KR0176418B1

KR0176418B1 - M-1 homologous gene derived from human tissue

Info

Publication number: KR0176418B1
Application number: KR1019960009150A
Authority: KR
Inventors: 최인성; 정태화; 김재화; 이영희; 이인애; 최용경; 송재찬; 임종순
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 1999-04-01
Also published as: KR970065715A

Abstract

본 발명은 닭의 생체 시스템에서 발암 유전자 myb에 의해서 유도되는 단백질인 mim-1 유전자와 상동성을 갖는 인체 조직 유래의 상동 유전자에 관한 것으로, 인체의 태아 간조직에서 발현되는 본 발명의 cDNA 클론 20G06으로부터 예측되는 단백질은 닭의 mim-1 단백질과 77%의 상동성을 보이며 특히 단백질의 생리적인 활성도와 관련이 높은 단백질 분자의 3차 구조를 결정하는데 중요한 역할을 담당하는 시스테인들과 그 주변의 아미노산 서열의 상동성이 잘 유지되고 있다. 이와같은 인체 조직 유래의 mim-1 상동 유전자는 아직 밝혀지지 않은 인체 조혈 세포계의 발암 기전을 이해하는 재료로써, 또한 이를 응용한 암의 진단 시약 및 치료제의 개발에 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to a homologous gene derived from human tissue having homology with the mim-1 gene, which is a protein induced by the oncogenic gene myb, in a chicken biological system. The cDNA clone 20G06 of the present invention is expressed in human fetal liver tissue. The protein predicted from is 77% homologous to chicken mim-1 protein, and cysteines and their surrounding amino acids play an important role in determining the tertiary structure of protein molecules, particularly those associated with protein physiological activity. The homology of the sequences is well maintained. The mim-1 homologous gene derived from human tissue is a material that understands the carcinogenic mechanism of the human hematopoietic cell system, which has not yet been identified, and can be usefully used for the development of diagnostic reagents and therapeutic agents for cancer to which the same is applied.

Description

Mim-1 homology gene from human tissue

제1도의 (a)는 인체 조직 유래 HM206 클론의 부분 염기서열을 나타낸 것이고, (b)는 상기 HM206 클론의 염기서열에서 예측되는 아미노산 서열과 유사성을 갖는 유전자를 데이터베이스 상에서 검색한 결과이고, (c)는 상기 HM206 클론의 염기서열에서 예측되는 아미노산 서열을 닭의 mim-1의 아미노산 서열과 비교한 것이고,(A) of FIG. 1 shows a partial nucleotide sequence of the human tissue-derived HM206 clone, (b) is a result of searching the database for a gene having similarity with the amino acid sequence predicted from the nucleotide sequence of the HM206 clone, (c ) Is the amino acid sequence predicted from the base sequence of the HM206 clone is compared with the amino acid sequence of mim-1 of chicken,

제2도는 HM206 클론을 탐색자로 하여 인체 태아 간 조직의 cDNA 라이브러리에서 분리한 각 클론들의 크기와 상대적 위치를 비교한 것이고,Figure 2 compares the size and relative position of each clone isolated from the cDNA library of human fetal liver tissue using the HM206 clone as a searcher.

제3도는 본 발명의 인체 조직 유래의 mim-1 상동 유전자의 전체 염기서열 및 이로부터 예상되는 아미노산 서열을 나타낸 것이고,Figure 3 shows the entire sequence of the mim-1 homologous gene derived from human tissue of the present invention and the amino acid sequence expected therefrom,

제4도는 본 발명의 인체 조직 유래의 mim-1 상동 유전자의 아미노산 서열과 닭의 mim-1 유전자의 아미노산 서열을 비교한 것이고,4 is a comparison of the amino acid sequence of the mim-1 homologous gene derived from human tissue of the present invention and the amino acid sequence of the mim-1 gene of chicken,

제5도는 인체 태아 간 조직에서 발현되는 인체 mim-1 상동 유전자의 mRNA를 노던 블롯팅(Northern blotting)한 결과를 나타낸 것이다.5 shows the results of Northern blotting mRNA of the human mim-1 homologous gene expressed in human fetal liver tissue.

본 발명은 닭의 mim-1(myb induced myeloid specific protein-1) 유전자와 상동성을 갖는 인체 조직 유래의 상동 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 닭의 발암 유전자 myb에 의해 유도되는 새로운 단백질 중에서 전골수세포(promyelocyte)에서만 특이하게 발현되는 단백질인 mim-1의 유전자와 상동성이 있는 인체 조직 유래의 mim-1 상동 유전자에 관한 것이다.The present invention relates to homologous genes derived from human tissues having homology with the myb induced myeloid specific protein-1 (mim-1) gene in chickens, and more specifically, in the new protein induced by myb carcin gene myb. It relates to a mim-1 homologous gene derived from human tissue homologous to the gene of mim-1, a protein that is specifically expressed only in promyelocytes.

RNA 바이러스의 감염에 의하여 일어나는 암의 발현기전을 살펴보면, 먼저 바이러스의 RNA 염색체가 역전사 효소에 의해 DNA로 전환된 후 숙주의 염색체에 유입되고 유입된 바이러스의 암 유전자가 숙주의 발현기구에 의하여 세포내에서 발현됨으로써, 세포 성장에 대한 항상성이 파괴되어 끊임없는 세포의 증식으로 암화가 일어나게 된다. 이 과정은 암 유전자의 발현산물 자체에 의한 직접적인 작용이라기 보다는 암 유전자에 의해서 발현이 유도되는 여러 단백질들의 상호 작용에 의하여 일어나는 것이다(Van Beveren C. et al., RNA Tumor Virus 2nd ed. Cold Spring Harbor New York pp. 567-1148(1985)).Looking at the cancer expression mechanism caused by the infection of the RNA virus, first the RNA chromosome of the virus is converted into DNA by reverse transcriptase, then enters the host chromosome and the cancer gene of the virus introduced into the cell by the host expression mechanism By expression in, homeostasis to cell growth is disrupted and cancer occurs due to constant cell proliferation. This process is not due to direct expression of cancer genes, but rather by the interaction of several proteins with expression induced by cancer genes (Van Beveren C. et al., RNA Tumor Virus 2nd ed. Cold Spring Harbor New York pp. 567-1148 (1985).

이와 같이 암 유전자에 의해 발현이 유도되는 단백질 중 닭의 mim-1 단백질은 RNA 바이러스 E26에서 유래되는 암 유전자인 v-myb에 의해 닭의 전골수세포에서 새롭게 발현되는 것이 확인되었다. 부화 21일째 된 닭의 조직을 사용하여 정상 조직에서 mim-1 유전자의 발현상태를 조사한 결과, 조혈 세포계의 전구조직인 골수세포에서만 mim-1 유전자가 발현되고 이외의 뇌, 심장, 폐, 신장, 근육, 흉선 및 췌장 조직에서는 발현되지 않는다는 것과, 수정 2일째의 배엽 및 4일째 태아의 섬유아세포에서도 mim-1 유전자가 발현되지 않는다는 것이 확인되었다.As described above, it was confirmed that chicken mim-1 protein among proteins induced by cancer genes is newly expressed in chicken whole bone marrow cells by v-myb, a cancer gene derived from RNA virus E26. The mim-1 gene was expressed in normal tissues using chicken tissue at 21 days of hatching, and the mim-1 gene was expressed only in bone marrow cells, which are progenitors of hematopoietic cells, and other brain, heart, lung, kidney and muscle , Thymus and pancreas tissues, and mim-1 gene was not expressed in embryonic embryos on day 2 and embryonic fibroblasts on day 4.

즉, mim-1 유전자는 조혈 세포계에서만 발현된다는 것을 알 수 있는데 여러 형태의 조혈세포를 포함하는 골수세포계 중에서도 탐식세포에서는 발현되지 않고 골수세포(myelocyte)에서만 발현되었다. 배양 세포계를 통한 실험에서는, 여러 종류의 암 유전자에 의하여 형질전환된 세포 중 E26 바이러스의 v-myb 유전자에 의하여 형질전환된 전골수세포에서만 그 발현이 확인되었다(Ness, Marknell and Garf, Cell, 59, 1115-1125(1989); Queva, et al., Development, 114, 125-133(1992)).In other words, it can be seen that mim-1 gene is expressed only in hematopoietic cell system. Among myeloid cell system including various types of hematopoietic cells, it is expressed not in phagocytic cells but only in myelocytes. In experiments with cultured cell lines, expression was confirmed only in promyelocytic cells transformed by the v-myb gene of E26 virus among cells transformed by various cancer genes (Ness, Marknell and Garf, Cell, 59). 1115-1125 (1989); Queva, et al., Development, 114, 125-133 (1992).

네스 등에 의하여 분리된 닭의 mim-1 유전자의 상보적 DNA(cDNA)는 1037개의 염기로 구성되어 있는데, 이 배열로부처 유추되는 326개의 아미노산으로 이루어지는 하나의 번역구조(open reading frame)가 알려져 있고, 이로부터 분자량이 35,000 달톤인 단백질이 만들어 진다. 염기서열에서 아미노산 서열로의 번역은 대부분의 진핵세포 유전자에서의 번역 개시코돈인 ATG의 메티오닌으로부터 시작되어 (Kozak, Nucl. Acids Res. 12, 857-872(1984)), 번역 종결코돈인 TAA 코돈이 두번 반복됨으로써 종결된다.Complementary DNA (cDNA) of the mim-1 gene of chicken isolated by Ness et al. Consists of 1037 bases. An open reading frame consisting of 326 amino acids inferred from this sequence is known. This results in a protein with a molecular weight of 35,000 Daltons. Translation from nucleotide sequence to amino acid sequence begins with methionine of ATG, a translation initiation codon in most eukaryotic genes (Kozak, Nucl. Acids Res. 12, 857-872 (1984)), TAA codon, a translation termination codon This is repeated by repeating twice.

닭의 mim-1 유전자의 염기서열은 408개의 염기를 한 단위로 하는 서열이 두 번 반복되는 구조를 갖는데 두 개의 반복서열 간에는 73%에 이르는 높은 상동성이 존재한다. 또한 한 반복단위에는 7개의 시스테인 코돈이 존재하는데, 이는 mim-1 유전자에서 발현되는 단백질의 구조 결정에 매우 중요한 역할을 한다.The base sequence of the chicken mim-1 gene has a structure in which a sequence of 408 bases is repeated twice, and there is a high homology of 73% between the two repeat sequences. In addition, there are seven cysteine codons in one repeat unit, which play an important role in determining the structure of the protein expressed in the mim-1 gene.

닭의 mim-1 유전자의 발현 조절 부위 내에는 v-myb 유전자 산물이 결합하는 장소로 추측되는 염기서열이 3군데 존재하는데, 이 부위에 E26 바이러스의 myb 유전자에서 발현된 단백질이 결합되어 mim-1 유전자의 발현이 유도된다는 사실이 보고되었다(Ma X-P., et al., Cancer Reserch, 54, 6512-6516(1994)).There are three nucleotide sequences in the chicken's mim-1 gene expression control site that are thought to be the site of v-myb gene product binding, and the protein expressed in the myb gene of E26 virus binds to mim-1. It has been reported that gene expression is induced (Ma XP., Et al., Cancer Reserch, 54, 6512-6516 (1994)).

현재까지 암의 분자 생물학적 발현기작에 대해서는 확실히 밝혀지지 않았으나, 암이 복잡한 생화학적 과정의 최종적인 결과로 나타난다는 점에 유의해 볼 때 닭의 조혈 세포계에서 암 유전자에 의하여 발현이 유도되는 유전자와 상동성을 가지고 있는 새로운 인체 유전자의 탐색은, 사람의 조혈 세포계에서 발생하는 암의 기작을 연구할 수 있는 중요한 연구재료가 될 수 있을 뿐 아니라, 이를 이용하여 발병이 야기되는 경로를 연구하게 되면 암의 진단과 더 나아가서는 암의 치료제 개발 등에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.To date, the molecular biological expression mechanism of cancer is not clear, but considering that cancer is the final result of a complex biochemical process, the expression of cancer-induced genes in chicken hematopoietic cell line The discovery of new human genes that have same sex is not only an important research material for studying the mechanism of cancer that occurs in human hematopoietic cell lines, but it can also be used to study the paths that cause cancer. It is expected to be used for diagnosis and further development of cancer treatment.

따라서, 본 발명의 목적은 바이러스 유래의 암 유전자인 v-myb에 의하여 닭의 생체내에서 발현이 유도되는 mim-1 단백질과 유사성이 있는 아미노산 서열을 갖는 새로운 인체 조직 유래의 유전자 및 이의 클론에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a gene derived from human tissues and clones thereof having an amino acid sequence similar to mim-1 protein, which is induced in vivo in chickens by v-myb, a virus-derived cancer gene. To provide a transformed transformant.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 염기서열의 전체, 또는 하기 염기서열의 일부로서, 하기 염기서열과 40 내지 100%의 상동성을 갖는 유전자를 검색할 수 있는 6개 이상의 염기를 포함하는 인체 조직 유래의 mim-1 상동 유전자:In accordance with the above object, in the present invention, the human tissue comprising six or more bases capable of searching for a gene having a homology of 40 to 100% with the following nucleotide sequence as a whole or a part of the following nucleotide sequence. Mim-1 homology gene from:

및 상기 유전자의 클론에 의해 형질전환된 대장균을 제공한다.And E. coli transformed with the clone of the gene.

이하 본 발명을 좀더 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

26주가 된 인체 태아 간조직으로부터 전사 RNA(mRNA)를 분리하여 이에 상응하는 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 λZAP IIXR 벡터에 클로닝함으로써 인체 태아 간 조직에서 발현되는 유전자들의 라이브러리(cDNA library)를 작성한다. 이 라이브러리로부터 닭의 v-myb 암유전자 유도 단백질인 mim-1과 아미노산 수준에서 54%의 상동성과 73%의 유사성을 나타내는 HM206 클론을 분리한 후, 이 클론의 DNA 배열을 탐색자로 하여 인체 태아 간 조직 cDNA 라이브러리로부터 단백질의 전체 구조를 포함하는 클론들을 검색한다.Isolation of transcriptional RNA (mRNA) from human fetal liver tissue at 26 weeks, synthesizing corresponding complementary DNA (cDNA) and cloning into λZAP IIXR vector to create a library of genes expressed in human fetal liver tissue (cDNA library) do. From this library, HM206 clone, which shows 54% homology and 73% similarity at amino acid level with mim-1, chicken v-myb oncogene-inducing protein, was isolated, and the DNA sequence of the clone was used as a searcher for human fetal liver. Retrieve clones containing the entire structure of the protein from the tissue cDNA library.

분리한 클론들 중 유전자의 전체 염기서열을 포함하는 가장 긴 cDNA 클론을 선택하여 cDNA 전체 염기서열을 결정하고, 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 닭의 mim-1 단백질의 아미노산 서열과 비교한다. 이와같이 얻어진 클론을 20G06으로 명명하였으며, 20G06으로 형질전환된 대장균을 1995년 4월 28일자로 부다페스트 조약에 의거 국제공인 기탁기관으로 인정된 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 설치된 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8663P 호로서 기탁하였다.Among the isolated clones, the longest cDNA clone containing the entire nucleotide sequence of the gene is selected to determine the cDNA total nucleotide sequence, and the amino acid sequence deduced therefrom is compared with the amino acid sequence of the chicken mim-1 protein. The clone thus obtained was named 20G06, and the Escherichia coli transformed with 20G06 was deposited on the Gene Bank installed in the Biotechnology Research Institute affiliated to the Korea Institute of Science and Technology, which was recognized as an international depositary institution under the Budapest Treaty on April 28, 1995. Deposited as KCTC 8663P.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

[실시예 1]Example 1

cDNA 라이브러리의 제작 및 부분 염기서열 결정Construction and partial sequencing of cDNA library

임신 26주째 인체 태아 간 조직으로부터 구아니딘 티오시아네이트와 산성페놀을 이용한 방법(Chomzynski, et al., Anal. Biochem. 162, 156-159(1987))으로 세포내에 함유된 전체 RNA를 분리하고 올리고(dT)-셀룰로오즈 칼럼을 이용하여 poly(A) RNA를 분리하였다. cDNA 라이브러리를 작성하기 위하여, 17개의 (dT)가 연결된 올리고 염기를 프라이머로 하고 poly(A) RNA 5㎍과 몰로니 류케미아 바이러스 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성한 다음, RNA 분해 효소와 대장균의 DNA 합성효소를 사용하여 두 번째 가닥의 cDNA를 합성하였다.The whole RNA contained in the cell was isolated and raised from the human fetal liver tissue at 26 weeks of gestation by using guanidine thiocyanate and acid phenol (Chomzynski, et al., Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)). poly (A) RNA was isolated using a dT) -cellulose column. To prepare the cDNA library, the first strand of cDNA was synthesized using 17 (dT) linked oligonucleotides as a primer and 5 μg of poly (A) RNA and Molecular Ryuchemia virus reverse transcriptase. Next, a second strand of cDNA was synthesized using RNA digestase and Escherichia coli DNA synthase.

이어서 수득된 cDNA를 운반체 벡터에 클로닝하기 위하여, 먼저 제한효소 EcoRI의 연결쇄(adaptor)를 연결한 다음, 제한효소 XhoI으로 절단하여 cDNA의 양쪽말단에 벡터의 양 말단과 상보적인 배열을 만들었다. cDNA의 양쪽말단에 벡터의 양 말단과 상보적인 배열을 만들었다. cDNA 라이브러리에 포함되는 염기의 길이를 크게 하고 클로닝 효율을 높이기 위하여, 제한효소에 의해 절단된 DNA의 조각들과 200개 염기 이하의 작은 길이의 cDNA는 세파크릴 칼럼을 사용하여 제거하였다.Then, in order to clone the obtained cDNA into the carrier vector, the linker of the restriction enzyme EcoRI was first linked, and then cleaved with the restriction enzyme XhoI to make an arrangement complementary to both ends of the vector at both ends of the cDNA. Both ends of the cDNA were complementary to both ends of the vector. In order to increase the length of the base included in the cDNA library and increase the cloning efficiency, fragments of DNA cut by restriction enzymes and cDNAs of less than 200 bases in length were removed using a Sephacryl column.

이후 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 절단한 벡터 λZAP IIXR에 상기 cDNA를 연결하여 시험관내 패키징(packaging) 방법으로 파아지를 제조하여 인체 태아 간조직의 cDNA 라이브러리를 작성하였다. 각 클론의 부분 염기서열을 결정하기 위하여, 먼저 cDNA 라이브러리의 파아지에 ExAssist 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 대장균 내에서 pBluescript 플라스미드로 잘라내었다.Since the cDNA was linked to the vector λZAP IIXR cut with restriction enzymes EcoRI and XhoI, phages were prepared by in vitro packaging to prepare a cDNA library of human fetal liver tissue. To determine the partial sequencing of each clone, the phage of the cDNA library was first infected with ExAssist helper phage and cut out with pBluescript plasmid in E. coli.

다시 플라스미드를 포함하는 대장균에 M13 헬퍼 파아지를 감염시켜 한 가닥의 M13 DNA 파아지로 추출하여 부분 염기서열 결정을 위한 주형 DNA로 사용하였다. 염기서열 결정은 SK 프라이머(5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3')와³⁵S-dATP, 시쿼네이즈(sequenase) 키트 Version 2.0을 이용하여 연쇄 종결반응(Sanger, et al., Proc. Nacl. Acad. Sci. 74, 5463-5467(1977))을 수행하고 7M 우레아(urea)를 포함하는 6% 아크릴아미드 젤에 전기영동하여 분석하였다.E. coli containing the plasmid was then infected with M13 helper phage and extracted with one strand of M13 DNA phage to use as template DNA for partial sequencing. Sequence determination was performed by chain termination reaction using SK primer (5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3 ') and ³⁵ S-dATP, sequence kit (Version 2.0) (Sanger, et al., Proc. Nacl. Acad. Sci. 74, 5463-5467 (1977)) were analyzed by electrophoresis on 6% acrylamide gels containing 7M urea.

[실시예 2]Example 2

핵산 염기서열과 아미노산 서열의 상동성 분석Homology Analysis of Nucleic Acid Sequences and Amino Acid Sequences

cDNA의 염기서열에 대한 검색은 생명과학연구소 내의 근거리 통신망으로 연결된 주컴퓨터를 통하여, 핵산 염기서열의 분석은 BLASTN 프로그램을 사용하여 GenBank 데이터 베이스를 검색하였고, 아미노산의 분석은 BLASTX 프로그램을 사용하여 스위스 포트 프로테인(swiss port protein) 데이터베이스를 검색하였다(Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410(1990)).cDNA sequencing was performed through a host computer connected to a local area network in the Life Sciences Institute. Analysis of nucleic acid sequences was performed using the BLASTN program and GenBank databases were analyzed. Amino acid analysis was performed using the BLASTX program. A database of protein (swiss port protein) was searched (Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)).

[실시예 3]Example 3

mim-1과 유사성을 가지는 HM206 클론의 분리 및 염기서열 결정Isolation and Sequence Determination of HM206 Clones Having Similarities with mim-1

데이터베이스를 통하여 검색한 유전자들 중에서 닭의 mim-1 단백질의 61개 아미노산 중 33개의 아미노산(54%)과 서열이 일치하고, 그 밖의 12개 아미노산(19%)이 유사한 성질을 갖는 아미노산으로 구성되어 전체적으로 73%의 유사성을 보이며, 인체에서 새롭게 발견된 상보적 DNA 클론 HM206을 선별하였다.Among the genes searched through the database, 33 amino acids (54%) of 61 amino acids of chicken mim-1 protein were identical in sequence, and the other 12 amino acids (19%) were composed of amino acids with similar properties. 73% similarity overall, complementary DNA clone HM206 newly found in humans was selected.

제1도(a)는 인체 조직 유래 HM206 클론의 부분 염기서열을 나타낸 것이고, (b)는 상기 HM206 클론의 염기서열에서 예측되는 아미노산 서열과 유사성을 갖는 유전자들을 데이터베이스 상에서 검색한 결과이고, (c)는 상기 HM206 클론의 염기서열에서 유추되는 아미노산 서열을 닭의 mim-1의 아미노산 서열과 비교한 것이다.Figure 1 (a) shows a partial nucleotide sequence of the human tissue-derived HM206 clone, (b) is a result of searching the database for genes having similarity with the amino acid sequence predicted from the nucleotide sequence of the HM206 clone, (c ) Compares the amino acid sequence inferred from the nucleotide sequence of the HM206 clone with the amino acid sequence of mim-1 of chicken.

여기에서 보면, GenBank의 데이터베이스에 등재된 유전자의 등록번호와 유전자의 이름이 기록되어 있고 리딩 프레임(reading frame)은 핵산 염기서열을 3개씩 짝을 이루어 번역할 때 사용된 번역 골격이며, 하이 스코어(high score)는 염기서열의 상동성을 숫자로 표현한 것인데 동일한 염기로 일치될 경우는 +5, 일치되지 않는 경우에는 -4로 하여 전 염기에서 얻어진 값을 합한 것으로 수치가 높을수록 유사성이 높은 것을 의미한다.Here, the registration number and gene name of the genes listed in GenBank's database are recorded, and the reading frame is a translation skeleton used when translating three nucleic acid sequences in pairs, and a high score ( high score) is a numerical representation of the homology of the nucleotide sequence, which is +5 if they match the same base, and -4 if they do not match.The higher score indicates the higher similarity. do.

또한 확률(probability)은 검색된 염기서열이 우연히 데이터베이스의 자료와 일치할 확률을 나타낸다. 따라서 전산기에 의한 검색결과에 따르면 상보적 DNA 클론 HM206의 염기서열은 검색의 결과 얻어지는 어떤 유전자의 염기서열보다도 닭의 mim-1 유전자와 높은 상동성을 가지고 있으며, 현재까지 닭 이외의 어떤 종에서도 mim-1 유전자와 유사한 염기서열을 가진 유전자 및 단백질은 밝혀져 있지 않다.Probability also indicates the probability that the searched sequences will coincide with data in the database. Therefore, according to the results of the computerized search, the nucleotide sequence of the complementary DNA clone HM206 has higher homology with the chicken mim-1 gene than the nucleotide sequence of any gene obtained as a result of the search. Genes and proteins with base sequences similar to those of the −1 gene are not known.

[실시예 4]Example 4

인체 mim-1 상동 유전자의 전체 염기서열 및 아미노산 서열 비교Comparison of Total and Amino Acid Sequences of Human mim-1 Homologous Genes

HM206 클론을 이용하여 인체 조직에서 mim-1 상동 유전자의 cDNA 전체 염기서열을 얻기 위하여 플라크 하이브리다이제이션(hybridization) 방법으로 라이브러리를 검색하여 7개의 클론을 분리하였다. 제2도는 클론 HM206을 탐색자로 하여 인체의 태아 간 cDNA 라이브러리에서 분리한 각 클론들을 비교한 결과를 나타낸 것으로, HM206을 포함한 8개 클론들 각각의 상대적인 길이 및 전체 유전자 상에서 각각의 클론이 차지하는 번역 골격의 위치를 비교한 것이다. 제3도는 이와같이 분리한 7개의 클론들 중 유전자의 전체 염기서열을 포함하는 상보성 DNA 클론 20G06의 핵산 염기서열과, 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.In order to obtain cDNA full sequence of mim-1 homologous gene in human tissue using HM206 clone, 7 clones were isolated by searching the library by plaque hybridization method. Figure 2 shows the result of comparing clones isolated from human fetal liver cDNA library using clone HM206 as a searcher.The translational skeleton occupied by each clone on the relative length and total gene of each of the eight clones including HM206. The position of is compared. Figure 3 shows the nucleic acid sequence of the complementary DNA clone 20G06 containing the entire base sequence of the gene among the seven clones thus separated, and the amino acid sequence inferred therefrom.

클론 20G06은 674개의 염기로 이루어져 있으며, 6가지의 번역 골격으로 번역한 결과 메티오닌으로 시작하는 mim-1과 유사한 한 개의 번역 구조(open reading frame)를 가지고 있는 것을 확인하였다. 이 핵산 염기서열로부터 유추되는 151개로 이루어진 아미노산 서열은 닭의 mim-1 단백질의 136개 아미노산의 반복단위와 높은 유사성을 가지고 있다. 클론 20G06으로 형질전환된 대장균 SOLR/20G06을 1995년 4월 28일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 제 KCTC 8663P호로서 기탁하였다.Clone 20G06 was composed of 674 bases and was translated into six translational backbones and had an open reading frame similar to mim-1 starting with methionine. The 151 amino acid sequence deduced from this nucleic acid sequence has high similarity with the repeating unit of 136 amino acids of chicken mim-1 protein. Escherichia coli SOLR / 20G06 transformed with clone 20G06 was deposited as KCTC 8663P with the Gene Bank of Korea Institute of Science and Technology.

제4도는 본 발명의 인체 조직 유래의 mim-1 상동 유전자의 아미노산 서열과 닭의 mim-1 유전자의 아미노산 서열을 비교한 것으로, 여기에서는 닭의 mim-1 단백질의 두 개의 반복단위 중 전반부를 구성하는 아미노산 서열과 비교한 결과만을 제시하였으나, 후반부를 구성하는 아미노산 서열과 비교한 경우에도 이와 동일한 양상을 보인다. 이들 아미노산 서열을 비교하면 33번부터 165번까지 133개의 아미노산 중 73개의 아미노산(55%)이 동일하고, 30개의 아미노산(22%)이 유사하여 총 77%에 이르는 81개의 아미노산 서열에서 유사성을 나타낸다.4 is a comparison of the amino acid sequence of the mim-1 homologous gene derived from human tissue of the present invention and the amino acid sequence of the mim-1 gene of chicken, wherein the first half of the two repeating units of the chicken mim-1 protein is constituted. The results are shown in comparison with the amino acid sequence, but when compared with the amino acid sequence constituting the second half shows the same aspect. Comparing these amino acid sequences, 73 amino acids (55%) out of 133 amino acids from 33 to 165 are identical, and 30 amino acids (22%) are similar, representing a similarity in a total of 77 amino acid sequences of 77%. .

인체 조직에서 발견된 mim-1 상동 유전자의 발현산물인 단백질은 특히 단백질의 2차 구조를 형성하는데 중요한 시스테인을 중심으로 높은 상동성을 보이고 있으므로 단백질의 3차 구조가 닭의 mim-1 단백질과 매우 유사할 것으로 예측할 수 있다. 이 단백질의 구조를 판단하기 위해, 제4도의 아미노산 서열중 *로 표시된 시스테인을 중심으로 한 염기서열을 닭의 mim-1 단백질과 비교하였다.Proteins, which are expression products of mim-1 homologous genes found in human tissues, show high homology, particularly around cysteines, which are important for the formation of protein secondary structures. It can be expected to be similar. To determine the structure of the protein, the nucleotide sequence centered on the cysteine indicated by * in the amino acid sequence of FIG. 4 was compared with the mim-1 protein of chicken.

그 결과 cDNA 클론 20G06의 경우는 그 구조가 6개의 시스테인으로 구성되어 있어 7개의 시스테인으로 구성된 닭의 mim-1 유전자의 각 반복단위보다 시스테인의 수가 하나 적으나 숫적으로 비교적 잘 보존되어 있으며, 시스테인 주위의 염기서열은 동일 유전자 내의 다른 부분들보다 높은 유사성을 보이고 있어 구조적으로도 잘 보존되어 있음을 알 수 있다.As a result, in the case of cDNA clone 20G06, its structure is composed of six cysteines, and the number of cysteines is one less than that of each repeat unit of mim-1 gene of chicken composed of seven cysteines, but the number is relatively well preserved. The nucleotide sequence of shows higher similarity than other parts of the same gene, it can be seen that it is well conserved structurally.

[실시예 5]Example 5

인체 mim-1 상동 유전자의 mRNA 분석MRNA analysis of human mim-1 homology gene

인체의 태아 간 조직에서 RNA를 분리하여 포름알데히드 젤에서 전기영동한 후 나일론 막으로 옮기고 UV-가교결합제를 이용한 RNA를 고정시켰다. cDNA 클론 HM206에서 얻은 DNA 절편을 동위 원소인³²P로 표지하여 제조한 하이브리다이제이션 탐침을 이용하여 노던 블롯팅(Sambrook, et al., DNA Cloning; A laboratory mannual, (1989))하였다. 제5도는 인체 태아 간 조직에서 발현되는 인체 mim-1 상동 유전자의 mRNA를 노던 블롯팅한 결과이며, 여기에서 보듯이, 약 0.7kb 및 1.1kb의 전사체(transcript)가 존재함을 확인할 수 있다.RNA was isolated from fetal liver tissues of the human body, electrophoresed in formaldehyde gel, transferred to nylon membrane, and the RNA was fixed using UV-crosslinking agent. cDNA clones obtained from the DNA fragment HM206, using a hybridization probe prepared by labeling with an isotope ³² P Northern blotting; was (Sambrook, et al, DNA Cloning . A laboratory mannual, (1989)). 5 is a result of Northern blotting mRNA of the human mim-1 homologous gene expressed in human fetal liver tissue, as shown here, it can be confirmed that the presence of about 0.7kb and 1.1kb transcripts (transcript) .

이상에서 살펴본 바와같이 본 발명의 인체 조직 유래의 mim-1 상동 유전자는 아직 밝혀지지 않은 인체 조혈 세포계의 발암기전을 이해하기 위한 연구 재료로서, 또한 이를 응용한 암의 진단 시약 및 치료제의 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.As described above, mim-1 homologous gene derived from human tissue of the present invention is a research material for understanding the carcinogenic mechanism of the human hematopoietic cell system, which is not yet identified, and is also useful for the development of diagnostic reagents and therapeutic agents for cancer by applying the same. Will be available.

Claims

Mim-1 homologous genes derived from human tissues comprising at least 6 bases capable of searching for genes having a homology of 40-100% homology with the following base sequences, as a whole or as part of the following base sequences:

The transformant transformed by the mim-1 homologous gene clone of Claim 1.

The E. coli SOLR / 20G06 (KCTC 8663P) according to claim 2.