨서를 함유하는 단편으로 대체시켜 플라스미드 pVｒ1으로부터 작제한다[참조 : Queen et al., Proc. Nat1, Acal. Sci. USA, 86, 10029(1989)].

제4도. 항체없이 염색(---), 키메라성 C4G1 항체(....), 사람화된 ()C4G1 항체로 염색시킨 HEL 92.1.7 세포의 형광세포 측정. 세포를 FACS 완충액(PBS+2% FCS+0.1% 나트륨 아자이드)에 약 5×10⁶/ml로 현탁시킨다. 100㎕의 세포 현탁액을 폴리스티렌 튜브로 옮기고 얼음상에서 30분간 80ng의 정제된 항체와 함께 항온처리한다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 FITC 표지된 염소 항-사람 Ig 항체와 얼음상에서 추가로 30분간 더 항온처리한다. 세포를 다시 세척하고 최종적으로 PBS+1% 파라포름알데하이드중에 재현탁시킨다. 세포를 FACS 메이트(Becton Dickinson 제조) 상에서 분석한다.

제5도. 시그날 서열을 포함하지 않은, 사람화된 C4G1 항체(위쪽 선) 및 마우스 C4G1 항체(아래쪽 선)의 경쇄(제5a도) 및 중쇄(제5b도) 가변영역의 아미노산 서열. 각각의 쇄중 3개의 CDR을 밑줄로 나타내었다. 마우스 아미노산 또는 사람화된 항체중의 컨센서스 사람 아미노산으로 대체로 주쇄중의 잔기는 이중 밑줄로 나타내었다. 사람화된 C4G1 항체의 완전한 경쇄(제5c도) 및 중쇄(제5d도)의 아미노산 서열.

제6도. 사람화돤 C4G1 중쇄(rh29-rh32) 및 경쇄(rh33-rh36)의 작제에 사용된 올리고뉴클레오타이드. 다음의 올리고뉴클레오타이드 쌍을 혼합하고 클레나우폴리머라제 또는 앰플리태크(AmpliTaq)로 연장시키며 pUC18에 연결시키기 전에 지정된 효소로 절단한다 : rh29 및 rh30과 XbaI 및 EcoRI, rh31 및 rh32와 XbaI 및 EcoRI, rh33 및 rh34와 XbaI 및 HindIII, rh35 및 rh36과 XbaI 및 HindIII. 그후 rh29-rh-30및 rh31-rh32 단편을 pUC18로부터 XbaI 및 XhoI으로 절단해내고 pVg1-dhfr의 XbaI 부위내로 서로 연결시킨다; 그후 rh33-rh34 및 rh35-rh36 단편을 XbaI 및 HindIII로 절단해내고 pVk의 XbaI 부위 내로 함께 연결시킨다.

제7도. 각각, 사람화된 Fab 및 F(ab')₂단편의 중쇄 발현을 위해 사용된, 플라스미드 pHFad.D(제7a도) 및 pHF(ab') 2.D(제7b도)의 개략적인 도면. 이 플라스미드는 플라스미드 pVg1-dhfr(제3도)과 유사하나 pHFab.D는 C_H1 및 사람 Cr1 유전자의 힌지 액손(hinge exon)의 첫번째 5개 아미노산만을 함유하며 이어 정지 코돈과 스플라이스 공여 시그날이 뒤따르고; pHF(ab') 2.D는 힌지로서 C_H1과 C_H2의 첫번째 2개 아미노산만을 함유하며, 이후에 정지 코돈 및 스플라이스 공여 시그날이 뒤따른다. 최종 액손뒤에는 폴리 A 시그날을 함유하는 마우스 r2a 고정 영역 유전자 이외로부터의 영역이 따른다. F(ab')₂-1로 지정된, 사람화된 C4G1 항체의 Fab 단편(제7c도) 및 재조합 F(ab')₂단편(제7d도)의 중쇄의 아미노산 서열.

제8도. 혈소판에 대한 사람화된 C4G1 항체 및 마우스 C4G1 항체와 단편의 경쟁적 결합. 약 3×10⁷혈소판을 4.5ng의 방사능-요오드처리한 마우스 C4G1 트레이서 항체(3.5μCi/㎍) 및 다양한 양의 미표지 마우스 C4G1 항체 또는 단편(폐쇄 기호) 또는 사람화된 C4G1 항체 또는 단편(개방 기호)와 함께 항온처리한다. (A) 완전한 항체, (B) Fab 단편, (C) 마우스 F(ab')₂및 사람화된 F(ab')₂-1 단편.

제9도. 마우스(A) 및 사람화된 (B) C4G1 항체에 의한 혈소판 응집의 억제. Y-축은 광투과 %를 나타내고, X-축은 시간(분)을 나타낸다. 각 패널 중의 짙은 상부 곡선은 항체가 가해지지 않을때 혈소판 응집에 의해 유발된 광 투과에 있어서의 증가를 나타내고; 밝은 하부 곡선은 항체의 첨가가 광투과 변화로 측정되는 바와 같이 혈소판 응집을 강하게 억제시킴을 나타내고 있다.

[본 발명 수행의 최적 방식]

본 발명에 따라, GPII_b/III_a관련된 에피토프와 특이적으로 반응하는 사람화된 면역글로불린이 제공된다. GPII_b/III_a에 대해 약, 10⁷M^-1이상 및 바람직하게는 10⁸M^-1내지 10¹⁰M^-1또는 그 이상의 결합 친화도를 갖는 이들 면역글로불린은, 예를 들어 혈소판 응집을 예방할 수 있다. 사람화된 면역 글로불린은 사람 주쇄를 가질 것이며, GPII_b/III_a항원과 특이적으로 반응하는 면역 글로불린, 통상적으로 마우스 면역 글로불린으로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다. 바람직한 양태에서는, 하나 이상의 CDR이 C4G1항체로부터 유래할 것이다. 따라서, 경제적으로 대량 제조할 수 있는 본 발명의 면역글로불린은, 예를 들어, 여러가지 방법에 의해 사람 환자에 있어 혈소판-중재된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

기본적인 항체 구조 단위는 4량체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 4량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 이루어져 있으며, 각 쌍은 하나의 "경" (약 25kD) 및 하나의 "중" 쇄(약 50-70kD)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부위는 우선적으로 항원 인지를 관장하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 구성된 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부분은 우선적으로 유효기(efector)의 기능을 나타내는 고정 영역을 한정한다.

경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)로 분류된다. 중쇄는 감마(r), 뮤(α), 델타(δ) 또는 입실론(ε)으로 분류되며 항체의 이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 고정 영역은 약 12개 또는 그 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 약 10 또는 그 이상의 아미노산의 "D" 영역을 함유하는 중쇄와 결합되어 있다[참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는, Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., Chapter 7, pgs, 131-166, Raven Press, N.Y.(1984)].

각각의 경/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 모두 비교적 보존된 주쇄 영역의 동일한 일반적 구조를 나타내는 쇄는 3개의 과가변성 영역(또한 상보성 결정영역 또는 CDR로도 부름)에 의해 결합된다[참조 : 본원에서 참고로 인용되는 "Sequeces of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U. S. Deparment of Health and Human Services, (1987); and Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917(1987)]. 각 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR들은 특정한 에피토프에 결합할 수 있는 주쇄 영역에 의해 정렬된다.

본원에서 사용되는 "면역글로불린"이란 실질적으로 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 나타낸다. 인지된 면역글로불린 유전자에는 κ, λ, α, r, δ, ε 및 μ고정 영역 유전자가 포함될 뿐 아니라 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자도 포함된다. 이 면역글로불린은 항체 이외의 여러가지 형태, 예를 들어, Fv, Fab, 및 F(ab')₂뿐만 아니라 이작용성 하이브리드 항체[예 : 참조 : Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol., 17, 105(1987)] 및 일본쇄[예 : 참조 : Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883(1988); Bird et al., Science, 242, 423-426(1988); 본원에서 참고로 인용됨]로도 존재한다[참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는, generally, Hood et al., Immunology, Benjamin, N. Y., 2nd Ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Hunkapiller and Hood, Nature, 323 15-16 (1986)].

키메라 항체는, 중쇄 및 경쇄 유전자가, 통상적으로 유전자 조작에 의해 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 단편으로부터 작제된 항체를 말한다. 예를 들어, 마이스 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변(V) 단편을 사람 고정(C) 단편, 예를 들어 r1 및 r3에 결합시킬 수 있다. 따라서, 통상적인 치료학적 키메라 항체는 마우스 항체로부터의 V 또는 항원-결합 영역과 사람 항체로부터의 C 또는 유효기 영역으로 이루어진(물론 다른 포유동물종도 사용될 수 있다) 하이브리드 단백질아다.

본원에서 사용되는 바와 같이 "주쇄 영역"이란, 키베트 등[상기 참조]이 정의한 바와 같이, 단일 종내의 상이한 면역글로불린중에서 비교적 보존된 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역(다시 말해서 CDR 이외의 영역)의 부위를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, "사람 주쇄 영역"이란 천연적으로 생성되는 사람 항체의 주쇄 영역과 실질적으로 동일한(약 85% 또는 그 이상) 주쇄 영역을 말한다.

본원에서 사용된, "사람화된 면역글로불린"이란, 사람 주쇄, 하나 이상의 비-사람 항체로부터의 CDR을 포함하며, 여기에서 존재하는 어떠한 고정 영역은 사람 면역글로불린 고정 영역과 실질적으로 동일한, 다시 말해서, 85-90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 동일한 면역글로불린을 나타낸다. 따라서, 가능하다면 CDR을 제외한 사람화된 면역글로불린의 모든 부분이 실질적으로 하나 또는 그 이상의 천연 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 동일하다. 예를 들어, 사람화된 면역글로불린은 키메라성 마우스 가변 영역/사람 고정 영역 항체를 포괄하지는 않는다.

사람화된 항체는, 사람 치료시 사용하는데 있어 마우스 및 일부 경우 키메라 항체보다 3개 이상의 잠재적인 장점을 갖는다 :

1) 유효기 부위가 사람 부위이기 때문에, 이는 사람 면역 시스템의 다른 부분 보다 더 잘 반응한다[예를 들어, 보체-의존적 세포독성(CDC) 또는 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)에 의해 보다 효율적으로 표적 세포를 파괴한다].

2) 사람 면역 시스템은 외래인 사람화된 항체의 주쇄 또는 C영역을 인지하지 않으므로, 이와 같이 주입된 항체에 대한 항체 반응은 전체적으로 외래인 마우스 항체나 부분적으로 외래인 키메라성 항체에 비해 약하다.

3) 주입된 마우스 항체의 사람 순환계내 반감기는 정상인 항체의 반감기에 비해 훨씬 짧다고 보고된 바 있다[참조 : Show, D, et al., J. Immunol., 138, 4534-4538(1987)]. 주입된 사람화된 항체는 아마도 천연적으로 생성되는 사람 항체와 필수적으로 동일한 반감기를 가지므로, 투여에 따라 보다 적거나 낮은 빈도의 용량이 가능하도록 한다.

한 측면에서, 본 발명은 GPII_b/III_a항원, 예를 들어 모노클로날 항체 C4G1, 7E3, 10E5 또는 AP-2와 같은 항원의 목적하는 에피토프와 결합할 수 있는 면역글로불린으로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 적절한 사람 주쇄 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 결합된다. 사람 주쇄 영역과 관련하여, CDR이 제공하는 비-사람 면역글로불린의 주쇄 또는 가변 영역 아미노산 서열을 사람 면역글로불린 서열 수집물 중 상응하는 서열과 비교하여 상동성이 높은 서열을 선별한다. 발현시 모노클로날 항체 C4G1의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는, 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 제2도에 나타낸 바와 같다. 코돈 변성 및 비-임계적 아미노산 치환 때문에, 하기 기술하는 바와 같이, 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 이들 서열에 대해 용이하게 치환시킬 수 있다. 사람화된 면역글로불린의 설계는 다음과 같이 수행할 수 있다 :

(1) 아미노산이 다음의 카테고리에 포함될 때, 사용될 사람 면역글로불린(수용체 면역글로불린)의 주쇄 아미노산은 CDR이 제공하는 비-사람 면역글로불린(공여체 면역글로불린)으로부터의 주쇄 아미노산으로 대체된다;

(a) 수용체 면역글로불린의 사람 주쇄 영역중 아미노산은 이 위치에서 사람 면역글로불린에 대해 낯설며, 이와 달리, 공여체 면역글로불린중의 상응하는 아미노산은 이 위치에서 사람 면역글로불린에 대해 통상적이다;

(b) 아미노산의 위치는 CDR 중의 하나에 바로 인접해 있거나;

(c) 아미노산은 3차 구조 면역글로불린 모델내에서 CDR의 약 3Å이내에 있다[참조 : 본원에서 참고로 인용되는 문헌 : Queen et al., 상기 참조 및 Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869(1991)].

(2) 수용체 면역글로불린의 사람 주쇄 영역중의 아미노산 및 공여체 면역글로불린중의 상응하는 아미노산이 각각 이 위치에서 사람 면역글로불린에 대해 낯설 때, 이와 같은 아미노산은 해당위치에서 사람 주쇄 영역에 대해 통상적인 아미노산으로 대체시킬 수 있다. 사람화된 면역글로불린 제조에 대한 상세한 설명은 상기 문헌[Queen et al., and Co et al; 상기 참조]을 참조한다.

폴리뉴클레오타이드는 통상적으로, 천연적으로-관련되거나 또는 이종인 프로모터 영역을 포함하여, 사람화된 사람 면역글로불린 암호화 서열에 작동적으로 연결된 발현조절 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 것이다. 바람직하게는, 이 발현 조절 서열은 진핵성 숙주세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터중에서 진핵성 프로모터 시스템에 될 것이지만, 원핵성 숙주세포에 대한 조절 서열 또한 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주내로 혼입되게 되면, 해당 뉴클레오타이드 서열의 고 발현에 적합한 조건하에서 숙주를 유지시키고, 경우에 따라, 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 완전한 항체, 결합 단편 또는 다른 면역글로불린 형태를 수집 및 정제할 수 있다.

궁극적으로 목적하는 사람화된 항체를 발현시킬 수 있는 본 발명의 핵산 서열은 여러가지 상이한 폴리뉴클레오타이드(게놈성 또는 cDNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오타이드 등) 및 성분(예 : V, J, D 및 C 영역)으로부터 뿐만 아니라, 여러가지 상이한 기술로도 형성시킬 수 있다. 현재는 적절한 게놈성 및 합성 서열을 결합시키는 것이 가장 보편적인 제조 방법이지만, cDNA 서열 또한 활용할 수 있다[참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는 문헌, 유럽 특허 공개 공고 제0 239 400호 및 Reichmann, L, et al., Nature, 332, 323-327(1988)].

사람 고정 영역 DNA 서열은 다양한 사람 세포로부터, 그러나 바람직하게는 죽지않는 B-세포로부터 널리 공지된 방법에 따라 분리할 수 있다[참조 : Kabat, 상기 참조 및 WP87/02671]. 본 발명의 면역글로불린을 제조하기 위한 CDR은 PII_b/III_a에 결합할 수 있는 모노클로날 항체로부터 유사하게 기원하며, 마우스, 래트, 래빗을 포함하는 어떠한 편리한 포유동물 또는 기타 항체를 생성할 수 있는 다른 척추 동물에서 널리 공지된 방법으로 제조한다. 적합한 폴리뉴클레오타이드 서열 공급원 세포 및 면역글로불린의 발현 분비용 숙주 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션[참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는 미합중국 매릴랜드 로크빌, Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Fifth Edition(1985)]과 같은 다수의 공급원으로부터 입수할 수 있다.

본원에서 특정하게 기술된 사람화된 면역글로불린외에, 다른 "실질적으로 상동성"인 개질된 면역글로불린은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 다양한 재조합 DNA 기술을 활용하여 설계 및 제조할 수 있다. 예를 들어, 주쇄 영역은, 다수의 아미노선 치환, 말단과 중간체의 부가 및 결실 등에 의해 일차 구조 수준에서 천연 서열과는 상이할 수 있다. 게다가, 본 발명의 사람화된 면역글로불린에 대한 기본으로서 각종의 상이한 사람 주쇄 영역이 단독으로 또는 혼합되어 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 부위-지정 돌연변이 유발과 같이 여러가지 널리 공지된 기술에 의해 용이하게 달성할 수 있다 [참조 : 본원에서 참고로 인용되고 있는 문헌, Gillman and Smith, Gene, 8,81-97(1979) and Roberts S. et al., Nature, 328, 731-734(1987)].

달리는, 일차 항체 구조의 단지 일부만을 포함하는 폴리펩타이드 단편을 제조할 수 있으며, 이 단편은 하나 이상의 면역글로불린 활성을 갖는다(예를 들어, 보체 고정활성). 이들 폴리펩타이드 단편은 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 완전한 항체를 단백분해적 절단하여 제조하거나, 예를 들어 CH1 뒤에 정지 코돈을 삽입하여 Fab 단편을 제조하거나 힌지 영역뒤에 정지 코돈을 삽입하여 F(ab')₂단편을 제조하는 것과 같은, 부위-지시된 돌연변이 유발을 사용하여 벡터 pVk 및 pVg1-dhfr(제3도) 내 목적하는 위치에 정지 코돈을 삽입시켜 제조할 수 있다. 일본쇄 항체는 DNA 링커를 써서 VL과 VH를 결합시킴에 의해 제조할 수 있다[참조 : Huston et al., 상기 참조 및 Bird et al., 상기 참조]. 또한, 다른 많은 유전자와 같이, 면역글로불린-관련 유전자가 각각 하나 이상의 독특한 생물학적 활성을 가지는 별도의 작용성 영역을 함유하므로, 신규한 특성을 갖는 융합 단백질을 제조하기 위해 이 유전자를 다른 유전자로부터의 작용성 영역에 융합시킬 수도 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 서열들이 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 후에(즉, 발현 조절 서열의 기능을 보장하도록 위치된 후) 숙주내에서 발현될 것이다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 에피좀으로서 또는 숙주 염색체성 DNA의 통합 부분으로서 숙주 유기체내에서 복제될 수 있다. 통상, 발현 벡터는 선별 마커, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유하며 목적하는 DNA 서열을 사용하여 형질전환시킨 세포의 검출을 허용할 것이다[참조 : 미합중국 특허 제4,704,362호; 본원에서 참조로 인용됨].

이. 콜라이(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하기 위해 특히 유용한 하나의 원핵세포 숙주이다. 사용하기에 적합한 기타 미생물 숙주는 바실러스속, 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) 및 기타 엔테로박테리아세아에속(enterobacteriaceae), 예를 들어, 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 상기 원핵 세포 숙주에서, 이들은 또한 발현 벡터를 제조할 수 있으며, 통상적으로 숙주 세포와 양립하는 발현 조절 서열(예를 들어, 복제 오리진)을 함유할 것이다. 또한, 특정 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예를 들어, 락토오즈 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열을 사용하여 전형적으로 발현을 조절할 것이며 전사 및 해독을 개시하고 완결하기 위한 리보좀 결합 부위 등을 갖는다.

기타 미생물, 예를 들어, 효모가 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 사카로 마이세스(Saccharomyces)는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당 효소를 포함하는 프로모터, 및 경우에 따라 복제 오리진, 종결 서열 등과 같은 발현 조절 서열을 포함하는 적합한 벡터를 지난 바람직한 숙주이다.

미생물 이외에, 포유동물 조직 세포 배양이 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 발현 및 생성시키기 위해 사용될 수 있다[참조 : Winnacker, From Genes to Clones, VCH publishers, N.Y., N.Y. (1987); 본원에 참조로 인용됨]. 진핵 세포가 실질적으로 바람직한데, 그 이유는 완전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 특정수의 적합한 숙주 세포주가 당해 분야에서 개발되어 왔으며 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골종양 세포주 등 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 이들 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예를 들어, 복제 오리진, 프로모터, 인헨서[참조 : Queen et al., Immunol. Rev. 89, 49-68(1986); 본원에 참조로 인용됨] 및 필수적인 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보좀 결합 부위, RNA 스프라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 터미네이터 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종바이러스, 거대세포증바이러스 등으로부터 기원한 프로모터이다.

관건의 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 암호화 서열과 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터가 세포 숙주의 타입에 따라 변경되는, 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포내로 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염이 원핵 세포를 위해 통상 사용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션(electropration)이 기타 세포 숙주를 위해 사용될 수 있다[참조 : Maniatis et al., Moleuclar Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1980); 본원에서 참조로 인용됨].

일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 이의 이량체, 개개의 경쇄 및 중쇄 또는 기타 면역글로불린 형태가 당해 분야의 표준 방법, 예를 들어, 암모늄 설페이트 침전법, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등에 따라 정제될 수 있다[참조 : Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); 본원에 참조로 인용됨]. 약 90 내지 95% 이상이 동종성인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 98 내지 99% 이상의 동종성이 약제학적 용도용으로 가장 바람직하다. 필요한 경우 부분적으로 또는 동종성으로 일단 정제된 다음 폴리펩타이드는 치료학적으로(예를 들어, 체외적으로) 또는 검정 절차, 면역형광성 염색 등을 수행하고 현상하는데에 사용될 수 있다[참조 : Immunological Methods, Vols. I and II, Lefkovits and Pernis, Eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 및 1981)].

본 발명의 면역글로불린은 통상적으로 심장혈관계 질환 및 기타 혈전색전증성 질환을 치료하는데 있어서 각각 용도가 있음이 밝혀질 것이다. 예를 들어, 치료용으로 적합한 통상적인 질환 상태는 급성 심근 경색, 불안정성 앙기나, 발작, 일시적인 허혈성 에피소우드(transient ischemic episodes), 심한 정맥 혈전증 및 폐 색전증을 포함한다[참조 : Hoffbrand ＆ Pettit, Essential Haematology, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1980)]. 면역글로불린은 또한 혈관 형성술 과정 또는 혈관 수술후의 재폐쇄 및 투석, 체외 심폐성 순환 등과 같은 체외 혈액 순환후 또는 동안의 폐색을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 면역글로불린은 또한 신장염, 말초 순환 부전, 폐색성 혈전맥관염, 이식후 혈전증, 만성 동맥 폐쇄증, 폐색성 동맥 경화증, 관상 경화등, 울혈성 심장 마비, 뇌혈관성 경축등과 같은 기타 혈소판-중재된 질환의 치료시의 용도가 발견될 것이다. 또한 면역글로불린은 혈전증성 혈소판감소성자반병, HUS 및 혈소판-중재된 자가면역 질환을 치료하기 위해, 전이를 차단하기 위해, 및 거핵구 또는 거핵아구의 분화 또는 성장을 자극하기 위해 사용될 수 있다.

GPII_b/III_a-결합성 항체중 혈소판의 응집을 억제할 수 있는 면역글로불린으로부터 기원한 CDR은 본 발명의 사람화된 면역글로불린을 위해 바람직하게 사용될 수 있다. 또한 7E3 및 유사한 항체와 같은 맥관성 내피 세포와 반응하는 항체는 내피 세포 상해를 야기시킬 가능성이 있는 것으로 공지되어 있다[참조 : Annals New York Academy of Science, 614, 204, (1991)]. 결과적으로, C4G1 또는 유사한 면역글로불린으로부터 기원한 CDR을 사용하는 것이 항체에 의해 결합되는 항원성 결정 인자가 혈소판 상에 존재하지만 맥관성 내피 세포상에는 부재하거나 감소된 양으로 존재하도록 하는데 있어 더욱 바람직하다. 본 발명의 사람화된 면역글로불린, 예를 들어, 마우스 항체 C4G1에 의해 확인되는 항원성 결정 인자에 결합하는 사람화된 면역글로불린은 투여되는 경우 내피 세포 상해를 야기시키지 않을 것으로 예상된다.

ADP 또는 아드레날린 자극에 의해 야기된 혈소판의 응집의 경우에, 가역성 제1차 응집은 효능제의 첨가 후에 일어나며, 이어서 용량 의존적으로 가역성이고 방출 반응을 수반하는 제2차 응집이 일어난다. 혈소판이 항체로 미리 처리되는 경우 7E3 또는 유사한 항체는 혈소판의 응집을 억제한다고 공지되어 있지만 혈소판 응집 진행동안 첨가되는 경우에 혈소판의 응집을 억제하는 항체는 공지되어 있지 않다. 그러나, C4G1 할체가 제1차 응집의 생성후 첨가되는 경우, C4G1 항체는 제1차 응집 뿐만 아니라 제2차 응집을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, C4G1 항체 또는 C4G1 항체와 유사한 기능을 갖는 면역글로불린으로부터 기원한 CDR을 이용하여 제조된 사람화된 면역글로불린은 또한 혈전증성 질환의 급성단계 동안 혈소판의 활성화 및 응집의 초기 단계를 억제할 것이라는 것이 가능성 대두되었다.

혈액중 트롬복산 A₂, PAI-1등의 수준은 혈전증성 질환을 치료하기 위해 PTCA, PTCR 등을 사용한 혈류의 재구성 후 급속히 증가한다고 공지되어 있다. 이의 원인으로서, 혈소판의 활성화 및 TGF-β₁, pDGF 등과 같은 다양한 조정기의 방출이 중요한 인자로서 간주된다. 시험관내에서 실험한 경우 마우스 C4G1 항체가 ADP 자극에 의해 유발되는 혈소판의 응집 뿐만 아니라 혈소판의 방출 반응을 억제할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 결과적으로, 혈소판의 응집 및 혈소판의 방출 반응을 억제할 수 있는 면역글로불린으로부터 기원한 CDR을 이용하여 제조된 사람화된 면역글로불린, 예를 들어, 마우스 C4G1 항체는 혈소판의 응집 뿐만 아니라 사람에게서 사용되는 경우 혈소판의 방출 반응을 억제할 것으므로 PTCA, PTCR 등과 같은 혈류의 재구성에 의한 치료후 부작용을 억제할 수 있을 것이다.

본 발명의 사람화한 면역글로불린은 또한 상이한 혈소판 항원 또는 응괴 인자와 반응성인 기타 항체, 특히 사람화한 항체와의 배합물로 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람화된 면역글로불린의 칵테일이 반응할 수 있는 적합한 항원에는 VLA-2, VLA-5, GPIb, GPIV, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 트롬빈 및 혈소판 트롬빈 및 혈소판 트롬빈 수용체가 포함된다[참조 : Coller, New Eng. J. Med. 322, 33(1990)].

면역글로불린은 또한 기타 치료제와 함께 개별적으로 투여되는 조성물로서 사용될 수 있다. 통상적으로, 제제는 아스피린 및 헤파린을 포함할 수 있지만, 심장혈관계 질환의 치료를 위해 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 많은 첨가제(예, tPA)가 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 사람화된 면역글로불린 및 이의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 투여용으로 특히 유용하다. 비경구 투여용 조성물은 통상 면역글로불린 또는 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체중에 용해된 이의 칵테일 용액을 포함할 것이다. 각종의 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 5% 글루코오즈, 사람 알부민 용액등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 입자 물질을 포함하지 않는다. 이들 조성물은 통상적으로 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 적당한 생리학적 조건을 위해 요구되는 것으로서 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조절제, 완충제, 강장제, 독성 조절제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨, 시트르산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형중 면역글로불린의 농도는 매우 다양하며, 즉 약 0.5% 미만, 통상 약 1중량% 이상 내지 15 또는 20중량% 미만일 수 있으며 1차적으로 유체 용적, 점도 등을 기준으로하여 선택되는 특정의 투여 방식에 따라 선택될 것이다.

따라서, 통상적인 주사용 약제학적 조성물은 멸균 완충수 1ml 및 면역글로불린 1 내지 10mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 통상적인 정맥 주입용 조성물은 멸균 링게르액 250ml 및 면역글로불린 150mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여될 수 있는 조성물을 제조하기 위한, 실질적 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있거나 명백할 것이고 보다 상세하게는 문헌[참조 : Pemington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1981); 본원에서 참조로 인용됨]에 기술되어 있다.

본 발명의 면역글로불린은 저장을 위해 동결되거나 동결건조될 수 있으며 사용전에 적합한 담체중에 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상의 면역글로불린을 사용한 경우 효과적인 것으로 밝혀졌으며 당해분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 면역글로불린 활성 손실을 초래할 수 있으며(예를 들어, 통상의 면역글로불린을 사용한 경우, IgM 항체는 IgG 항체보다 활성 손실이 더욱 큰 경향이 있다) 따라서 사용 수준은 이를 보정하기 위해 조정되어야 함이 당해 분야의 숙련가에게 인지될 것이다.

본 발명의 사람화된 면역글로불린 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 치료학적 또는 예방학적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서, 조성물은 동맥 혈전증 또는 기타 혈소판-중재된 질환을 이미 앓고 있는 환자에게 상기 질환 및 이의 합병증을 치료 또는 최소한 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 상기를 달성하기에 충분한 양을 "치료학적 유효량"으로 정의한다. 상기 용도를 위해 유효한 양은 질환의 중증도 및 환자 고유 면역계의 일반적인 상태에 따라 다를 것이지만, 일반적으로 환자당 면역글로불린 약 1 내지 약 200mg, 보다 통상적으로 환자당 5 내지 25mg 범위의 용량이 사용된다. 본 발명의 물질은 일반적으로 심각한 질병 상태, 즉 생명을 위협하거나 극도로 생명을 위협하는 상태에서 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 이러한 경우, 외래 물질을 최소화하고 본 발명의 존재하는 사람화된 면역글로불린에 의해 달성되는 "외래 물질" 거부반응의 가능성이 낮다는 측면에서, 주치의가 이 면역글로불린의 실제적인 과량을 투여하는 것도 가능하며 바람직한 것으로 여겨진다. 대표적인 예방학적 용도는 돌연한 폐쇄를 방지하기 위해 발룬(balloon)기구 혈관혈성술을 시술한 환자, 및 추가의 발작을 예방하기 위한 심장 발작 또는 마비가 있는 환자의 치료이다.

조성물의 단일 투여 또는 복수 투여는 주치의에 의해 선택되는 용량 수준 및 양식으로 수행할 수 있다. 어느 경우에서나, 약제학적 제형은 환자를 효율적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 면역글로불린을 제공해야만 한다.

특수 양태에 있어서, 본 발명의 사람화된 면역글로불린을 포함하는 조성물은 사람 환자에 있어서 혈전의 존재 및 위치를 진단하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 이에 제한되지는 않으나, 마우스 항체 C4G1에 의해 결합된 항원성 결정인자는 혈소판상에 존재하나 혈관 내피 세포상에서 감소된 양으로 존재하거나 존재하지 않는다. 따라서, 마우스 항체 C4G1에 의해 동정된 항원성 결정인자에 결합하는 사람화된 면역글로불린과 같은, 본 발명의 사람화된 면역글로불린을 표지하여 현저한 농도의 활성화된 혈소판을 함유하는 해부학적 부위(예 : 혈전 부위)를 동정하는데 사용한다. 예를 들어, 이에는 제한되지 않지만, 하나 이상의 표지화 잔기는 사람화된 면역글로불린에 부착될 수 있다. 표지화 잔기의 예는 라디오파크 염료(radiopaque dye), 라디오 컨트라스트제(radiocont rast agent), 형광성 분자, 스핀-표지된 분자, 효소, 또는 특히 방사선 의학적 또는 자기 공명상 기술에서 진단 가치가 있는 표지화 분자를 포함하나, 이로써 제한되지는 않는다.

본 발명의 사람화된 면역글로불린은 또한 시험관내 광범위한 용도가 있음이 밝혀졌다. 일예로써, 면역글로불린은 GPII_b/III_a항원의 검출, 혈소판 분리 등에 이용될 수 있다.

진단 목적을 위해서, 면역글로불린은 표지하거나 표지 하지 않을 수 있다. 표지되지 않은 면역글로불린은 사람 면역글로불린 고정 영역에 대해 특이적인 사람화된 면역글로불린과 반응성이 있는 다른 표지된 항체(제2 항체)와 함께 사용될 수 있다. 달리는, 면역글로불린을 직접 표지할 수 있다. 방사성핵종, 불소, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드(측히 합텐) 등과 같은 광범위한 표지를 사용할 수 있다. 많은 유형의 면역검정이 유용하며 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.

키트는 또한 세포 활성에 대한 보호 또는 검출시 본 면역글로불린을 사용한 용도 또는 선택된 항체의 존재에 대해 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역글로불린 조성물은 일반적으로, 단독 또는 바람직한 세포 유형에 대해 특이적인 추가의 항체와 함께, 용기내에서 동결건조된 형태로써 제공될 수 있다. 표지 또는 독소에 합합되거나 접합되지 않을 수 있는 면역글로불린은, 트리스, 포스페이트, 카보네이트 등과 같은 완충액, 안정화제, 방부제, 불활성 단백질(예 : 혈청 알부민)등, 및 사용 지침서와 함께 키트내에 포함된다. 일반적으로, 이 물질은 활성 면역글로불린의 양을 기준으로 하여 약 5% 미만으로 존재할 것이며, 일반적으로 면역글로불린 농도를 다시 기준으로 하여 약 0.001 중량%의 총량으로 존재한다. 흔히, 총 조성물의 약 1 내지 90중량%로 존재할 수 있는, 활성 성분을 희석시키기 위한 불활성 증량제 또는 부형제를 포함하는 것이 바람직하다. 면역글로불린에 결합할 수 있는 제2항체를 검정중에 사용하는 경우, 이것은 일반적으로 별개의 바이알중에 존재할 것이다. 제2항체는 통상적으로 표지에 접합되며 상술한 면역글로불린 제형과 함께 동일한 방식으로 제형화된다.

하기 실시예는 나열하기 위함이며 이에 한정되지는 않는다. 실시예들이 비록 C4G1 항체에 속한다해도, GPII_b/III_a항체에 대한 결합 치환도가 높은 사람화된 항체의 제조는, GPII_b/III_a의 에피토프에 결합하는 10E5, 7E3, AP-2 또는 다른 모노클로날 항체로부터의 CDR의 사용을 고려할 수 있다.

[실시예]

중쇄 및 경쇄 cDNA의 클로닝

중쇄 및 경쇄 가변성 영역 유전자에 대한 cDNA를, 고정 영역에 대해 하이브리드화되고 HindIII 부위를 함유하는 3' 프라이머와 및 dG 테일에 대해 하이브리드화하고 EcoRI 부위를 함유하는 5' 프라이머를 사용하여, 고정된 폴리머라제 쇄 반응[polymerase chain reactions; E.Y. Loh et al., Science, 243, 217(1989)]으로 클론한다(제1도의 반응도식 참조). PCR 증폭된 단편은 EcoRI 및 HindIII로 분해하여 서열분석용의 pUC18 벡터내로 클론시킨다. C4G1에 대해, 2개의 r-1 특이적이고 2개의 κ특이적인 클론을 서열분석한다. 2개의 r-1 클론 및 2개의 κ클론은 각각 서열이 동일하다. cDNA 가변성 영역 서열 및 유추된 아미노산 서열은 제2도에 나타낸다.

키메라 항체(chimeric antibody)의 작제 및 발현

키메라 항체 유전자를 작제 및 발현시키기 위해 2개의 플라스미드 벡터를 제조한다. 플라스미드 pVg1-dhft(제3a도)는 사람 거대세포증바이러스 IE1 프로모터 및 인헨서[참조 : M. Boshart et al., Cell, 41, 521(1985)], 선행하는 인트론의 일부를 포함하는 사람 게놈성 Cr1 단편, 및 선별용의 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhft) 유전자[참조 : Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, (2495); 본원에서 참조로 인용]를 포함한다. 플라스미드 pVk(제3b도)는 pVg1-dhfr과 유사하나 사람 게놈성 Cκ단편 및 gpt 유전자를 함유한다. C4G1 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유도체는 폴리머라제 쇄 반응에 cDNA로 부터 제조한다. 5' 프라이머는 ATG 코돈에서 출발하는 V 영역에 하이브리드화되며 XbaI 부위를 함유하고; 3' 프라이머는 J 영역의 마지막 15개 뉴클레오타이드에 하이브리드화되며 스플라이스 공여체 시그날(splice donor signal) 및 XbaI 부위를 함유한다[참조 : Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029(1989); 본원에서 참조로 인용]. 변형된 V 영역은 CMV 프로모터와 고정 영역의 부분적 인트론 사이에서 각각의 플라스미드 벡터의 XbaI 부위에 클론시킨다.

키메라 항체의 발현을 위해서, 중쇄 및 κ쇄 플라스미드를 전기영동에 의해 Sp2/0 마우스 골수종 세포내로 형질감염시키고 gpt 발현을 위해 세포를 선별한다. 최대량의 완전한 선별하는 클론을 ELISA로 검출한다. 정제된 키메라 C4G1 항체는 유동 혈구계산에 의해, GPII_b/III_a항원을 발현하는 HEL 92.1.7 세포에 결합되는 것으로 밝혀졌다(제4도).

사람화된 항체의 컴퓨터 모델링

사람화된 항체내 높은 결합 친화도를 유지하기 위해서, 퀸(Queen) 등의 일반적인 방법을 수행한다[참조 : Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029(1989) 및 W090/07861; 본원에서 참조로 인용]. 사람 항체가 원래의 뮤린 항체와 더욱 상동일수록, 친화도를 감소시킬 수 있는 뮤린 CDR 내로 염좌가 도입되게 될 사람 주쇄와 뮤린 CDR의 결합은 더 일어나지 않을 것이다. 일반적으로, 동일한 사람 항체로부터의 중쇄 및 경쇄는 주쇄 서열을 제공하기 위해 선택되며, 이로써 2개의 쇄가 조립될 때 부적합성의 가능성은 감소된다. NBRF 단백질 서열 데이타베이스에 대한 서열 상동성 조사를 기본으로 하여[MicroGenie Sequence Analysis Software(Beckman 제조원)로 수행], 항체 Eu를 선택함으로써 C4G1의 사람화에 대한 주쇄 서열을 제공한다.

컴퓨터 프로그램 ENCAD[참조 : M. Levitt, J. Mol. Biol., 168, 595(1983); 본원에서 참조로 인용]를 사용하여 C4G1 가변영역의 모델을 작제한다. 이 모델은 CDR이 C4G1 주쇄내 아미노산과 강력하게 상호작용하기에 충분하도록 인접하고 있는 C4G1 주쇄내 아미노산을 측정하는데 사용한다(하기 범위 4). 사람화된 경쇄 및 중쇄 C4G1 가변 영역을 설계하기 위해서, 위치가 하기 5개의 범주 하나 이상에 속하는 것을 제외하고는 각 위치에서 Eu 항체내에서와 동일하도록 아미노산을 선택한다 :

(1) 이 위치는 CDR 내에 속한다.

(2) Eu 아미노산은 이 위치에서 사람 항체에 대해 일반적인 것이 아니며, C4G1 아미노산은 이 위치에서 사람 항체에 대해 대표적인 것이다.

(3) 이 위치는 CDR에 매우 인접하고 있다.

(4) 상술한 모델은 이 아미노산이 항원 결합 영역(CDR)에 물리적으로 인접할 수 있음을 나타낸다.

상기 범주(2)에서, "일반적인 것이 아니다"라는 의미는 Eu 경쇄 및 중쇄로서 동일한 아그룹(참조 : Kabat et al. 상기 정의한 바와 같음)내 사람 서열의 약 20% 미만에서 발생한 아미노산을 포함하는 것으로 해석되며, "대표적인 것"이란 이 아그룹내 사람 서열의 약 25% 이상, 그러나 일반적으로 50% 이상으로 발생되는 아미노산을 포함하는 것으로 해석된다. 이 범주내 위치에 대하여, 마우스 C4G1 항체로 부터의 아미노산을 사용한다. 또한 이 위치는 (5) Eu 아미노산이 상기 위치에서 사람 항체에 대해 매우 일반적인 것은 아니며, C4G1 아미노산이 상이하지 않고 또한 일반적인 것도 아닌 경우 5번째 범주에 속한다.

따라서 상기 위치에서 사람 항체에 대해 대표적인 항체를 사용할 수 있다.

각각의 범주내 아미노산은 표 1에 나타낸다. 일부 아미노산은 하나 이상의 범주내에 속할 수 있다. 사람화된 C4G1 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 최종 서열은, 마우스 C4G1 서열과 비교하여 제5a도 및 제5b도에 나타낸다.

[표 1]

사람화된 항체의 합성

사람화된 항체에 대한 유전자를 작제하기 위하여, 대표적인 면역글로불린 시그날 펩타이드를 포함하며, 일반적으로 마우스 서열내에서 발견된 코돈을 이용하는, 사람화된 중쇄 및 경쇄의 단백질 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 선별한다. 몇개의 변성 코돈을 변화시켜 제한 부위를 생성시키거나 바람직하지 않은 부위를 제거한다. 뉴클레오타이드 서열은 또한 각각의 말단에서 키메라 유전자 및 XbaI 부위내에 사용된 동일한 스플라이스 공여체 시그날을 포함한다. 각각의 유전자는 4개의 중첩되어 있는 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 작제한다. 각각의 가변 영역 유전자에 대해서, 변경된 쇄상에 중첩되어 있는 올리고뉴클레오타이드의 2개의 쌍을 합성하며, 이 쌍은 전체의 암호화 서열 외에 시그날 펩타이드 및 스플라이스 공여체 시그날을 포함한다(제6도). 올리고뉴클레오타이드는 어플라이드 바이오 시스템 380B DNA 합성기(Appiled Biosystems 380B DNA synthesizer) 상에서 합성한다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 염기 길이는 약 110 내지 140개이며 약 15개의 염기가 중첩되어 있다. 이 본쇄 DNA 단편을 올리고뉴클레오타이드의 각 쌍으로 부터 클레노우 폴리머라제로 합성하고, 제한 효소로 분해하며, pUC18 벡터에 연결하여 서열분석한다. 다음 각각 정확한 1/2의 서열을 지닌 2개의 단편을 pVg1-dhft 또는 pVk 발현 벡터의 XbaI 부위내에 적절한 배향으로 연결하여 완전한 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조한다. 예를 들어, 사람화된 C4G1 가변 영역 유전자는 pVg1-dhfr 중의 XbaI 단편상에 함유된다. 이 반응은 문헌(참조 : Maniatis et al., 상기 참조)에 잘 공지된 조건하에서 수행한다. 사람화된 C4G1 항체의 완전한 경쇄 및 중쇄의 예상되는 아미노산 서열은 제5c도 및 제5d도에 나타낸다.

중쇄 및 경쇄 플라스미드는 전기영동에 의해 Sp2/0 마우스 골수종 세포내에 형질감염시키고 이 세포를 gpt 발현에 대해 선별한다. ELISA에 의해 배양 상층액 중에서 사람 항체 생산을 검정함으로써 클론을 선별하고, 가장 우수하게 생성하는 클론으로부터 항체를 정제한다. 조직 배양 상층액은 스타필로코커스의 단백질 A-세파로즈 CL-4B(파마시아 제조원)의 컬럼 위에 이동시킴으로써 정제한다. 결합된 항체는 0.2M 글라이신-HCI, pH 3.0으로 용출하여 1M 트리스 pH 8.0으로 중화시킨다. 완충액은 PD10 컬럼(파마시아 제조원) 위에 이동시켜 PBS와 교환한다.

사람화된 Fab 및 F(ab')₂단편의 합성

사람화된 Fab 및 F(ab')₂단편을 합성하기 위하여 2개의 추가 벡터를 작제한다(제7a도 및 제7b도). 효소 분해에 의해 제조된 F(ab')₂단편으로부터의 벡터를 사용하여 직접 제조한 재조합 F(ab')₂단편을 구별하기 위하여, 재조합 단편을 F(ab')₂-1로 지정한다. BamHI 부위와는 역시계 방향인 XbaI 부위로부터, 이 플라스미드는 pVg1-dhfr과 동일하다(제3a도). 그러나, 완전한 사람 Cr1 유전자 대신에, 플라스미드 pHFab.D는 C_H1 엑손 및 힌지엑손(hinhe exon)의 첫번째 5개의 아미노산에 이어, 정지 코돈 및 스플라이스 공여체 시그날을 함유하며, 플라스미드 pHF(ab')2.D는 C_H1, 힌지 및 C_H2의 첫번째 2개의 아미노산(힌지의 일부로서 스플라이스에 연결된 코돈이 계수됨)에 이어, 정지 코돈 및 스플라이스 공여체 시그날을 함유한다. 두 플라스미드 모두에서, 최종 엑손은 162-bp Sall-BamHI 단편후에 오며, 이것은 마우스 r2a 고정 영역 유전자의 C_H3 엑손에 즉시 이어오는 영역으로부터 기원한 것이며 폴리아데닐화 시그날을 함유한다. 상술한, 사람화된 C4G1 중쇄 가변 영역 유전자를 함유하는 XbaI 단편을 각각의 플라스 pHFab.D 및 pHF(ab')2.D.의 XbaI 부위내에 적절한 배양으로 삽입한다. 모든 플라스미드는 유전 공학 분야의 숙련가들에게 잘 공지되어 있는, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 폴리머라제 쇄 반응을 포함하는 표준 방법으로써 작제한다. 사람화된 C4G1 Fab 및 F(ab')₂-1 단편내 중쇄의 예측되는 아미노산 서열을 제7c도 및 제7d도에 나타내며; 이 단편내 경쇄는 완전한 항체에서와 동일하다(제5c도).

각각의 중쇄 함유 플라스미드를 전기영동에 의해 사람화된 C4G1 경쇄 함유 플라스미드와 함께 Sp2/0 세포내로 각각 형질감염시킨 다음, gpt 발현을 위해 세포를 선별한다. ELISA에 의해 배양 상층액중에서 사람 항체 단편에 대해 검정함으로써 클론을 스크리닝하고 최대 생성 클론으로부터 사람화된 C4G1 항체 Fab 또는 F(ab')₂-1단편을 정제한다. 각 단편에 대해, 먼저 농축된 배양 상층액을 20mM 트리스(pH 8.6)중의 DEAE-세파로스 컬럼내로 통과시키고, 추가로 정제하기 위해 비흡착 분획을 사용한다. Fab 단편은 CM-세파로즈 및 페닐-세파로즈상에서 크로마토그래피하여 추가로 정제시키는 한편, F(ab')₂-1 단편은 CM-세파로즈 및 페닐-세파로즈와 S-200상에서 크로마토그래피함으로써 추가로 정제하여 당해 분야에서 널리 공지된 방법을 사용하여 Fab' 의 기타 올리고머로부터 F(ab')₂-1을 분리시킨다. 당해 분야에 공지된 기타 단백질 제조방법 및 정제공정을 적용할 수도 있다. 예를 들면, F(ab')₂-1의 DEAE-세파로즈 비흡착 분획을 pH 9.0의 10mM 환원 글루타티온중에서 항온처리하여 F(ab')₂-1의 수율을 증가시킬 수 있다.

사람화된 C4G1 항체 및 분획을 약간 상이하거나 상당히 상이한 다른 방식으로 정제할 수도 있다. 각각의 경우, 세포를 10,000g에서 10분동안 원심분리시킴으로써 배양 상층액으로부터 제거하고 상층액을 0.45㎛ 여과기를 사용하여 여과한 다음, 완전히 항체에 대해서 분자량 컷-옵프(MWCO)치가 30,000인 막을 사용하고 단편들에 대해서 분자량 컷-옵프치가 10,000인 막을 사용하여 약 20배로 농축시킨다. 예를 들면, 완전히 사람화된 C4G1 항체를 제조하기 위해서는, 농축된 배양 상층액을 1M 트리스를 사용하여 pH 7.5로 조정하고, 10분동안 10,000g으로 원심분리시킨 다음, 0.45㎛ 여과기를 통하여 여과시킨다. 이어서, 샘플을 0.15M NaCl, 0.05M 트리스(pH 7.5), 평형물로서의 2mM EDTA 및 세척 완충액을 사용하여 단백질 A-세파로즈 FF 컬럼(Pharmacia) 위에 부하한다. 트리스 염기를 사용하여 pH 3.5로 조절시킨 0.1M 아세트산으로 항체를 용출시킨 다음, 트리스를 사용하여 수거된 분획을 pH 7.5로 조정한다. 이어서, 푸울(pool)을 멸균 투석 튜빙(sterile dialysis tubing)을 사용하여 PBS에 대해 투석하고, 0.2㎛ 여과기를 사용하여 여과 멸균시킨다.

원숭이에 있어 생체외 실험용의 사람화된 C4G1 Fab 단편을 정제하기 위해서는, 농축된 배양 상층액을 20mM 트리스(pH 8.6)에 대하여 투석여과하고 10,000g에서 10분동안 원심분리한 다음, 0.45㎛ 여과기를 통하여 여과시킨다. 샘플을 10mM 트리스(pH 8.6)로 평형화시킨 DEAE 세파로즈(Pharmacia) 컬럼에 적용한 다음, 비흡착 분획을 수집한다. DEAE 푸울을 MES에서 10mM로 만들고 HCl로 pH 6.5가 되게 조정한다. 이어서, 샘플을 10mM MES(pH 6.5)로 평형화시킨 CM 세파로즈(Pharmacia)에 적용하고 0 내지 500mM NaCl 구배로 용출시킨다. Fab 단편은 제1피크에 함유된다. 피크 분획의 푸울을 10,000 MWCO 막을 사용하여 농축시키고 PBS로 평형화시킨 세파크릴 S-200(Pharmacia) 컬럼위에 부하한다. 피크 분획을 수거하고 0.2㎛ 여과기를 사용하여 여과 멸균시킨다.

사람화된 C4G1 F(ab')₂-1의 단편은 다음과 같이 제조 및 정제할 수 있다. 농축된 배양 상층액을 20mM 트리스(pH 8.6)에 대하여 투석여과하고, 10분동안 10,000g으로 원심분리시킨 다음, 0.4㎛ 여과기를 통하여 여과시킨다. 샘플을 10mM 트리스(pH 8.6)으로 평형화시킨 DEAE 세파로스(Pharmacia) 컬럼에 적용하고 비흡착 분획을 수집한다. DEAE 푸울을 10,000 MWCO 막을 사용하여 약 10배로 농축시키고, 아세트산을 사용하여 pH 5.0으로 조정한 다음, 원심분리시켜 침전물을 제거한다. 이어서, 트리스를 사용하여 샘플의 pH를 9.0으로 조정하고, 10mM 환원 글루타티온을 가하고 22℃에서 30분동안 항온처리한다. 이어서, 샘플을 4℃에서 16시간 동안 0.1M 트리스(pH 9.0)에 대하여 투석하면, 약 30%의 F(ab')₂-1이 형성된다. 이어서, 샘플을 10,000 MWCO 막을 사용하여 약 10배로 농축시키고 세파크릴 S-200 컬럼위에 부하한다. 90kDa 피크를 수집하고 0.2㎛ 여과기를 사용하여 여과 멸균시킨다.

생성세포주를 농도가 증가하는 메토트렉세이트내에서 항온처리함으로써 보다 고농도의 사람화된 C4G1 항체 및 단편을 생성시키는 세포주를 수득한다[참조 : Simonsen et al., 상기 참조]. 또다른 방법으로는, 위에서 언급한 바와 같은 재조합 방법 대신 당해 분야에서 널리 공지된 방법[참조 : Antibodies. A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 참조문헌으로 인용함]을 사용하여 완전한 사람화된 C4G1 항체를 효소 절단하여 Fab 및 F(ab')₂단편을 제조할 수 있다.

예를 들면, F(ab')₂-2로 명명된 또다른 형태의 사람화된 C4G1 F(ab')₂단편은 다음과 같이 펩신 분해시켜 제조한다. 사람화된 C4G1 IgG 생성 세포의 배양 상층액은 1M 트리스를 사용하여 pH 8.5로 조정하고 50mM 트리스 pH 8.5, 150mM NaCl, 2mM EDTA로 평형화시킨 단백질 A 친화막장치(Nygene)에 적용한다. 항체 전체를 0.1M 글리신-HCl pH 2.5로 용출시키고 수거된 분획을 1M 트리스로 pH 3.5가 되게 조정한다. 이렇게 제조된 IgG를 돼지 위 점막으로부터의 펩신(Sigma 제조)에 의해 분해시킨다. 펩신을 0.1M 글리신-HCl pH 3.5에 용해시키고 IgG 용액(효소 : IgG비(w/w)는 1 : 100 이어야 한다)에 가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 역위시키면서 항온처리하고, 1M 트리스를 첨가하여 pH를 8.0으로 조정함으로써 반응을 중지시킨다. 이어서, 펩신 분해시킨 분획을 0.75M(NH₄)₂SO₄로 조정하고 50mM CH₃COONa pH 6.0, 0.75M (NH₄)₂SO₄로 평형화시킨 페닐-5pW(Tosoh 제조)컬럼에 적용한다. 샘플을 0.75M 내지 OM(NH₄)₂SO₄의 선형구배로 용출시킨다. F(ab')₂-2는 주 피크내에 함유되어 있다.

사람화된 항체의 특성

사람화된 C4G1 항체는 뮤린 및 키메라 항체와 비교시 특징적이다. 사람화된 항체와 유사한 방식으로 형광 적혈구 측정 분석에서 HEL 92.1.7 세포에 결합되는데(제4도), 이는 사람화된 항체가 GPII_b/III_a항원을 인지한다는 것을 나타낸다.

정제된 사람화된 C4G1 항체, Fab 단편, F(ab')₂-1 단편 및 F(ab')₂-2 단편을 환원시키고 SDS PAGE 겔상에 로오드한다. 전체 항체는 대략 분자량 25kDa 및 50kDa의 2개 밴드를 나타내고, Fab 및 F(ab')₂-1 단편은 대락 25kDa의 이증밴드를 나타낸다. 사람화된 C4G1 F9ab')₂-2단편을 SDS-PAGE 상에서 F(ab')₂-1 단편과 동일한 이동성을 나타낸다. 이들 결과는 그들의 아미노산 조성으로부터 산정한 경쇄 및 중쇄 또는 중쇄 단편의 분자량과 일치한다.

사람화된 C4G1 항체, Fab 단편 및 F(ab')₂-1 단편의 친화도는 각각의 마우스 C4G1 항체 및 단편과의 경쟁적 결합에 의해 측정한다. 정제된 사람 혈소판을 GPII_b/III_a항원의 공급원으로서 사용한다. 이 혈소판은 피콜-하이파이크(ficoll hypaque) 상에서 원심분리시킴으로써 정상 사람 공여체로부터의 연막(buffy coat)으로부터 정제한다. 증가량의 사람화된 또는 마우스 경쟁 항체 또는 단편을 방사성요오드화 트레이서 C4G1 항체(3.5μCi/㎍) 4.5ng에 가하고 변형된 티로드 완충액(Tyrode's buffer) 0.2ml 중에서 실온하에 1시간 동안 3×10⁷개 혈소판과 함께 항온 처리한다. 세포를 빙냉 완충액 2ml로 세척한 다음, 펠렛화한다. 방사능을 측정하고 결합 및 자유 트레이서 항체의 농도를 산정한다(제8도). 각종 항체 및 단편의 결합 친화도는 문헌[참조 : Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029(1989)]에서와 같이 산정한다. 결과는 각각의 사람화된 C4G1 항체와 마우스 C4G1 항체간의 결합 친화도(제8a도) 및 사람화된 C4G1 FAb 단편과 마우스 C4G1 Fab 단편간의 결합 친화도(제8b도) 사람화된 C4G1 F(ab')₂단편과 마우스 C4G1 F(ab')₂단편간의 결합 친화도(제8c도)에 있어 어떠한 상당한 차이도 존재하지 않는다는 것을 명백히 나타낸다. GPII_b/III_a항원의 공급원으로서 HEL 92.1.7 세포를 사용하여 경쟁적 결합을 수행할 경우에도 동일한 결과가 수득된다. 더우기, 이들 세포에 대한 실제 결합 친화도 모두는 대략 10⁸M^-1이상이다.

혈소판 응집을 억제하는 마우스 및 사람화된 C4G1 항체와 단편의 능력을 측정한다. 금방 채혈한 시트레이트화 혈액을 200xg에서 10분 동안 원심분리시킴으로써 제조한 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)에 각각의 항체 또는 단편을 5㎍/ml의 최종 농도로 가하고 37℃에서 교반시키면서 5분 동안 항온처리한다. ADP를 4.6μM의 최종 농도로 가하여 응집을 개시시킨다. 혈소판 응집은 시엔코 듀얼 샘플 응집 측정기(모델 DP-247F 또는 HEMA-TRACER)를 사용하여 광투과로 모니터링한다. 사람화된 C4G1 항체와 마우스 C4G1 항체가 응집을 억제하거나(제9도) 또는 각각의 사람화된 단편 및 마우스 FAb 및 F(ab')₂-1 단편이 응집을 억제시키는데 있어서의 능력에는 현저한 차이가 없었다. 또한 응집을 억제하는 사람화된 C4G1 F(ab')₂-1과 F(ab')₂-2 단편의 능력에 있어서도 전혀 현저한 차이가 없었다.

뮤린 및 사람화된 C4G1 항체가 사람 양막 정맥 내피세포(HUVEC)에 결합하는 것은, GPIII_a에 특이적인, 뮤린 모노클로날 항체 B6A3의 결합과 비교하여 시험한다. 항체가 HEL 92.1.7 세포에 결합하는 것 또한 시험할 수 있다. 항체는 상술한 바와 같이 방사능 표지시킨다(3.5μCi/㎍). 500μl의 HUVEC 또는 HEL 92.1.7(2×10⁴/ml, 2×10⁵/ml, 2×10⁶/ml)의 현탁액을 1.5ml 에펜도르프 튜브내, 실온 또는 4℃에서 100fmol의 각각의 모노 클로날 항체와 90분간 항온처리한다. 항온처리한 후, 튜브 내용물을 에펜도르프 원심분리 튜브내의 실리콘 오일상에 적층시키고 실온에서 10,000xg으로 2분간 회전시킨다. 펠렛 및 상층액을 r 카운터내에서 별도로 계수한다. 비특이적 결합은 100-배과량의 미표지된 항체에서 측정하고 총 결합으로부터 감하여 특이적 결합을 계산한다. 뮤린 및 사람화된 C4G1 모노클로날 항체 모두는 HEL 92.1.7 세포 뿐만 아니라 뮤린 B6A3에 대해 세포밀도 2×10⁵/ml 및 2×10⁶/ml에서 특이적 결합을 나타낸다. 이와 달리, 뮤린 C4G1 이나 사람화된 C4G1 어느것도 어떠한 세포밀도에서 HUVEC에 대해 특이적 결합을 나타내지 않는 반면, 뮤린 B6A3은 2x10⁶/m1에서 HUVEC에 특이적으로 결합한다.

ADP-유도된 혈소판 응집에 대한 생체외 억제 활성

사람화된 C4G1 Fab 및 F(ab')₂단편이 원숭이로부터의 생체의 혈소판 응집을 억제하는 능력에 대해 측정한다. 건강한 사람 지원자로부터의 혈소판 모두가 사람화된 C4G1과 반응한다 해도, 일부 레서스 원숭이로부터의 혈소판은 사람화된 C4G1과 반응하지 않았다. 따라서, 본 실험을 위해서 사람화된 C4G1과 반응하는 혈소판을 지닌 레서스 원숭이만을 선택한다.

각 단편을 5ml의 염수용액중에 현탁시키고 레서스 원숭이(수컷, 체중 2.8 내지 5.0kg)에게 정맥내 투여한다. 위약 투여 대조군에서는, 5ml의 염수 용액을 투여한다, 케타민하이드로클로라이드로 마취시킨 상태에서, 투여 1시간후에 채혈하고, 즉시 시트레이트 처리하여 200g에서 10분산 원심분리시킨다. 상층액을 PRP(혈소판이 풍부한 혈장)로 사용한다. 혈소판이 결핍된 혈장(PPP)은 혈액을 2,000g에서 원심분리시켜 PRP를 제거한 후 잔류 혈액으로부터 제조한다. PRP를 PPP로 희석시켜 3×10⁸/ml의 혈소판 수를 얻는다.

응집을 개시시키기 위해 20μM의 최종 농도로 ADP를 가한다. 광투과로 혈소판 응집을 모니터링한다.

사람화된 C4G1 Fab 및 F(ab')₂-1 단편으로 처리한 원숭이로부터 수득한 혈소판에서는 혈소판 응집이 완전히 억제되었다. 이 F(ab')₂-1 단편은 체중 kg당 0.5mg의 용량으로도 혈소판 응집을 완전히 억제한다. 이 단편의 처리는 원숭이에서 현저한 혈소판 감소증을 유발하지 않는다.

전술한 내용으로부터, 본 발명의 사람화된 면역글로불린은 다른 GPII_b/III_a특이적 항체보다도 여러가지 장점을 제공한다는 것이 명백할 것이다. 마우스 모노 클로날 항체와 비교하여, 본 발명의 사람화된 면역글로불린은 사실상 적은 외래 아미노산 서열을 함유한다. 사람 환자에게 주사한 후 항원성의 이 같은 감소는 현저한 치료학적 개선을 나타내는 것이다.

각각의 문헌과 특허원들이 참고문헌으로서 특정적으로 및 개별적으로 제시된 바와 같이, 본원에서의 모든 문헌 및 특허원들은 참고로 인용되고 있다. 발명을 분명히 하고, 이해를 돕기 위한 목적으로 설명과 실시예에 의해 본 발명이 어느 정도 상세히 기술되긴 했으나, 청구된 특허청구의 범위내에서 특정의 변화 및 변경이 실행될 수 있음이 자명할 것이다.

Claims (14)

1. (1) 사람화된 면역글로불린에 대한 에피토프가 사람 혈소판상의 당단백질 GPII_b/III_a내에 존재하며,

   (2) 사람화된 면역글로불린에 대한 에피토프가 사람 혈관 내피 세포내에 존재하지 않고,

   (3) 사람화된 면역글로불린의 결합 친화도가 약 10⁷M^-1또는 그 이상이며,

   (4) 사람화된 면역글로불린이 효능제와 반응하여 사람 혈소판의 응집을 차단할 수 있는 특성을 갖는, 사람화된 면역글로불린.
2. 제1항에 있어서, 마우스 모노클로날 항체 C4G1으로부터 기원한 상보성 결정 영역(CDR) 하나 이상을 포함하는, 사람화된 면역글로불린.
3. 제2항에 있어서, 상보성 결정 영역이

   (1) ARG ALA SER GLN ASP ILE ASN ASN TYR LEU ASN

   (2) ASN TYR LEU ILE GLU,

   (3) TYR THR SER THR LEU HIS SER,

   (4) VAL ILE TYR PRO GLY SER GLY GLY THR ASN TYR ASN GLU LYS PHE LYS GLY,

   (5) GLN GLN GLY ASN THR LEU PRO TRP THR 및

   (6) ARG ASP GLY ASN TYR GLY TRP PHE ALA TYR로 이루어진 그룹중에서 선택된 사람화된 면역글로불린.
4. 제3항에 있어서, 제5a도에 나타낸 서열 상부의 성숙한 경쇄 가변 영역과 실질적으로 상동성인 서열 및 제5b도에 나타낸 서열 상부의 성숙한 중쇄 가변 영역과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 사람화된 면역글로불린.
5. 제4항에 있어서, 제5c도에 나타낸 바와 같은 성숙한 경쇄 가변 영역과 실질적으로 상동성인 서열 및 제5d도에 나타낸 바와 같은 성숙한 중쇄 가변 영역과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 사람화된 면역글로불린.
6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 사람화된 면역글로불린을 효소로 분해함으로써 수득가능한 사람화된 면역글로불린.
7. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제5항중 어느 한 항에 있어서, Fab 또는 F(ab')₂인 사람화된 면역글로불린.
8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 사람화된 면역글로불린을 포함하는, 혈전색전중 질환 치료제.
9. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 사람화된 면역글로불린의 성숙한 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열 또는 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 사람화된 면역글로불린의 성숙한 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
10. 제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포한하는 발현 벡터.
11. 제10항에 따른 발현 벡터로 형질감염된 세포.
12. 성숙한 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 제1발현 벡터 및 성숙한 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 제2발현 벡터로 이루어진 제58항에 따른 2개의 발현 벡터로 형질감염된 세포.
13. 제11항 또는 제12항에 따른 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 사람화된 면역글로불린을 수집하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 사람화된 면역글로불린의 제조방법.
14. 제11항 또는 제12항에 따른 세포를 배양하는 단계, 배양물로부터 사람화된 면역글로불린을 수집하는 단계 및 수득되는 사람화된 면역글로불린을 효소로 분해하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 사람화된 면역글로불린의 제조방법.