KR0153138B1 - 향균성 미생물제제 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균성 미생물제제 및 그 제조방법을 개시하고 있다. 본 발명의 항균성 미생물제제는 신규의 항균성 스트렙토마이세스 속의 균주인 CYD 10과 WYE 117 중의 어느 하나를 포함하고 있으며 분말형과 액체형으로 제조될 수 있다. 분말형 미생물제제의 경우에는 톱밥, 키틴분말, 키토산, 라미나린, 카르복시케틸셀룰로오스 및 셀로바이오스를 포함하며, 액체형 미생물제제의 경우에는 팩틴, 알긴산, 콜로이드 키틴, 키토산, 라미나린, 카르복시메틸셀룰로오스, 글리세롤, 황산암모늄을 포함하고 있다. 본 발명의 항균성 미생물제제는 신규의 항균성 균주로 인해 항균효과가 뛰어나고, 항균성 균주의 활성을 유지하기에 매우 적합하다.

Description

항균성 미생물 제제 및 그 제조방법

본 발명은 항균성을 가지고 있는 미생물제제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식물이 성장하고 있는 토양의 리조스피아(rhizosphere)에 착생하는 곰팡이 병원균을 제어함으로써 식물 생장을 증진시키는 특성을 가지고 있는 스트렙토마이세스 속의 새로운 균주를 포함하는 미생물제제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

토양에 존재하는 곰팡이류의 병원균들은 농업과 원예산업에 커다란 경제적 손실을 야기하고 있다. 피씨움(Pythium spp.), 라이족토니아(Rhizoctonia spp.), 피토프쏘라(Phytophthora spp.), 푸사리움(Fusarium spp.), 베르티실리움(Verticilium spp.), 스클레로티니아(Sclerotinia spp.)와 스클레로티움(Sclerotium spp.)등은 흔히 발견되는 주요한 곰팡이류의 병원균들이다. 이들은농작물과 원예작물의 씨앗 썩음병, 뿌리 썩음병, 모잘록병, 잎 또는 줄기 썩음병, 시들음병등을 일으킨다. 특히 피씨움, 라이족토니아와 피토프쏘라 등은 다양한 종의 식물에 질병을 유발시키고, 그 감염속도가 매우 빠르므로 경작자들은 식물의 질병 방제를 위하여 여러 가지 종류의 곰팡이 살균제를 혼합하여 사용하고 있다. 즉, 여러 가지 살균제가 혼합되어 있는 복합살균제중 적어도 한 종류는 식물의 질병을 제어할 것이라는 단순한 가정하에 복합살균제 등을 주기적으로 사용하고 있는 것이다. 그러나, 곰팡이 살균제의 집중적인 사용에 의해 곰팡이로 인한 질병을 제어할 수 있다고 하더라도, 새로운 질병이 계속적으로 발생될 뿐만아니라 내성을 가진 곰팡이 병원균의 출현으로 식물병의 효과적인 방제가 점차 어려워지고 있다.

화학적으로 합성된 농약, 습열처리, 태양복사 및 훈증등이 묘포와 재배지의 식물 병원균을 제어하기 위하여 사용되었는데, 이러한 처리방법들은 식물의 병원균 제어에 유익한 토착 미생물을 멸종시키는 문제 뿐만아니라, 특히 맹독성의 합성농약으로 인해심각한 환경오염 문제도 야기하고 있다. 이들 합성농약은 또한 씻겨서 손실되는 량을 감안하여 대랑 사용되어야 하는 점에 기인하는 문제점과 리조스피아 토양으로의 침투성이 미약하여 식물의 뿌리에 발생되는 질병을 제어하기가 어렵고 1회 사용만으로는 재배기간 동안 식물 병원균 방제를 기대할 수 없는 실정이다.

따라서, 식물의 질병을 방제하기 위하여 리조스피아에 착생하는 특정의 미생물을 이용하는 것이 경제적이며 환경보호측면에서도 보다 효과적이므로 자연으로부터 항균성이 우수한 새로운 미생물 균주를 분리하기 위해 많은 연구가 이루어져 왔다.

이와 관련한 종래 기술로서, 먼저 EP 공개 제 0294053호에는 식물의 생장을 촉진하는 조성물로서 N-아실 락탐 화합물과 미생물 균주를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 미합중국특허 제 4,595,589호에는 토탄(peat)을 주성분으로 하는 현탁액 상태의 미생물 전달매체 조성물과 미생물 균주를 포함하는 조성물을 이용하여 식물의 생장을 촉진하고 병해를 방지하는 방법이 개시되어 있으며, 미합중국특허 제 5,403,584호에는 초탄(peat moss), 모래와 옥수수를 주성분으로 하는 미생물 전달매체와 미생물 균주를 포함하는 조성물을 상기와 같은 용도로 이용하는 방법이 개시되어 잇다. 이중 EP 특허는 화학적으로 합성된 화합물을 이용하고 있는 데서 오는 문제점을 여전히 안고 있고, 상기 미국 특허에개시되어 있는 조성물은 모두 자연에서 얻어지는 물질들로 이루어지므로 환경오염 문제를 해결하는데는 도움이 되지만 그 성분상의 문제로 인해 멸균 후 분말상으로 제조되기가 용이하지 않고 또한 현탁액상으로도 안정하게 유지되기가 곤란하여 식물의 종자에 직접 처리하는 경우에 그다지 효과적이지 않을 뿐만 아니라 보다 중요한 것은 이들이 식물생장을 촉진하는 비료물질로서 작용하는 것과 동시에 효과적인 식물 병해 방지제로서 작용하기에는 부족하다는 것이다.

따라서, 본 발명자는 식물 병해 방지 효과가 보다 우수한 미생물 균주를 분리하고, 이러한 미생물 균주의 생존성을 높은 수준으로 유지할 수 있는 전달매체를 제조하기 위해 연구를 거듭해 온 결과 본 발명의 미생물 균주를 포함하는 미생물제제를 개발하게 되었다.

그러므로, 본 발명의 목적은 곰팡이 병원균을 제어하는데 효과적인 미생물을 포함하고 있는 미생물제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물제제의 제조방법으로서, 식물의 종자나 뿌리 또는 토양에 처리하기에 적합하며 상기 미생물을 생존상태로 유지하기에 적합한 미생물제제의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 식물의 곰팡이 병원균을 제어하므로써 식물의 생장을 증진시킬 수 있는 미생물제제로서 스트렙토마이세스 모스코우(Streptomyces moscow) WYE 117 (KCTC 0222BP)과 스트렙토마이세스 속 균주 CY

D 10 (KCTC 0222BP) 중의 적어도 하나를 포함하고 있는 미생물제제가 제공된다.

여기에서, 상기 식물은 밭작물이며, 특별히 제한되지는 않으나 오이, 토마토, 고추, 인삼, 상치인 것이 바람직하다.

바람직하기로는, 상기 미생물제제는 상기 미생물 균주에 대한 분말형 미생물 전달매체를 포함하며, 상기 분말형 미생물 전달매체는 톱밥 0.1-99.9중량%와 키틴분말, 키토산, 라미나린, 카르복시멜틸 셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 0.1-99.9중량%를 포함하며, 보다 바람직하기로는 전달매체 총중량에 대하여 0.1-5중량%의 셀로바이오스를 더 포함하며, N-소스로서 0.03-1.0중량%의 질산암모늄 또는 황산암모늄을 더 포함한다.

여기에서, 상기 미생물 균주가 콜로니 형성단위(colony forming unit:cfu)로서 상기 분말형 미생물 전달매체 1g당 1.0×10⁷-10¹²개, 바람직하기로는 10⁷-10¹⁰개 포함되어 있다.

바람직하기로는, 상기 미생물제제는 상기 미생물 균주에 대한 액체형 미생물 전달매체를 포함하며, 상기 액체형 미생물 전달매체는 팩틴 0.1-16중량%와 알긴산, 콜로이드키틴, 키토산, 라미나린 및 카르복시메틸셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의성분 0.5-50중량%와 그 나머지량의 물을 포함하며, 보다 바람직하기로는 0.1-5중량%의 글리세롤을 더 포함하며, 가장 바람직하기로는 0.03-1.0중량%의 질산암모늄 또는 황산암모늄을 더 포함한다.

여기에서, 상기 미생물 균주는 cfu로서 상기 액체형 미생물 전달매체 1m1당 10⁷-10¹²개, 바람직하기로는 10⁷-10⁹개 포함되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 톱밥 0.1-99.9중량%와 키틴분말, 키토산, 라미나린, 카르복시멜틸셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 0.1-99.9중량%를 혼합하여 얻어진 혼합물에 상기 혼합물 중량에 대하여 0.1-5중량%의 셀로바이오스를 더 혼합한 다음 0.15-1.5배 중량의 물을 첨가하여 멸균함으로써 분말형 미생물 전달매체 조성물을 제조하고, 항균성 미생물 균주로부터 얻은 균사와 균체를 상기 멸균된 전달매체 조성물에 혼합하고, 상기 균주와 전달매체의 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 항균성 미생물 균주를 포함하고 있는 분말형 미생물제제의 제조방법이 제공된다.

바람직하기로는, 상기 멸균은 118-125℃에서 1-3시간 습열멸균한 다음 160-190℃에서 3-12시간 건열멸균하는 단계로 이루어진다.

바람직하기로는, 상기 미생물 균주가 cfu로서 상기 분말형 미생물 전달매체 1g당 1.0×10⁷-10¹²개, 보다 바람직하기로는 10⁷-10¹⁰개 혼합된다.

바람직하기로는, 상기 동결건조단계 후 포장하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의다른 목적은 또한 팩틴 0.1-16중량%와 알긴산, 콜로이드키틴, 키토산, 라미나린 및 카르복시메틸셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 0.5-50중량%와 글리세롤 0.1-5중량%, 질산암모늄과 황산암모늄 중의 적어도 한 화합물 0.03-1.0중량%와 그 나머지량의 물을 혼합한 다음 멸균하여 균질의 액체형 미생물 전달매체 조성물을 제조하고, 항균성 미생물 균주로부터 얻은 균사와 균체를 상기 멸균된 전달매체 조성물에 혼합하는 단계를 포함하는 상기 액체형 미생물제제의 제조방법에 의해서도 달성된다.

상기 멸균공정은 통상의액체 배지 멸균방법에 따라 이루어진다.

바람직하기로는, 상기 미생물 균주가 cfu로서 상기 액체형 미생물 전달매체 1m1당 1.0×10⁷-10¹²개, 바람직하기로는 10⁷-10⁹개 혼합된다.

바람직하기로는, 상기 균주와 액체형 미생물 전달매체 조성물의 혼합물을 포장하는 단계를 더 포함한다.

본발명의 미생물제제는 항균성 미생물 균주로서 본 발명자가 분리, 동정한 균주를 포함하고 있는 점에 특징이 있으나, 본 발명의 미생물제제의 제조방법에서는 본 발명의 신규 균주 뿐만 아니라 항균성을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 전달매체를 이용할 수 있는 특성을 가지고 있는 것이면 어느 것이든 무방하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

1. 배지의 종류 및 조성

본 발명에서는 다음과 같은 배지들이 이용되었으며, 이들은 모두 사용전 121℃에서 15분간 멸균되었다.

1) CYD (casamino acid/yeast extract/dextrose) 한천배지는 증류수 1.0 리터당 카사미노산(Difco) 0.5g/1, 이스트 추출물(Difco) 0.8g/1, 덱스트로오스 0.4g/1, K₂HPO₄2.0g/1 및 한천 18g/1로 구성하였으며, ph는 7.2-7.4로 조정하였다.

2) WYE (water/teast extract) 한천배지는 이스트 추출물 0.25g/1, K₂PH₄2.0g/1 및 한천 18g/1로 구성하였으며, ph는 7.2-7.4로 조정하였다.

3) 키틴 (chitin) 한천배지는 1리터의 증류수에 4-6g의 콜로이드 키틴 (Hsu and Lockwood, 1975 참조), 6g의 (NH₄)₂SO₄, 2g의 K₂HPO₄, 0.4g의 MgSO₄·7H₂O, 0.3g의 NaCl, 0.1g의 CaC0₃, 1.0ml의 미량염용액 및 20g의 한천으로 구성하였으며, ph는 7.0-7.2로 조정하였다. 여기에서, 미량염용액은 증류수 100ml에 0.1g의 FeSO₄·7H₂O, 0.1g의 MnCL₂·4H₂O와 0.1g의 ZnSO₄·7H₂O로 구성하였다.

4) 라미나린 (laminarin) 한천배지는 키틴한천 배지의 콜로이드 키틴 대신에 라미나린 (0.25w/v%)으로 구성하였으며, ph는 7.2-7.4로 조정하였다.

5) 변형된 벤넷 (modified bennett) 액체배지는 1리터의 증류수에 2g의 이스트 추출물, 2g의 비프 추출물, 2g의 펩톤, 10g의 글루코오스와 니스타틴 5kg/ml로 구성하였으며, ph는 6.5-7.5로 조정하였다.

6) 변형된 벤넷 한천배지는 변형된 벤넷 액체배지에 2.0w/v%의 한천으로 구성하였다.

7) ISP #2 배지: 이스트 추출물-맥아 추출물 배지로서 증류수 1리터당 이스트 추출물 (Difco) 4g, 맥아 추출물 (Difco) 10g, 덱스트로오스 4g 및 한천 15-20g으로 구성하였으며, pH는 7.3으로 조정하였다.

8) ISP #3 배지: 오트밀 한천배지 (Difco)이다.

9) ISP #4 배지: 무기염-전분 한천배지로서 증류수 1리터당 K₂HPO₄1g, MgSO₄·7H₂O 1g, NaCl 1g, (NH₄)₂SO₄2g, CaCO₃2g에 상기 미량염용액 1.0ml을 혼합한 다음 한천 15-20g을 혼합하여 제조하고 pH는 7.4로 조정하였다.

10) ISP #5 배지: 글리세롤-아스파라긴 한천배지로서 증류수 1리터당 글리세롤 10g, 아스파라긴 1.0g, K₂HPO₄1g과 상기 미량염용액 1.0ml 및 한천 15-20g으로 구성하였으며, pH는 7.0-7.2로 조정하였다.

11) ISP #6 배지: 펩톤-이스트 추출물 한천배지로서 증류수 1리터당 펩톤 철 한천 (Pepton-Iron-Agar, Difco) 36g과 이스트 추출물 1g으로 구성하였으며, pH는 7.0-7.2로 조정하였다.

12) ISP #7 배지: 타이로신 한천배지로서 증류수 1리터당 글리세롤 15g, 타이로신 0.5g, 아스파라긴 1.0g, K₂HPO₄0.5g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, NaCl 0.5g 및 Fe₂SO₄·7H₂O 0.01g에 상기 미량염용액 1.0ml을 혼합한 다음 한천 15-20g을 혼합하여 제조하고 pH는 7.0-7.4로 조정하였다.

2. 스트렙토마이세스 모스코우 WYE 117과 스트렙토마이세스 속 균주 CYD 10의 동정

스트렙토마이세스 균주 CYD 10과 WYE 117은 버기스 메뉴얼 (Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology (1989))과 국제 스트렙토마이세스 프로젝트(International Streptomyses Project (ISP) (1974)) 및 윌리암 등의 벙법 (Williams, S.T. 등, A probability matrix for identification of Streptomyces, J. Gen. Micorbiol. 129: 1815-1830, 1983, Numerical classification of Streptomyces and relatdted genera, J. Gen. Microbiol. 129: 1743-1813, 1983)에 근거한 형태학적, 생리학적 및 화학적 특성을 조사하여 동정하였다. 배양상 특성과 형태학적 특성은 ISP 배지를 이용하여 배양한 후 광학 현미경 및 전자현미경을 이용하여 균사 및 포자를 관찰함으로써 이루어졌다.

3. 접종용 세포배양액 제조 및 균주의 보관

접종용 세포 배양은 50ml의 변형된 벤넷 액체배지가 들어 있는 500ml 삼각플라스크에 CYD 한천배지상의 포자를 접종한 후 25℃-33℃, pH 6.5-7.5, 130-300rpm으로 1-4일간 진탕 배양하였다.

CYD 한천배지를 이용하여 25℃에서 포자가 형성될 때까지 균주들을 배양한 후 4℃에서 보관하였고, 4주마다 주기적으로 계대배양 하였다.

4. 진탕배양법을 이용한 균사 및 포자 세포의 제조

스트렙토마이세스 균주 CYD 10과 WYE 117의 균사 및 포자 세포 생산은 200ml의 변형된 벤넷 액체배지가 들어 잇는 1.0리터 삼각 플라스크에 상기 접종배양용 배양액을 8ml 접종한 후 25℃-33℃, pH 6.5-7.5, 130-300rpm으로 진탕하면서 3-7일간 배양함으로써 이루어졌다. 이 배양액을 4,000rpm 에서 10분간 원심분리한 후 무균조작하여 생산된 균사와 포자세포를 회수하였다.

5. 곰팡이 병원균

항균성 테스트를 위한 곰팡이 병원균으로는, 피씨움 얼티멈(Pythium ultimum)

, 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxyspo

rum), 푸사리움 삼부싱텀(Fusarium sambucinctum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 피토프쏘라 캡사이시(Phytophthora casici), 피토프쏘라 파라시티카(Phytophthora parasitica), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum) 및 베르티실륨 다흘리애(Verticillium dahliae)를 사용하였다.

이들 곰팡이 균주는 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco) 배지나 CMA(Corn Meal Agar, Difco) 배지에서 25℃ 에서 배양한 다음 4℃에서 보관하였다.

6. 토마토 파종토양 분석

토마토 파종을 통한 미생물제제의 활성 평가는 피씨움 종과 피토프쏘라 종의 곰팡이 병원균이 자연적으로 감염되어 있는 토양을 충청북도 괴산읍에 위치한 고추재배 노지에서 (깊이 15cm 까지의 토양) 수집하여 이용하였다. 이 토양의 피씨움 종과 피토프쏘라 종의 균수는 공지된 방법으로 측정하였다 (Stanghellini, M.E. 등, A quantative method for the isolation of Pythium ultimum from soil, Phytopathology, 60:551-552, 1970; Kannwischer, M.E. 등, The influence of a fungicide on the epodemiology of black shank of tobacco, Phytopathology, 68:1760-1765, 1978). 균수 측정에 이용된 플레이트는 25℃ 에서 배양하여 저배율 현미경을 (x10) 사용하여 주기적으로 관찰하였다. 배지상의 콜로니 수는 12, 48, 72 및 96시간 배양 후 관찰하였다. 2w/v% 한천배지에서 자란 표본 균주를 형태적 동정의 대조균주로 사용하였다 (Stanghellini 등, 전술한 문헌과 동일). 피토프쏘라 선택 배지에서 자라는 표본 균주도 또한 형태적 동정의 대조 균주로 사용하였다.

파종시 피씨움 얼티멈과 피토프쏘라 종의 균수는 건조 토양 1g당 각각 354±15 와 213±21인 것으로 나타났다. 다른 피씨움 종의 개체수는 건조 토양 1g당 194±11 이었다. 그외에 곰팡이 병원균 푸사리움 종과 스클레로티니아 종의 개체수는 건조 토양 1g당 각각 49±6 와 123±17이었다. 수집된 토양에는 피씨움 종과 피토프쏘라 종이 우점종으로 존재하는 곰팡이 병원균인 것으로 나타났다. 토양의 산도는 5.6 이엇으며 채로 곱게 친 후 사용하였다.

7. 미생물 제제의 세포수 결정

분말형 미생물 제제 1.0g 을 멸균된 증류수 9ml에 넣고 10 분간 혼합하여 균질의 현탁액을 만든 후 연속희석 및 도말법으로 CMA 배지상에서 단위 g당의 콜로니 형성단위(colony forming unit:cfu)로서 세포수를 결정하였다. 액체 미생물 제제의 세포수도 이와 동일한 방법으로 결정하였다.

8. 미생물 제제의 활성 분석

미생물 제제의 식물 생장촉진활성과 곰팡이 병원균 제어활성을 알아보기 위하여 본 발명의 미생물 제제를 토마토, 고추 또는 인삼 종자에 처리하고 노지나 적당한 매체에 파종한 후 발아율, 발아한 식물의 생장과 수확 증진 및 발병율 감소등의 측면에서 비처리 대조군과 비교하여 평가하였다.

이하, 실시예를 참고로 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

[실시예 1]

미생물균주에 대한 샘흘 채취 및 분리

본 발명의 균주를 분리하기 위해 미국 워싱톤주 풀만시 와 아이다호주 모스코우시 지역에 위치한 네 곳에서 채취한 리조스피아의 토양시료를 멸균된 증류수에 현탁킨 후 연속희석 및 도말법으로 CYD 배지와 WYE 배지를 이용하여 배양하여 생성되는 단일 콜로니 들에 해대 곰팡이 세포벽 분해효소 생산 여부, 항균성 여부, 뿌리 착생 생장 여부, 저온생장성 여부 (4℃, 8℃), 다양한 탄소원 이용 여부, 성장속도, 대량생산성 등의 복합적인 측면에서 노지환경에서 효과적으로 미생물제제 활성을 나타내는데 유리한 특성을 갖는 우수한 균주를 선택하는 방식으로 원하는 균주인 본 발명에 따른 두 종류의 균주를 분리하였다. 이렇게 하여 분리된 균주들을 25℃에서 방선균이 포자를 형성하도록 4-10일간 배양한 후 형성된 단일 콜로니를 새로운 CYD 또는 WYE 한천배지에 계대배양함으로써 순수분리 하였다. 순수분리한 균주 CYD 10과 WYE 117을 CYD 사면 배지에 접종하고 25℃ 및 30℃에서 배양하여 포자를 형성시킨 후 4℃에서 보관하였으며 4주마다 계대배양 하였다.

[실시예 2]

균주의 동정 및 특성분석

실시예 1에서 얻은 균주를 동정하기 위하여 상기 버기스 매뉴얼등의 방법에 따라 형태학적, 생리학적 및 화학적 특성에 대한 분석실험을 실시하였다. 이들 분석시험의 결과가 표1 내지 표4에 나타나 있다.

전술한 버기스 매뉴얼과 ISP, 윌리암 등의 방법에 따라 표1 내지 표4에 나타나 있는 결과를 분석한 결과 본 발명에서 얻은 두 종류의 균주가 신규한 스트렙토마이세스 종인 것으로 동정되었다. 즉, CYD 10은 형태학적, 생리학적 및 화학적 특성과 텍스 거리 (Tax distance: 0.37), 95% 텍손 반경 (Taxon redius: 0.4236) 및 윌콕스 확률 (Willcox Probability: 91.54%)에 대한 분석치로부터 클러스터 (Cluster) 19에 속하는 스트렙토마이세스 코랄러스와 유사하나 사슬당 포자수, ISP 배지에서의 콜로니색, 확산성 피그먼트, 멜라닌 색소의 생산 등의 면에서 차이를 나타내었다. WYE 117의 경우에는 기존의 보고된 균주와 비교해볼때 텍스 거리가 텍손 반경을 벗어나고 윌콕스 확률이 85% 이하의 낮은 유사성을 나타냄으로써 공지의 종과는 아주 상이한 특징을 갖는 스트렙토마이세스 모스코우 WYE 117인 것으로 동정하였다. 이들은 또한 모두 항곰팡이, 식물 생장촉진기능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 한편, 이 균주들은 부다페스트 조약에 따라 1996년 1월 8일자로 대한민국 대전광역시 소재의 생명공학연구소 내 유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Vioscience and Biotechnolohy)에 기탁번호 KCTC 0223BP및 KCTC 0222BP로 각각 기탁되었다.

[실시예 3]

최적성장온도범위 측정실험

특정 온도에서의 성장 및 최적성장온도범위를 알아보기 위하여 실시예 2에서 동정된 스트렙토마이세스 속의 균주 CYD 10과 WYE 117을 변형된 벤넷 한천배지에 접종한 후 4℃, 8℃, 27℃, 37℃ 및 45℃에서 3주동안 배양하면서 그 성장상태를 1주마다 관찰하였다. 그 결과를 성장하는 속도를 따라 양호하게 성장 (＋); 서서희 성장 (±); 성장 못함 (-) 등으로 평가하여 표5에 나타내었다.

상기 표5에 잘 나타나 있듯이, WYE 117은 4℃에서 잘 자라는 반면에 CYD 10은 4℃에서 3주 정도 배양했을 때 서서희 자라기 시작하였다. 두 균주는 8℃에서 매우 왕성하게 자랐으나 37℃와 45℃에서는 자라지 못하였다.

[실시예 4]

효소의 활성 및 길항성 분석

(1) 효소의 활성 측정

키티나제 (chitinase)와 베타-1,3-글루카나제 (β-1,3-glucanase)가 곰팡이 병원균 균사를 공격하여 죽이는데 중요한 역할을 하는 효소로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 신규의 스트렙토마이세스 속의 균주에 대해 다음과 같이 이들 효소 활성을 측정하였다.

콜로이드 키틴을 유일한 탄소원으로 포함하는 키틴 한천 배지에 균주를 접종한 후 30℃에서 14일간 배양하여 콜로니 형성여부 및 그 형성 속도를 관찰함으로써 키티나제 활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 균주인 CYD 10과 WYE 117은 모두 키티나제 활성이 매우 높은 것으로 나타났다.

이어서, 베타-1,3-글루카나제 활성을 측정하기 위하여 라미나린을 유일한 탄소원으로 하는 라미나린 한천배지에 균주를 접종한 후 27℃에서 7일간 배양하여 콜로니 형성여부 및 그 형성속도를 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 균주인 CYD 10과 WYE 117은 모두 매우 높은 베타-1,3-글루카나제 활성을 나타내었다.

(2) 대조쌍 길항성 분석

순수분리한 균주 CYD 10과 WYE 117의 길항성은 플래이트 대조쌍 실험을 통해 곰팡이 병원균의 생장저해 정도를 알아봄으로써 측정하였다.

본 발명의 균주를 CMA 배지에 접종한 후 30℃ 에서 6-10 일간 배양하였다. 이 플래이트의 중앙에 왕성하게 자란 병원균 곰팡이 균사를 갖는 PDA (Photato Dextrose Agar) 블록을 접종하여 25℃에서 균주에 따라 24시간 내지 182시간 배양하였다. 한편, 대조실험용으로 동일한 PDA 블록을 본 발명의 균주가 접종되지 않은 CMA 플래이트에 접종하여 마찬가지로 배양하였다. 본 발명의 균주에 의한 병원균 곰팡이의 성장저해효과로서 측정한 길항성 실험에 대한 결과는 3회의 반복실험을 통한 평균치로서 하기 표6에 나타내었다. (표6 참조).

[실시예 5-12]

분말형 미생물제제의 제조

본 발명의 미생물 균주의 생존성을 유지하기에 적합하며 식물의 종자, 뿌리 또는 토양으로의 용이한 처리를 가능하게 하는 분말조성물을 하기 표7에 기재되어 있는 조성으로 혼합한 1kg의 분말 조성물에 200ml의 증류수를 첨가한 다음 121℃에서 1시간씩 2회 습열멸균하고 이어서 180℃에서 6시간 동안 건열멸균하여 분말형 미생물 전달매체 조성물을 제조하였다. 이때, 톱밥은 분쇄기를 이용하여 분쇄한 다음 60메쉬(250마이크론)를 통과한 입자의 형태로 이용하였다. 한편, 본 발명의 균주를 전술한 바와 같이 벤넷 액체배지 (1리터)에서 배양한 후 수확한 균사 및 포자를 멸균된 증류수 200ml에 넣고 균일하게 혼합한 후 다시 상기 멸균된 조성물에 혼합하여 동결건조함으로써 분말형 미생물제제를 제조하였다. 이때, 분말형 미생물 전달매체 조성물 1g에 대해 균주가 cfu로서 10 개 존재하도록 혼합하였다. 이렇게 하여 제조된 분말형 미생물제제는 상온저장능력이 우수하여 냉장보관을 요하지 않으며 12개월 후에도 그 활성을 유지하였다.

[실시예 13-19]

액체형 미생물제제의 제조

본 발명의 미생물 균주의 생존성을 유지하기 적합하며 식물의 종자, 뿌리 또는 토양으로의 용이한 처리를 가능하게 하는 액체조성물을 하기 표8에 기재되어 있는 조성으로 혼합하여 pH를 7.0-7.2로 조절하면서 교반하여 균일한 혼합액을 얻은 다음 이를 121℃에서 40분간 습열멸균하였다. 한편, 본 발명의 균주를 전술한 바와 같이 벤넷 액체배지 (1리터)에서 배양한 후 수확한 균사 및 포자를 상기 멸균된 액체형 미생물 전달매체 조성물에 혼합하였다. (실시예 13-17). 또 다른 방법으로는 ISP #3 및 #4 배지 (실시예 18-19)를 이용하여 25-30℃에서 1-2주간 배양한 다음 0.1w/v%의 트윈20용액을 이용하여 포자를 회수하여 상기 멸균된 액체형 미생물 전달매체 조성물에 혼합하였다. 이때, 액체조성물 1ml에 대해 균주가 cfu로서 10 개 존재하도록 혼합하였다. 이렇게 하여 얻은 액체형 미생물제제를 4℃에서 보관하였다. 액체형 미생물제제는 종자나 묘종의 뿌리에 처리하는데 매우 효과적이었다.

[실시예 20]

미생물제제의 활성

실시예 5-12에 따라 제조된 동결 건조한 분말형 미생물제제와 실시예 13-19에 따라 제조되어 4℃에서 보관된 액체형 미생물제제의 활성은 종자 또는 뿌리에 직접처리하거나 묘포나 모판, 풋트, 팟팅 배합물이나 토양에 혼합하여 간접적으로 사용하는 방법을 통해 식물의 생장촉진과 곰팡이 병원균에 대한 제어기능의 여부로서 측정하였다.

(1) 토마토 종자를 이용한 미생물제제의 활성 평가

토마토 종자를 본 발명의 미생물제제 (실시예5-실시예19)로 처리한경우와 처리하지 않은 경우(대조실험)에 대해 토마토 식물의 생장을 관찰하였다. 상기 실시예에 따라 제조된 미생물제제를 이용한 경우에 얻은 결과의 평균치와 대조실험을 통해 얻은 결과를 비교하므로써 본 발명의 미생물제제의 활성을 평가하였다. 이 실험에서 토양으로는 전술한 바 있는 충청북도 괴산에서 채취한 토양을 사용하였다.

액체형 미생물제제의 경우에는 토마토 종자를 10분 정도 교반하면서 침적처리하는 방식으로 처리가 이루어졌고, 분말형 미생물제제의 경우에는 종자를 멸균한 증류수에 적신 후 미생물제제를 균일하게 코팅처리한 후 파종하였다.

발아 및 생장 실험을 위해 전술한 토양으로 플라스틱 풋트를 채운 후 처리한 토마토 종자와 처리하지 않은 토마토 종자를 파종하고 동일한 흙으로 얇게 덮어 풋트를 준비하였다. 풋트 실험은 풋트당 4개의 종자를 파종하였으며 동일한 풋트를 12개 (즉, 하나의 실시예에서 얻은 한 종류의 미생물제제에 대해 48회의 반복실험을 하는 효과임)씩 준비하고 대조군에 대해서도 마찬가지로 12개의 풋트를 준비하여 15℃-30℃로 유지되는 그린하우스에 랜덤블락배열방식으로 배열하였다. 화학비료는 사용하지 않았으며 적당한 수분을 유지하기 위하여 주기적으로 물을 분무하였다. 토마토 종자를 발아를 주기적으로 관찰 기록하였으며 최종 발아수는 27일 후에 관찰 기록하였다. 그 최종 결과를 표9에 나타내었다.

표9에 나타나 있는 바와 같이 처리한 토마토 종자에 발아한 식물 생장이 비처리 대조군과 비교할 때 월등하게 증가하였다. 파종 27일 후 왕성하게 자라는 4 잎사귀 토마토 식물 개체수가 비처리 대조군의 경우 40개 가운데 13개인 반면에 본 발명의 미생물제제로 처리한 경우 건강하고 왕성하게 자라는 4 잎 토마토 식물의 개체수가 각각 23과 27로 월등히 증가하였다.

(2) 고추 재배를 통한 미생물제제의 활성 분석

고추 식물의 대상으로 노지 포장시험을 실시하므로써 미생물제제의 활성을 측정하였다.

실시예9에 따라 제조한 미생물제제를 이용하였다. 고추 종자 처리 직전의 스트렙토마이세스 균주 CYD 10의 세포수는 1.2x10 cfu/g이었다. 파종 전 종자를 물에 침지하여 적신 후 상기 미생물제제를 처리하였다. 비처리 대조군으로는 종자를 물로만 적시고 상기 미생물제제를 처리하지 않은 것을 이용하였다. 이들 처리 및 비처리 종자를 묘포에 파종하여 물을 주기적으로 공급하고 25℃-30℃로 유지하였다. 고추묘가 1.5-2.0cm 크기로 자랐을 때 25개의 씨들링 풋트(5cmx5 cm, 깊이 6cm) 당 미생물제제 2.5g (즉, 풋트 1개당 미생물제제 0.1g)을 모래-흙으로 된 배합토양에 혼합하여 풋트마다 채워넣은 다음 고추묘를 모판에 이식하였다. 비처리 대조군의 경우에는 미생물제제를 첨가하지 않은 배합토양을 사용하였다. 필요에 따라 물을추가로 공급하면서 15℃-35℃의 그린하우스에서 재배하였다. 이때에도 마찬가지로 풋트를 랜덤블락배열 방식으로 배열하였다. 처리 및 비처리 대조군의 고추묘를 그린하우스에서 10주간 재배한 후 노지에 이식하였다.

식물의 성장, 크기, 수확량 및 질병발생은 이식 후 70일과 106일 재배 후 평균값과 발병율(%)을 각각 관찰하여 기록하였다. 그 결과를 처리군과 비처리 대조군 모두 600 개체수에 대한 평균값으로서 표10에 나타내었다.

표10에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 미생물제제로 처리된 경우에는 발병율이 매우 감소되며 매우 왕성하게 자랐고 고추 수확량도 현저히 증가하였다 (21.87%). 이는 본 발명의 미생물제제가 실제 노지포장시험에서도 곰팡이 병원균 제어와 생장촉진 및 수확증진에 매우 효과적임을 나타내는 것이다.

(3) 묘삼 재배를 통한 미생물제제의 활성분석

먼저 종자 발아를 촉진시키기 위하여 인삼종자의 개갑을 실시하였다. 3-4년된 인삼식물에서 수확한 인삼 종자를 깨끗한 모래와 혼합하여 [모래/종자:2/1(v/v)] 플라스틱 단지에 담았아. 단지에 물을 충분히 주고 깨끗한 나일론 망으로 덮은 후 공기가 잘 통하는 그늘진 곳에 두고 주기적으로 물을 주어 수분을 유지하였다. 이같은 처리는 7월부터 파종하기 전 10 월말까지 진행하였다. 이 기간동안 어떤 화학 비료도 사용하지 않았으며 모래를 제거한 다음 개갑한 종자를 회수하였다. 이어서, 개갑한 인삼종자를 다음과 같은 방법으로 표면 살균하였다: 1) 개갑한 인삼 종자를 깨끗한 나일론 주머니에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한 0.1% (v/v) 트윈 20 용액에 침지하여 가볍게 저어 주면서 5분간 제척하고, 2) 0.5% (v/v) 차아염소산 용액에 10분간 침지한 다음 멸균된 1.0리터 증류수가 들어 있는 2리터 비이커에 침지하여 가볍게 저어 주면서 세척하였다. 이러한 세척 과정을 5회 반복 실시하였다.

토마토 종자를처리하는 방법과 마찬가지로 전처리된 개갑 인삼 종자를 미생물제제로 처리하였다. 종자 처리전 세포수를 10 -10 cfu/g 으로 조정하였다. 비처리 대조군으로는 미생물제제로 처리하지 않은 것을 이용하였다. 각각의 처리당 인삼 종자 160개를 사용하였다. 처리 및 비처리 인삼 종자를 준비한 묘삼 재배 묘포에 파종하였다. 묘포에 비닐과 볏짚을 덮고 한절기를 보냈다. 다음해 이른 봄 묘포에 덮었던 비닐과 볏짚을 걷고 재배기간동안 직사광선을 피하기 위한 빛가림 지붕을 설치하였다. 늦가을에 이 지붕을 제거하고 냉해를 방지하기 위하여 묘포를 볏짚으로 덮어 주었다. 다음해 이른봄 묘포의 덮개를 걷고 묘삼을 수확하였다.

본 발명의 미생물제제의 활성에 대해서는 비처리대조군의 묘삼의 성장과 비교하여 묘삼의 생장 증진과 이식 가능한 묘삼 비율로 측정하였다. 묘삼의 이식 여부결정은 묘삼의 크기 (길이), 굵기와 무게 및 무병의 건실한 묘삼상태를 기준으로 결정하였다. 이식 가능한 묘삼 비율은 이식 가능한 묘삼으로 판정을 받은 묘삼 수를 각각의 처리 인삼 종자수로 나누어 계산하였다. 묘삼 무게는 이식 가능한 묘삼 전체 무게를 묘삼수로 나누어 평균값으로 나타내었다. 이러한 결과를 표11에 나타내었다.

표11에 나타나 있는 바와 같이, 스트렙토마이세스 균주 CYD 10 또는 WYE 117을 포함하는 미생물제제로 처리한 경우 비처리 대조군에 비해 인삼 생장이 훨씬 왕성하였고 뿌리 생장이 크게 증가하였다. 비처리 대조군의 이식 가능한 묘삼 비율이 17%인데 비해 각각 균주 CYD 10와 WYE 117를 포함하는 미생물제제로 처리한 경우에는 이식 가능한 건실한 묘삼 비율이 53%와 47%로 월등히 증가하였다.

실제 노지 인삼 묘포 재배에서 본 발명의 미생물제제로 처리된 개갑인삼종자를 파종하였을때 비처리 대조군과 비교하여 3배이상의 이식가능한 묘삼을 생산함으로써 본 발명의 미생물제제가 묘삼의 곰팡이 병원균 제어와 뿌리 생장촉진에 매우 뛰어난 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.

Claims (15)

1. 식물의 곰팡이 병원균을 제어하므로써 식물의 생장을 증진시킬 수 있는 미생물제제로서 스트렙토마이세스 모스코우 (Streptomyces moscow) WYE 117 (KCTC 0222BP)과 스트렙토마이세스 속 균주 CYD 10(KCTC 0223BP) 중의 적어도 하나를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
2. 제1항에 있어서, 상기 식물이 토마토, 인삼, 오이, 고추, 상치인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
3. 제1항에 있어서, 상기 미생물제제가 상기 균주에 대한 분말형 미생물 전달매체를 더 포함하며, 상기 분말형 미생물 전달매체가 톱밥 0.1-99.9중량%와 키틴분말, 키토산, 라미나린, 카르복시멜티셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 0.1-99.9중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
4. 제3항에 있어서, 상기 분말형 미생물 전달매체가 전달매체 총중량에 대하여 0.1-5중량%의 셀로바이오스와 0.03-1중량%의 질소원을 더 포함하며, 상기 질소원이 질산암모늄 또는 황산암모늄인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
5. 제3항 또는 4항에 있어서, 상기 균주가 상기 분말형 미생물 전달매체 1g당 콜로니형성단위로서 10⁷-10¹²개 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
6. 제1항에 있어서, 상기 미생물제제가 상기 균주에 대한 액체형 미생물 전달매체를 더 포함하며, 상기 액체형 미생물 전달매체가 팩틴 0.1-16중량%와 알긴산, 콜로이드키틴, 키토산, 라미나린 및 카르복시메틸셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 0.5-50중량%와 그 나머지량의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
7. 제6항에 있어서, 상기 액체형 미생물 전달매체가 전달매체 총중량에 대하여 0.1-5중량%의 글리세롤과 0.03-1.0중량%의 질소원을 더 포함하며, 상기 질소원이 황산암모늄 또는 질산암모늄인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
8. 제6항 또는 7항에 있어서, 상기 균주가 상기 액체형 미생물 전달매체 1ml당 콜로니형성단위로서 10⁷-10¹²개 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
9. 제4항 기재의 항균성 미생물 균주를 포함하는 분말형 미생물제제의 제조방법에 있어서, 톱밥 0.1-99.9중량%와 키틴분말, 키토산, 라미나린, 카르복시메틸셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 0.1-99.9중량% 를 혼합하여 얻어진 혼합물에 상기 혼합물 중에 대하여 0.1-5중량%의 셀로바이오스와 0.03-1.0중량%의 질소원으로서 질산암모늄 또는 황산암모늄을 더 혼합한 다음 0.15-1.5배 중량의 물을 첨가하고 멸균하여 균질의 분말형 미생물 전달매체 조성물을 제조하고, 항균성 미생물 균주로부터 얻은 균사와 균체를 상기 멸균된 분말형 미생물 전달매체 조성물에 혼합하고, 상기 균주와 전달매체의 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분말형 미생물제제의 제조방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 멸균이 121℃에서 1-3시간 습열멸균한 다음 160-190℃에서 3-12시간 건열멸균함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 분말형 미생물제제의 제조방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 항균성 미생물 균주와 미생물 전달매체의 혼합과정에서 상기 항균성 미생물 균주를 상기 분말형 미생물 전달매체 1g당 콜로니형성단위로서 10⁷-10¹²개 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제9항에 있어서, 상기 동결건조 단계 후 동결건조된 미생물제제를 포장하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제7항 기재의 항균성 미생물 균주를 포함하는 액체형 미생물제제의 제조방법에 있어서, 팩틴 0.1-16중량%와 알긴산, 콜로이드키틴, 키토산, 라미나린 및 카르복시메틸셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분 0.5-50중량%와 글리세롤 0.1-5중량%와 0.03-1.0중량%의 질소원으로서 황산암모늄 또는 질산암모늄과 그 나머지량의 물을 혼합하고 멸균하여 균질의 액체형 미생물 전달매체 조성물을 제조하고, 항균성 미생물 균주로부터 얻은 균사와 균체를 상기 멸균된 액체형 미생물 전달매체 조성물에 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체형 미생물제제의 제조방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 항균성 미생물 균주가 상기 액체형 미생물 전달매체 1ml당 콜로니형성단위로서 10⁷-10¹²개 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 항균성 미생물 균주와 상기 액체형 미생물 전달매체 조성물을 혼합한 후 포장하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.