JPWO2020036181A1 - 細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
細胞集団からターゲットクローン細胞を単離又は同定する方法であって、
(i)バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを導入した細胞集団を調製するステップ;
(ii)任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップ;
(iii)標的とされたバーコード配列を有する細胞において、上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、上記バーコード配列認識モジュールと上記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより上記レポータータンパク質を正常に発現させるステップ;
(iv)上記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップ;
を含む、方法。
[2]
上記複合体は、上記核酸変異部位において1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する若しくは欠失させる、又は1以上のヌクレオチドを挿入するものである、[1]に記載の方法。
[3]
上記核酸変異が、N末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列(ATG)における変異である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
上記バーコード配列にはATGが含まれない、[3]に記載の方法。
[5]
上記バーコード配列認識モジュールが、ガイドRNAであり、
上記核酸変異修復酵素がCasタンパク質と連結しており、
上記ガイドRNAは上記バーコード配列の少なくとも一部と相補的な配列を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットが、個々の細胞に導入されている、細胞集団。
[7]
上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異が、N末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列(ATG)における変異である、[6]に記載の細胞集団。
[8]
上記バーコード配列にはATGが含まれない、[6]又は[7]に記載の細胞集団。
[9]
任意のバーコードを標的とする核酸配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とが結合した複合体を含む、[6]〜[8]のいずれかに記載の細胞集団。
(i)バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを導入した細胞集団を調製するステップ、
(ii)任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップ、
(iii)標的とされたバーコード配列を有する細胞において、上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、上記バーコード配列認識モジュールと上記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより上記レポータータンパク質を正常に発現させるステップ、
(iv)上記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップ。
ステップ(i)は、バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセット(遺伝学的回路)を導入した細胞集団を調製するステップである。
ステップ(ii)は、任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップである。
ステップ(iii)は、標的とされたバーコード配列を有する細胞において、上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、上記バーコード配列認識モジュールと上記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより上記レポータータンパク質を正常に発現させるステップである。
ステップ(iv)は、上記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップである。
以下の実施例で使用したプラスミドの一部を表1に示す。
<レポーター発現・異常発現ベクター>
レポーター異常発現ベクターとして、以下のRFPベクターを構築した。
5’ ADH1 promoter−PAM−barcode−9thGTG−RFP−ADH1 terminator 3’(配列番号4)
9thRFPは、RFPのアミノ酸配列において9番目に出現するメチオニンを開始コドンとして用い、それより上流(N末端側)の配列を削除した通常より短いORFをもつRFPを意味し、9thGTG−RFPは、上記9thRFPにおける開始コドンであるメチオニンをコードするATGをGTGに変換した変異体であることを意味する。バーコード配列(barcode)として、(WSNS)4Nで表されるランダムDNAバーコードから5’ AGCGTGTCAGGGTGACC 3’(配列番号9)を使用した。
Cas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクターとして、5’ADH1 promoter−Cas9 variant(−PmCDA1−UGI)−CYC1 terminator 3’から構成されるベクターを使用した(配列番号2)。ネガティブコントロールとしては、5’ADH1 promoter−dCas9−CYC1 terminator 3’(配列番号1)を使用した。
バーコード配列認識モジュール(ガイドRNA)発現ベクター(Target sgRNA、配列番号7)を以下のように構築した。
5’ SNR52 promoter−filler−sgRNA scaffold−SUP4 terminator 3’から構成されるベクター(配列番号6)をバックボーンとして使用した。上記バックボーンからfiller配列を除去し、その代わりとしてバーコード配列に対応するスペーサー配列(バーコード認識領域、5’ CACGGTCACCCTGACACGCT 3’(配列番号10))をインサートした。
酵母は、酵母ツーハイブリッド用のY8800株を使用した。市販のキット(Frozen−EZ Yeast Transformation IITM, ZYMO RESEARCH社)を用いて、上述したベクターを形質転換した。寒天培地はSD−His−Leu−Ura+Adeを用い、植菌後48時間から72時間程度30℃で培養してコロニーを得た。以下表2に、実施例にて使用した選択寒天培地の組成を示す。
酵母のコロニーを表3に示す選択液体培地でコロニーを直接懸濁あるいは5時間以上培養した後、上清を除き、2μL程度の菌体をスライドグラスに載せ、カバーグラスで固定し、蛍光顕微鏡(BZ−X710,KEYENCE社)を用い細胞観察を行った。結果を図1に示す。また、マイクロプレートリーダー(インフィニットF200 Pro−FL/T、TECAN社)を用いてRFPの蛍光強度を測定した結果を図2に示す。Target sgRNA及びdCas9−AID−UGIを用いた場合において、一部RFP蛍光が確認された。これは、核酸変異修復酵素であるPmCDA1による一塩基ゲノム編集によって、開始コドンが修正によるものであると考えられた。なお、酵母としてBY4741株を用いた場合にも同様の結果が得られた。上記方法は、細胞の単離法のレポーターシステムとして有用である可能性が示唆された。
<レポーター異常発現ベクター>
レンチウィルスベクターpLVSIN−CMV−Puro(Takara)に、(WSNS)4Nで表されるランダムDNAから任意のバーコード配列が付与された変異EGFP(pLV−eGFPから配列を取得し、開始コドンをコードするATGをGTGに変換させたもの)をそれぞれPCR法により増幅し、クローニングした。
上記レポーター異常発現ベクターを二つのヘルパープラスミドpMD2.G(https://www.addgene.org/12259/(配列番号11)及びpsPAX2(https://www.addgene.org/12260/(配列番号12))とともにHEK293Ta細胞へトランスフェクションし、レンチウィルスを産生させた。レンチウィルス粒子を回収後、このウィルスをHEK293Ta細胞に感染させ、ピューロマイシン選択により本レポーターがゲノムに組み込まれた細胞株を得た(図3 バーコード化された293Ta細胞)。
これと同時に、レポーター異常発現ベクター(pLV−CS−110(lenti−T002−GTG−EGFP)、配列番号13)の構築に使用したランダムDNAバーコード配列群のうち、T002バーコード配列(AACTATAACATCATTTCGTG、配列番号14)を標的とするガイドRNA(On−target gRNA、配列番号15)(pLV−CS−076(lentiGuide−T002))、並びにT002バーコード配列を標的としないネガティブコントロールガイドRNA(Off−target gRNA、配列番号16)(pLV−CS−077(lentiGuide−Scramble1)を得た。前記細胞株に対し、前記Cas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター(Target−AID、CMVp−Sp_nCas9−PmCDA1−UGI、配列番号17)(pcDNA3.1_pCMV−nCas−PmCDA1−ugi pH1−gRNA(HPRT))並びに前記ガイドRNA発現ベクターをトランスフェクションし、3日後にフローサイトメーターFACS Verse(BD Biosciences社製)によりGFP陽性細胞の割合を解析した。
実施例2に記載の方法で、レンチウィルスの標的細胞への感染効率を10%以下となるようにコントロールし、平均で1コピーのバーコードが各ゲノム組み込まれることに想定し、レポータープラスミドをHEK293Ta細胞へ配置した。これにより、およそ100種類程度のバーコード化されたレポーターGFPをゲノムに有するヒト培養細胞(HEK293Ta)を調製することができた。
<CRISPR activation, CRISPRa>
dCas9(不活性型のCas9変異体)に転写因子が融合された複合体を用いることで、バーコード依存的に下流のマーカー遺伝子を転写レベルで活性化できると考えられる。そのため、CRISPRaレポーター又はガイドRNA(gRNA)によっても細胞集団のバーコード化は可能である。そこで、ATGをGTGに変換したレポーターを使用する方法による特異性を、CRISPRaレポーターを使用する方法及びガイドRNAを使用する方法の特異性と比較した。
(1)GTG−EGFPレポーターをゲノムに持つ細胞株に対する、Cas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター(CMVp−Sp_nCas9−PmCDA1−UGI)並びにバーコードを標的とするガイドRNAによる一塩基置換を介した発現誘導(GTG−GFPバーコードシステム);
(2)CRISPRaレポーターをゲノムに持つ細胞株に対する(バーコード配列をCRISPRaレポーターにクローニングし、HEK293Ta細胞へレンチウィルスで感染させ、ピューロマイシン又はブラストサイジン選択より細胞株を樹立)、gRNA−dCas9−転写因子複合体による発現誘導(CRISPRaバーコードシステム);
(3)ガイドRNAをゲノムに持つ細胞株に対し(バーコード配列をCRISPRa用のガイドRNAにクローニングし、HEK293Ta細胞へレンチウィルスで感染させ、ピューロマイシン又はブラストサイジン選択より細胞株を樹立)、CRISPRaレポーターをそのあと細胞へトランスフェクションすることによる発現誘導(gRNAバーコードシステム);
<レポーター異常発現ベクター>
5’ ADH1 promoter−BsmBI−filler−BsmBI−9thRFP−ADH1 terminator 3’から構成されるベクター(配列番号3)をBsmBI(NEW ENGLAND BioLab社)で制限酵素処理し(55℃、1時間以上)、精製したものをバックボーンとして使用した。
Cas9変異体−核酸変異修復酵素発現ベクターとして5’ ADH1 promotern−nCas9−PmCDA1−UGI−CYC1 terminator 3’から構成されるベクターを使用した(表6参照、配列番号35)。
<バーコード認識モジュール(ガイドRNA)発現ベクター>
5’ SNR52 promoter−BsmBI−filler−BsmBI−sgRNA scaffold−SUP4 terminator 3’から構成されるベクター(配列番号6)をBsmBI(NEW ENGLAND BioLab社)で制限酵素処理し(55℃, 1時間以上)、精製したものをバックボーンとして使用した。インサートとして、配列が5’ BsmBI−PAM−barcode−GTG 3’及び5’ BsmBI−GTG−barcode−PAM 5’となるオリゴ対をデザインし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(タカラバイオ社)によるリン酸化とアニーリングを同時に行なうことにより、突出末端のBsmBI切断面を有するDNA断片を得た(アニーリングは37℃で30分、95℃で5分の反応ののち、95℃から25℃になるまで12秒の反応を1サイクルごとに1℃ずつ温度を低下させる工程を合計70回繰り返した)。バーコード認識配列(バーコード認識領域)は(WSNS)4Nで表わされるセミランダムDNAバーコード配列に対応し、DNAバーコードプールの次世代シーケンサーでの配列解析結果から、任意のsgRNAのバーコード認識配列を決めた。バックボーンベクターとインサートは1:10の割合で混合され、Golden Gate法(37℃で5分、20℃で5分を合計15回繰り返したのちに55℃で30分)で反応させた。反応後のサンプルは大腸菌(NEB 5α)に形質転換され、コロニーを培養・プラスミド抽出(日本ジェネティクス社抽出キットを使用)してそれぞれ12種類の目的のベクターを得た。精製後のベクターはサンガーシーケンシング法により配列を確認した。上記12種類のベクターにそれぞれ含まれるバーコード認識配列を表7に示す。
酵母は、出芽酵母の標準株であるBY4741株を使用した。市販のキット(Frozen−EZ Yeast Transformation IITM, ZYMO RESEARCH社)を用いた。
Cas9変異体とsgRNAを形質転換したのちに得られた酵母コロニーのプレートをゲル撮影装置に内蔵されたブルーライト(FAS−V,日本ジェネティクス社)で照射し、赤く光る(RFP発現が期待される)コロニーをサンプリングした。RFP発現が期待されるものとしてサンプリングされたコロニーの例示を図8に示す。左は配列番号42のバーコード認識配列を含むsgRNA(sgRNA_BC7)を用いた場合、右は配列番号43のバーコード認識配列を含むsgRNA(sgRNA_BC8)を用いた場合の結果を示す。
ブルーライト照射によりサンプリングされたRFP発現コロニーのスクリーニング(コロニーの突き間違いの確認)のため、酵母コロニーサンプルの濁度及び蛍光強度の測定を行なった。測定にはマイクロプレートリーダー(インフィニットF200PRO,TECAN社)を使用した。酵母コロニーを選択液体培地(SD−His−Leu−Ura+Ade)で培養あるいは懸濁した後、必要に応じて培養液を希釈し、96穴プレート(透明)にサンプルを200μL添加して濁度を測定した。同様にして、96穴プレート(黒色,不透明)にサンプルを200μL添加して蛍光強度を測定した。濁度及び蛍光強度の測定の結果、目的のコロニーをサンプリングできたことが確認された。
サンプリングされた目的のコロニーにおけるバーコード配列付近の配列を、サンガーシーケンシング法によりにより確認した。その結果、バーコード配列下流の9thRFPにおけるGTGが開始コドンへ変換され、変異が修復されていることが確認された(図9)。
細胞集団から任意の細胞を単離又は同定するためには、1コロニーにおいて単一のバーコードシグナルが観察されることが好ましい。そこで、以下のように、Cas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクターを形質転換したのちにレポーター発現ベクターを形質転換した場合(Method A)と、レポーター発現ベクターを形質転換したのちにCas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクターを形質転換した場合(Method B)におけるバーコードシグナルの比較を行った。
5’ ADH1 promoter−BsmBI−filler−BsmBI−9thRFP−ADH1 terminator 3’から構成されるベクター(配列番号3)をBsmBI(NEW ENGLAND BioLab社)で制限酵素処理し(55℃、1時間以上)、精製したものをバックボーンとして使用した。
Cas9変異体−核酸変異修復酵素発現ベクターとして5’ ADH1 promotern−nCas9−PmCDA1−UGI−CYC1 terminator 3’から構成されるベクターを使用した(表6参照、配列番号35)。
酵母は、出芽酵母の標準株であるBY4741株を使用した。市販のキット(Frozen−EZ Yeast Transformation IITM, ZYMO RESEARCH社)を用いて、上述したベクターを形質転換した。
第一段階として、Cas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター(Target−AID)を形質転換した。寒天培地はSD−Leu+Adeを用い、植菌後48時間から72時間程度30℃で培養してコロニーを得た。
第一段階で得られたコロニーからコンピテントセルを調製した。調製には市販のキット(Frozen−EZ Yeast Transformation IITM, ZYMO RESEARCH社)を使用した。
第一段階として、レポーター発現ベクターを形質転換した。寒天培地はSD−His+Adeを用い、植菌後48時間から72時間程度30℃で培養してコロニーを得た。
サンプリングされたシングルコロニーにおけるバーコード配列付近の配列を、サンガーシーケンシング法によりにより確認した。その結果、Cas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター(Target−AID)を形質転換したのちにレポーター発現ベクターを形質転換したサンプル(Method A)においては、複数のバーコードシグナルが混じった配列が確認された。一方、レポーター発現ベクターを形質転換したのちにCas9タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター(Target−AID)を形質転換したサンプル(Method B)においては、それぞれのサンプルから単一のバーコード配列が確認され、1コロニーが単一のプラスミド(バーコード)を保持していることが示された。なお、Method Aの順番で形質転換をした場合には、プラスミドプールを酵母へ形質転換する際のDNA濃度、使用する酵母株、バーコードの複雑性及び液体培地における培養時間を変化させても、1コロニーに複数のバーコードが保持させる結果は変わらなかった。
Claims (9)
- 細胞集団からターゲットクローン細胞を単離又は同定する方法であって、
(i)バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを導入した細胞集団を調製するステップ;
(ii)任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップ;
(iii)標的とされたバーコード配列を有する細胞において、前記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、前記バーコード配列認識モジュールと前記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより前記レポータータンパク質を正常に発現させるステップ;
(iv)前記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップ;
を含む、方法。 - 前記複合体は、前記核酸変異部位において1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する若しくは欠失させる、又は1以上のヌクレオチドを挿入するものである、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸変異が、N末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列(ATG)における変異である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記バーコード配列にはATGが含まれない、請求項3に記載の方法。
- 前記バーコード配列認識モジュールが、ガイドRNAであり、
前記核酸変異修復酵素がCasタンパク質と連結しており、
前記ガイドRNAは前記バーコード配列の少なくとも一部と相補的な配列を含む、請求項1〜4いずれか一項に記載の方法。 - バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットが、個々の細胞に導入されている、細胞集団。
- 前記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異が、N末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列(ATG)における変異である、請求項6に記載の細胞集団。
- 前記バーコード配列にはATGが含まれない、請求項6又は7に記載の細胞集団。
- 任意のバーコードを標的とする核酸配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とが結合した複合体を含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の細胞集団。
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