KR0136899B1 - 신규의 링커를 갖는 안트라사이클린 결합체 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Description

신규의 링커를 갖는 안트라사이클린 결합체 및 그의 제조방법

제1도는 본 발명의 면역결합체 제조에 사용되는 신규의 ADM-HZN 히드라존 유도체의 합성을 반응식으로 나타낸 도면.

제2도는 SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)나 혹은 2-IT(2-이미노티올란)을 이용하여 모노클로날 항체(MAB)를 우선 티올화시킨 다음 이 티올화된 항체를 ADM-HZN과 반응시켜 ADM의 13-케토 위치에 히드라존 결합을 가지며 링커암(linker arm)에 디술파이드 결합을 갖는 본 발명의 면역결합체를 형성시키는 단계로 된 본 발명의 한 구체예의 면역결합체의 합성을 도식적으로 나타낸 도면.

제3도는 모노클로날 항체에 치환된 반응성 티올기의 수 (SH/NAB비율)를 SPDP-티올화 5E9 및 3Al 모노클로날 항체를 ADM-HZN과 축합시켜 생산한 면역결합체에서 얻어진 최종 ADM/MAB 몰비율과 비교한 분산도(scattergram).

제4도는 2-IT-티올화 5E9 및 3Al 항체를 ADM-HZN과 반응시켜 생산한 면역결합체에서 얻어진 최종 ADM/MAB몰비율과 SH/MAB 비율을 비교한 분산도.

제5도는 SPDP-티올화 항체 또는 2-IT-티올화 항체를 이용하여 제조한 본 발명의 면역결합체의 단백질 수율과 ADM/MAB몰비율과의 관계를 나타낸 분산도.

제6도는 ADM/MAB 몰비율대 IgG1 이소타잎의 모노클로날 항체(예컨대,5E9 및 3Al)나 도는 IgG₂이소타잎의 모노클로날 항체(예컨대,L6)를 이용한 면역결합체 제조물에서 얻어진 단백질 수율을 비교한 분산도. 상기 항체들은 SPDP로 티올화시킨것들임.

제7도는 2-IT를 이용하여 티올화시킨 것을 제외하고는 (제6도에서와 같이)IgG1 대 IgG2 이소타잎의 항체를 갖는 면역결합체의 단백질 수율을 ADM/MAB몰 비율과비교한 분산도.

제8도는 각각의 결합되지 않은 모노클로날 항체들의 결합 곡선과 본 발명의 2개의 면역결합체의 결합곡선을 비교한 것을 그래프 형태로 나타낸 도면.

제9도는 pH범위 4-7에 있어서의 본 발명의 면역결합체의 안정성을 도시한 HPLC 크로마토그래피를 나타낸 도면. 이 크로마토그래프는 pH가 점점 산성이 되어 갈수록 면역결합체로부터의 유리 ADM 방출이 증가하는 것에 의해 나타나는 바와같이 본 발명의 아실히드라존 결합의 산-민감성을 입증한다.

제10도는 DTT처리후 본 발명의 면역결합체로부터 ADM부분이 방출됨을 나타내는 HPLC 크로마토그래프 도면.

제11도는 연한천 집락 형성 측정법을 이영하여 Daudi 세포주에 대한 본 발명의 면역결합체의 선택적인 세포독성을 그래프 형태로 도시한 도면. 이 면역결합체들은 2-IT-티올화 항체를 이용하여 제조하였다.

제12도는 한계 희석법을 이용하여 Namalwa 세포에 대한 본 발명의 면역결합체의 선택적인 세포독성 및 유리 ADM에 비교했을 때 증가된 본 발명의 면역결합체의 강도를 그래프 형태로 도시한 도면.

제13도는 연한천 집락 형성 측정법을 이용하여 Daudi세포에 대한 본 발명의 면역결합체의 선택적인 세포독성을 그래프 형태로 도시한 도면. 이 경우, 면역결합체는 SPDP-티올화 항체를 이용하여 제조하였다.

제14도는 티올화제로서 SPDP를 이용하여 제조한 본 발명의 다른 면역결합체의 선택적인 세포독성을 그래프 형태로 도시한 도면. 이 면역결합체는 항원-양성 Daudi 세포 및 Namalwa세포에 대해서는 세포독성적이었으나, 항원-음성 HSB-2 세포에 대해서는 세포독성적이지 않았다. 연한천 집락 형성 측정법 이용.

제15도는 집락 형성측정법을 이용하여, 인체 결장암종 세포주 (5E9+, 3A1-)에 대한 본 발명의 5E9 및 3A1의 선택적인 세포독성을 도시한 도면.

제16도는 leu-ala 디펩티드 링커를 통해 ADM의 아미노 당잔기에서 모노클로날항체에 ADM을 부착시킴으로써 제조한 면역결합체의 Daudi 세포에 대한 세포독성의 결여를 그래프 형태로 나타낸 도면.

제17도는 본 발명의 신규의 ADM-HZN 유도체를 환원시킨다음 SMPB(숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트)로 처리한 항체와 반응시켜 그 구조내에 티오에테르 결합이 있는 링커 암을 갖는 면역결합체를 생성시키는 본 발명의 면역결합체의 합성공정을 도식적으로 나타낸 도면.

제18도는 13-케토 아실히드라존 결합에 덧붙여, 그의 링커암내에 티오에테르 결합을 갖는 본 발명의 면역결합체의 독성을 그래프 형태로 도시한 도면. 이 면역결합체는 Namalwa세포에 대해서, 유리 ADM 보다 더 큰 강도를 나타내었다. 3H-티미딘 인코퍼레이션 분석법이용.

제19도는 제18도의 면역결합체의 HSB-2세포에 대한 세포독성을 그래프 형태로 나타낸 도면. 동일한 3H-티미딘 인코퍼레이션 분석법 이용.

제20도는 항원-양성 세포대 항원-음성 세포에 대한 본 발명의 면역결합체의 선택적인 세포독성을 그래프 형태로 나타낸 도면으로, 상기 면역결합체는 13-케토 아실히드라존 결합에 덧붙여, 그의 링커 암내에 티오에테르 결합을 갖는다.

제21도는 마우스에 있어서의 인체 Daudi 종양 이종이식편에 대한 본 발명의 면역결합체의 생체내 항종양 활성을 그래프 형태로 도시한 도면. 상기 면역결합체는 동투여량의 유리 ADM을 사용했을 때 나타난 것보다 더 큰 항종양 활성을 나타내엇다.

제22도는 Q7Dx3처리 계획 및 정맥투여 방식을 사용하여 조사한 마우스에 있어서의 인체 Daudi 종양 이종이식편에 대한 투여량을 달리한 ADM의 생체내 항종양 활성을 일정 기간에 걸쳐 그래프 형태로 도시한 도면.

제23도는 마우스에 있어서의 인체 Daudi 종양 이종이식편에 대한 본 발명의 면역결합체의 생체내 항종양 활성을 최적화시킨 유리 ADM(10-11mg/kg/ 주사의 투여량으로 Q7Dx3 처리 계획에 따라 정맥 투여함)의 항종양 활성과 비교한 것을 그래프 형태로 나타낸 도면. 상기 면역결합체가 더 큰 항종양 활성을 나타내었다.

제24도는 정맥 투여 방식으로 처리 계획과 투여량을 달리하여 조사한 마우스에 있어서의 인체 Ramos 종양 이종이식편에 대한 ADM의 생체내 항종양 활성을 표형식으로 나타낸 도면.

제25도는 일회 주사처리 계획 및 정맥 투여 방식을 이용하여 마우스에 있어서의 인체 Ramos 종양 이종이식편에 대한 ADM의 생체내 항종양 활성을 ADM의 투여량을 달리하여 일정시간에 걸쳐 그래프 형태로 나타낸 도면.

제26A도는 마우스에 있어서의 인체 Ramos 종양 이종이식편에 대한 본 발명의 면역결합체의 생체내 항종양 활성을 최적화 시킨 유리 ADM(16-18mg/kg/주사의 투여량으로 QlDx1 처리 계획에 따라 정맥 투여함)의 항종양 활성과 비교한 것을 그래프 형태로 나타낸 도면. 상기 면역결합체가 유리 ADM보다 더 큰 항종양 활성을 나타내었다.

제26B도는 면역결합체내의 생체내 항종양 활성을 결합체의 투여량을 달리하여 일정시간에 걸쳐 나타낸 도면으로 결합체의 항종양효과의 특성이 투여량 의존성임을 나타낸다. 제26A도 및 26B도에서 시험한 면역결합체의 투여량은 괄호안에 나타낸 항체 투입량과 함께 결합된 안트라사이클린의 인풋으로 주어진다.

제27도는 a)본 발명의 봄베신-ADM결합체; b)본 발명의 EGF-ADM결합체; 및 c)본 발명의 트랜스페린-ADM결합체의 화학적 구조를 도시한 도면이다.

제28도는 각각 역상 C-18 칼럼 및 이온-교환 CX-300 칼럼상에서 행한 시스-봄베신의 2가지 HPLC 크로마토그래프 도면임, 각 크로마토그래피는 220 및 280nm에서 수행하였다. 이 도면은 본 발명의 봄베신-ADM결합체를 제조하는데 사용된 시스-봅베신 제제의 순도를 입증해 준다.

제29도는 본 발명의 시스-봄베신-ADM 결합체의 질량 스펙트럼을 도시한 도면.

제30도는 Swiss 3T3 세포상의 경쟁적 결합분석을 그래프 형태로 나타낸 도면으로, 이때,¹²⁵I-GRP로 본 발명의 시스-봄베신-ADM결합체와 시스-봄베신 또는 GRP의 농도를 증가시키면서 정지시키고 세포에로의¹²⁵I-GRP결합의 저해를 측정하였다. 이 분석은 시스-봄베신-ADM 결합체에 의한 세포상의 봄베신 섭수체에 대한 결합활성의 보유도를 입증하는 것이다.

제31도는³H-티미딘 인코퍼레이션 분석을 이용한, SVT2 세포에 대한 본 발명의 시스-봄베신- ADM 결합체의 세포독성을 그래프 형태로 나타낸 도면임. 결합체는 세포에 대해 유리 ADM이나 ADM-HZN보다 더 강력한 강도를 나타내었다.

제32도는³H-티미딘 인코포레이션 분석을 이용한, HCT116 세포에 대한 본 발명의 시스-봄베신-ADM 결합체의 세포독성을 그래프 형태로 나타낸 도면임.

제33도는³H-티미딘 인코포레이션 분석을 이용한, Swiss 3T3 세포에 대한 본 발명의 시스-봄베신- ADM 결합체의 세포독성을 그래프 형태로 나타낸 도면임.

제34도는 본 발명의 EGF-ADM결합체 제제의 순도를 나타내는 HPLC 크로마토그래프 도면임.

제35도는 A431 세포상의 경쟁적 결합분석을 그래프 형태로 나타낸 도면으로, 이때,¹²⁵I-EGF를 본 발명의 RGF-ADM 결합체나 또는 EGF의 농도를 증가시키면서 정지시키고 세포에로의¹²⁵I-EGF 결합의 저해를 측정하였다. 이 분석은 EGF-ADM 결합체에 의한 세포상의 EGF 섭수체에 대한 결합 활성의 보유도를 입증하는 것이다.

본 발명은 신규의 안트라사이클린 결합체 및 그의 제조방법에 대한 것이다. 더욱 구체적으로 설명하자면, 본 발명은 제거하고자 하는 선별적인 세포집단과 반응성인 제2분자와 이에 13-케토 아실히드라존 결합을 통해 결합된 최소한 하나의 안트라사이클린 분자로 이루어진 결합체에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 한 구체예에 따라, 결합체는 제거하고자 하는 선별적인 세포집단과 반응성인 항체- 이 항체는 그 구조상 공유적으로 결합된 몇 개의 세포독성 안트라사이클린 분자를 가지고 있음- 로 이루어진다.

각각의 안트라사이클린 분자는 링커 암을 통해 항체에 결합되어 있으며, 여기서 안트라사이클린은 그의 13-케토 위치에서 산-민감성 아실 히드라존 결합을 통해 그 링커에 결합되어 있다. 본 발명의 바람직한 한가지 구체예는 아드리아마이신이 13-케토 위치에서 아실히드라존 결합을 통해 링커 암에 부착되어 있는 아드리아마이신 면역결합체에 관한 것이다.

링커는 부가적으로 면역결합체에의 항체 부착부분으로서 디술파이드 또는 티오에테르 결합을 함유한다.

본 발명의 또다른 구체적예에 따라, 안트라사이클린이 링커암을 통해 상피성장인자(EGF)나 봄베신과 같은 배위자(ligand)에 결합되며, 상기 안트라사이클린은 그의 13-케토 위치에서 산-민감성 아실히드라존 결합을 통해 링커에 결합되어 있다. 링커는 그 구조내에 디술파이드 또는 티오에테르 결합을 부가적으로 함유할 수 있다. 덧붙여, 본 발명에 따라, 안트라사이클린의 새로운 아실히드라존 유도체가 합성되며 본 발명의 결합체 제조시 사용된다.

본 발명의 면역결합체의 산-민감성 아실히드라존 결합은 표적 세포의 외부 또는 내부의 산성 환경에서 안트라사이클린을 면역결합체로부터 방출시킨다. 따라서 본 발명의 결합체 및 방법은 암 및 기타 종양, 비-살세포성(non-cytocidal) 바이러스 또는 기타 병원체 감염, 및 자기면역 장애와 같은 질병의 치료에 있어 선택된 세포집단을 차별적으로 죽이기 위한 항체-중개 약물 전달계에서 유용하게 사용된다. 안트라사이클린류는 세포독성 활성을 나타내는 항생물질 화합물이다. 연구결과 안트라사이클린은 다음과 같은 몇가지 상이한 기작에 의해 세포를 죽이는 것으로 나타났다 : 1) 세포의 DNA로 이 약물분자가 삽입(intercalation)됨으로해서 DNA-의존성 헥산 합성을 저해함 ; 2) 이 약물에 의해 생산된 유리기가 세포 거대분자와 반응하여 세포에 손상을 입힘 ; 또는 3) 이 약물 분자가 세포막과 상호반응함[예컨대, C. Peterson외., Transport And Storage of Anthracyclines In Experimental Systems And Human Leukemia, Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy, F.M. Muggia외 (편집), p132 (Martinus Nijhoff 출판사 1982); N.R. Bachur, Free Radical Damage, 동문헌, pp 97-102 참고].

이들의 강한 세포독성 강도 때문에, 안트라사이클린류는 백혈병, 유방암종, 페암종, 난소선암종, 및 육종과 같은 여러 가지 암의 치료에 사용되어왔다. [예컨대, P.H. Wiernik, Current Status of Andriamycin And Daunomycin In Cancer Treatment, Anthracyclines : Current Status And New Developments, S.T. Crooke 외 (편집). pp. 273-94(Academic 출판 1980) 참고].

흔히 사용되는 안트라사이클린류로는 아드리아마이신과 다우노마이신을 들수 있다. 비록 이 화합물들이 선별적인 세포집단이 제거되어야 할 것으로 여겨지는 신생조직 및 기타 질병 상태를 치료하는데 유용하기는 하지만, 이들의 치료적 효능은 이들의 투여에 연관된 투여량 의존성 독성에 의해 종종 제한된다. 예컨대, 종양을 치료하는데 있어서 골수억압과 심장독성은 전형적인 해로운 부작용이다 [ S.T. Crooke, Goals For Anthracycline Analog Development At Bristol Laboratories Anthracyclines : Current Status And New Developments, 상기문헌, p11참고].

이리하여 종양 치료시 종양관련 항원에 지향된 항체에 안트라사이클린을 연결시킴으로써 이러한 화합물들의 치료효과를 개선시키려는 시도가 행해져왔다. 이러한 방식으로서, 약물을 종양부위에 전달 또는 표적화'하는 것이 가능하며 신체의 정상세포에 미치는 그의 독성적인 부작용 효과도 감소시킬 수 있다. 종양관련 항원에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 연결된 안트라사이클린류, 즉 아드리아마이신(ADM)이나 다우노마이신(DAU)으로 이루어진 면역결합체가 기술분야에 알려져 있다 [예컨대, J. Gallego 외, Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor Activity, Int. J. Cancer, 33, pp. 737-44(1984) 및 R. Arnon 외., In Vitro And In Vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies, Immunological Rev., 62. pp. 5-27 (1982) 참고].

항체에 안트라사이클린을 부착시키기 위한 접근방식에서는 안트라사이클린의 아미노 당부분에서의 결합이 가장 빈번히 사용되어왔다. 예컨대, 아미노 당을 과요오드산 나트륨으로 처리함으로써 산화시키고 Schiff 염기 형성을 통해 항체상의 리신 잔기에 직접 부착시킨다 [예컨대, B. Hurwitz 외, The Covalent Binding of Daunomycin And Adriamycin To Antibodies, With Retention of Both Drug And Antibody Activities, Cancer Res., 35, pp. 1182-86 (1975) 참고].

다른 한편 항체의 카르복실기에 안트라사이클린의 아미노당의 카르보디이미드-매개 결합을 통해 안트라사이클린을 항체에 연결시켜왔다. [예컨대, E. Hurwitz 외, 상기문헌 참고]. 또한 안트라사이클린은 약물의 아미노당 및 항체의 아미노기를 글루타르알데히드로 교차 결합시킴으로써 항체에 연결시키기도 하였다 [예컨대, M. Belles-Isles 외, In Vitro Activity of Daunomycin-Anti-Alpha Fetoprotein Conjugate On Mouse Hepatoma Cells, Br. J. Cancer, 41, pp. 841-42 참고 (1980)]. 그러나, 안트라사이클린 분자의 아미노당 부분이 항체에 대한 결합에 의해 변형되어 있는 면역결합체에 대한 연구결과 결합된 약물의 세포독성 활성이 손실된 것으로 나타났다 [예컨대, R. Arnon 외, 상기 무헌, pp 7-8]. 덧붙여, 안트라사이클린 동족체에 행한 연구결과 안트라사이클린의 아미노당 부분에서의 변형은 약물 동족체의 세포독성 활성을 모약물에 비해 저하시키는 것으로 밝혀졌다. [예컨대, K. Yamamoto 외,Antitumor Activity of Some Derivatives of Daunomycin At The Amino And Methyl Keton Functions, J. Med. Chem., 15, pp. 872-75 (1972) 참고].

또한 안트라사이클린, 다우노마이신을 약물의 14-탄소 (C-14) 위치에서 항체에 직접 연결시켜 기타 면역결합체를 제조 하기도 하였다. 그러나, 종양 세포에 대한 이 면역결합체들의 선택적인 세포독성 활성은 재현시키기가 용이하지 않았으며 20μg/ml의 농도인 경우에서만이 변함없이 나타났다 [J.Gallego 외, 상기문헌 참고].

일본 특허출원 제274658호에는 13-케토 아실히드라존 결합을 통해 안트라사이클린을 항체에 결합시키는 것이 기재되어 있다. 이 결합은 항체의 유도화 및 이어서 이 유도체를 안트라사이클린과 반응시키는 단계로된 방법을 이용하여 수행되었다. 그러나 이 방법은 항체의 유도화가 바람직스럽지 못한 비특이적인 반응을 야기시키고 안트라사이클린 : 항체비율이 매우 낮기 때문에 좋은 방법이 못된다.

첫 번째 방법에 따라서는, 히드라진의 존재하에서 항체를 카르보디이미드로 처리하여 히드라지도 항체 유도체를 생산한다음 이를 안트라사이클린과 반응시켜 안트라사이클린이 항체 구조에 직접 연결되게 하였다. 그러나, 결과적인 면역 결합체는 항체 분자와 집단체를 이루기 쉽다. 더욱이, 이 방법은 항체 분자상의 수적으로 제한된 카르복실산기를 요구하기 때문에, 이 면역결합체들은 안트라사이클린 : 항체 비율이 낮다 (약 1.1-1.3).

두 번째 방법에서는 항체를 무수 숙신산과 반응시켜 항체의 아미드산 유도체를 생산한다. 다음 이 유도체를 히드라진과 반응시켜 항체 히드라지드 유도체를 만들고 이를 안트라사이클린, 즉 다우노마이신과 반응시킨다. 이 두 번째 방법은 항체 유도체와 히드라진과의 반응이 비특이적이어서, 목적하는 히드라지드 유도체에 덧붙여서 다른 항체 유도체의 혼합물이 생산된다는 점에서 무효화된다. 그러므로, 274658 출원에서 언급된 바와같이, 안트라사이클린대 항체의 몰비율은 매우 낮다 (약 1, 일본 특허출원, p264, 칼럼1 참고).

또한, 항체의 탄수화물 부분에의 안트라사이클린의 C-13 히드라존 유도체의 결합을 개시하고 있는 유럽특허출원 공개번호 제294294호도 참고 바람.

끝으로, 기타의 안트라사이클린 히드라존류가 G.L. Tong 외, J. Med. Chem., 21, pp. 732-37 (1978); T. Smith 외, J. Med. Chem. Soc., 21, pp. 280-83 (1978); 및 R. T. C. Brownlee 외, J. Chem. Soc., pp. 659-61 (1986)에 기재되어 있다. 또한 다우노마이신 및 아드리아마이신의 비스-히드라존류가 기재 되어있는 미합중국 특허 제4,112,217호도 참고할 수 있다.

다른 연구에서는, 세포독성 활성을 강화시키고 약물의 독성을 저하시키기 위해 안트라사이믈린류를 덱스트란이나 폴리글루탐산과 같은 고분자 담체에 연결시켰다 [예컨대, R. Arnon 외, 상기문헌, p5. 및 E. Hurwitz 외.

Soluble Macromolecules As Carriers For Daunorubicin, J. Appl. Biochem., 2, pp. 25-35 (1980) 참고]. 이 담체-연결 안트라사이믈린류를 또한 종양 관련 항원에 지향된 항체에 공유적으로 결합시켜 종양 세포에 특이적으로 세포독성 약물을 표적화시키기 위한 면역결합체를 생성 시켰다. 예컨대, 아드리아마이신을 카르복시메틸-덱스트란 히드라지드 브리지를 통해 항종양 항체에 연결시키는데 여기서 아드리아마이신의 테트라사이클린 고리의 C-13카르보닐 측쇄에서 카르복시메틸 덱스트란의 히드라진 유도체에 연결시켜 히드라존을 생성하였다. 다음 항체를 글루타르알데히드로 덱스트란 히드라지드에 연결시켜 아드리아마이신-덱스 항체결합체를 만들었다 [R. Arnon외, Monoclonal Antibodies As Carriers For Immunotargeting Of Drugs, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Ttherapy, R. W. Baldwin 외 (편집), pp 365-83 (1985) 및 E. Hurwitz 외, A Conjugate of Adriamycin And Monoclonal Antibodies To Thy-1 Antigen Inhibits Human Neuroblastoma Cells In Vitro, Ann. N. Y. Acad. Sci., 417, pp. 125-36 (1983) 참고]

그러나, 담체의 이용에는 어떠한 불이익이 따른다. 예컨대, 담체-함유 면역결합체는 그 크기가 상당히 크며 생체내의 망상내피계통(reticuloendothelial system)에 의해 신속히 제거된다. [예컨대, R. O. Dillman외, Preclinical Trials With Combinations And Conjugates Of T101 Monoclonal Antiobody And Doxorubicin, Cancer Res., 46, pp. 4886-91 (1986) 참고].

담체-함유 면역결합체의 이러한 급속한 제거는 치료에 유리히지 않을 수 있는데 그 이유는 결합된 약물이 그의 목적하는 작용부위, 즉, 사멸시키고자하는 선택적인 세포군에 도달하게 되지 못하게 때문이다. 덧붙여, 고분자 담체의 존재는 면역결합체의 안정성에 나쁜 영향을 미칠 수 있으며 결합체의 항체의 결합 활성을 저하시키는 것으로 나타났다 [예컨대,M. J. Embleton외, Antiobody Targeting Of Anti-Cancer Agents, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Ttherapy, R. W. Baldwin 외 (편집),pp. 323-24 (1985) 참고]. 더욱이, 종양 세포 연구에서는, 고분자 담체-함유 면역결합체가 생체내 종양세포의 위치를 찾아낼 수 있다는 중거가 없다. 직접- 결합된 약물-항체 결합체가 생체내 종양 세포의 위치를 찾아냄을 입증한 C. H. J. Ford 등의 논문 Localization And Toxicity Study of A Vindesine-Anti-CEA Conjugate In Patients With Advanced Cancer [Br. J. Cancer, 47, 35-42 (1983)]과 비교하기 바람.

이렇게 하여, 특이적인 결합과 담체를 이용함으로써 항체에 안트라사이클린을 결합시키는 것을 기재하였다.

상술한 바와같이. 이러한 면역결합체의 사용에는 사용된 특이 결합이나 담체에 의존하는 분명한 불이익이 수반된다. 특정의 배위자-독소 결합체 역시 개시된 바 있다. 예컨대, I. Pastan의 미합중국 특허 제 4,545,985호에는 다수의 EGF 섭수체를 갖는 세포에 대해 사용하기 위한 용도로 Pseudomonas외독소 (PE)가 EGF에 1:2의 비율로 결합된 외독소 결합체가 개시되어 있다. EGF-리신 A 및 EGF-디프테리아 독소 결합체도 만들어진 바 있다 [예컨대, D. B. Cawley 외., Epidermal Growth Factor-Toxin A Chain Conjugates; EGF-Ricin A Is A Potent Toxin While EGF-Diphtheria Fragment A Is Nontoxic, Cell, 22, pp. 563-70 (1980) 및 N. Shimizu 외., A Cytotoxic Epidermal Growth Factor Cross-Linked To Diphtheria Toxin A-Fragment, FEBS Letters, 118 (No. 2), pp. 274-78 (1980) 참고]. 더욱이, TGF-α, IL-2, IL-6 및 CD4와 같은 성장인자, 단백질 및 폴리펩티드를 이용하여 Pseudomonas 외독소 융합 단백질도 제조되었다 [예컨대, I. Pastan 외., Novel Cytotoxic Agents Created By The Fusion Of GrowthFactor And Toxin Genes, Fourth Internatl. Conference On Monoclonal Antibody Immunoconjugates For Cancer, p. 36 (March 30-April 1, 1989); H. Lorberboum 외., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 1922-26 (1988); V. K. Chaudhary 외., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 4538-42 (1987); C. B. Siegall 외., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 9738-42 (1988); 및 V. K. Chaudhary 외., Nature, 335, pp. 369-72 (1988) 참고].

또한 디프테리아 독소-α-멜라노사이트 자극 호르몬 융합단백질도 만들어졌다 [J R. Murphy 외., Genetic Construction, Expression And Melanoma-Selective Cytotoxicity Of A Diphtheria Toxin-Related α-Melanocyte-Stimulating Hormone Fusion Protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,pp. 8258-62 (1986) 및 J.R. Murphy의 미국 특허 제4,675,382호 참고].

그러나, 단백질 독소를 함유하는 재위자 결합체는 이종이식편 숙주에 있어 면역원적일 것으로 증명될 수 있다. 덧붙여, ADM 또는 DAU와 같은 안트라사이클린류가 트랜스페린[영국특허출원 GB2116979A호] 및 멜라노트로핀 [J. M. Varga 외, Melanotropin-Daunomycin Conjugate Shows Receptor- Mediated Cytotoxicity For Cultured Murine Melanoma Cells., Nature, 267, pp. 56-58 (1977) 참고]과 같은 특정한 단백질 또는 폴리펩티드 배위자에 화학적으로 결합되어있다. PCT 특허출원 WO 88/00837(EGF가 폴리머 담체를 통해 다우노마이신과 같은 세포독성 물질에 결합됨) 및 미국특허 제4,522,750호 및 4,590001호 (트랜스페린이 각각 빈카알킬로이드와 백금에 결합됨) 참고. 본 발명은 세포독성 안트라사이클린 분자를 링커 암을 통해 사멸시키고자하는 선별된 표적세포와 반응할 수 있는 분자에 결합시키는 신규의 화학을 제공한다. 이 세포-반응성 분자는 항체와 같은 단백질이나 봄베신 또는 EGF와 같은 배위자일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에 따라, 몇 개의 안트라사이클린 분자를 선별된 표적세포집단과 반응성인 항체에 결합시킨다. 각각의 안트라사이클린을 링커 암을 통해 항체에 연결시켜 본 발명의 신규한 면역결합체를 만들며, 이때 상기 안트라사이클린은 그의 13-케토 위치에서 아실히드라존 결합을 통해 링커에 부착되어있다. 예컨대, 본 발명의 한가지 바람직한 구체예는 신규의 아드리아마이신 히드라존 유도체 (ADM-HZN)를 합성한 다음 이를 티올화시킨 항체와 축합시켜 이 안트라사이클린을 링커 암을 통해 항체에 부착시키는 것에 관한다.

ADM C-13 위치에 생성된 아실히드라존 결합은 ADM이 링커에 결합하는 장소 역할을 한다. 덧붙여, 항체의 결합부위로서 링커내에 디술파이드 결합이 존재한다. 또다른 바람직한 구체예에 따라, ADM-HZN을 환원시켜 술프히드릴기를 발생시키고 결과된 신규의 히드라존 유도체를 말레이미드 유도화 항체와 축합시켰다. 이렇게 함으로써 ADM의 C-13 위치에의 링커의 결합위치로서의 아실히드라존 결합과 항체에의 링커 결합 부분으로서의 링커내의 티오에테르 결합을 갖는 링커가 생성된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 따라, 신규의 ADM-HZN 중간체를 봄베신, 트랜스페린 또는 EGF와 같은 티올화 배위자에 공유결합시켜 안트라사이클린을 링커 암을 통해 배위자에 부착시켰다. 기타 상술한 구체예에서와 같이, 안트라사이클린의 C -13 위치에서 형성된 아실히드라존 결합을 통해 안트라사이클린을 링커에 결합시킨다.

덧붙여, 디술파이드 또는 티오에테르 결합이 링커 구조내에 존재할 수 있다. 이 구체예들로부터 분명하듯이, 본 발명은 본 발명의 결합체를 제조하는데 유용한 안트라사이클린의 개로운 아실히드라존 유도체를 제공한다. 본 발명의 면역결합체의 안트라사이클린 : 항체의 몰비율은 약4-10이며 선별된 표적 세포를 사멸시키기 위한 세포독성적인 약물 활성과 항체를 모두 다 지니고 있다. 본 명세서에 기재된 안트라사이클린 배위자 결합체는 그 안트라사이클린 : 배위자 비율이 적어도 1이며, 섭수체 결합활성과 세포독성 약물 활성을 모두 보유한다.

이 결합체들에 있어 링커 암에의 안트라사이클린의 결합위치에 산-민감성 히드라존 결합이 존재하며, 부가적으로, 본 발명의 바람직한 구체예의 링커 암중의 디술파이드 또는 티오에테르 결합은 예컨대 리소조옴 소포내와 같이 세포내에서 흔히 겪게되는 환원 및 산성 조건하에서 활성약물을 방출시키기에 이상적으로 적합화된 것이다.

본 발명의 결합체는 본 발명의 결합체의 적어도 한가지의 약리적 유효량과 약리적으로 허용되는 담체로 이루어진 것과 같은, 약리적 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 약리적 유효량의 본 발명의 조성물을 이용하여 약리적으로 허용되는 방식으로 포유동물을 치료하는 방법뿐만 아니라, 제거하고자 하는 선택된 표적 세포 집단으로 세포독성 약물을 선택적으로 전달하는 방법도 포괄한다. 유리하게도, 본 발명에 기재된 면역결합체, 약리적 조성물 및 방법들은 암 및 기타 종양, 비-살세포성 바이러스, 또는 기타 병원체 감염, 및 자가면역 장애등과 같은 질병을 치료하는데 있어 제거하고자하는 표적 세포를 우선적으로 선별 사멸시키기 위해 선택된 세포집단에 세포독성 안트라사이클린 약물을 표적화 시키는데 있어 유용한 접근 방법을 제공한다.

본 발명이 보다 완전히 이해될 수 있도록, 다음에 보다 상세히 기재하였다. 본 발명은 암, 및 기타 종양, 비-살세포성 바이러스 또는 병원체 감염, 및 자가면역 장애와 같은 질병을 치료하는데 있어, 신규의 안트라사이클린 면역결합체, 신규의 안트라사이클린 아실히드라존 유도체, 그들의 제조방법, 약리적 조성물 및 제거하고자 하는 선택된 세포집단에 세포독성 안트라사이클린 을 전달하는 방법에 관한 것이다.

더욱 구체적으로는, 본 발명은 제거하고자 하는 선별된 세포집단과 반응성인 분자와 이에 결합된 적어도 하나의 안트라사이클린 분자로 이루어진 안트라사이클린 결합체에 관한 것으로, 상기 안트라사이클린은 13-케토 아실히드라존 결합에 의해 세포-반응성 분자에 연결되어 있다. 상기 세포-반응성 분자는 항체와 같은 단백질이나 봄베신 또는 EGF와 같은 배위자일 수 있다.

그러므로, 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 선별된 세포집단에 지향되어 있으면서, 그 구조에 결합된 몇 개의 안트라사이클린 분자를 갖는 항체로 된 면역결합체에 관한다. 이 안트라사이클린 분자는 각 분자와 항체사이에 링커 암이 형성되는 식으로 항체에 공유적으로 결합되며, 링커는 안트라사이클린의 13-케토 위치에서 아실히드라존 결합에 의해 안트라사이클린에 결합되어 있다. 또다른 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 선별된 세포집단의 세포표면과 관련된 하나이상의 섭수체와 반응하는 폴리펩티드 또는 펩티드 배위자와 같은, 배위자를 갖는 안트라사이클린-배위자 결합체도 포함하며, 이때 상기 배위자는 그 구조에 결합된 적어도 하나의 안트라사이클린 분자를 갖고 있다. 안트라사이클린은 그의 13-케토 위치에서 아실히드라존 결합에 의해 안트라사이클린에 결합된 링커 암에 의해 펩티드에 공유적으로 결합된다.

본 발명의 결합체는 우선 신규의 안트라사이클린 히드라존 유도체를 생성시킨 다음 이를 적합한 특이성을 갖는 항체와 반응시키는 방식으로 하여 단계적으로 제조할 수 있다. [예컨대, R. R. Hardy, Purificattion And Coupling Of Flurorescent Proteins For Use In Flow Cytometry, Handbook Of Experimental Immunology, 제1권 : 종래의 항체 커플링 기술의 토론을 위한 Immunochemistry, D. M. Weir 외 (편집). pp. 31.4-31.12 (4판, 1986) 참고]. 안트라사이클린과 면역결합체의 항체성분을 연결시키기는 링커 암의 길이는 안트라사이클린에 대한 링커의 결합지점이 안트라사이클린의 C-13 위치에서의 아실히드라존 형태인한 여러 가지로 다양할 수 있다.

링커 암은 약물로부터 항체에 이르는 결합 지점들간의 그 길이를 따라 디술파이드, 티오에테르, 아미드, 카르바메이트, 에테르 또는 에스테르 결합과 같은 다른 결합을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 면역결합체를 구성하는 안트라사이클린은 13-탄소(C-13 위치에 케토기를 함유하는 안트라사이클린이면 어느것이든 무방하다. 이러한 안트라사이클린류에는 아드리아마이신, 다우노마이신, 데토루비신, 카르미노마이신, 이다루비신, 에피루비신, 에소루비신, 4'-THP-아드리아마이신, AD-32, 및 3'-데아미노-3-' (3-시아노-4-모르폴리닐)-독소루비신이 포함되나 이들로 한정되는 것은 아니다 [A. M. Casazza, Experimental Studies On New Anthracyclines, Adriamycin : Its Expanding Role In Cancer Treatment, M. Ogawa 외 (편집), pp. 439-52 (Excerpta Medica 1984) 참고]. 결합체에 있어서, 안트라사이클린과 연결되는 세포-반응성 분자는 제거하고자 하는 세포집단과 결합하거나 반응하는 것이면 어떠한 분자이든지 무방하다. 이러한 분자에는 항체와 같은 고분자 단백질 (일반적으로 10,000 달톤 초과), 저분자 단백질 (일반적으로 10,000달톤 미만), 폴리펩티드 또는 펩티드 배위자, 및 비-펩티드 배위자를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 본 발명의 면역결합체를 구성하는 항체들은 제거하거나 사멸시키고자 하는 특정 세포집단과 반응성인 항체이면 어느것이든 무방하다.

이러한 항체의 예로는, 암종, 흑색종, 임파종, 뼈 또는 연조직 육종에서 발견되는 항원과 같은 종양 관련 항원에 결합하는 항체뿐만 아니라 바이러스 또는 기타 병원체 관련 항원에 결합하는 항체, 및 비정상적인 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 들 수 있으나 이에 한정시키는 것은 아니다. 이 항체들은 폴리클로날이거나 바람직하게는 모노클로날 일수 있으며 기술분야에 잘 수립되어 있는 기술로 생산시킬 수 있다 [예컨대, R. A. DeWeger 외., Eradication Of Murine Lymphoma And Melanoma Cells By Chlorambucil-Antibody Complexes, Immunological Rev., 62, pp. 29-45 (1982). (tumor-specific Polyclonal antibodies Produced and used in conjugates) 및 M. Yeh 외., Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, pp. 2927-31 (1979) 및 J. P. Brown 외 Structural Characterization Of Juman Melanoma-Associated Antigen p97 With Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (No. 2), pp. 539-46 (1981) ( tumor-specific monoclonal antibodies Produced) 참고]. 예컨대, 인체 폐암종 세포에 특이적인 모노클로날 한체 L6, 또는 골육종 세포에 특이적인 모노클로날 항체 791T/36를 이용할 수 있다. 더욱이, 비-내면화 또는 바람직하게는, 내면화 항체도 사용가능하다. 본 발명에서 사용하는 항체라는 용어에는 본래의 고유한 항체분자, 또는 항체 분자의 활성 결합 영역, 예컨대 Fab나 또는 F(ab')를 함유하는 단편이 포함된다. 모노클로날 항체를 이용하는 경우, 항체는 마우스나 사람 기원 또는 잡종(키메릭) 항체일 수 있으나, 이에 한정시키는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 배위자라는 용어에는 선별된 표적세포 집단의 세포표면과 관련된 섭수체에 특이적으로 결합하는 분자이면 어느것이든 포함됨을 이해하여야 할 것이다. 본 발명의 안트라사이클린-배위자 결합체를 생성시키는데 사용될 수 있는 바람직한 배위자에는 트랜스페린, EGF, 봄베신, 가스트린, 가스트린-방출 펩티드, 혈소판-유도성 성장 인자, IL-2, IL-6, TGF-α, VGF-β, 인슐린 및 인슐린-유사 성장인자 I 및 II와 같은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 배위자를 들수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 기타 비-펩티드 배위자에는 스테로이드, 탄수화물 및 렉틴이 포함된다.

이렇게, 예컨대 항체나 배위자와 같은 본 발명의 면역결합체의 세포-반응성 분자는 항체 또는 배위자와 반응성인 특정 세포 집단에 안트라사이클린 분자를 전달하는 역할을 한다. 예컨대, 종양 세포의 표면에서 발견되는 항원에 지향된 항체는 그 종양 세포에 결합하여 그의 안트라사이클린을 전달하며 또한 AIDS를 일으키는 인체 면역결핍 바이러스 (HIV)의 단백질에 지향된 항체는 그의 세포독성 안트라사이클린을 HIV-감염 세포에 전달할 것이다. 이와 유사하게, 암종과 같은 종양세포는 EGF 섭수체와 같은 어떠한 섭수체를 고밀도로 우선적으로 발현시키기 때문에, EGF와 같은 배위자는 그의 안트라사이클린에 결합되어 이를 암종세포에 전달할 것이다.

항체나 배위자가 반응성을 나타내는 특정 세포집단 부위 또는 그 사이에서의 약물 방출은 그 특정 세포를 선별적으로 사멸시키는 결과를 초래한다. 그러므로, 본 발명의 결합체는 제거하고자 하는 특정 세포집단이 결합체가 결합할 수 있는 세포 표면항원을 갖는 세포집단인 질병이면 어느것이든 그의 치료레 유용하다는 것이 분명하다.

본 발명의 면역결합체가 유효한 질병에는 암, 기타 종양, 비-살세포성 바이러스 또는 AIDS, 헤르페스, CMV (시토메갈로바이러스), EBV (엡스타인 바 바이러스), 및 SSPE (아급성경화성전뇌염), 및 류마티스성 관절염과 같은 기타 병원체 감염을 들수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.

이론으로 연결된 것은 아니다, 항체-또는 배위자-연결 안트라사이클린 분자, 즉 본 발명의 결합체의 형태를 띤 분자는 항체 특이성을 통해 사멸시키고자 하는 표적 세포에 전달된 다음 막-부착 비결합 항체 및 배위자의 내면화를 초래하는 동일한 엔도사이토시스 경로를 통해 세포에 들어가는 것으로 믿어지고 있다 [예컨대, I. Pastan 외, Pathway Of Endocytosis Endocytosis I. Pastan 외. (편집). pp 1-44 (Plenum 출판사 1985) 참고].

일단 세포내로 들어가면, 결합체를 함유하여 식균 소포는 1차 리소조옴과 융합하여 2차 리소조옴을 생성시킨다 [예컨대, M. J. Embleton 외, 상기문헌, p334 참고]. 안트라사이클린 분자는 산-민감성 아실히드라존 결합을 통해 결합체의 항체 또는 배위자 성분에 결합하기 때문에, 결합체가 식균 소포 및 리소조옴의 산성 조건에 노출되면 결합체로부터 안트라사이클린이 방출된다. 또한, 방출된 안트라사이클린은 완전한 세포독성 활성 수행능이 있는 비교적 변형되지 않은 약물로 믿어진다.

그러므로, 결합체의 산-민감성 히드라존 결합은 표적 세포내에서 세포독성 약물을 방출시키는데 있어 매우 유리하며, 이 표적 세포들에 대한 결합체의 세포독성을 향상시킨다. 다른한편, 히드라존 결합은 예컨대 종양 부위와 같이 표적 세포의 외부 또는 주변의 환경에서의 산성 및 환원 조건하에서 분해될 수도 있으며, 방출될 수도 있으며, 방출된 약물은 종양 세포에 의해 취해지게 될 것이다.

본 발명의 결합체 및 그의 제조방법을 안트라사이클린, 즉, 아드리아마이신을 여러 항체에 연결시킨 바람직한 구체예로 예시한다. 우선, 신규의 아드리아마이신 히드라존 유도체를 2단계 반응으로 합성시켰다. 이질이작용기 시약인 SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)를 히드라진과 반응시켜 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드를 생성시킨다음 히드라지드를 아드리아마이신 염산염 (ADM-HCl)과 반응시켜 피리딜-보호 디술파이드 부분을 함유하는 ADM의 신규한 아실히드라존 유도체를 생성시켰다. 히드라존 생성을 용이하게 하기 위해 트리플루오로초산과 같은 산 촉매를 사용할 수도 있다.

생성된 유도체는 13-3-(2-피리딜디티오)프로피오닐-히드라존 염산염 (ADM-HZN)이라고 표시하였다 (제1도 참고). 다음, 이 신규의 ADM-히드라존 유도체를 SPDP로 미리 티올화시킨 모노클로날 항체와 반응시킨다음 2-IT (2-이미노티올란)로 티올화 또는 환원시켰다 (제2도 참고).

결과적인 면역결합체는 아실히드라존 결합을 통해 각 ADM의 C-13 위치에 부착되어 있는 링커 암에 의해 모노클로날 항체에 결합된 ADM 분자로 이루어져 있으며, 여기서 링커 암은 부가적으로 디술파이드 결합을 가지며 이를 통해 항체에 부착되어 있다. (제2도 참고).

본 발명의 또다른 구체예는 또다른 신규의 아드리아마이신 히드라존 유도체의 합성에 관계되는데 여기서는 상술한 ADM-HZN을 환원제인 DTT(디티오트레이톨)나 트리부틸 포스핀으로 추가 처리하여 13-｛3-(메르캅토프로피오닐)｝아드리아마이신 히드라존을 생성시켰다 (제17도 참고). 다음 이 유도체를 예컨대 SMPB (숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트)와 반응시킴으로써 말레이드가 부착된 모노클로날 항체와 반응시켰다.

제17도에 나타난 바와같이 각 ADM의 C-13 위치에서의 히드라존 결합에 의해 부착된 링커 암과 항체에 대한 부착 부분으로서 티오에테르 결합을 갖는 면역결합체를 생성시켰다.

그러므로, 약물과 항체를 연결시키는 링커 암은 결합이 안트라사이클린의 13-케토 위치에서 산-민감성 히드라존 결합을 함유하는 것인한 몇가지 성분과 결합으로 이루어질 수 있다. 또다른 구체예에 따라, 본 발명의 신규한 ADM-HZN 유도체를 봄베신, EGF 또는 트랜스페린과 같이, 티올기를 지니게끔 먼저 유도시킨 배위자와 반응시켰다. 봄베신의 경우, 시스테인 잔기를 펩티드의 아미노 말단에 도입하여 ADM-HZN 과의 결합을 위해 반응성 술프히드릴기를 제공하였다.

쥐의 EGF의 경우, 이 폴리펩티드를 SPDP와 반응시켜 ADM-HZN과의 결합을 위해 분자의 아미노 말단에 반응성 술프히드릴기를 도입하였다. 트랜스페린의 경우, 이 단백질을 먼저 2-IT와 반응시켜 단백질 구조상에 반응성 티올기를 도입하였다.

각 경우에 있어서, 티올화된 배위자를 ADM-HZN과 반응시켜 배위자와 약물 사이에 링커를 갖는 본 발명의 안트라사이클린-배위자 결합체를 생성시켰다. 이때 링커는 아실히드라진 결합을 통해 각각의 안트라사이클린의 C-13 위치에 부착되어 있다. 덧붙여, 링커는 그 구조내에 디술파이드 결합을 함유한다 (제27도 참고).

다른 한편, ADM-HZN을 DTT로 환원시킨 다음 (면역결합체 제조시 상술한 바와 같음) 말레이미드기가 부착되어 있는 배위자와 상술한 바와같이 반응시킬 수 있다. 그러므로 ADM의 C-13 위치에 히드라존 결합에 의해 부착되어 있고, 그 구조내에 티오에테르 결합을 함유하는 링커 암을 갖는 ADM-배위자 결합체를 제조할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 다음의 일반식 I, II 또는 III을 갖는 13-케토-함유 안트라사이클린의 신규한 아실히드라존 유도체를 제공한다:

상기 일반식중, R¹은 CH₃, CH₂OH, CH₂OCO(CH₂)₃CH₃,, CH₂OCOCH (OC₂H₅)₂이고;

R는

또는

으로서 이때 X는 H, NO2 또는 할로겐이고 R³은 OCH₃, OH 또는 수소이고; R⁴는 NH₂, NHCOCF3 , 4-모르폴리닐, 3-시아노-4-모르폴리닐, 1-피페리디닐, 4-메톡시-1-피페리디닐, 벤질아민, 디벤질아민, 시아노메틸아민 또는 1-시아노-2-메톡시에틸아민이고; R⁵는 OH, O-THP 또는 수소이며; R⁶은 OH 이거나, 또는 R⁵가 OH 또는 O-THP인 경우 R⁶이 OH가 아니라면, 수소이고; n은 1에서 10까지의 정수임;

상기 일반식중, R¹은 CH₃, CH₂OH, CH₂OCO(CH₂)₃CH₃,, CH₂OCOCH (OC₂H₅)₂이고; R³은 OCH₃, OH 또는 수소이고; R⁴는 NH₂, NHCOCF₃, 4-모르폴리닐, 3-시아노-4-모르폴리닐, 1-피페리디닐, 4-메톡시-1-피페리디닐, 벤질아민, 디벤질아민, 시아노메틸아민 또는 1-시아노-2-메톡시에틸아민이고; R⁵는 OH, O-THP 또는 수소이며; R⁶은 OH 이거나, 또는 R⁵가 OH 또는 O-THP인 경우 R⁶이 OH가 아니라면, 수소이고; n은 1에서 10까지의 정수임;

상기 일반식중, R¹은 CH₃, CH₂OH, CH₂OCO(CH₂)₃CH₃,, CH₂OCOCH (OC₂H₅)₂이고;

R²는

또는

으로서 이때 X는 H, NO₂또는 할로겐이고 R³은 OCH₃, OH 또는 수소이고;

R⁴및 R⁷은 각각 수소, 알킬, 치환 알킬, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환아릴, 아르알킬 또는 치환아르 알킬이거나; 또는 R⁴, R⁷및 N이 함께 4내지 7원 고리를 형성하며, 여기서 상기 고리는 임의로 치환될 수 있으며; R⁵는 OH, O-THP 또는 수소이고; R⁶은 OH 이거나, 또는 R⁵가 OH 또는 O-THP일때 R⁶이 OH가 아니라면, 수소이고; n은 1에서 10까지의 정수이다.

상기 안트라사이클린 아실히드라존류는 본 발명의 결합체의 제조시 신규의 중간체를 나타내며 기재된 바람직한 구체예에서 설명되는 바와같이, 각각 ADM-HZN 및 13-｛3-(메르캅토프로피오닐)｝아드리아마이신 히드라존에 의해 예시된다.

상기 일반식으로부터 알수 있는 바와같이, 본 발명의 아실히드라존 중간체에는 아드리아마이신, 다우노마이신 및 카르미노마이신과 같은 몇가지 공지의 안트라사이클린중 어느것의 히드라존이던지 포함된다. 덧붙여, 이 중간체에는 안트라사이클린 구조상의 특정위치에서 유도된 아실히드라존류(예컨대, 4'THP-아드리아마이신 히드라존 및 3'-데아미노-3'-(3-시아노-4-모르폴리닐)아드리아마이신 히드라존)가 포함된다.

후자의 이 중간체들은 우선 안트라사이클린을 유도화시켜 목적하는 동족체를 만든다음 이 동족체를 이용하여 본 발명의 히드라존 중간체를 제조함으로써 합성할 수 있다. 공지의 안트라사이클린 동족체로는 미합중국 특허 제4,464,529호 및 제4,301,277호에 기재된 (3'-데아미노-3'-(4-모르폴리닐) 또는 3'-데아미노-3'-(3-시아노-4-모르폴리닐)안트라사이클린 동족체), 미합중국 특허 제4,202,967호 및 제4,314,054호 (3'-데아미노-3'-(1-피페리디닐) 또는 3'-데아미노-3'-(4-메톡시-1-피페리디닐)안트라사이클린 동족체), 미합중국 특허 제4,250,303호 (N-벤질 또는 N,N-디벤질 안트라사이클린 동족체), 미합중국 특허 제4,591,637호 (N-메톡시메틸 또는 N-시아노메틸 안트라사이클린 동족체) 및 미합중국 특허 제4,303,785호 (안트라사이클린의 아세탈 동족체)를 들수 있다.

이렇게, 이들 공지의 안트라사이클린 동족체를 상술한 바와같이 반응시켜 신규의 아실히드라존류를 제조한 다음 이를 기재된 바와같이 목적하는 특이성을 갖는 항체 또는 배위자에 결합시킬 수 있다. 다른 한편, 본 발명의 유도되지 않은 아실히드라존 중간체는 기재된 바와같이 아드리아마이신, 다우노마이신 또는 카르미노마이신과 같은 유도되지 않은 안트라사이클린으로부터 제조할 수 있으며, 다음 이 신규의 중간체를 유도화시켜 목적하는 바와같이 치환된 신규의 아실히드라존을 얻을 수 있다. 예컨대, 미합중국 특허 제4,464,529호에 기재된 공정을 이용하여 ADM-HZN을 그의 아미노 당 부분에서 2,2'-옥시디아세트알데히드로 환원적으로 아민화시켜 유도화하여 3'-데아미노-3'-(3-시아노-4-모르폴리닐) 아드리아마이신 히드라존을 생산할 수 있다. 이와 유사하게, ADM-HZN을 아미노 당 부분에서 유도화하여 3'-데아미노-3'-(4-모르폴리닐)ADM 히드라존 (미합중국 특허 제4,301,277호 참고) 3'-데아미노-3'-(1-피페리디닐)ADM 히드라존 (미합중국 특허 제4,202,967호 참고), 3'-데아미노-3'-(4-메톡시-1-피페리디닐) ADM 히드라존 (미합중국 특허 제4,314,054호 참고), N-벤질 ADM 히드라존 및 N,N-디벤질 ADM 히드아존 (미합중국 특허 제4,250303호 참고) 또는 N-메톡시메틸 ADM 히드라존 및 N-시아노메틸 ADM 히드라존(미합중국 특허 제4,591,637호 참고)과 같은 신규의 아실히드라존 유도체를 제조할 수 있다.

덧붙여, 미합중국 특허 제4,303,785호에 기재된 바와같이 알반식 I-III의 R 위치에서 ADM-HZN을 유도화하여 4'-THP-ADM 히드라존과 같은 히드라존의 아세탈 유도체를 제조할 수 있다.

본 발명의 아실히드라존류를 유도화시키기 위한 이 새로운 공정들은 안트라사이클린의 출발물질 히드라존으로서 ADM 외에 다우노마이신이나 카르미노마이신을 이용하여, 역시 본 발명의 범주에 속하는 N-벤질 다우노마이신 히드라존 또는 3'-데아미노-3'-(4-모르폴리닐)카르미노마이신 히드라존과 같은 신규 화합물을 제공할 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명에 따라 제조한 안트라사이클린-항체 면역 결합체의 평가결과 이 면역결합체는 여러 가지 분석 조건하에서 임파종 및 암종 세포 모두에 대해 항체-지향 세포 사멸성을 나타냈으며 항체 결합 활성을 유지한 것으로 나타났다.

이렇게 해서 결합체의 항체가 지향된 항원을 갖는 세포들은 안트라사이클린에 의해 효과적으로 사멸되는 반면 이러한 항원을 갖지 않은 세포들은 사멸되지 않는다. 사실 몇가지의 실험에서, 항체-전달된 안트라사이클린은 동량의 비결합 안트라사이클린보다 더 강력한 것으로 밝혀졌다.

종양세포로의 흡수(업티이크)기작 및 세포내 전달 기작의 차이가 유리 약물 및 항체-결합 약물사이에 관찰되는 강도의 차이의 원인이 될 수 있을 것이다. 게다가, 마우스에 있어서의 인체 종양 이종이식편을 이용한 연구는 본 발명의 면역결합체가, 몇가지 경우 종양을 완전히 퇴화시키는 생체내 종양 발육 억제 능력을 가짐을 증명하였다.

본 발명의 면역결합체는 비결합 안트라사이클린에 비해 더 큰 강도를 지니고 종양 발육을 더 광범위하게 억제하는 것으로 나타났다. 더욱이, 본 면역결합체는 유리 약물보다 동물에 의해 훨씬 더 많이 인내되며, 결합되지 않은 단독의 안트라사이클린 보다 적어도 10배 덜 독성적이다.

본 발명의 면역결합체의 결합 및 세포독성 특성은 안트라사이클린의 아미노 당 부분을 통해 항체에 직접 안트라사이클린을 연결시킨 문헌에서 보고된 면역결합체들 보다 개선된 것으로 나타난다. 상기와 같은 아미노 당-연결 면역결합체들은 종종 안트라사이클린대 항체의 몰비율리 낮으며 유리 약물에 비해 세포독성이 저하되고 항체 결합 특성도 저하된 것으로 나타났다 [예컨대, R. Arnon 외, Immunological Rev., 62, 상기문헌; E. Hurwitz 외, Cancer Res., 35, 상기문헌; 및 R. Yamamoto 외, 상기문헌 참고].

또한, 본 발명의 면역결합체에 대해 수행한 안정성 시험결과 안트라사이클린은 세포 환경에서 발견되는 것과 유사한 환원 및 산성 조건하에서 면역결합체로부터 방출되는 것으로 나타났다.

그러므로, 본 명세서에 기재된 면역결합체에서 관찰되는 높은 세포독성 약물활성의 보유는 비교적 변형되지 않은 약물이 표적세포에 전달된다는 사실로 설명될 수 있을 것이다.

덧붙여, 본 발명자들은 몇가지의 상이한 이소타잎의 항체를 이용하여, 안트라사이클린 : 항체 분자의 몰비율이 약 4-10이 되도록 반응조건을 최적화시킬 수 있었다. ADM-HZN 유도체로 축합시킨후 회수된 단백질의 양은 몰비율이 10을 초과하자 극적으로 감소하였다. 몰비율이 10을 초과하는 경우에 면역결합체를 수득하는데 있어서의 주요 제한사항은 수용액중에서의 결합체의 용해도 저하와 안트라사이클린과 단백질과의 물리적 연결에 기인하는 것으로 나타났다.

생체외 연구결과 본 발명의 안트라사이클린-배위자 결합체가 표적세포를 사멸시키는 능력이 입증되었다. 예컨대, 본 발명자들의 연구결과 어떠한 안트라사이클린-배위자 결합체는 종양세포에 대한 세포독성을 유지하는 한편 그들의 특이적인 섭수체 결합활성을 보지하는 것이 입증되었다.

그러므로, 여기 기재된 바와같이 제조한 시스-봄베신-ADM 결합체는 비결합 시스-봄베신의 경우 관찰된 것과 동일한 정도의 결합활성을 봄베신 섭수체-양성세포주에 대해 나타내며 생체외에서 형질전환된 섬유아세포에 대해 고도로 세포독성적이었다. 사실, 시스-봄베신-ADM 결합체는 유리 ADM 이나 ADM-HZN 보다 훨씬 강력하였다.

덧붙여, EGF-ADM 결합체와 트랜스페린-ADM 결합체도 기재된 바와같이 제조되었다. 유리약물에 비해 본 발명의 면역결합체의 항종양 활성이 개선되어 있으며 또한 그들의 전신에 미치는 독성이 낮음을 보이는 본 발명자들의 생체내 연구결과는 본 발명의 면역결합체의 증가한 치료율을 가리키는 것이다. 그러므로, 본 발명은 또한 암 및 기타 종양, 비-살세포성 바이러스 또는 기타 병원체 감염, 및 자가면역 질병과 같은 질병을 치료하기 위한 약리적 조성물, 배합물 및 치료방법도 포함한다. 더욱, 구체적으로는 본 발명은 적어도 한가지의 안트라사이클린을 함유하는 결합체의 약리적 유효량을 약리적으로 허용되는 방식으로 숙주 포유류에게 투여하는, 포유류에 있어서의 질병 처리방법을 포함한다.

본 발명의 방법의 다른 구체예에는 조합적인 화학 요법에서의 이용을 위해, 몇가지 상이한 항체나 배위자를 갖는 결합체들을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것도 포함된다,

예컨대, 본 발명의 한 구체예에는 결합체의 항체 성분의 특이성을 달리하는 몇가지의 안트라사이클린-면역결합체, 즉각 면역결합체가 상이한 항원 또는 목적하는 세포집단에 존재하는 동일한 항원상의 상이한 에피토프, 또는 상이한 부위에 결합하는 항체를 갖는 몇가지 면역결합체를 이용하는 것이 포함될 수 있다. 이 면역결합체들의 안트라사이클린 성분은 같거나 다를 수 있다.

예컨대, 이 구체예는 종양 표면상의 여러 항원의 양을 알 수 없거나, 항원 발현에 있어서 종양세포집단이 이질적인 경우, 그리고 충분한 양의 약물이 종양부위의 모든 종양세포에 표적되었는가를 알고 싶은 경우에 특정종양을 처리하는데 특히 유용할 수 있다. 종양에 대해 상이한 항원적 또는 에피토프 특이성을 나타내는 몇가지 결합체를 사용하면 종양 부위에서 충분한 약품을 얻을 가능성이 증가된다. 덧붙여서, 이 구체예는 정상

조직이 모두 동일한 종양 관련 항원을 가질 가능성이 적기 때문에 종양에 대해 고도의 특이성을 얻는데 있어 중요하다 [참고. I. Hellstrom 외, Monoclonal Antibodies To Two Determinants Of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity, J. Immunol., 127 (No.1), pp. 157-60 (1982)].

다른 한편, 결합체중 안트라사이클린 성분만 다른 몇가지 상이한 면역결합체도 이용할 수 있다. 예컨대, 특정 항체를 다우노마이신에 연결시켜 제2의 면역결합체를 생성시킬 수 있다. 다음 두 결합체 모두 치료할 숙주에 투여하면, 항체 특이성에 의해, 제거하고자 하는 특정 세포집단의 부위로 국소화될 것이다. 다음 두 약물은 모두 그 위치에서 방출되게 된다. 이 구체예는 종양과 같은 특정 세포집단의 약물 내성이 불분명한 경우에 중요한데 그 이유는 이 방법이 표적 세포내 또는 표적 세포 부위에서 몇가지의 상이한 약물을 방출시키기 때문이다.

추가적인 구체예에는 한가지 이상의 안트라사이클린을 특정한 항체에 결합시켜 그의 표면에 여러 가지 상이한 안트라사리클린 분자를 갖는 면역결합체를 생성시키는 것이 포함되는데 여기서 모든 안트라사이클린 분자는 13-케로 아실히드라존 결합을 통해 항체에 연결시킨다. 이 구체예의 면역결합체를 투여하면 표적 세포내에 또는 그 부위에서 몇가지 다른 약물이 방출된다. 더욱이, 특이한 항원뿐 아니라 그의 표면에 특이한 배위자에 대한 섭수체를 지니는 세포집단에 약물을 표적시키는 경우 안트라사이클린-항체 및 안트라사이클린-배위자 결합체의 배합물을 이용할 수 있다.

본 발명의 안트라사이클린 결합체는 정맥,복강,경구,임파구,또는 종양과 같은 특정 세포집단의 부위에 직접 투여하는 것과 같은 통상적인 투여형태를 이용하여 약리적 조성물 형태로 투여할 수 있으나, 투여방식을 상기와 같이 제한하는 것은 아니다. 정맥 투여 방식이 바람직하다. 면역결합체의 경우, 생체내 치료에서는, 잡종항체나 Fab 또는 F(ab')₂와 같은 항체 단편을 함유하는 결합체를 이용하는 것이 유용할 수 있다.

본 발명의 약리적 조성물-안트라사이클린 면역결합체를 포함하는 -은 정제,알약,분말제,액상용액 또는 현탁액,좌약,폴리머 마이크로캡슐 또는 마이크로베지클, 리포조옴, 및 주사용 또는 주입용 용액과 같은 여러 가지 고체, 반고체 및 액체 투여 형태일 수 있으며 상기예로 국한되는 것은 아니다. 바람직한 형태는 투여방식 및 치료응용에 의존한다.

약리적 조성물에는 또한 인체 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질,물,또는 염 또는 인산염과 같은 완충물질, 또는 전해질과 같이 기술분야에 알려진 종래의 약리적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.

본 발명의 결합체 조성물의 가장 효과적인 투여 형식 및 복용 섭생은 병의 위중도와 경과, 환자의 건강상태 및 치료에 대한 반응 그리고 치료를 담당하는 의사의 진단에 따라 달라진다. 따라서, 결합체 및 모든 부수적 화합물의 복용은 각 환자에 따라 적정되어야만 한다. 그럼에도 불구하고 본 발명의 안트라사이클린 면역결합체의 효과적인 투여량은 약 1-약 100mg/m²안트라사이클린 또는 약 500-5000mg/m²항체의 범위에 든다 할 수 있다. 안트라사이클린-배위자 결합체의 유효량은 약1-약 100mg/m²안트라사이클린 또는 약1-약100mg/m²배위자의 범위일 수 있다.

본 발명의 보다 완전한 이해를 돕기위해, 다음의 실시예를 실었다. 이러한 실시예들은 오직 설명 목적을 위한 것으로서 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 한정시키고자함이 아님을 이해하여야만 한다.

실시예 1

다음의 실시예는 약물이 그의 13-케토 위치에서 히드라존 결합을 통해 모노클로날 항체에 직접 연결된 본 발명에 따른 신규의 안트라사이클린 면역결합체의 제조에 관한 것이다.

본 실시예에 기재된 특정구체예는 ADM을 모노클로날 항체에 결합시켜 면역결합체의 ADM 분자에 대한 부착지점으로서 아실히드라존 결합을 갖는 링커 암을 갖는 면역결합체를 생성시키는 것에 관한 것으로, 여기서 링커는 항체에 대한 그의 부착 부분으로서 디술파이트 결합을 추가로 갖는다. 본 구체예는 또한 ADM의 신규한 아실히드라존 유도체(ADM-HZN)도 제공한다.

아드리아마이신 히드라존의 형성

본 구체예의 면역결합체의 제조에 있어 첫번째 단계로서, ADM-히드라존 유도체를 우선 다음과 같이 합성하였다: 이소프로필 알코올중의 0.3ml의 1M 히드라진, 즉 NH₂NH₂용액을 THF(테트라히드로퓨란)3중의 SPDP(70mg,0.22mmol)의 차가운 용액에 첨가하였다. 0℃에서 20분간 교반시킨후, 생성물을 CH₂Cl₂로 추출하고, 염수로 세척하고 K₂CO₃로 건조시켰다. 용매를 증발시킨 후 얻은 잔사를 중성 알루미나 (5% MeOH,95%CH₂Cl₂)로 크로마토그래피 시켜 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(제1도의 화합물2) 21mg(41%)을 얻었다. 이 히드라지드와 아드리아마이신 HCI(Sanraku Inc. 사제,일본)을 MeOH 5ml에 용해시킨다음 실온의 암실에서 6일간 교반시켰다. 반응후 역상 박층 크로마토그래피(TLC)(MeOH : H₂O= 2:1, 3% w/v NH₄OAc함유)처리하였다. 이 기간후, 용매를 증발시키고 잔사를 C18컬럼상에서 크로마토그래피 처리하였다.(MeOH : H₂O=3:2, 3% w/v NH₄OAc함유). 분획들을 모아 동결건조시키고 감압하에서 초과량의 NH₄OAc를 제거하였다. 잔사를 MeOH에 용해시키고 아세토니트릴을 첨가하여 침전시켜 아드리아마이신 13-(3-(2-피리딜디티오)프로피오닐)-히드라존 염산염(이하 ADM-HZN이라 약칭 제1도의 화합물 4) 45mg(72%)을 얻었다. ADM-HZN은 다음의 특성을 갖는다: 융점125°어두워지며 잘 정의되지않음: NMR(아세톤-d₆δ) 1.25(s,3H, J=6HZ),1.77(m.1H), 2.06(m,1H), 2.30(m,1H), 2.53(d,1H,J=15HZ), 2.89-3.8(m,6H), 3,71(m,1H), 3.85(m,1H), 3.97(m,1H), 4.07(s,3H), 4.78(s,2H), 5.21(m,1H), 5.58(t,1H,J=7HZ), 7.12(m,1H), 7.64(d,1H,J=8HZ), 7.75(m,2H), 7.90(t,1H,8HZ),7.98(d,1H,J=8HZ), 8.37(d,1H,J=4HZ), 10.50(s,1H), 10.52(s,1H),14.19(bs,1H); IR(KBr)3438, 1674, 1618, 1579, 1419, 1286, 1016, 988, 698cm^-1; FABMS(글리새롤)m/e 755(M+1), 737, 645, 625, 609.

모노클로날 항체의 티올화

상술한 바와 같이 제조한 ADM-HZN을 생각해둔 모노클로날 항체로 반응시키기전에, 항체는 티올화 시켜야만, 즉 항체 분자상에 반응성 슬프히드릴기를 도입하여야한다.

사용한 모노클로날 항체들은 다음과 같다: 1)5E9, 모든 분열하는 인체 세포상의 트랜스페린 수용체와 반응성이고 암 세포의 여러 가지 조직형과 교차 반응성인 IgG₁항체; 2)T33A1(이하 3A1이라 약칭), 40Kd 인체 T세포 항원과 반응성이며 몇몇 T세포 백혈병에서도 발견되는 IgG1 항체; 3) G28.5, 50Kd 인체 B세포 항원과 반응성이고 인체 B세포 임파종과도 반응성인 IgG1 항체 ; 4) G28.1, 39Kd 인체 B세포 항원과 반응성이고 B세포 임파종과도 반응성인 IgG1 항체; 및

5)L6,인체의 비-소형 세포 폐 암종상의 당지질 항원과 반응성인 IgG2a 항체.

5E9 및 T3341모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 얻었다. C.Bruck 등의 One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies From Ascitic Fluid By DEAR-Affigel Blue Chromato graphy,J.Immun.Methods. 5b.pp.319-19(1982)에 따라 BALB/c마우스에서 생산된 복수로부터 각각의 항체를 정제하였다. 정제한G28.5, G28.1 및 L6 은 J.Ledbefter박사와 I.Hellstrom박사(Oncogen사;시애틀,워싱턴)가 제공하였다. L6 및 G28.5 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마는 각각 1984년 12월 6일 및 1986년 5월 22일자로 ATCC에 기탁하여 수탁번호 HB8677 및 HB9100을 부여 받았다. G28.1 모노클로날 항체는 기술분야에서 CD37항원의 주요 에피토프와 반응성인 것으로 알려진 몇가지 항체중의 하나이며 A.J.Michael(편집) Leukocyte Typing III, 옥스포드 대학교 출판(영국,1987)에 의해 특정지워졌다. 이러한 항- CD37 항체중 몇가지는 상업적으로 구득할 수 있다.

이 항체들중 어느것이던지를 SPDP로 타올화시키는 것은 다음과 같이 수행하였다: 에탄올에 용해시킨 SPDP(Pierce Chemical Co.사제.이리노이) (50mM)를 PBS 중 선택한 모노클로날 항체, 예컨데, 5E9(5-10mg/ml)에 첨가하여 최종농도 5-10mM DL 되게 하였다. 반응혼합물을 30℃에서 30분간 정치시켰다. 미반응 SPDE를 PD-10컬럼(Pharmacia사제)을 이용하여 겔 여과 크로마토그래피 처리하여 SPDP-유도화 항체로부터 분리하엿다. 티오피리딜 보호기를 과량의 DTT로 환원시킴으로써 제거하였다. 환원된 항체를 PD-10컬럼에 통과시켜 유리티올-함유 항체를 ADM-HZN 유도체와 축합시키는데 사용하였다. (제2도 참고)

반응성 티올기를 또한 21T를 이용하여 항체 단백질상에 도입하였다: 항체((pH8.0의 1mM EDTA, 50mM NaCl, 50mM 트리에틸아민중의 5-10mg/ml)를 최종농도 5-10mM이 되게 21T(Pierce Chemical Co.사제.일리노이)와 혼합하였다. 4℃에서 90분간 반응을 수행하여 티올화 항체를 2M Nacl/PBS로 평형화시킨 PD-10 칼럼에서 분리하였다.

항체에 삽입된 반응성 티올기의 숫자를 G.L.Ellman,Arch. Biochem. Bioptys., 82, pp. 70-77(1959)의 공정에 따라 DTNB(5,5'-디티오비스-2-니트로벤조산)(E412=14150)를 이용하여 결정하였다.

티올화 모노클로날 항체와 ADM-HZN 과의 결합

상술한 바와 같이 티올화된 모노클로날 항체를 각각 ADM-HZN에 연결시키는 몇가지 결합을 다음에 수행하였다(제2도 참고).

ADM-HZN을 메탄올에 용해시키고 PBS 중의 SPDP-티올화 항체나 또는 2M NaCl/PBS중의 2-IT-티올화 항체에 첨가하였다. 일반적인 실험에서는, 10-20개의 반응성 티올기를 함유하는 모노클로날 항체에 ADM-HZN 10 당량을 첨가하였다. 결합반응은 4℃에서 하룻밤 정지시켜 행하엿다. 반응 혼합물을 10,000 x g로 원심분리 시킨 다음 결합된 ADM 을 PD-10컬럼을 통과시킴으로써 미반응 ADM으로부터 분리시켰다. 항체에 결합된 안트라사이클린의 양을 495nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. (E₄₉₅=8030). 항체 단백질의 양은 280nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다.(1mg?mi=1.4 OD단위). 280nm에서의 ADM 흡광도의 중복을 보정하기 위해 다음 공식을 이용하였다.

면역결합체를 HPLC분석을 이용하여 미결합 ADM 도는 ADM 유도체의 존재에 대해 분석하였다. HPLC는 5마이크론 IB-SIL C18 비이드로 충전시킨 PHENOMENEX 칼럼을 이용하여 수행하였다. 비결합 ADM-HCl, ADM-HZN (0.1μ mole), 또는 0.5-5μmole 약물 당량을 함유하는 면역결합체를 칼럼에 부하시켜 메탄올 및 pH4.5 의 10mM 인산 암모눔(70:30)으로 1.5ml분의 유속으로 용출시켰다. 생성된 면역결합체 모두는 HPLC분석에 의한 바로는 약물을 많이 함유하지 않았다.(1%).

본 발명의 면역결합체의 특징화

이렇게 제조한 면역결합체는 약물과 각 모노클로날 항체 사이에 다리를 형성하는 링커 암과 그의 13-케토 위치에서 결합된 ADM 분자로 이루어졌다. 또한, 티오피리딜 보호 디술파이드 결합을 함유하는 ADM-HZN 유도체에 유리 티올기가 있는 모노클로날 항체를 첨가하는 것은 항체에 ADM 을 연결하는 링커에 디술파이드 결합을 생성시키게 하였다(제2도 참고). 본 구체예에 따라 제조한 면역결합체에는 5 E9-ADM-7.5, 3Al-ADM-7.0, L6-ADM-9.0 및 G28.1-ADM-9.0이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니며, 여기서 상기 표시의 첫 번째 부분은 결합체를 만드는데 사용된 모노클로날 항체를 나타내고, 두 번째 부분은 항체에 연결된 안트라사이클린을 나타내며 숫자는 해당 면역결합체에 있어서의 ADM./항체의 몰비율을 나탄낸다.

본 구체예에 따라 얻어지는 ADM/ 항체의 몰비율은 모노클로날 항체에 도입된 티올기의 수와 항체에 첨가된 ADM-HZN 유도체의 양에 의존 하였다. 제3도 및 제4도의 분산도는 약8개의 티올기를 함유하는 5E9 및 3A1 모노클로날 항체와 ADM-HZN을 축합시켰을 때 3-4의 ADM/항체 비율이 얻어짐을 나타낸다. 일반적으로, 이 반응에서는 단백질에 비해 ADM-HZN을 10배 몰을 초과시켜 첨가하였다. ADM/항체 비율은 18-25개의 티올기를 함유하는 항체들을 사용하자 8-10으로 증가하였다. 모노클로날 항체를 티올화 시키기위해 SPDE와 2-IT를 사용했을 때 관찰된 ADM/항체 비율에는 큰 차이는 없었다(제3도 및 제4도 참고). 그러나, 약물을 항체에 결합시킨 다음의 최종 단백질 수율은 2-IT-로 티올화시킨 항체보다 SPDE로 티올화시킨 항체의 경우에 다소 더 높은 것으로 나타났다(제5도 참고). 5E9 및 3A1과 같은 SPDP-티올화 항체의 경우에는 대체로 50-80%의 단백질 수율이 얻어지는 반면 동일한 항체를 2-IT 를 이용하여 티올화 시킨 경우에는 단백질 수율이 20-50%였다. 덧붙여, SPDP 또는 2-IT로 결합을 수행하는데 있어서는 5E9 및 3A1 과 같은 IgG1 이 소타잎 모노클로날 항체를 사용했을 때 다소 좋은 면역결합체 수율을 얻었다(제6도 및 7도 참고).

본 발명의 면역결합체의 결합 활성은 I¹²⁵-표지 항체를 사용하는 경쟁 분석으로 측정하였다. 각각의 항원-양성 및 항원-음성 세포(1 x 10⁶)을 2% FBS 가 함유된 RPMI 1640 0.1ml에 현탁시키고 50μg/ml 농도로 시작하여 2배 연속 희석시킨 미결합 모노클로날 항체 또는 면역결합체 0.1ml와 혼합하였다. 2배로된 세포 현탁액을 혼합시키면서 4℃에서 1시간동안 정치시켰다. 다음 세포를 2회 세척하고 5μg/ml의¹²⁵I-표지 동종항체(1-50 x 10⁴cpm/μg항체 단백질) 0.1ml에 현탁시켰다. 시료를 4℃에서 1시간동안 정치시키고 4℃로 냉각시킨 디부틸: 디노닐 프탈레이트의 1:1 혼합물 0.15ml위에 겹도말(overlay)하였다. 시료를 10,000 x g로 4℃에서 1분간 원심 분리시키고 세포-결합숫자(펠렛)를 LKB감마 계수로기로 세었다.

본 발명의 면역결합체에 의한 결합 활성의 유지는 다음의 표1에서 입증된다.

표 1

ADM-HZN결합 후 평가한 상대적 결합 친화도

^a[IT]= 트레이서 항체를 50% 억제하는 항체 결합체의 몰농도^b

[Tt]= 트레이서 항체를 50% 억제하는 항체의 몰 농도^c

K_conj= 다음의 공식을 사용하여 계산한 상대적인 (K)친화도 :

K_Ab는 Scatchard 분석법으로 측정한 바와같이 비결합

MAb의 평형상수임

표에 나타난 바와 같이, SPDP를 사용하여 제조하고 몰비율이 3.5내지 8.5 사이인 5E9 면역결합체는 비결합 5E9와 비교해 볼 때 그들의 원래 활성의 80% 이상을 유지하였다. 2-IT를 이용하여 제조한 5E9 면역결합체도 높은 결합 활성을 유지하였다. SPDP를 사용하여 제조한 3A1 면역결합체는 항체 결합 활성에 있어 다소의 손실을 보였다. 일반적으로, 이들 항체 및 기타 항체에 대한 ADM 의 결합은 항체 결합 활성을 비교적 적은 정도로 손상시켰다.

제8도는 비결합 5E9 및 3A1 모노클로날 항체의 결합곡선과 비교해 본 본 발명의 두 면역결합체, 즉 5E9-ADM-7.5 ALC 3A1-ADM-7.0의 결합 곡선을 나타낸다. 이 곡선을 얻기위해, 면역결합체를 1x10⁶항원-양성HSB-2 표적 세포가 함유된 완전 생육배지 0.1ml중에서 4℃에서 정치시켰다. 1시간후, 세포를 배지에서 2회 세척하고 FITC-표지시킨 염소의 항-마우스 IgG (Boehringer-Mannheim사제)의 1:40 희석물을 함유하는 배지 0.1ml 에서 30분간 추가로 정치시켰다. 세포들을 Coulter Epics v 형광 세포 분석기로 분석하였다. 세포 표면 형광을 유사하게 희석시킨 비결합 모노클로날 항체를 이용하여 얻은 형광과 비교하였다. 도면이 가리키듯, 각 면역결합체의 결합활성은 항원-양성세포를 포화시키는데 요구되는 면역결합체에 농도가 비결합 항체의 경우에 요구되는 농도보다 기껏해야 1회의 2배 희석만큼 크다는 사실에 의해 입증되는 바와같이 유지되었다. 비결합 항체 및 면역결합체사이의 형광 강도의 고평부에 차이가 나는 것은 비결합 항체에 비해 면역결합체로의 2차 FITC-염소의 항-마우스 시약의 결합이 감소된 때문인 것으로 밝혀졌다. pH4.0 내지 7.0사이에서의 본 발명의 구체예의 면역결합체 -L6-ADM 결합체-의 안정성을 HPLC 분석으로 조사하였다. L6-ADM-9.0결합체를 각각의 pH의 인산 완충액중에서 37℃에서 24시간동안 정치시켰다.

다음 각 용액을 HPLC컬럼에 적용시키고 비결합 약물의 양을 측정하였다. 제9도에 나타난 바와같이, 상이한 pH에서 24시간 정치시킨후 검색된 단일 화합물의 칼럼 체류시간은 ADM-HCl 스탠다드의 칼럼 체류시간과 유사하였다. 24시간후 면역결합체로부터 방출된 물질의 양은 pH가 7에서 4로 저하함에 따라 증가하였다.

미처리 대조군은 pH7.4의 인간염 완충액에서 -20℃에서 저장시킨 결합체의 크로마토그래피를 나타낸다. 그러므로 면역결합체는 항체 단백질로부터 ADM을 방출시키는 산-민감성 결합기를 갖는다. 이러한 결과는 제2도에 나타난 바와같이 링커 암에 ADM을 연결시키는 히드라존 결합의 존재와 일치하는 것이다. 본 발명의 구체예에 따라, 디술파이드 결합도 포함하는 링커암을 통해 항체에 ADM을 부착시켰다(제2도 참조).

따라서 본 구체예의 면역결합체를 DTT로 환원시킴으로써 ADM 부분을 방출시키는 것도 가능해야만 할 것이다. 그러므로, L6-ADM 결합체인 L6-ADM-9.0을 10-배 과량의 DTT로 처리하고, 실온에서 15시간 정치시킨다음 HPLC 칼럼에 부하시켰다. ADM-HCl 및 ADM-HZN 스탠다드를 동시에 칼럼에 걸고 크로마토그래피로부터의 피크는 제10도에 나타내었다. L6-ADM-9.0은 DTT를 첨가하기 전에는 비결합 약물의 검색 가능한 피크를 갖지 않았다.

HPLC 분석은 ADM-HZN 유도체 보다는 ADM-HCl 쪽에 더 유사한 칼럼 체류시간을 갖는 단일 피크가 나타남을 보여주었다 (제10도 참고). DTT 처리후 방출된 ADM의 양은 항체에 결합된 출발 ADM-유사 부분이 생리적 조건, 즉 전형적인 세포환경인 산성 및 환원 조건하에서 본 발명의 면역결합체로부터 방출됨을 입증한다.

본 발명의 면역결합체의 세포독성 활성

본 발명의 면역결합체를 몇가지 분석시스템을 이용하여 생체외 세포독성에 대해 시험하였다. 연한천 집락 형성 분석법에 따라, ATCC로부터 얻은 Daudi (Burkitt' 임파종) 세포 (표현형 : 5E9+, 3A1-)를 완전배지 [RPMI 1640 배지에 10% 송아지 태아혈청 첨가]에서 배양하였다. 배지 1ml중 1% 10⁵개의 세포를 연속희석시킨 5E9-ADM 또는 3A1-ADM 면역결합체나 또는 비결합 ADM에 1.5시간동안 노출시켰다. 각 희석은 3배로 행하였다. 대조군은 유사하게 처리하였으나 약물에는 노출시키지 않은 세포들로 하였다. 다음 세포들을 세척하고 15% FBS 및 0.3% 아가로스가 함유된 RPMI 1640배지 (Marine colliod)에 현탁시켰다. 다음 세포 현탁액 1ml (1x10³세포)를 6-웰 마이크로타이터 판(Costar 사제)의 0.4% 아가로스층 위에 겹도말 하였다. 사료를 37℃에서 7-10일간 정치시키고 결과적인 집락을 0.5ml의 1mg/ml p-요오드니트로테트라졸륨 바이올렛(Sigma사제)으로 48시간동안 염색시켰다. Optimax 40-10 영상 분석기를 사용하여 집락수를 세고 집락 형성 저해도는 약물 처리 세포나 또는 면역결합체 처리세포를 미처리 대조군과 비교하여 결정 하였다.

제11도는 5E9 항원-양성 및 3A1 항원-음성 Burkitt'임파종 세포주, daudi 세포에 1.5시간 노출시킨 후의 5E9-ADM 결합체, 5E9-ADM-7.5 및 3A1-ADM 결합체, 3A1-ADM-7.0의 세포독성 활성을 비교한 것이다.

이 면역결합체 두가지는 모두 2-IT로 티올화시켜 제조하였다. 투여량 반응곡선 비교 결과 항원 산생 표적 세포에 대한 본래 결합 활성의 93%를 보우하는 5E9-ADM-7.5 결합체 (제8도 참고)는 비결합 대조군 결합체인 3A1-ADM-7.0보다 훨씬 강력한 것으로 나타났다. 대수 세포 사멸(log cell kill)의 척도를 제공하는 한계희석 분석법을 이용하여, 보다 긴 노출 포맷(24시간)으로 해서, 상술한 두가지 면역결합체의 세포독성 약물 활성을 시험하였다. 이 분석법은 M.Colombatti 등의 Selective Killing of Target Cells By Antibody-Ricin A Chain or Antibody-Gelonin Hybrid Molecules: Comparison of Cytotoxic Potency And Use In Immunoselection Procedures, J.Immino., 131,pp.3091-95(1983)에 기재된 바와 같이 필수적으로 Namalwa세포 (표현형:5E9+,3A1-)를 이용하여 수행하였다. ATCC 로부터 얻은 세포를 면역결합체와 22시간동안 정치시키고, 대수 세포 사멸을 측정하였다. 대수 세포 사멸을 한계 세포 농도에서 자라지않은 웰의 부분에 의해 평가한 플레이팅 효율에 기초하여 산출하였다.

제12도에 나타난 바와 같이, 5E9-ADM-7.5 는 비결합 3A1-ADM-7.0결합체와 비교했을 때 여러 농도에서 1-2로그 더 큰 세포 사멸을 나타내었다. 5E9-ADM-7.5 의 최고 투여량에서 세포사멸 5로그까지 측정되었다.

덧붙여, 비결합 3A1면역결합체에 대한 세포독성 활성은 검색되었으나, 세포독성 수준은 해당량의 비결합 ADM 의 경우보다 낮았다. 그러나, 5E9 면역결합체의 활성은 여러 농도에 있어서, 유리 ADM의 해당 투여량보다 높았다.

상술한 바와 같이,5E9-ADM-7.5 와 3A1-ADM-7.0 면역결합체를 티올화제로서 2-IT를 이용하여 합성하였다. 티올화제로서 SPDP를 이용하여 제조한 면역결합체의 경우에도 역시 면역특이적 세포독성이 관찰되었다.

제13도는 티올화제로서 SPDP 를 이용하여 만든 5E9-ADM 및 3A1-ADM 면역결합체의 Daudi 세포에 대한 선별적인 세포독성 활성을 상술한 연한천 집락 형성 분석법을 이용하여 나타낸 것이다. SPDP를 이용하여 제조한 면역결합체의 선별적인 세포독성에 대한 추가적인 증거는 제14도에서 찾아볼 수 있는데, 여기서는 G28.1-ADM-9.0면역결합체를 연한천 집락형성분석을 이용하여 2개의 G28.1 항원-양성 세포주, Daudi 및 Nmalwa세포주, 및 하나의 G28.1 항원-음성 인체 T세포 백혈병 세포주인 HSB-2에 대해 시험하였다. HSB-2 세포는 ATCC로부터 얻었다. 도면에 나타난 바와 같이, 이 면역결합체는 두가지 항원-양성 세포주에 대해서는 세포 독성적이었으나 항원-음성 세포주에 대해서는 세포 독성적이지 않았다.

M.Brattain박사 [Bristol-Myers Labs. 휴스턴,텍사스)가 기증한 족장-의존성 인체 결장 암종 세포주, HCT116 을 이용한 집락 형성 분석법에도 면역결합체, 5E9-ADM-7.5 에 의한 항원-양성 세포의 선택적 사멸이 관찰되었다.

암종 세포의 단층 배양제를 트립신-EDTA(Gibco사제)로 배양 플라스크로부터 제거하고, 세척시킨다음 22-게이지 바늘을 통과시켜 단일세포 현탁액을 얻었다. 5E9-ADM-7.5 .3A1-ADM7.0 또는 비결합 ADM을 1x10⁵암종세포가 함유된 배지 0.2ml에 연속 희석시켰다. 각 희석은 3배로 행하였다. 대조군에는 미처리 또는 항체-처리 세포가 포함되었다. 세포를 3시간 배양시키고, 배지에서 1회 세척하고 1ml 중의 1x10³세포를 12-웰 마이크로타이터판(Coster사제)에 플레이팅 시켰다. 판을 37℃에서 7-10일간 정치시키고 순수 메탄올로 10분간 고정시켰다. 집락을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 Optimax40-10 영상 분석기로 세었다. 제15도에 나타나 바와 같이, 암종세포를 3A1-ADM-7.0에 노출 시켰을때보다 5E9-ADM-7.5에 노출시켰을 때 더 큰 세포독성이 관찰되었다.

약물의 아미노 당에서 항체와 연결된 ADM은 약물활성이 크게 손실된다는 많은 보고가 있었으므로, 본 발명자들은 연한천 집락 형성 분석시스템을 이용하여, leu-ala 디펩티드링커를 통해 약물의 아미노 당부분에서 항체에 ADM 을 부착시켜 제조한 면역결합체들의 세포독성을 시험 하였다. 제16도에 나타난 바와 같이, 5E9-ADM-4.0 펩티드-연결 결합체도, 3A1-ADM-3.9 펩티드-연결 결합체도 Daudi 세포에 대해 세포독성을 나타내지 않았다. 결합체를 만드는데 사용한 ADM-leu-ala 유도체는 비결합 ADM의 해당량보다 2로그만큼 덜 강력하였다.

실시예 2

실시예2는 본 발명에 따른 안트라사이클린 면역결합체의 제조방법을 기재하는 것으로 여기서는 ADM분자에 대한 결합부분으로서 아실히드라존 결합을 가지며 항체에 대한 결합부분으로서 티어에테르 결합을 갖는 링커 암을 통해 모노클로날 항체에 ADM을 결합시킨다. 본 구체예는 또한 ADM의 신규한 아실히드라지드 유도체도 제공한다.

링커 암에 티오에테르 결합을 갖는 면역결합체의 제조

모노클로날 항체 5E9 (2.5ml 인산 완충 염수증 2.5mg)를 30℃에서 30분간 SMPB(숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트)(테트라히드로퓨란 100μ1중 59.5μg)와 반응시켰다. 구연산나트륨 완충액으로 pH를 6.0으로 조정하였다. 혼합물을 PD-10겔 여과 칼럼(Pharmacia사제)를 통과시켜 미반응 물질로부터 말레이미드-함유 항체를 분리하였다. 다음 실시예1에 기재된 바와 같이 제조한 ADM-HZN 유도체(1mg)를 NaOH/H₂O(9:1) 1ml에 용해시키고 ADM-HZN 0.5μmole을 아세톤: H₂O 4:1중의 트리-n-부틸-포스핀 0.5μmole과 반응시켜 새로운 환원된 ADM-HZN을 제조하였다(제17도 참조). 10분 후, 톨루엔중의 0.1M황을 첨가하여 남아있는 포스핀을 파괴시켰다. 다음 환원된 ADM-HZN을 5E9 말레이미드-함유 항체와 혼합하였다. 이렇게 생산된 면역결합체를 PD-10겔 여과 칼럼으로 통과시켜 정제하였다. 몇몇 경우, 톨루엔 용매가 완전히 제거되지 않았을 때에는, 유기 용매층이 분리되어 반응 혼합물로부터 단백질이 약간 부유된다. 용매를 제거하는데는 약한 공기흐름을 이용하고 변성된 단백질은 혼합물을 16,000xg로 2분간 원심분리시켜 제거하였다. 다음 면역결합체가 함유된 맑은 상등액을 겔 여과시키고 pH7.4의 PBS에서 분석하였다. ADM/항체 몰 비율은 실시예1에서와 같이 OD280ALC OD495를 이용하여 분광광도계로 측정하였다. 전형적 반응의 경우 3 내지 4의 몰 비율을 갖는 면역결합체를 생산시켰다.

티오에테르 결합을 갖는 면역결합체의 세포독성 활성

DNA 합성의 저해를 측정하는³H- 티미딘 인코포레이션 분석법을 이용하여 본 실시예의 구체예에 따라 제조한 몇가지 면역결합체를 항원-양성 종양세포주와 항원-음성 종양 세포주에 대한 세포독성에 대해 시험하였다. 상기 분석법에 따라, 면역결합체 또는 비결합 ADM 을 완전 배지에서 희석시키고 각 희석물 100μ1을 96-웰 마이크로타이터판주의 웰에 첨가하였다. 각 희석은 3배로 하였다. 종양세포를 배지에 현탁시키고 1x10⁵세포가 함유된 100μ1를 각 웰에 첨가하였다. 5% CO₂습한 대기중에서 세포를 37℃에서 24시간 정치시켰다. 1μCi[6-³H]-티미딘 (New England Nuclear, 15Ci/mmol)이 함유된 50 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간동안 정치시켰다. 세포를 Millititer sv판 (Millipore)에 옮기고, 25% 냉 트리클로로초산(TCA)으로 침전시켰다. 침전물을 5%냉 TCA 로 10회 세척하였다. 필터를 건조, 천공하여 Econoflour 액체 섬광액(New England Nuclear)에서 계수하였다. 모든 계수는 배경수치를 뺌으로써 보정하였다.

본 구체예에 따른 면역결합체-5E9-ADM-3.9-는 5E9 항원-양성 Namalwa 및 HSB-2세포에 대해 세포독성이 높았다(제18도 참고). 이 면역결합체는 비결합 ADM 의 동 농도보다 더 강력하였다. 다른 실험에서는 농도가 0.1μg/ml ADM미만인 3A1-ADM-6.0 면역 결합체 3A1- 항원-양성 HSB-2 세포에 대해서는 세포독성적이나 3A1-항원-음성 Namalwa 세포에 대해서는 세포독성적이지 않은 것으로 나타났다(제20도 참고). 보다 높은 농도에서는, 이 면역결합체의 세포독성은 두가지 세포주 모두에 대해 거의 동일하였다.

실시예 3

본 발명의 면역결합체의 생체내 항종양 활성

다음 본 발명의 면역결합체를 그들의 생체내 항종양 활성에 대해 시험하였다. 더욱 구체적으로는, 면역결합체가 마우스에 있어서의 인체 B 임파종 종양의 생육을 억제하는 능력을 시험하였다.

조직배양-유지시킨 임파구 세포를 피하(s.c) 접종하여 BALB/c 제모 마우스에서 1차 Daudi 및 Ramos(Burkitt'임파종)고체 종양을 수립하였다. Ramos세포주는 ATCC에서 구입할 수 있다. 다음 1x10⁷종양세포 0.1ml PBS를 마우스 옆구리에 피하이식시켜 Daudi 및 Ramos종양을 체중이 20-25mg(Harlan Sprague-Dawley)인 4-6주령 암컷 BALB/c(nu/nu)에서 생체내 계대시켰다. 두가지 종양세포주 모두 200 내지 4000mm³의 직선적인 생육율을 나타내었다. 대수 증식기증의 평균 종양 부피 배가시간은 Daudi 종양의 경우 6.9±0.8일 이었고 Ramos 종양의 경우에는 4.4±0.6일 이었다. 종양부피(v)는 다음 공식으로 산출하였다.

상기 식중 L=길이(mm)이고 W=폭(mm)이다.

종양 세포의 부피가 Daudi 종양의 경우 400-600mm³, Ramos 종양세포의 경우 250-400mm³에 달했을 때 마우스를 무작위적으로 1군당 5-10마리로하여 ADM-HCI(즉,유리기), 본 발명의 ADM-면역결합체, 비결합 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체와 ADM과의 혼합물로 처리하였다. 시험된 면역결합체(즉, 그의 항체성분이 사멸시킬 종양세포와 반응 성인)로 얻어진 항종양 활성을 비결합 결합체(즉, 종양집단과 반응성이 아닌 결합체)의 항종양 활성과 비교하여 세포사멸성의 특이성을 입증하였다. 항체와 유리약물과의 혼합물은 콘트롤이었으며 이는 약물과 항체사이에 공유커프링이 필요함을 나타내는 것이었다.

결과는 처리군으로부터의 생육 곡선을 비접종 대조군의 것과 비교했을 때 종양 부피 배가시간(TVDT: tumor volume doubling time)에 있어서의 지체로부터 계산한 종양배가지체(TDD:tumor doubling delay)나 혹은 종양생육 억제(T-C)로서 표현하였다. TDD는 다음의 식으로 계산하였다.

상기 식중 T 는 처리군에 있어서 종양이 3000mm³에 달하는데 걸린 시간(일), C는 대조군에 있어서 종양이 3000mm³에 달하는데 걸린 시간(일), 그리고 TVDT(종양부피 배가 시간)는 대조군(미처리) 마우스에 있어서 종양부피가 1500에서 3000mm³으로 증가하는데 걸린시간(일)을 나타낸다. 각 지점은 실험군에 있어서의 평균 종양 부피를 나타낸다.

이 연구조사시, Daudi 또는 Ramos 종양에 미치는 ADM-면역결합체의 항종양 활성을 a)동일한 투여량, 투여경로, 및 계획을 이용한 유리 약물을 사용하여 얻어진 활성, 및 b)최적 투여량, 최적 투여경로, 및 최적 계획으로서 유리약물을 사용하여 얻어진 활성과 비교하였다.

모든 연구에 있어서, ADM-HCI 약물처리는 분말화시킨 이 약물에 50-100λ를 첨가하고, PBS에 용해시킨 약물을 주사하는 날 mg/kg/주사의 특정 투여량으로 희석시켜서 이를 종양산생 마우스에게 정맥(i.v.꼬리정맥) 또는 복강(i.p)투여하였다. 이 연구에 사용한 ADM-면역결합체는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며 이들 모두는 본래의 항체 결합 활성의 90% 이상을 유지하였다. 특히, 모노클로날 항체 5E9 및 G28.1을 이 연구에서 면역결합체의 항체성분으로 이용하였다. ADM-면역결합체를 PBS 중 4℃에서 저장하고 제조후 2주일 이내에 사용하였다. 시험한 면역결합체 모두와 비결합 항체는 복강내로 투여하였다.

또한, 본 예에서 사용하는 처리계획표시 Q7D x 3은 각 약물군의 각 마우스를 3회 주사, 이때 각 주사는 7일 간격으로, 즉 1주일 간격으로 3주일간 주사시킨 것을 가리키는 것이다. 이와 유사하게, Q5D x2는 각 군의 마우스에게 5일 간격으로 총 2회 주사하는 처리계획을 의미한다. Q1D x1은 1회 주사를 의미한다. 그러므로, 처리계획 표시에서 첫 번째 숫자는 주사간격(일), 마지막 숫자는 처리계획당 총 주사횟수를 나타낸다.

그러므로 본 발명의 ADM-면역결합체의 항종양 활성은 우선 상응하는 또는 해당투여량, 투여경로 및 계획에서의 유리 ADM-HCI 약물과 비교하여 평가하였다. Daudi 종양에 대한 5E9-ADM 면역결합체, 5E9-ADM-1.8(몰비율=MR=1.8 ADM 분자/MAB)의 항종양 활성을 a)해당 약물 투여량(4.1mg/kg/주사)에서의 비결합 ADM/HCI, b)해당 항체 투여량 (630mg/kg/주사)에서의 5E9 모노클로날 항체, c) 5E9항체와 ADM-HCI과의 혼합물(4.1mg ADM + 630mg 5E9), 및 d)대조군으로서 비결합 면역결합체, L6-ADM-8.6(4.1mg/kg/주사ADM)과 비교하였다.

마우스(5마리/군)에게 초기 종양크기가 800내지 1100mm³범위에 달했을때인 종양 이식후 제20 및 25일에 (즉,Q5D x 2계획)복강 투여하였다. 본 실험에서 사용한 투여량은 유리 약물의 경우 최대로 인내되는 투여량(MTD:maximum tolerated dose),복강투여, 즉 LD₁₀(10%의 동물치사율)을 야기시키는 주어진 어떠한 경로 혹은 계획을 통해 투여한 약물 투여량을 나타낸다(다음의 표1 참고).

제21도가 나타내는 바와 같이, 5E9-ADM결합체의 경우에 커다란 항종양 활성이 얻어졌다. 게다가, 이 항종양 활성은 동량ㄹ 유리 약물에서 관찰된 것보다 더 높았다. 그리고, 다음의 표4가 가리키듯이, 결합체로 처리한 다섯 마리의 쥐가운데 세 마리는 완전한 종양 퇴화(치유)를 나타냈으며 이는 1.5TDD에 해당한다. 이와 대조적으로,ADM-HCI 및 비결합5E9 및 L6-ADM 비결합 결합체는 항종양 활성을 나타내지 않았다. 몇가지 종양 발육 저해가 ADM-HCI과 5E9와의 혼합물 이용시 관찰되었으나, 이 효과는 일시적이었으며 오직 통게적으로 별의미가 없는 0.2TDD를 나타내었다.

이 실험에서, 유리약물은 유리약물을 4-5mg/kg 이상으로 복강 투여했을때와 관련한 독성 때문에 4.1mg/kg주사의 양으로 투여하였다. 이러한 낮은 투여량의 경우, 유리ADM 및 ADM과 모노클로날 항체와의 혼합물의 두가지는 모두 불활성적이었다. 그러나, 제21도가 분명히 밝히듯,이렇게 낮은 농도에서도, ADM면역결합체는 종양 생육을 저해하는데 있어 여전히 활성적이었다.

다음, 본 발명자들은 Daudi종양에 대한 ADM-면역결합체의 항종양 활성을 최적 투여량, 투여경로 및 투여계획으로 주어진 비결합 약물을 이용하여 얻은 항종양 활성과 비교하여 측정하였다. 본 발명자들은 우선,Daudi 세포에 대해 최대의 항종양 활성을 나타내게 하는 유리 ADM-HCI의 투여량, 경로, 및 계획을 결정해야만 했다. 이 최적화 연구를 위해, 상이한 투여경로,투여량 및 투여계획을 이용하여 마우스를 ADM-HCI로 처리하였다. 접종 간격은 사용된 처리계획에 의존하였다. 다음 TDD 값을 상술한 바와 같이 측정하였다.

이 최적화 연구의 결과를 다음의 표2에 요약하였다. 표2로부터 알 수 있듯이, 정맥 투여시기는 Q7D x 3계획은 11mg/kg/주사의 투여량인 경우 종양 생육 지체 및 종양 퇴화속도 모두의 관점에서 최적 항종양 반응을 나타냈는데, 이는 정맥투여 Q7D x 3계획을 이용한 약물의 경우에도 MTD였다.

표2

^a각 약물군으로부터의 결과^B

T-C: T-C는 미처리 대조군(C)에 비교한 약물처리군(T)의 3000mm3에 도달하는데 걸린 시간 지연 일수

완전퇴화 (CR) : 손으로 만져 알 수 있는 종양 크기미만으로의 종양 체적의 일시적 감소

치유 : 종양의 재발육의 징조가 전혀 없는 완전 퇴화

CD/T : 한 군내에서의 총 동물수에 대한 죽은 동물의 수.최후 약물 투여로부터 55일 후까지 약물 사멸을 기록하였음.

Daudi 종양세포에 대한 유리 약물의 항종양 활성을 제22도에 추가로 도시하였다. Q7Dx3 처리계획으로 정맥투여를 이용하여, ADM-HCl 처리후, 각각 투여량 의존 형식으로 9,10 또는 11mg/kg/주사로 투여하자 Daudi 종양 이종이식편의 발육이 크게 억제되었다. 대조군 마우스는 처리하지 않았다. 11mg/kg/주사인 MTD에서의 종양 발육 억제(T-C)는 1.1TDD에 해당하는 28일이었다. 복강 투여를 이용하는 여러 가지 계획도 시험하였다.

상술한 바와같이, ADM-HCl의 MTD, 복강투여는 4-5mg/kg/주사 사이인 것으로 측정되었다. 표 2B에서 알 수 있듯이, 유리약물은 복강 투여경로를 통한 그의 MTD에서 Daudi 세포에 대한 불활성이었다. 그러므로, 본 발명자들은 유리약물에 대한 최적 항종양 활성이 MTD에서 Daudi 종양 세포의 발육을 억제하는 것으로 나타난 약물 투여량인 11mg/kg주사인 정맥 투여를 통해 얻어질 수 있는 것으로 결정했다.

그러므로, 이 실험에 있어, Daudi 종양에 대한 항-종양 활성의 최적 ADM-HCl 투여량은 약11mg/kg주사이고, 최적 계획은 Q7Dx3이었고 최적 투여경로는 정맥 투여인 것으로 결정하였다.

본 발명자들은 다음 본 발명의 ADM-면역결합체의 Daudi 종양에 대한 항종양 활성을 상술한 최적 조건하에서 주어진 유리 ADM-HCl 약물의 항종양 활성과 비교하였다. Q5Dx2 계획에 따라 복강투여시킨 G28.1-ADM 면역결합체, G28.1-ADM 7.6 (MR=7.6 약물/MAB)을 Q7Dx3 계획에 따라 10,11 및 12mg/kg/주사의 양으로 정맥 투여시킨 ADM-HCl 과 비교하였다.

제23도 및 다음의 표3에 나타난 바와같이, 유리약물은 활성적이었으며, 11mg/kg (그의 MTD)에서 종양 발육에 있어 28일 지연을 나타내고 8마리의 마우스중 2마리는 완전히 종양이 퇴화되었다 (치유). 시험된 최고 투여량(18.7mg ADM, Q5Dx2,복강투여)에서 면역결합체는 잘 인내되었으며(사망 없음, 체중 손실 없음), 유리약물보다 다소 높은 항종양 활성을 나타내고 8마리중 3마리에서 종양이 완전히 퇴화된 것으로 나타났다. 재차, 비결합 L6-면역결합체, 비결합 G28.1 또는 비결합 G28.1과 ADM-HCI과의 혼합물의 경우에는 항종양 활성이 없었다. 따라서, 본 발명자들은 ADM -면역결합체가 비결합 약물의 그의 최적 투여량 및 계획으로 정맥 또는 복강투여하여 얻어질 수 있는 것보다 훨씬 높은 정도로 종양 발육을 억제한다고 결론지었다.

표 3

최적화 ADM-HCI(Q7Dx3 : 정맥투여)에 비교한 MAB 결합 ADM(Q5Dx2:복강투여)의 Daudi종양 이종이식편에 미치는 항종양 활성

*표2의 해설 참고

표4는 5E9 및 G28.1 면역결합체의 상이한 제조물을 이용했을 때 흉선제거 마우스에 있어서 Daudi 종양 이종이식전에 대해 얻어진 항종양 활성을 요약한 것이다. 최고 반응율은 항체 투여량이 500mg/kg 이상일 때 항상적으로 얻어졌다. 이 투여량에서, 항종양 활성은 몰 비율이 1.8 내지 8.6인 결합체를 이용하여 얻어졌다. 모노클로날 항체 투여량이 증가하면, 두가지 TDD, 즉 종양발육억제, 및 종양퇴화율에 있어서 상응하는 증가가 일어나는 것으로 입증되는 바와 같이, 항종양 활성은 결합 약물 투여량보다 항체 투여량에 더 의존하는 것으로 나타났다. 모든 실험에서, 동량의 항체 및 결합 약물 투여량으로 시험한 비결합 L6-ADM 결합체에서는 항종양 활성이 나타나지 않았다.(결과는 나타내지 않음). 덧붙여, 이 표는 동일한 약물 투여량에서 불활성인 유리약물과 비교한 본 발명의 면역결합체의 증가된 강도를 나타낸다(상기 표2 와 비교).

표4

Daudi 종양 이종이식편에 대한 adm-면역결합체의 항종양 활성^a

누적 투여량 (mg/kg)

^a계획 : Q5Dx2, 결로 : 복강투여, MR : 약물분자/MAB의 몰비율^b

T-C : T-C 미처리 대조군(C)에 비교한 약물 처리군(T)의 3000mm³에 도달하는데 걸린 시간 지연 일수^c

치유 : 치유된 동물수/처리된 동물수^d

3회 투여로 시험한 5E9-ADM-4.2^e

3회 투여로 시험한 G28.1-ADM-7.6^f

대조군에서의 사망

다음의 표5는 본 발명의 ADM-면역결합체 대 비결합 약물을 이용하여 얻은 감소된 독성을 증명한다. 나타난 바와 같이, 면역결합체는 복강 투여한 유리 ADM보다 적어도 10배는 독성이 약했다.

표 5

종양 산생 누드 마우스에 있어서의 유리 ADM 및 MAB-ADM의 독성^a

^aDaudi 또는 Ramos 종양산생 마우스^b

N = 실험횟수^c

ADM = 유리 또는 MAB에 결합된 형태로 주어진 양^d

D/T = 사망수/총처리수

마지막으로, 제26A도와 표6은 인체 Ramos 종양에 대한 G28.1-ADM 결합체의 항종양 활성을 나타낸다.

재차, Ramos 종양에 대한 면역결합체의 항종양 효과를 최적 결과를 나타내는 조건, (즉 16-18mg/kg/주사의 투여량으로 1회 주사시 얻어지는 것으로 예측됨)하에서 유리 ADM-HCl을 이용하여 관찰된 효과와 비교하였다

(제24도 및 제25도 참고). 시험된 최고 면역결합체 투여량(10.6mg/kg)에서, 결합체의 항종양 활성은 18mg/kg의 유리약물을 이용하여 얻어진 활성보다 0.5TDD 만큼 더 높았고 (25% 치사율), 16mg/kg의 ADM-HCl의 활성보다 1.0TDD만큼 더 높았다 (12% 치사율). 이 투여량에서의 결합체는 체중 손실이나 사망을 나타냄이 없이 처리된 동물 모두가 이를 잘 인내하였다. G28.1-ADM의 항종양 활성은 또한 제26B도에 나타난 바와같이 투여량 의존성인 것으로 나타났다.

그러므로, 결합체의 투여량을 감소시키면 TDD 및 완전한 퇴화수가 감소되는 결과가 야기되었다. 비교할만한 투여량 (10.6mg/kg)에서의 L6-ADM (비결합) 결합체는 불활성이었다.

표 6

Ramos종양 이종이식편을 이용한 MAB결합 ADM(Q1Dx4: 복강투여)대 최적화 ADM-HCI(Q1Dx1:정맥투여)의 항종양 활성

^a주사당 투여량^b

표2의 해설 참고

그러므로 상기 실시예는 세포독성 안트라사이클린 약물을 신규의 산-민감성 아실히드라존 연결을 통해 항체에 연결시킨 신규의 안트라사이클린 면역결합체의 제조방법을 나타낸다. 면역결합체는 항체 결합 활성(즉, 표적 세포 특이성)과 세포독성 약물 활성을 모두 보유하며 표적 세포의 전형적인 세포 환경인 산성 및 환원적 조건하에서 유리 비변형 약물을 방출시킨다.

이 결합체들의 항종양 활성은 생체외 및 생체내 모두에서 입증되었으며 유리 비결합 안트라사이클린으로 얻어진 활성보다 컸다. 더욱이, 면역결합체는 비결합 약물보다 생체내에서 훨씬 높은 정도로 인내되었다. 그러므로, 분 발명의 면역결합체는 개선된 치료율(항종양 활성 및 독성에 있어)을 나타내며 따라서, 암 및 기타 종양, 비-세포독성 바이러스 또는 기타 병원체 감염 및 자가면역 장애와 같은 질환의 치료시 이러한 세포들은 선택적으로 사멸시키기 위해 세포독성 약물을 표적 세포 집단에 전달하는데 유효하다.

실시예 4

다음의 실시예는 아드리아마이신이 그의 13-케토 위치에서 아실히드라존 결합을 통해 펩티드 배위자인 봄베신에 연결되는 신규의 안트라사이클린-배위자 결합체의 제조방법에 관한 것이다.

봄베신-ADM 결합체의 제조

Vega Biotechnologies (터스콘, 아리조나주)에 의해 아마노산 배열 : Cys -Glu -Gln- Lys- Leu- Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂인 조(組) 시스-봄베신이 제조되었다. 다른한편, 본 발명자들은 Fmoc 보호 아미노산의 활성화 펜타플루오로 에스테르를 이용하여 Milligen 9050 펩티드 합성기상에 시스-봄베신을 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 떼어내어 92.5% 트리플루오로아세트산, 2.5% 트리페놀 및 5% 페놀중에서 25℃ 2시간동안 정치시킴으로써 측쇄 보호기를 제거하였다.

다음 C18 역상 HPLC (Perkin Elmer 410 Bio HPLC)에 이어 이온-교환 HPLC를 이용하여 조펩티드 혼합물로부터 시스-봄베신을 정제하였다. 전형적인 제제에는, 조펩티드 10mg과 디티오트레이톨 (DTT) 20mg이 pH6.0의 0.01M 초산암모늄중의 10% 아세토니트릴에 용해되어 있으며, pH6.0의 0.01M 초산암모늄중의 10-50% 아세토니트릴 구배를 이용하여 분리하였다.

용출물은^OD280에서 모니터하였다. 분획들(1ml)을 수집하고 전술한 실시예 1에 기재된 바와같이 DTNB와 반응시켜 반응성 티올기를 함유하는 분획들을 동정하였다.

반응성 티올기를 함유하는 분획들은 봄베신 섭수체와 상호반응하는 것으로 알려진 봄베신 펩티드의 영역에 결합하는 항-붐베신 모노클로날 항체와 Elisa 분석에서 봄베신 면역활성에 대해 시험하였다. 이 분석은 다음과 같이 수행하였다 : 봄베신 펩티드 (100ng-1μg)를 임뮬론 II Elisa 판상에 37℃에서 2시간동안 흡수시켰다.

이 판들을 37℃에서 3% 젤라틴으로 2시간동안 차단하고, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 5회 세척하고, 37℃에서 1시간동안 마우스의 항-붐베신 항체 (Boehringer Mannhem사)와 함께 정치시킨 다음 PBS Tween 20으로 5회 세척하였다. 다음 판들을 제조자의 지침(Kirkegaard and Perry)에 따라 TMB 기질로 디벨롭시키기에 앞서, 과산화효소-표지된 토끼의 항-마우스 Ig(Boehringer Mannheim)와 함께 정치시켰다.

유리 술프히드릴기를 함유하고 봄베신 면역반응성을 나타내는 분획을 모아 10% 아세토니트릴중 2-50% 염 구배(500mM 초산암모늄, pH6.0)를 이용하여 이온-교환 HPLC (Aquapore CX-300 10μm 칼럼, Rainin)에 의해 추가로 정제하였다. 용출액을^OD280에서 모니터하고 1ml 분획을 DTNB법에 의해 유리티올기에 대해, 그리고

붐베신 면역반응성에 대해서는 Elisa 분석법에 의해 상술한 바와같이 시험하였다. 분획을 수집하고, Savant 스피드-백을 이용하여 농축시킨 다음 상술한 바와같이 C18 칼럼에서 HPLC에 의해 재크로마토그래피 처리하였다. 최종의 시스-봄베신 생성물은 HPLC 크로마토그래피에서 단일 피크를 나타내었다 (제28도 참고).

다음 정제시킨 시스-봄베신을 다음과 같이 ADM-HZN과의 반응에 이용하였다 : 정제된 시스-봄베신은 1mg/ml 정제 Lys³-봄베신에 대해^A280^2.08을 기초로하여 10mM 초산암모늄 (1.25- 2mg/ ml) 중에 약 5-8mg/4ml로 만들었다. 7M NH₄OH를 이용하여 pH를 7.0으로 조정한다음, 400μl 메탄올중 2.5-4mg의 ADM-HZN을 첨가하였다. 이 용액을 보덱스로 교반하여 가끔씩 혼합시키면서 20℃에서 1시간, 이어서 4℃에서 12시간 방치하였다. 전분리공정을 통해 아세토니트릴 농도를 40%로 유지시킨 것을 제외하고는 상기 유리 펩티드의 경우 개괄한 조건을 이용하여 유리 약물로부터 시스-봄베신-ADM 결합체를 이온-교환 HPLC에 의해 분리하였다. 결합체를 함유하는 분획을 수집하고, Savant 스피드-백상에서 건조시킨다음, 상술한 바와같이 역상 HPLC 분리용 출발 완충액에 용해시켰다. 다음 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 펩티드-약물 결합체로부터 유리 펩티드를 분리하였다 (상기 유리펩티드 정제시 설명된 바와 같음). 칼럼을 280nm 및 495nm에서 모니터하였다. 결합체를 함유하는 분획을 모아 건조시킨다음 추가 특징화를 위해 -20℃에서 저장하였다. 다른 한편, 펩티드의 리신잔기 (Lys³)에서 봄베신 펩티드에 AND이 연결된 봄베신-ADM 결합체를 제조하였다. 이 방법에 따라, 봄베신 (Lys³-봄베신이라고도 함)을 25℃ pH8.5에서 1시간동안 3몰 과량의 SPDP 와 함께 정치시켰다. C18 역상 HPLC에 의해 재크로마토그래피 처리하였다. 다음 환원된 펩티드를 2몰 과량의 ADM-HZN과 함께 25℃에서 1시간, 이어서 4℃에서 14시간동안 정치하였다. 그러나, 약물로부터 펩티드-약물 결합체를 분리하려는 시도는 다음의 두가지 이유 때문에 문제점이 있었다 : 1) 상기의 시스-봄베신의 제조시 기재된 바와같은 C18 크로마토그래피 상에서, 펩티드-약물 결합체 (상기와 같이 Elisa 분석에 의해 검색됨)는 소수성이며 ADM-HZN과만 매우 유사하게 행동하고 환원된 펩티드와는 다르다는 것과 2) 리신 잔기를 통한 봄베신의 변형이 펩티드상의 전하를 변경시켜 이온교환 크로마토그래피에 의해 유리약물로부터 이를 분리하는 것이 더욱 어렵게 됨. 그러므로 시스-봄베신 펩티드를 통한 커플링이 선호되었다.

봄베신-ADM 결합체의 특징화

상술한 바와같이 시스-봄베신으로부터 제조한 봄베신-ADM 결합체는 제27도에 도시된 구조를 가지며, 이 ADM은 13-케토 위치에서 아실히드라존 결합을 통해 링커 암에 결합되어 있다.

펩티드와 약물을 연결하는 링커는, 그 구조내에 디술파이드 결합을 함유하였다. 제29도는 시스-봄베신-ADM 결합체의 질량 스펙트럼을 도시한다. 이 분석은 시스-봄베신과 ADM의 1:1 첨가물에 해당하는 2357의 분자이온을 보여준다. 시스-봄베신-ADM 결합체를 ATCC로부터 얻은 정상적인 마우스의 섬유아세포 세포주인 Swiss 3T3 세포계상의 봄베신 섭수체에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 결합은¹²⁵I-표지된 가스트린-방출 펩티드(GRP )를 사용하는 경쟁분석에 의해 측정하였다. 봄베신과 마찬가지로, GRP는 Swiss 3T3세포와 같은 섭수체-양성세포의 표면상의 봄베신 섭수체에 결합한다.

따라서, 시스-봄베신, GRP 또는 시스-봄베신-ADM 결합체의 농도를 증가시키면서¹²⁵I-표지된 GRP를 정지시켜 특이적 결합 방사능을 정량하였다. 이러한 방식으로,¹²⁵I-GRP 결합의 저해를 측정하였다. 분석은 다음과 같이 행하였다 : 10% 송아지 태아 혈청, 페니실린 (100units/ml) 및 스트렙토마이신 (100μg/ml)가 보강된 MEM 배지 (완전배지)중에서 150cm²T- 플라스크에서 Swiss 3T3 세포를 단일층으로 될 때까지 생육시켰다 (5-7일). 세포가 단일층으로 자란후, 배지를 인슐린(5μg./ml), 트랜스페린 (5μg./ml) 및 셀레나이트나트륨 (5ng./ml)이 보강된 MEM 완전 배지로 대체하였다. 다시 24시간동안 세포를 정치시켜 RPMI/HITS [BSA (5mg /ml), HEPES (4.7mg/ml), 인슐린 (5μg./ml), 트랜스페린 (5μg./ml) 및 셀레나이트나트륨 (5ng./ml) 함유 RPMI 1640]로 러버 폴리스만을 이용하여 스크래핑시켜 수확하였다. 세포를 1회 세척하고 22게이지 바늘을 통해 3회 계대시켜 단일세포 현탁액을 얻었다.

다음,¹²⁵I-GRP (2ng/ml, 2000Ci/mmol) 150μl이 첨가된 5 x 10⁵세포 함유 튜브에 여러 가지로 희석한 (3중) 10μ1의 시스-봄베신, GRP 또는 봄베신-ADM 결합체를 첨가하였다. 튜브를 혼합하고 와동 플랫포옴상에서 1시간동안 실온으로 정치하였다. 마이크로퓨지 튜브내에서 1:1의 디부틸프탈레이트 : 디옥틸프탈레이트 층으로 12,000xg로 원심분리시킴으로써 세포-결합¹²⁵I-GRP 를 분리하였다. 튜브를 건조 얼음상에서 냉각시켜 세포 펠렛을 분리하여 LKB 1275 감마 계수기에서 계수하였다.

제30도에 나타낸 바와같이, GRP, 시스-봄베신 및 시스-봄베신-ADM 결합체에 의해 3T3 세포에 대한¹²⁵I-표지된 GRP의 결합의 특이적인 경쟁이 있었다. 더욱 중요한 것은, 세가지 분자의 경쟁곡선에 커다란 차이점이 없었다는 것으로, 이는 이들 분자가 봄베신 섭수체에 대해 유사한 치환도를 나타냄을 가리키는 것이다. 그러므로, 봄베신에 대한 ADM의 결합은 펩티드의 결합 활성을 방해하지 않으며, 결합체는 봄베신 섭수체-양성 세포에의 결합활성을 보유한다.

본 발명자들의 연구결과 시스-봄베신과 봄베신은 섭수체-양성 세포상에 동일한 결합 활성을 나타냄이 확인되었다.

봄베신-ADM 결합체의 세포독성활성

³H-티미딘 흡수 분석을 이용하여 시스-봄베신-ADM 결합체의 세포독성활성을 측정하였다. 이 분석에 따라, 세포표면상에 봄베신 섭수체를 지니는 여러 유형의 세포를 96-웰마이크로타이터판 (5000세포/웰)에 첨가하여 MEM 배지중에서 37℃ 24시간 생육시켰다. 이 세포들은 상술한 섬유아세포주인 Swiss 3T3, ATCC로부터 얻은 형질전환 섬유아세포주 SVT2 세포계, 및 실시예 1에서 설명한 결장암종 세포주인 HCT116 세포주를 포함하였다. RPMI 1640 배지, 소의 혈청 알부민(5mg/ml), HEPES (0.02M), 인슐린 (5μg/ml), 트랜스페린 (5μg./ml) 및 셀레나이트나트륨(5ng/ml)을 함유하는 HITS 배지에서, 시스-봄베신-ADM 결합체, ADM, ADM-HZN 또는 시스-봄베신-ADM에 20μg/ml 봄베신을 더한 혼합물로 희석물을 만들었다. 세포를 함유하는 웰에 결합체, 약물 또는 혼합물의 각 희석물(3중) 50μl를 첨가하여 37℃에서 최소 1시간동안 정치시켰다.

배지만 첨가된 대조군 웰을 유지시켰다.

다음 세포를 세척하고, 신선한 배지 200μl를 첨가하여 이 웰을 습한 5% CO₂대기중 37℃에서 HITS 배지중에서 다시 38-44시간동안 정치시켰다. 각각의 웰에 50μl 배지 중의³H-티미딘 1μCi (New England Nuclear)를 첨가하여 37℃에서 4시간동안 정치시켰다. EDTA (0.53nM) 중의 트립신 (0.05%) 용액을 15분간 첨가하고 매쉬 수확기에서 수확하였다.

RPI 3a70B 섬광액에 필터를 놓고 벡크만 LS5801 섬광계수기에서 계수하였다. 다음 공식을 이용하여 세포독성을 결정하였다 :³H-TdR의 억제 % =

본 발명자들은 본 발명의 결합체 존재하에서, 세포주의 봄베신-섭수체-양성세포주의 DNA로의³H -티미딘 삽입의 억제를 측정함으로써, 세포에 대한 결합체의 세포독성 효과를 측정하였다. 제31도에 나타난 바와같이, 시스-봄베신-ADM 결합체는 SVT2 세포에 대해서 매우 세포독성적이었으며, 실제도 유리 ADM 이나 ADM-HZN보다 더욱 강력하였다. 시스-봄베신-ADM 결합체의 세포독성 활성의 일부가 과량의 봄베신(즉, 결합체와 봄베신의 혼합물)에 의해 방해되었는데, 이는 결합체의 세포독성 효과가 적어도 부분적으로는 결합체의 봄베신 섭수체에 대한 특이결합에 기인함을 가리키는 것이다. 제32도 및 33도에 나타낸 바와 같이, 결합체는 HCT116 및 Swiss 3T3 세포에 대해서도 특이 세포독성적이었다. (2시간 노출후).

실시예 5

다음의 실시예는 본 발명의 또다른 안트리사이클린-배위자 결합체의 제조에 관한 것으로, 여기서 ADM은 13-케토 아실히드라존 결합에 의해 ADM에 부착된 링커를 통해 폴리펩티드 배위자인 EGF에 결합되어 있다.

EGF-ADM 결합체의 제조

본 발명의 이구체예에서는, ADM을 Biomedical Technologies, Inc. (스타우튼, MA)로부터 구입한 쥐의 EGF에 결합시켰다. EGF는 마우스의 하악골 글랜드로부터 얻어, Cohen 등의 방법 [J. B. C., 237, pp. 1555-62 (1962)]을 변형하여 정제시킨 것으로, 0.1mg/amp에서 멸균 동결건조 분말 (cat #:BT-201)로서 구입하였다.

Savage외., J. Biol. Chem., 22, p. 7669 (1973) 참고.

다음 SPDP를 이용하여 펩티드를 티올화시켜 펩티드에 반응성 티올기를 도입하였다. 그러나, 쥐의 BGF의 경우에는, SPDP 부착을 위한 내부 리신 잔기가 없으므로, 유일한 SPDP 부착 부위는 아미노-말단 아미노산에 있으며, 이는 EGF 분자당 적어도 하나의 반응성 술프히드릴기를 갖는 화합물을 초래한다 (DTT로 환원시킨 후). 이 분자는 내부 리신 분자를 갖지 않기 때문에 인체 EGF를 티올화시키면 이론적으로는 더 큰 정도로 치환이 일어나야 할 것이다.

그러므로, EGF를 0.1ml PBS에 우선 용해시켜 최종 농도 1.0mg/ml로 하였다. 이 용액에, SPDP 0.01ml (최종농도 : 10mM) (실시예 1에 기재된 바와같이 구입 및 희석. 항체 티올화용)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 30분간 정지시킨후 0.02ml의 DTT(50mM)를 첨가하여 티오피리딜 보호기를 제거하였다. 3,500 분자량은 분리해내는 투석막을 이용하여 PBS에 대해 마이크로 투석함으로써 티올화 EGF로부터 과량의 DTT와 SPDP 를 제거하였다 (Spectrum Medical Industries Inc., cat#:132723).

다음 티올화된 쥐의 EGF를 ADM-HZN의 5-6배 과량과 반응시켜 상기 실시예 1에 설명된 바와같이 희석하였다. 이 실시예에서는, 최종 부피 0.2ml PBS로 하여 SPDP-티올화 EGF에 0.01ml ADM-HZN (1.2 x 10²M)을 첨가하여, 4℃로 냉각하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 밤새정치시키고, 상술한 바와같이 SPDP를 제거하기 위해 PBS에 대해 투석하여, 결합체로부터 어떠한 미반응 약물도 제거하였다. HPLC를 이용하여 결합체의 순도를 측정하였다 (제34도 참고).

5 마이크론 RP18 비이드로 채운 Brownlee 칼럼상에서 HPLC를 수행하였다. EGF-ADM 결합체를 쥐의 비결합 EGF (동일원 및 로트 #)와 비결합 ADM과 비교하였다. 시료를 1.0ml/분으로하여 포름산 암모늄 (pH2.8)/아세토니트릴 구배에 의해 용출시켰다.

제34도에 나타난 바와같이, 결합 EGF, 즉, 본 발명의 EGF-ADM 결합체를 비결합 EGF와 비교하자, 새로운 단백질 피크에 대해 단백질의 보유시간에 균일한 이동이 있었다. 이와 유사하게, 결합체를 비결합 ADM에 비교하자, 유리 ADM으로부터 결합 약물 피크의 보유시간에 있어 유사한 이동이 관찰되었다. 이 HPLC 크로마토그래피는 최종의 결합체 제제에 유리 약물 (495nm 에서 검색된 바와 같이)이나 유리 배위자 (280nm에서 검색됨)가 1%미만으로 존재함을 나타낸다.

결합체의 순도는 비-환원 SDS-PAGE 겔 (8-25% 구배 겔) (자료 나타내지 않음)상에서 SDS-PAGE 분석에 의해서도 측정하였다. 각각의 단백질 밴드는 실버 염료로 염색하여 분석하였다 (Pharmacia Phastgel silver stain kit; cat #: 17-0617-01). EGF-ADM 결합체 (약0.1 및 0.05mg/ml)를 쥐의 비결합 EGF의 세가지 희석물 (1, 0.1. 및 0.01mg/ml)과 비교하였다. EGF-ADM 제제에 있어 비결합 EGF 단백질에 해당하는 분명한 단백질 밴드는 없었다. 이 실험은 EGF-ADM 결합체 제제에 비결합 EGF가 존재하지 않는다는 제34도의 결과를 지지해주었다.

EGF-ADM 결합체의 결합 활성의 보유

ADM-HZN과 EGF의 화학적 커플링후 EGF 결합활성의 보유도를 A431 세포주를 이용하여, 경쟁적 방사능 동위원소 분석에 의해 측정하였다. 상기 세포주는 인체의 폐 암종으로부터 유래한 것으로 본 발명자들은 이들을 1-4 x 10⁷분자의 EGF와 결합시킬 수 있었다 (결과는 나타내지 않음). 10% FCS를 함유하는 RPMI 1640 생육배지 중에 희석시킨 세포들을 분석전 24시간동안 96-웰 마이크로타이터 판(5x10⁵세포/웰)에 위치시켰다. 분석하는날, 부착 세포집단으로서 생육한 A431 세포를 2% 소의 혈청 알부민을 함유하는 DMEM (이하 완충액 A라 칭함) 2배 연속 희석한 EGF 또는 EGF-ADM 0.051ml와 완충액 A 중에 희석된¹²⁵I-표지 EGF (50ng/ml) 0.05ml와 함께 세포를 (3중으로) 정치시켰다. (최종부피: 0.1ml/웰). 세포를 4℃에서 4시간 정치시키다

음 완충액 A로 3회 세척하였다. 세포를 1.0M NaOH로 가용화시켜 96-웰 플라스틱판으로부터 세포를 제거하고, 세포-결합¹²⁵I-EGF의 양을 LKB 모델 1272 감마 계수기 상에서 계수하여 측정하였다.

A431 세포상의 그의 섭수체에 대한 EGF-ADM 결합체의 결합 활성은¹²⁵I-표지 EGF의 결합을 저해하는 EGF-ADM의 농도증가에 따른 능력을 비교한 도면인 제35도에 나타난 바와 같다.

이 자료는¹²⁵I-결합의 저해로서 제시되며 (B/Bo) 여기서 이 값은 여러농도의 억제제를 사용한때의 세포결합 방사능 계수치(B)를 억제제가 없을때의 세포결합 계수치(Bo)로 나눈 값이다. 2가지 별개의 EGF-ADM 결합체 제제를 비결합 EGF와 비교하였다. 2가지 결합체 제제는 모두 유사한 결합 활성을 나타내었다. 비결합 EGF와 비교했을 때, EGF-ADM 결합체는 A431 종양 표적 세포상의 EGF 섭수체에 대한 결합 활성을 단지 조금 손실한 것으로 나타났다.

실시예 6

본 발명의 결합체의 또다른 예는 안트라사이클린-배위자 결합체 제조에 관한 것으로, 여기서 ADM은 단백질 배위자인 트랜스페린에 결합되어 있는데, 13-케토 아실히드라존 결합을 통해 약물에 부착된 링커를 통해 연결되어 있다. (제27도 참고)

트랜스페린-ADM 결합체의 제조

100% 철-치환된 인체 홀로-트랜스페린 5.1mg (Sigma)을 50mM 트리에탄올아민, 50mM NaCl 및 1mM EDTA을 함유하는 완충액 2ml에 용해시켰다. pH8.0, 다음 2-IT 40μl(50mM)를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 3시간동안 정치시켰다.

다음 티올화 펩티드를 실시예 1에 상술한 바와 같이 PD-10컬럼 (Pharmacia) 상에서 분리하였다. 이어서, ADM-HZN 135μl(2.1mM)를 PBS 완충액중의 티올화 트랜스페린 2.7ml에 첨가하고 반응 혼합물을 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 반응 혼합물을 2000rpm에서 10분간 원심분리 시키고 PD-10 칼럼을 통해 통과시킴으로써 비반응 ADM으로부터 트랜스페린-ADM 결합체를 분리하였다. 결합체를 함유하는 빈 부피를 모았다.

1mg/ml 트랜스페린에 대해^A280을 이용하여 측정하자 ADM/트랜스페린의 몰비율은 4.6이었다.

따라서 실시예 4-6은 안트라사이클린-배위자 결합체의 제조를 나타내는 것으로 여기서 세포독성 안트라사이클린 약물을 사멸시키고자 하는 선별된 세포집단과 관련된 섭수체와 반응성인 배위자에 결합시킨다. 안트라사이클린을 신규의 산-민감성 아실히드라존 결합을 통해 배위자에 연결시킨다. 본 발명에서 설명되는 결합체는 배위자가 그의 섭수체에 결합하는 능력뿐 아니라 배위자에 의해 표적화된 세포집단에 대한 안트라사이클린의 세포독성도 보유한다.

본 발명자들이 이제까지 본 발명의 몇가지 구체예를 제공하였으나, 본 발명의 면역결합체 및 방법을 이용하는 다른 구체예를 제공하기 위해 본 발명의 기본 개념을 변화시킬 수 있음은 분명하다. 따라서, 본 발명의 범주는 실시예에 의해 이제까지 기재한 몇가지 특정 구체예보다는 첨부된 특허청구의 범위에 의해 규정되어야 한다.

Claims (13)

1. 사멸시키고자 하는 선별된 세포집단과 반응성인 배위자에 연결된 적어도 하나의 안트라사이클린 분자로 이루어지며, 이때 안트라사이클린은 C-13 위치에 케토기를 갖고 있고 링커 암을 통해 배위자에 부착되어 있으며, 링커 암은 안트라사이클린의 13-케토 위치에서 아실히드라존 결합에 의해 안트라사이클린에 공유적으로 결합된 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
2. 제 1항에 있어서, 링커 암이 디술파이드 결합 또는 티오에테르 결합을 추가로 함유하는 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
3. 제 1항에 있어서, 배위자가 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 분자인 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
4. 제 3항 있어서, 배위자가 봄베신, EGF, 트랜스페린, 가스트린, 가스트린-방출 펩티드, 혈소판-유도된 성장인자 IL-2, IL-6, TGF-α, VGF, TGF-β, 인슐린 및 인슐린-유사 성장인자 I 및 II인 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
5. 제 1항에 있어서, 안트라사이클린이 아드리아마이신, 다우리아마이신, 데토루비신, 카르미노마이산신, 이다루비신, 에피루비신, 에소루비신, 4＇-THP-아드리아마이신, AD-32 및 3＇-데아미노-3＇-(3-시아노-4-모르폴리닐)-독소루비신 중에서 선택되는 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
6. 제 1항에 있어서, 배위자가 봄베신이고 안트라사이클린은 아드리아마이신인 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
7. 제 1항에 있어서, 배위자가 EGF이고 안트라사이클린은 아드리아마이신인 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
8. 제 1항에 있어서, 배위자가 트랜스페린이고 안트라사이클린은 아드리아마이신인 것이 특징인 안트라사이클린-배위자 결합체.
9. a) 배위자를 티올화제와 반응시키고 ;

   b) 티올화된 배우자를 다음 일반식 I, II 또는 III의 아실 히드라존과 반응시키는 단계로 됨을 특징으로 하는 제1항의 안트라사이클린-배위자 결합체의 제조 방법 :

   

   (식 중, R¹은 CH₃, CH₂OH, CH₂OCO(CH₂)₃CH₃또는 CH₂OCOCH(OC₂H₅)2 ;

   R²는

   

   또는

   

   (식 중, X는 H,NO₂또는 할로겐) ; R³는 OCH₃, OH 또는 수소 ; R⁴는 NH₂, NHCOCF₃, 4-모르폴리닐, 3-시아노-4-모르폴리닐, 1-피페리디닐, 4-메톡시-1-피페리디닐, 벤질아민, 디벤질아민, 시아노메틸 아민 또는 1-시아노-2-메톡시에틸 아민 ; R⁵는 OH, O-THF 또는 수소 : R⁶는 OH 또는 수소이고 단, R⁵가 OH 또는 O-THP이면 R⁶는 OH가 아니며 ; n은 1내지 10의 정수임)

   

   (식 중, R¹은 CH₃, CH₂OH, CH₂OCO(CH₂)₃CH₃또는 CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂; R³는 OCH₃, OH 또는 수소 ; R⁴는 NH₂, NHCOCF₃, 4-모르폴리닐, 3-시아노-4-모르폴리닐, 1-피페리디닐, 4-메톡시-1-피페리디닐, 벤질아민, 디벤질아민, 시아노메틸 아민 또는 1-시아노-2-메톡시에틸 아민 ; R⁵는 OH, O-THF 또는 수소 : R⁶는 OH 또는 수소이고 단, R⁵가 OH 또는 O-THP이면 R⁶는 OH가 아니며 ; n은 1내지 10의 정수임)

   

   (식 중, R¹은 CH₃, CH₂OH, CH₂OCO(CH₂)₃CH₃또는 CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂;

   R²

   

   또는

   

   (식 중, X는 H,NO₂또는 할로겐) ; R³는 OCH₃, OH 또는 수소 ; R⁴와 R⁷은 독립적으로 수소, 알킬, 치환 알킬, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 아르알킬 또는 치환 아르알킬이거나 또는 ; R⁴, R⁷과 N은 함께 4 내지 7원 고리를 형성하며, 여기서 상기 고리는 임의로 치환될 수 있고 ; R⁵는 OH, O-THF 또는 수소 ; R⁶는 OH 또는 수소이고 단, R⁵가 OH 또는 O-THP이면 R⁶는 OH가 아니며 ; n은 1내지 10의 정수임)
10. 제 9항에 있어서, 아실히드라존이 ADM-HZN인 것이 특징인 제조방법.
11. a) SPDP 를 히드라진과 반응시켜 3-(2-피리딜티오)프로피오닐 히드라지드를 생성시키고 ;

    b) 아드리아마이신-염산염을 상기 히드라지드와 반응시켜 ADM-HZN을 생성시킨다음 ;

    c) 티올기가 부착되어 있고, 사멸시키고자하는 선별된 세포집단과 반응성인 배위자와 상기 ADM-HZN을 반응시키는 단계로 됨을 특징으로 하는 제1항의 안트라사이클린-배위자 결합체의 제조방법.
12. a) SPDP 를 히드라진과 반응시켜 3-(2-피리딜티오)프로피오닐 히드라지드를 생성시키고 ;

    b) 아드리아마이신-염산염을 상기 히드라지드와 반응시켜 ADM-HZN을 생성시킨다음 ;

    c) 상기 ADM-HZN을 환원제로 처리하여 13-3-(메르캅토프로피오닐)아드리아마이신 히드라존을 생성시킨다음 ;

    d) 말레이미드기가 부착되어 있고, 사멸시키고자하는 선별된 세포집단과 반응성인 배위자와 상기 히드라존을 반응시키는 단계로 됨을 특징으로하는 제1항의 안트라사이클린-배위자 결합체의 제조방법.
13. 제 1항에 따른 적어도 한가지의 안트라사이클린-배위자 결합체의 약리적 유효량과 약리적으로 허용되는 담체로 이루어짐을 특징으로하는 암, 비악성 종양, 비세포사멸성 바이러스 또는 병원체 감염, 및 자가면역장애로 이루어진 군에서 선택되는 질병의 치료에 유효한 약리적으로 허용되는 조성물.

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