KR0125117B1

KR0125117B1 - 항 에이즈(aids)효과를 갖는 신규한 인간 면역 결핍 바이러스(hiv)프로테아제 억제 화합물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0125117B1
Application number: KR1019940013423A
Authority: KR
Inventors: 윤홍식; 박지효; 최낙현; 손영찬; 최호일; 이창선; 고종성; 김성천
Original assignee: 성재갑; 1997년12월05일
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 1997-12-05
Also published as: EP0687675A3; EP0687675A2; KR960000878A; JPH08193077A; JP2987313B2

Abstract

본 발명은 하기 일반식(I)로 표시되는 인간 면역 결핍 바이러스(HlV) 프로테아제의 억제 화합물과 그의 제조방법 및 HIV 감염으로 발생되는 후천성 면역 결핍증의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

상기 식에서, A는 하기 일반식으로 표시되는 작용화된 아실이고,

n은 0 또는 1이며, R¹는(C₁내지 C₄) 저급 알킬 또는 아미드로 치환된 (C₁내지 C₂) 저급 알킬중에서 선택되고, R²는 (C₁내지 C₄)저급 알콕시, 질소원자를 포함하는 방향족 중에서 선택되고, B는 하기 일반식(II)으로 표시되는 작용화된 아민이고,

R³와 R⁴는 각각 독립적으로 (C₁내지 C₄)저급 알킬, 방향족 라디칼, 방향족 라디칼로 치환된 (C₁내지 C₄)저급 알킬중에서 선택된다.

Description

항 에이즈(AIDS)효과를 갖는 신규한 인간 면역 결핍 바이러스(HIV )프로테아제 억제 화합물 및 그의 제조물

본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로테아제를 억제하는 신규한 화합물과 그의 제조방법 및 HIV 감염으로 발생되는 후천성 면역 결핍증(AlDS)의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

HlV는 유전 정보를 RNA 형태로 간직하는 레트로바이러스이다. 이 바이러스의 구조는 가장 내부에 유전정보인 RNA와 이 RNA로부터 거꾸로 DNA를 만들어낼 수 있는 역전사효소(reverse transcriptase)가 존재하고, 이 RNA와 역전사효소는 껍질 단백질에 의해 둘러싸여 있으며, 그 바깥쪽에는 지질막이 보호막을 형성하고 있다. 이 지질막에서는 gp-120과 gp-40으로 불리우는 글리코프로테인들이 박혀 있는데, 이 gp-120이 바이러스가 T-세포를 인식하여 침투하는데 결정적 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

바이러스의 작용 기전이 복잡성을 띨수록 그에 대한 퇴치방법 개발의 가능성이 높아지게 되는데, HlV의 경우도 여러 바이러스중 가장 복잡한 형태의 복제 메카니즘을 갖고 있기 때문에 여러 형태의 치료제가 개발되었다. 현재까지 가장 잘 알려진 치료제는 역전사효소 억제제이다. 역전사효소는 RNA로부터 DNA를 복제하는 효소로서, 이러한 특이성 때문에 RNA 바이러스, 즉 레트로바이러스에서만 존재하는 효소이다. 이렇게 레트로바이러스에만 존재한다는 점 때문에 이들 역전사효소를 억제하는 화합물이 부작용을 최소화시키면서 HIV를 무력화시킬 수 있을 것으로 기대되었으며, 이에 따라 많은 역전사효소 억제제가 개발되었다. 보로-웰컴사의 아지도티미딘(azidothynndine(AZT))과 브리스톨-마이어스 스큅사의 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 그리고 호프만 라 로슈사의 2',3'-디데옥시시토신(DDC) 및 글락소사의 D4T 등이 이에 해당된다. 그러나 현재 이용되고 있는 이들 화합물들은 대부분 세포의 감염만 막아줄 뿐 이미 감염된 세포내에서의 바이러스 복제는 막지 못하기 때문에 질병을 완전히 치료하기 보다는 생명연장효과 정도만 있을 뿐이며, 혈소판 수의 감소, 골수혈구 감소등의 부작용을 야기시키고, 이들 화합물에 내성이 생긴 바이러스도 많이 발견되고 있다.

중요한 또 다른 치료제는 HlV 프로테아제 억제제이다 HlV는 껍질 단백질과 필요한 효소를 만들때 이들을 mRNA로부터 각각 합성해 내는 것이 아니고, 일단 껍질 단백질과 효소 등이 다 함께 결합되어 있는 긴 형태의 프로프로테인(proprotein)인 gap-단백질(P55) 또는 gap-pol 단백질(P165)을 먼저 만든 다음 이프로테인이 자신안에 있는 프로테아제에 의하여 껍질 단백질과 역전사효소, 인테그라제 등의 바이러스 형성에 필요한 효소들로 분해되게 된다. 이 분해 과정을 담당하는 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되게 되며, 프로테아제 억제제는 이러한 원리에 기초한 것이다. HIV 프로테아제는 99개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 두개의 똑같은 단위체가 이량체로 존재하고 있고, 각 단위체의 분자량은 10793이다. HlV 프로테아제는 반응 부위에 아스파르테이트-트레오닌-글리신의 배열을 갖는 전형적인 아스파르틱 프로테아제이다. HIV 프로테아제 억제제의 개발은 다른 종류의 아스파르틱 프로테아제(특히 레닌)의 억제제 개발 동향에 따르고 있다.

그 기본적인 접근 방식은 효소의 전이상태(transition state)와 유사한 화합물(transition state analogue,TSA)을 개발하여 효소의 친화도를 높임으로써 효소에 대한 결합력을 높이는데 있다. 이러한 방식으로 개발한 HIV 프로테아제 억제제는 여러 문헌에 개시되어 있다(Roberts, et al., Science 248,358(1990) ; 유럽 특허출원 공고 제0337714호; 제0346847호; 제356223호; 제352000호; 제357332호; 제362002호; 및 제361341호; Bone et al., JACS 1l3,9382(1991).

그러나, 이러한 공지의 HIV 프로테아제 억제제들은 모두 효소의 친화도를 높인 가역적 억제제이다.

이에, 본 발명자들은 전술한 전이상태를 모방한 가역적인 억제제보다 강력한 억제효과를 얻기 위하여, 전이상태와는 달리 시스-에폭사이드를 도입한 비가역적인 억제제를 개발한 바 있으며(본 출원인에 의해 1993년 6월 l4일자로 출원된 대한민국 특허출원 제93-10811호 참조) 본 발명에 이르러, 시스-에폭사이드 구조에 아미노산이 아닌 알킬아민을 C-말단에 도입함으로써 보다 강력한 항에이즈 효과를 갖는 새로운 화합물을 개발하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 후천성 면역결핍증 또는 HIV 감염의 예방 또는 치료에 유용한 C-말단에 알킬아민이 도입된 하기 일반식(I)의 시스-에폭사이드를 갖는 화합물 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 제공하는 것이다.

상기 식에서, A는 하기 일반식으로 표시되는 작용화된 아실이고.

R¹는 (C₁내지 C₄)저급 알킬 및 아미드로 치환된 (C₁내지 C₄) 저급 알킬중에서 선택되고, R²는 (C₁내지C₄)저급 알콕시 및 질소원자를 포함하는 방향족 라디칼중에서 선택되며, n은 0 또는 1이고, B는 하기 일반식(II)로 표시되는 그룹이고,

R³과 R⁴는 각각 독립적으로 (C₁내지 C₄)저급 알킬, 방향족 라디칼 및 방향족 라디칼로 치환된 (C₁내지 C₄)저급 알킬중에서 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ''저급 알킬''은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미하며, 질소원자를 포함하는 방향족 라디칼은 단환식 또는 이환식 방향족 라디칼에 1 내지 2개의 질소원자가 포함되어 있는 것으로, 예를 들어 피리딘 및 퀴놀린을 가리킨다.

본 명세서에서 사용된 아미노산에 관한 약어들은 아미노산 및 펩타이드에 대한 생화학적 명명법에 관한 IUPAC-IUB 합동회의에 따른 것이다[Eur. J. Biochem 1984. 158,9-31].

본 발명에 따른 화합물들은 또한 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미 화합물, 부분 입체이성질체 혼합물 및 개개의 부분 입체이성질체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 형태의 이성질체는 본발명에 포함된다.

본 발명의 바람직한 화합물은 다음과 같다.

본 발명에 따른 일반식(I)의 화합물은 하기 반응도식 1에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

반응도식 1

상기 식들에서, A 및 B는 상기에서 정의한 바와 같다.

상기 반응도식 1에 따르면 상기 일반식(가)의 화합물을 상기 일반식(나)의 화합물과 커플링 반응시켜서 상기 일반식(다)의 화합물을 얻은 다음, 이 화합물을 에폭사이드화 반응시켜서 일반식(라)의 화합물을 얻는다. 다음에는 화합물(라)로부터 벤질옥시카보닐 보호기를 제거한 뒤 상기 일반식(마)의 화합물과 커플링 반응시켜서 목적하는 일반식(I)의 화합물을 얻는다.

상기 에폭사이드화 반응은 메타클로로퍼벤조산을 사용하여 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.

또한, 상기 커플링 반응에는 커플링 시약으로서 예를 들면, 디사이클로 헥실 카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필 카보디미이드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산 클로라이드(BOP-C1), 디페닐포스포릴아지드(DPPA)등을 사용할 수 있으며, 이들로만 한정되는 것이 아니다. 달리, 일반식(가)의 카복실산을 산 할라이드 또는 기타 활성 에스테르 유도체로 전환시킨 후 커플링 반응시킬수도 있다. 상기 산 할라이드로는 산 클로라이드가 포함되며, 활성 에스테르 유도체는 아민과의 커플링 반응에 의해 아미드 결합을 형성하게 하거나 알콜과의 커플링 반응에 의해 에스테르 결합을 형성하도록 하기 위해 카복실산을 활성화시키는데 통상적으로 사용되는 것들로서, 예컨대, 메톡시카보닐클로라이드, 이소부톡시카보닐클로라이드 등과 같은 알콕시카보닐할라이드와, 커플링 시약으로부터 유도된 카복실산 무수물, N-하이드록시벤조트리아졸 유도된 에스테르, N-하이드록시프탈이미드 유도된 에스테르, N-하이드록시석신이미드 유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2,3-디카복스아미드 유도된 에스테르, 2,4,5-트리클로로페놀 유도된 에스테르 등이 포함되나, 이들로만 제한되는 것은 아나다.

벤질옥시카보닐 이탈 반응 역시 통상의 방법으로, 예컨대 Pd/C 촉매 존재하에서 수소가압하에 반용시켜 제거할 수 있다.

한편, 일반식(가)의 화합물은 다음의 하기 반응도식 2에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다.

반응도식 2

상기 식들에서, X는 할로겐원자로서 Br 또는 I이다.

상기 반응도식 2는 시스-β,γ-올레핀 산의 제조방법으로서 논문[Keinan et ai., Tetrahedron 47, 4631-4638(1991) 및 Corey Shimaji(1983), JACS 105,1662-1664]에 기술되어 있는 방법에 의거한 공정이다. 목적하는 일반식(가)의 화합물을 합성하기 위해, 상기 논문에 기재된 방법에 따라 K₂CO₃를 사용하여 일반식(사)의 L-N-벤질옥시카보닐-페닐알라닌알과 비티그 반응으로 상기 일반식(가)의 시스-β,γ-올레핀을 제조할 경우 70-80℃의 고온에서 반응시켜야 하므로 페닐알라닌알쪽에 라세미화가 일어나게 된다. 본 발명에서는 칼륨 헥사메틸디실라잔(KHMDS)을 염기로 사용하여 -78℃에서 반응을 시킴으로써 라세미화를 막을 수 있었다. 또한, 상기 논문에 기재된 방법에 따라 상기 일반식(아)의 오르토에스테르를 산처리하여 상기 일반식(자)의 화합물을 만든 후 염기 처리하여 보호기를 제거하는 경우에는 β-γ 올레핀산에서 α-β올레핀산으로 50% 이상 전환되어 목적 화합물의 수득률이 매우 낮아질 뿐 아니라 이의 분리에도 어려움이 따르기 때문에, 본 발명에서는 일반식(아) 화합물의 오르토에스테르를 산촉매 존재하에 t-부탄올을 용매로하여 용매의 환류온도로 가열 교반함으로써 α-β하여 용매의 환류온도로 가열 교반함으로써 α-β 올레핀산으로 전환되지 않은 화합물(가)를 80-90% 수율로 얻을 수 있다.

본 발명에서 일반식(II)의 그룹을 제공하는 작용화된 아민은 하기 반응도식(3) 및 (4)에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

반응도식 3

상기 식들에서, R은 페닐, 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필이고, X는 할로겐이다.

상기 반응도식 3은 이소부틸 니트릴로부터 그리나르 반응과 NaBH₄의 환원 반응에 의해 원하는 일반식(II)의 그룹을 제공하는 작용화된 아민을 제조하는 과정이다. 이 제조과정은 라세미체로 형성되기 때문에 t-부톡시카보닐-페닐알라닌을 커플링시킨 후 보호기인 t-부톡시카보닐 보호기를 제거하고 컬럼크로마토그래피를 실시하여 두개의 부분 입체이성질체를 분리하여 에드만법에 의해 각각의 이성질체를 분리하였다.

하기 반응도식 4는 반응도식 3에서 합성된 각각의 2-아미노-1-페닐-3-메틸-부탄의 입체화학을 결정하기 위해 (2S)-아미노-1-페닐-3-메틸-부탄을 합성하는 한 방법이다.

상기 반응도식(4)에서는, D-발린에 에톡시카보닐 보호기를 도입된 후 프리텔 크라프트 반응으로 카보닐쪽에 벤젠을 도입하여 화합물(차)를 합성하였다. 화합물(차)의 케톤기를 NaBH₄로 환원시켜 알콜로 만든후 보호기를 떼어내고 PB_r5와 팔라듐 촉매존재하에 수소 가압하에서 알콜기를 제거하여 원하는 (2S)-아미노-1-페닐-3-메틸-부탄을 합성하였다. 이를 반응도식 3에 의하여 합성된 동일 물질과 비교하면 먼저 분리되어 나오는 물질이 S(-)형태이고 나중에 분리되어 나오는 물질이 R(+)형태의 입체화학을 갖고 있었다.

본 발명의 화합물은 숙주에게 부여될 총 일일용량이 체중 1㎏당 20mg으로서, 한번에 또는 수회에 걸쳐 투여될 수 있으며, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용된 특정 화합물, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중등도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구투여할 수 있다.

주사용 제제, 예를 들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 수화제 또는 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다.

모노-, 디글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산은 주사용제제로 사용한다.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 가능하지만, 화합물 특성을 고려할 때 캅셀제와 정제가 특히 바람직하며, 정제로 할 경우에는 장피제로 제조하는 것이 유용하다. 고체투여 형태에는 활성화합물을 수크로오즈, 락토오즈 또는 스타치와 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 희석제외의 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 항 AIDS제, 면역 조절제등과 병행하여 투여를 할 수도 있다.

본 발명의 화합물과 혼합하여 투여될 수 있는 그러한 항 AIDS제에는 지도부딘(AZT), 디디옥시이노신(DDI), 디디옥시시티신(DDC), 리바비린, 콤파운드 Q, 알파인터페론, 베타인터페론, 폴리만노 아세테이트, 나트륨 포스포노포메이트, HAD-23, UA001, 에플로르니틴, 아사이클로비르가 포함된다.

본 발명의 화합물과 혼합하여 투여될 수 있는 면역조절제에는 브로피리민, 암프리겐, 항-인간알파인터페론항체 콜로니자극 인자, CL246738, 임페 2-2, 디에틸디티오카바메이트, 인터루킨-2, 알파-인터페론, 이노신프라노벡스, 메티오닌 엔케팔린, 무라밀-트리펩티드, TP-5, 에리트로포이에틴, 날트레손 및 종양 리사인자가 포함된다.

HIV 감염의 치료 및 예방을 위한 본 발명의 화합물의 제제는 상술한 것으로 제한되는 것이 아니며, HIV 감염의 치료 및 예방에 필요한 본 발명의 화합물의 유용한 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.

이와 같은 본 발명을 제조예 및 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 하기의 실시예는 본 발명에 따른 신규 화합물의 제조방법에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

제조예 1

단계 1

2-아미노-3-메틸-1-페닐부탄 하이드로클로라이드의 제조

50m1의 무수 테트라하이드로푸란(THF)으로 희석한 이소부틸 니트릴 13.8g(0.2몰)에 2.0M의 벤질 마그네슘 클로라이드 110ml(0.22몰)을 상온에서 가한 후 1시간 동안 환류하고 상온으로 식힌다. 메탄올 200m1과 11.4g(0.3몰)의 NaBH₄를 가한 다음 1시간동안 상온에서 교반하였다. 1N 염산을 가하여 반응을 종결시킨후, 용매를 감압증류하여 제거하고 1N NaOH 용액을 가하여 pH를 약 11로 맞춘다. 클로로포름으로 추출한후 무수 Na₂SO₄로 건조지킨 다음 메탄올성 염산을 가하고 컬럼크로마토그래피(용출제 : 디클로로 메탄 : 메탄올=10 : 1)를 실시하여 표제화합물 37.5g(수율 94%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCI₃)1.08(m,6H), 1.96(m,1H), 2.90-3.16(m,2H), 3.37(m,1H), 7.15-7.31(m,5H), 8.36(b,3H)

단계 2

L-(N-t-부톡시카보닐)-페닐알라닌일-2-(1-페닐-3-메틸-부틸)아미드의 제조

N-t-부톡시카보닐 페닐알라닌 26.5g(0.1몰)에 EDC, N-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)을 각각 1.5당량씩 가하고 디메틸포름아미드(DMF) 130ml, 트리에틸아민 15ml를 넣어 녹인다음 단계 1에서 생성된 화합물 20g(0.1몰)을 0℃에서 가하고 상온에서 5시간동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거한 후 에틸아세테이트에 녹이고 1N 염산과 NaHCO₃포화용액으로 씻어준 다음 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시키고 용매를 제거하여 37.7g(수율 92%)의 표제화합물을 얻었다.

단계 3

L-페닐알라닌일-2-(1-페닐-3-메틸-부틸)아미드의 제조

단계 2의 표제화합물 20.5g(0.05몰)을 디클로로메탄 30ml와 트리플루오로 아세트산 15ml에 녹이고 상온에서 1시간 동안 교반한 후 용매를 감압증류하여 제거한 다음 에틸아세테이트로 컬럼크로마토그래피를 실시하여 두개의 이성질체를 분리하였다.

Rf=0.50 및 0.45의 경우, 각각 8.0g 및 7.4g을 얻었고, 전체 수율은 99%이다.

¹H NMR(CDCl₃)

Rf=0.50 0.93(m,6H), 1.80(m,1H), 2.22(m,1H), 2.63(m,1H), 2.85(m,1H), 3.05(m,1H), 3.51(m,1H), 4.11(m,1H), 7.10-7.34(m,10H)

Rf=0.45 0.91(m,6H), 1.79(m,1H), 2.65-2.70(m,2H), 2.83(m.1H), 3.18(m,1H), 3.44(m,1H), 4.08(m,1H), 7.10-7.32(m,10H)

단계 4

2-아미노-3-메틸-1-페닐-부탄의 제조

단계 3의 각각의 생성물 1.46g(4.7밀리몰)을 무수 디클로로메탄 50m1에 녹이고 페닐이소티오시아네이트 0.66ml(5.5밀리몰)를 상온에서 가한 후 2시간 동안 환류하였다. 상온으로 식힌 후 트리플루오로아세트산 10ml를 가하고 60℃에서 40분간 환류한 다음 용매를 감압증류하여 제거하였다. 20ml의 물에 녹인후 에테르로 씻어내고 NaOH로 pH를 약 11로 맞춘후 클로로포름으로 추출하여 각각의 생성물을 수율 82 내지 85%로얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)0.94(m,6H),1.11(bs,2H), 1.65(m,1H), 2.39(m,1H), 2.82(m,2H), 7.16-7.32(m,5H)

[]_D① -38.1(C=0.12, 디클로로메탄)

[]_D② +38.1(C=0.12, 디클로로메탄)

제조예 2

단계 1

[(에톡시카보닐)아미노]-3-메틸-1-페닐-부탄-2-온의 제조

D-(N-에톡시카보닐)-발린 9.45g(0.05몰)을 150ml의 무수 디클로로메탄에 녹이고 0℃, 질소 대기하에서 0.25ml 디메틸 포름아미드와 50ml(0.053몰)의 옥살릴 클로라이드를 가한 다음 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 70ml의 무수 디클로로메탄과 650ml의 무수 벤젠을 가하고 -15℃에서 14.2g(0.105몰)의 알루미늄 트리클로라이드를 넣고 -15℃에서 14시간 동안 교반한 다음 150ml의 1N 염산과 150ml의 물을 넣고 반응을 종결시켰다. 유기층을 1N 염산, 물, NaHCO₃포화용액으로 차례대로 씻고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후 컬럼크로마토그래피(용출제 : 에틸아세테이트 : 헥산=5 : 95)를 실시하여 표제화합물 10.8g(수율 87%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)0.71(d,3H), 0.99(d,3H), 1.18(t,3H), 2.10(m,1H), 4.02(m,2H), 5.22(m,1H), 5.71(d.1H), 7.35-7.55(m,3H), 7.92(d,2H)

단계 2

(S)-2-아미노-3-메틸-1-페닐부탄의 제조

제조예 2의 단계 1의 표제화합물 10g(0.04몰)을 150ml의 메탄올에 녹인 후 2.3g(0.06몰)의 수소화 붕소나트륨을 서서히 가한 다음 상온에서 1시간동안 교반하였다. 초산을 가하여 반응을 종결시킨 후 메탄올을 감압증류하여 제거한 다음 포화 NaHCO₃용액으로 희석하고 디클로로메탄(2×100ml)으로 추출하였다. 감압증류하여 유기용매를 제거한 후 160ml의 메탄올/물(3/1)에 녹이고 5.6g(0.1몰)의 수산화칼륨을 가한 다음 3시간동안 환류하였다. 감압증류하여 용매를 제거한 후 물로 희석한 다음 인산을 가하여 산성으로 만들고 에테르(3×50ml)로 씻어 주었다. 2N NaOH를 수층에 가하여 pH를 약 11로 맞춘 후 디클로로메탄(4×100ml)로 추출한 다음 메탄올성 염산을 가하였다. 감압증류하여 용매를 제거한 후 200ml의 디옥산에 녹인 다음 17.3g(0.04몰)의 PB_r5를 가하고 95℃에서 2시간동안 교반하였다. 감압증류하여 용매를 제거한 다음 0℃에서 200ml의 에탄올에 녹인 후 2g의 10% Pd/C를 가하고 수소조건(55psi)에서 8시간 동안 교반했다. 반응용매를 셀라이트에 통과시켜 Pd/C를 제거한 후 용매를 감압증류한 다음 100ml 의 1N NaOH와 디클로로메탄(3×100ml)을 가하여 표제화합물을 추출한 후 유기용매를 제거하여 생성물 5.15g(수율 79%)를 얻었다.

[]_D= -37.0(C=0.12, 디클로로메탄)

제조예 3

단계 1

5-L-(N-벤질옥시카보닐)아미노-6-페닐-헥스-3-(시스)-엔일-4'-메틸-2',6',7'-트리옥사-비사이클로[2',2',2']옥세탄의 제조.

케이난 등의 방법(Keinan et a1, Tetrahedron 26, 4631-4638(1991))에 따라 합성된 1-(2-트리페닐포스포니움-메틸)-4'-메틸-2',6',7'-트리옥사-비사이클로[2',2',2']옥세탄 브로마이드 60.8g(0.12몰)을 400ml의 테트라하이드로푸란에 녹이고 -78℃에서 저어준 후 220ml의 칼륨 헥사메틸 디실라잔 0.5M 용액(0.11몰)을 가하고 1시간동안 -78℃에서 교반한다. L-(N-벤질옥시카보닐)페닐알라닌알 30g(0.106몰)을 테트라하이드로푸란 150ml에 녹인다음 -78℃에서 식혀서 위의 용액에 20분에 걸쳐서 천천히 가한 후 -78℃에서 1시간, 상온에서 1시간 교반하고 물을 가하여 반응을 종결시킨다. 반응 용액을 제거한 후 에틸아세테이트에 녹이고 NaHCO₃포화용액과 물로 씻어준 다음 유기층을 무수 NaSO₄로 건조시키고 컬럼크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 : 트리에틸아민 = 70 : 30 : 5)를 실시하여 36.5g(48% 수율)의 표제화합물을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)0.8(s,3H), 2.2∼3.0(m,4H), 3.9(s,6H), 4.6(m,1H), 4.8(br,1H), 5.05(s,2H), 5.4∼5.6(m,2H), 7.1∼ 7.5(m,10H)

[]_D= +25.2(C=0.50, 메탄올)

단계 2

5-L-(N -벤질옥시카보닐)아미노-6-페닐-헥스-3-(시스)-엔-1-카보닐산의 제조

제조예 3의 단계 1에서 얻은 화합물 2.5g(6밀리몰)을 1% 미만의 진한 염산이 포함된 t-부탄올, 물 혼합용액에 녹여 반응 용매의 환류온도로 약 20시간 교반한 뒤, 반응용매를 증류 감압하여 제거하고 에틸아세테이트로 희석한 뒤 K₂CO₃용액으로 씻어주었다. 유기층을 제거한 뒤 수층을 pH 2까지 맞춘 다음 에틸아세테이트로 추출하여 무수 MgSO₄로 처리하고 유기 용매를 제거하여 1.62g(60% 수율)의 표제화합물을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)2.7∼3.3(m,4H), 4.6(m.1H), 4.8(br,1H), 5.05(s,2H), 5.4(t,1H), 5.6(m,1H), 7.1∼7.3(m,10H)

Mass(FAB, m/e) 340(M+1)

제조예 4 내지 7

상기 제조예 1의 단계에서와 같은 방법으로 벤질마그네슘 클로라이드 대신, 페닐마그네슘 클로라이드, 2-페닐에틸 마그네슘 클로라이드 또는 2-페닐에틸 마그네슘 브로마이드, 3-페닐프로필 마그네슘 브로마이드, 메틸 마그네슘 클로라이드를 사용하여 작용화된 아민을 합성하고, 이를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

실시예 1

[[(5S)-[N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]부틸]아미드의 제조

단계 1

[(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)아이노]-3-(시스)-엔-6-페닐-1-헥사노일]-(2S)-[[l-페닐-3-메틸]-부틸]아미드의 제조

0.339g(1밀리몰)의 제조예 3에서 얻어진 생성물, EDC, HOBT. 트리에틸아민을 1.5당량씩 섞은 후 20ml의 디메틸포름아미드에 녹인 다음 (S)-2-아미노-3-메틸-1-페닐부탄 0.163g(1밀리몰)을 0℃에서 가하고 상온에서 12시간동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거한 후 에틸아세테이트에 녹이고 유기층을 1N 염산과 NaHCO₃포화용액으로 씻어주었다. 유기층 무수 MgSO₄로 건조하고 감압증류하여 제거한 후 컬럼크로마토그래피를 실시하여(에틸아세테이트 : 헥산=1 : 1) 표제화합물 0.38g(수율 87.5%)을 얻었다.

^lH NMR(CDCl₃)0.85-1.01(m,6H), 1.78(m,1H), 2.42-3.25(m,6H), 4.05(m,1H), 4.58(m,1H), 4.95(bs,1H), 5.08(m,2H), 5.35(m,1H), 5.58(m,1H), 7.09-7.41(m,15H)

단계 2

[(5S)-[(N-벤질옥시카보닐)아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일]-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]-부틸]아미드의 제조

실시예 1의 단계 1의 생성물 360mg(0.7밀리몰)을 20ml의 디클로로메탄에 녹이고 3당량의 메타클로로퍼옥시벤조산을 넣고 상온에서 24시간동안 교반하였다. 10% Na₂S₂O₃용액을 넣어 30분간 교반한 후 유기층을 NaHCO₃포화용액으로 씻어 주었다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조하고 유기용매를 제거하여 표제화합물 0.30g(수율 82%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃)0.83-0.99(m,6H), 1.77(m,1H), 2.61-3.24(m,8H), 3.74(m,1H), 4.11(m,1H), 4.95(m,1H), 5.10(s,2H), 7.21-7.50(m,15H)

단계 3

[[(5S)-[(N-(2-퀴놀린카보닐)-L--아스파라기닐]아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-1-헥사노일-(2S)-[[1-페닐-3-메틸]-부틸]아미드의 제조

실시예 1의 단계 2의 생성물 263mg(0.5밀리몰)을 20ml의 메탄올에 녹이고 10% 탄소상 팔라듐을 무게비로 약 10% 섞어 H₂조건(고무풍선)에서 3시간동안 교반하였다. 반응용매를 셀라이트에 통과시켜 무기금속을 제거한 후 반응용매를 제거하였다. 144mg(0.5밀리몰)의 2-퀴놀린카복실산, 1.5당량의 EDC, HOBT, 트리에틸아민을 10ml의 DMF에 녹이고 위에서 얻은 아민을 0℃에서 가한 후 상온에서 3시간동안 교반하였다. 감압증류하여 유기용매를 제거하고 에틸아세테이트에 녹인 후 NaHCO₃포화용액으로 씻어 주었다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조하고 컬럼크로마토그래피를 실시하여 표제생성물 197mg(수율 62%)을 얻었다.

^lH NMR(CDCl₃)0.83-0.99(m,6H), 1.76(m,1H), 2.58-3.36(m,11H), 4.01-4.28(m,2H), 5.01(d,1H), 5.65(d,1H), 6.29(m,1H), 6.55(m,1H), 6.94-8.35(m,16H), 9. 37(m,1H)

FAB MS(M+l) : 636

실시예 2 내지 9

실시예 1에서와 유사한 방법으로 반응을 실시하여 하기 표 2에 열거한 화합물들을 수득한다.

HIV 프로테아제의 억제 효능분석

본 발명의 화합물들의 HIV 프로테아제에 대한 억제 효능을 확인하기 위해 하기의 방법을 사용하였다.

먼저 반응기질이 없는 상태에서 상기 효소와 본 발명의 실시예 1 내지 9에서 제조된 화합물을 섞은 뒤(배양전 용액), 반응용액의 일부를 취하여 과량의 반응기질이 있는 용액(분석 용액)에 가하여 효소 활성의 감소정도를 남아있는 활성의 정도로서 측정하였다. 배양전 용액은 50mM 초산나트륨, pH 5.5, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 1mM 에틸 디아민 테트라 아세테이트(EDTA), 0.75M 황산 암모늄, 0.1% NP 40과 여러 농도의 실시예 1 내지 9의 화합물이 포함되어 있다. 억제 반응은 2.6nM의 HlV-1 프로테아제를 가함으로써, 개시하였다. 일정시간마다 10μL를 취하여, 상기와 동일한 완충용액에 l00μM의 반응기질이 포함되어 있는 80μL의 용액에 가하여 남아있는 효소 활성을 검정하였다. 이때, 반응기질로는 Ser-Nle-Ala-Glu-(p-NO₂) -Phe-Leu-Val-Arg-Ala-Lys-His의 11개 아미노산으로 이루어진 올리고 펩타이드를 사용하였으며, 이 기질은 HIV 프로테아제에 의해 (p-NO₂)-Phe과 Leu 사이의 아미드 결합이 끊어지게 된다. 반응속도는 (p-NO₂)-Phe의 280nm에서의 강한 흡광도를 이용하여, 반응전의 기질과 반응후의 생성물을 HPLC로 분리하여 생성물의 상대적 양을 측정함으로써 결정하였다. 시간에 따른 효소활성의 감소량을 구하고 감소량의 자연로그값(1n)을 시간에 대하여 그래프로 나타냄으로써 이로부터 K_obs를 구하였다. 억제상수는 하기식에 의해 구하였다.

억제효능이 뛰어나서 억제제의 농도를 효소의 농도보다 월등히 높은 조건(정상상태 속도)에서 실험할 수 없는 경우에는, 상기 식보다는의 식으로부터 정상상태 가정을 하지 않은 채 각 시간마다 살아있는 효소의 상대적 농도 E/(E+EI+EI')의 값을 KINSIM/FITSIM 프로그램에 입력하여 계산함으로써 억제상수 K_i와 K_ina그리고 2차 억제상수(Second order rate constant)인 k_ina/k_i를 구하였다.

억제상수의 결과는 표 3에 나타내었다.

항바이러스 활성 및 세포독성 측정

항바이러스 효과는 신카티움 형성 조사와 역전사효소 검정조사를 하여 바이러스 복제 저지를 50%하는 농도(IC₅₀)를 결정하였다.

1×l0⁵세포의 H9과 Sup T1 세포수를 24공 평판에 넣고 여러 농도의 본 발명의 화합물을 가하였다. 여기에 HIV-1 접종원을 200TCID₅₀(200배의 50% 세포감염 농도, tissue culture infections dose)을 넣고 rpmi-640 배지를 가한 후 37℃에서 배양하였다. Sup T1의 경우에는 3 내지 9일 후 신키티움이 형성된 갯수를 조사하였다. H9의 경우 3일 간격으로 배양액의 3/4을 같은 농도의 세 배양액으로 바꾸어 주었다. 9일후 6ml를 취해 l000r.p.m으로 10분동안 원심분리한 후 상층액 5ml를 취해 2.5ml의 30% PEG(폴리에틸렌글러콜, 분자량 약 6000 내지 약 8000)와 0.4M NaCl을 가하고 0℃에서 하룻밤 정도 방치하여 바이러스를 침전시켰다. 2000rpm으로 45분간 원심분리하여 상층액은 버리고, 침전물을 20μL의 역전사효소 현탁완충액을 가하여 희석시켜서 에펜도르프 관에 넣어 -70℃로 사용시까지 보관한다. 현탁 완충액의 조성은 50mM 트리스 완층액(sigma), pH 7.5, 1mM 디티오트레이톨, 20% 글리세롤 0.25M KCl과 트리톤 X-100 0.25%가 포함되어 있다. 위의 현탁액을 드라이 아이스에서 2분간 얼렸다가 2분간 37℃에서 녹이는 과정을 세번 되풀이 한 후 4℃에서 원심분리하여 상층액을 역전사효소 검정한다. 역전사효소 검정 용액에는 위의 바이러스현탁액 10μL, l0μL의 250mM 트리스 완충액, pH 7.5, 37.5mM MgCl₂, 0.25% 트리톤 X-100 용액, 1.2μl의 200mM 디티오트레이톨, 5μL의 100μM 올리고(dT)-폴리(A)(베링거만하임(BoeringerManheim),12-18올리고머),³H이 포함된 TTP(티민트리포스페이트) 1μL(1μCi), 그리고 23.6μL의 물을 넣었다. 1시간후 위의 용액들을 왓트만 DEB1 여과지에 부은 후 2×SSC 완충용액에 넣는다. 2×SSC 완충용액으로 세번 씻은후(1번에 10분정도 소요), 95%의 에탄올로 10%초간 두번 씻는다. 여과지를 알루미늄 호일에 넣고 적외선 전구로 말린 후 액체 섬광 계수기로 정량한다.

항 AIDS제의 최대 허용치를 결정하기 위한 세포 독성을 검사하기 위해, H9 세포 또는 Sup T1 세포에 0.1μM 내지 l00μM 범위의 화합물을 가한 후 rpmi-1640배지에서 37℃로 배양하고, 3일 간격으로 배양액을 바꾸어 주면서 세포의 증식 정도를 트리판 블루 다이 익스크루전 방법(Trypan blue dye exclusion technique)으로 혈구계산판에서 두주간 관찰한 후 세포독성 CT₅₀결정하였다. 측정된 항세균 활성 및 세포독성의 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

Claims

하기 일반식(I)의 시스-에폭사이드를 갖는 화합물 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는

용매화물 :

상기 식에서, A는 하기 일반식으로 표시되는 작용화된 아실이고,

n은 0 또는 1이고, R1은 아미노카보닐메틸이고, R²는 질소원자를 포함하는 방향족 라디칼이며 ; B는 하기일반식(II)로 표시되는 그룹이고,

R³와 R⁴는 각각 독립적으로 (C₁내지 C₄)저급 알킬, 방향족 라디칼 및 방향족 라디칼로 치환된 (C₁내지 C₄)저급 알킬중에서 선택된다.
제1항에 있어서, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(lR)-[{(1-페닐)-2-(메틸)}프로필]아미드, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(2S)-[{1-페닐)-2-(메틸)}부틸]아미드, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-{6-페닐-헥사노일-(3S)-[{(1-페닐)-(4-메틸)}펜틸]아미드, N-[N-L-[{N-(2--퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(4S)-[{(1-페닐)-(5-메틸)}헥실]아미드 및 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물인 화합물.
다음 일반식(가)의 화합물을 다음 일반식(나)의 화합물과 커플링 반응시켜 다음 일반식(다)의 화합물을 얻은 다음; 이 일반식(다)의 화합물을 에폭사이드화 반응시켜 다음 일반식(라)의 화합물을 얻고; 이 일반식(라)의 화합물로부터 벤질옥시카보닐 보호기를 제거한 뒤, 다음 일반식(마)의 화합물과 커플링 반응시켜서 다음 일반식(I)의 화합물을 제조하는 방법.

상기 식에서, A는 하기 일반식으로 표시되는 작용화된 아실이고,

n은 0 또는 1이고, R¹은 아미노카보닐메틸이고, R²는 질소원자를 포함하는 방향족 라디칼이며; B는 하기 일반식(II)로 표시되는 작용화된 아민이고,

R³와 R⁴는 각각 독립적으로 (C₁내지 C₄)저급 알킬, 방향족 라디칼 및 방향족 라디칼로 치환된 (C₁내지 C₄)저급 알킬중에서 선택된다.
일반식(바)의 트리옥사-비사이클로옥세탄 할로겐화물을 -78℃에서 칼륨헥사메틸디실라잔(KHMDS)의 존재하에, 하기 구조식(사)의 L-(N-벤질옥시카보닐)페닐알라닌알과 반응시켜 구조식(아)의 화합물을 수득한 다음, 이를 산촉매 존재하에, t-부탄올중에서 용매의 환류온도로 가열하므로써 구조식(가)의 화합물을 제조하는 방법;

상기 식에서, X는 할로겐 원자로서 Br 또는 I이다.
제1항에 따른 화합물의 치료학적 유효량과 약제학적으로 허용가능한 담체, 분산체, 수화제, 불활성 희석제, 부형제 및 윤활제중에서 선택된 1종 이상의 보조제를 함유하는 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 조성물.
제5항에 있어서, 기존의 항 AIDS제 또는 면역조절제를 1종 이상 함유하는 조성물.
제1항에 있어서, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-[디(이소프로필)-메틸]아미드 및 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물인 화합물.
제1항에 있어서, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일]-(1S)-[{(1-페닐)-2-(메틸)}프로필]아미드, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(2R)-[{(1-페닐)-(2-메틸)}부틸]아미드, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(3R)-[{(1-페닐)-(4-메틸)}펜틸]아미드, N-[N-L-[{N-(2-퀴놀린카보닐)-L-아스파라기닐}아미노]-(4R,3S)-에폭시-6-페닐-헥사노일-(4R)-[{(1-페닐)-(5-메틸)}헥실]아미드 및 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물인 화합물.