JPWO2012173228A1

JPWO2012173228A1 - ３´硫酸化コア１糖鎖に結合するプローブを用いるムチン１の分析方法、及び乳癌の検出又はモニタリング方法

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Publication number: JPWO2012173228A1
Application number: JP2013520599A
Authority: JP
Inventors: 克子山下; 浩子井手尾; 日野田　裕治; 裕治日野田
Original assignee: LSIP LLC
Current assignee: LSIP LLC
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2015-02-23
Also published as: CN103748466A; EP2722670A9; EP2722670A1; CA2850690A1; US20140186853A1; KR20140051249A; WO2012173228A1; EP2722670A4

Abstract

本発明の目的は、ＣＡ１５−３の測定方法では検出できない乳癌由来のムチン１も検出する方法を提供することである。前記課題は、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３?硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３?硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、又はムチン１に結合するムチン１結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、及びＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程、を含むことを特徴とするＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を分析する方法によって解決することができる。

Description

本発明は、３´硫酸化Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ糖鎖（以下、３´硫酸化コア１糖鎖と称することがある）を持つムチン１を分析する方法；その方法を用いた乳癌の検出若しくはモニタリング方法；３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析キット；及び乳癌の検出又はモニタリングキットに関する。

乳癌は女性の癌の４位であるが、３０歳から６５歳までの年齢層に限れば、女性の癌では第１位である。特に最近は日本人女性の乳癌が増えており、年間の新規患者数は４万人以上と言われている。

臨床検査項目のＣＡ１５−３は、乳癌のマーカーとして用いられており、乳癌の悪性度、並びに進展度の指標、及び治療効果のモニタリングとして有用である（非特許文献１）。ＣＡ１５−３は、ヒト乳汁脂肪球膜上の糖タンパク質であるＭＡＭ−６に対するモノクローナル抗体（１１５Ｄ８）（非特許文献２）及び乳癌肝転移組織に対するモノクローナル抗体（ＤＦ３）（非特許文献３）を用いる免疫測定法（サンドイッチ法）によって検出されている。このＣＡ１５−３の免疫測定法によって検出されている抗原は、上皮細胞由来のムチン１の細胞外ドメインである。
しかしながら、ＣＡ１５−３は、乳癌の予後の追跡に有用であるものの、感度が低く、従って全乳癌患者中陽性率が１５％と低いため、その用途が限られていた。

「ブリースト・キャンサー（ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ）」（日本）２００３年、第１０巻、ｐ．３８−４４「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ）」（米国）１９８４年、第３４巻、ｐ．１９７〜２０６「ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）」（米国）１９８４年、第３巻、ｐ．２２３〜２３２「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」（米国）２００２年、第１２巻、ｐ．１９９〜２０８「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）」（米国）２００９年、第１３１巻、ｐ．１７１０２−１７１０９

前記のようにＣＡ１５−３は、乳癌の悪性度、並びに進展度の指標、及び治療効果のモニタリングの指標として有用であるが、陽性率が低いという問題を有していた。
本発明の目的は、ＣＡ１５−３の測定方法では検出できない乳癌由来のムチン１も検出する方法を提供することである。また、その検出方法を用いることにより、乳癌の悪性度、並びに進展度のマーカー、及び治療効果のモニタリングマーカーを提供することである。更には、ＣＡ１５−３が検出できない早期の乳癌患者に存在するムチン１を分析する方法を提供することである。

本発明者らは、乳癌細胞から分泌されるムチン１について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、乳癌患者のムチン１が、糖鎖抗原であるＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖（３´硫酸化コア１糖鎖）を有していることを見出した。本発明者らは、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を認識することのできるプローブを用い、ＣＡ１５−３の測定方法よりも検出率の優れた分析方法を見出した。そして、本発明の分析方法を用いることにより、ＣＡ１５−３の測定方法では検出することのできない乳癌患者のムチン１を検出することが可能であることを見出した。特に、従来レクチンを用いたＥＬＩＳＡはレクチンの糖鎖に対するアフィニティーが低いため、感度の低いものが多かった。３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンを用いた本発明の分析方法は、非常に感度が高いものであり、この点からも、本発明は驚くべきものである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。

すなわち、本発明は、
［１］（Ａ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、又はムチン１に結合するムチン１結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程、を含むこと；又は
（Ｂ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、ムチン１に結合するムチン１結合プローブ又はムチン１の有する糖鎖に結合するムチン１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程、を含むこと；
を特徴とするＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法、
［２］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、を含むことを特徴とする、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法、
［３］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程；及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程；
を含む［２］に記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法、
［４］前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記ムチン１結合プローブが、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、そして前記ムチン１糖鎖結合プローブが、ムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又はムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片である、［１］〜［３］のいずれかに記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法
［５］前記３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンが、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、ガレクチン−６、ガレクチン−８、及びガレクチン−９からなる群から選択される、［４］に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法
［６］前記ガレクチン−４が、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、又は魚類由来のガレクチン−４である、［５］に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法、
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の分析方法により、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の量を分析することを特徴とする、乳癌の検出又はモニタリング方法、
［８］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ、を含むことを特徴とする、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット、
［９］（Ａ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ；及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ又はムチン１に結合するムチン１結合プローブ、又は
（Ｂ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ；及び
ムチン１に結合するムチン１結合プローブ、又はムチン１の有する糖鎖に結合するムチン１糖鎖結合プローブ、
を含むことを特徴とするＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット、
［１０］前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記ムチン１結合プローブが、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、そして前記ムチン１糖鎖結合プローブが、ムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又はムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片である、［８］又は［９］に記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを持つムチン１の分析キット、
［１１］前記３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンが、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、ガレクチン−６、ガレクチン−８及びガレクチン−９からなる群から選択される、［１０］に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを持つムチン１の分析キット、
［１２］前記ガレクチン−４が、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、又は魚類由来のガレクチン−４である、［１１］に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを持つムチン１の分析キット、
［１３］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を更に含む、［８］〜［１２］のいずれかに記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット、
［１４］［８］〜［１３］のいずれかに記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キットを用いる、乳癌の検出又はモニタリングキット、及び
［１５］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１、
に関する。
なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。

本発明のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法又は分析キットによれば、乳癌患者のムチン１を高率に検出することができる。また、本発明の分析方法又は分析キットによれば、乳癌患者の再発、又は転移の予測をすることが可能であり、乳癌の再発又は転移マーカーとして用いることが可能である。

ムチン１の主要な３´硫酸化Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ糖鎖を示した図である。ヒト、ブタ、マウス、ラット、アフリカツメガエル、及びサケのガレクチン−４のアミノ酸配列、並びにマウスのガレクチン−６のアミノ酸配列の相同性を示した図である。３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１のサンドイッチ法による測定における検量線を示したグラフである。再発あるいは転移した乳癌患者及び健常人の血清中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の測定値、及び再発した乳癌患者の血清中のＣＡ１５−３の測定値をプロットしたグラフである。３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の測定値及びＣＡ１５−３の測定値の相関を示す図である。再発した乳癌患者、手術後５年以上で再発の指摘のない乳癌患者、及び健常人の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の測定値を示す図である。ステージＩ及びステージＩＩの原発性乳癌患者におけるＣＡ１５−３及びＧａｌ４／ＭＵＣ１の測定値の相関性をプロットしたグラフである。

［１］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１
ムチン１は、約３００ＫＤａ以上の分子量を有する高度にグリコシル化されたＩ型膜糖タンパク質であり、短いＮ末端領域、中央領域、膜貫通領域、及びＣ末端の細胞質内領域からなる。前記中央領域は２０個のアミノ酸（ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡ）からなる固有の繰り返し配列（ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ）を含んでいる。ムチン１の遺伝子は多様性があり、前記繰り返し配列をコードする部分の数がおよそ２５から１２５まで変化している。また、ムチン１の遺伝子は、繰り返し配列の数以外にも、アミノ酸の欠失、挿入、及び置換が存在し、多様性が高い。前記中央領域における繰り返し配列の数が変化する領域（ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓ）は、ＶＮＴＲ領域と称され、Ｏ型グリカンを多く含んでいる。一方、中央領域の繰り返し配列以外の膜に近いペプチド部分には、Ｎ型グリカン及びＯ型グリカンが存在している。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は新規化合物であり、３´硫酸化コア１糖鎖及び２０個のアミノ酸（ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡ）からなる固有の繰り返し配列を有する限り、限定されるものではない。３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１において、３´硫酸化コア１糖鎖は、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１のＶＮＴＲ領域のＯ型グリカンに多く含まれている。
Ｎ末端領域、中央領域、膜貫通領域、及びＣ末端の細胞質内領域を含むムチン１タンパク質のアミノ酸配列の１例を配列番号１６に示すが、ムチン１は多様性を有しているため、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１のアミノ酸配列は、配列番号１６で表されるアミノ酸配列に限定されるものでない。前記繰り返し配列の数は限定されるものではないが、好ましくは１〜２００であり、より好ましくは５〜１５０であり、より好ましくは２０〜１３０であり、最も好ましくは２５〜１２５である。また、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１のＮ末端領域のアミノ酸配列、中央領域の繰り返しのアミノ酸配列及び繰り返し以外のアミノ酸配列、膜貫通領域のアミノ酸配列、並びにＣ末端の細胞質内領域のアミノ酸配列において、本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、変異を含むことができる。例えば、配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１００個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列でもよい。
なお、本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、シアリダーゼ処理を行うことにより、後述の３´硫酸化コア１糖鎖に結合するレクチンと反応性が増加する。この現象は、ムチン１の糖鎖に結合しているシアル酸が除去されることによって、立体的にマスクされていた３´硫酸化コア１糖鎖が露出されるためであると考えられる。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分子量も、限定されるものではないが、例えば２０ｋＤ〜１０００ｋＤである。３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、細胞膜に結合した膜結合型の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１でもよく、分泌型の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１でもよく、更にそれらの部分ペプチドでもよい。従って、乳癌患者の体液は、膜結合型３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１、分泌型３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１、及びそれらの部分ペプチドを含むことができる。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の発現している細胞又は組織は、限定されるものではなく、例えば、乳腺、肺、子宮、又は膵臓を挙げることができる。特には、後述の実施例に示すように、乳癌細胞、乳癌組織又は乳癌由来細胞株において、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１が発現している。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、例えば試料から分離されるものである。具体的には、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を含む生体由来の試料（例えば、血清若しくは血漿などの血液、又は乳癌組織）、又は乳癌由来の継代細胞、若しくはその培養上清などから分離することができる。例えば、前記試料を硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を用いて精製することができる。具体的には、３´硫酸化コア１糖鎖に結合する抗体、又は３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合する抗体を用いて、アフィニティーカラムを作成し、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、後述の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法において、標準物質として使用することができる。また、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析キットは、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を標準物質として含むことができる。

本明細書において、３´硫酸化コア１糖鎖は、より具体的には「ＳＯ_３ ⁻−３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」を意味する。ムチン１が有する３´硫酸化コア１糖鎖を含む糖鎖は、限定されるものではないが、
式（Ｉ）で表される３´硫酸化コア１糖鎖、

（以下、「３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）」と称する）、
式（II）で表される３´硫酸化コア１糖鎖、

（以下、「３´硫酸化コア１糖鎖構造（II）」と称する）、及び
式（III）で表される３´硫酸化コア１糖鎖、

（以下、「３´硫酸化コア１糖鎖構造（III）」と称する）
を挙げることができる。
なお、本明細書において、「コア１糖鎖」とは、「Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｒ」を意味する。

前記３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）、３´硫酸化コア１糖鎖（II）及び３´硫酸化コア１糖鎖（III）含有ムチン１は、正常人の血中には、ほとんど存在しておらず、乳癌患者の血中で増加しているものである。
また、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の糖鎖中の３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）の含量は、乳癌患者によって異なり、特に限定されるものではないが、例えば０．１〜９９モル％であり、１〜５０モル％でもよく、５〜１５モル％でもよい。３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の糖鎖中の３´硫酸化コア１糖鎖（II）の含量も、乳癌患者によって異なり、特に限定されるものではないが、例えば０．１〜９９モル％であり、１〜５０モル％でもよく、１〜１０モル％でもよい。硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の糖鎖中の３´硫酸化コア１糖鎖（III）の含量も、乳癌患者によって異なり、特に限定されるものではないが、例えば０．１〜９９モル％であり、１〜５０モル％でもよく、５〜１５モル％でもよい。
本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１には、３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）、３´硫酸化コア１糖鎖（II）、及び３´硫酸化コア１糖鎖（III）からなる群から選択される１つ又は２つ以上の３´硫酸化コア１糖鎖を有するムチン１が含まれる。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）、３´硫酸化コア１糖鎖（II）及び３´硫酸化コア１糖鎖（III）以外の糖鎖を有してもよく、例えば「Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖」、「Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｒ」、及び「Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｒ」、「Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ→Ｒ」又は「Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ→Ｒ」を挙げることができる。

［２］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法
本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法の第１の態様は、（Ａ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（以下、接触工程（Ａ−ａ）と称することがある）、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、又はムチン１に結合するムチン１結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（以下、接触工程（Ａ−ｂ）と称することがある）、及びＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程、を含むことを特徴とする。
また、本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法の第２の態様は、（Ｂ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（以下、接触工程（Ｂ−ａ）と称することがある）、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、ムチン１に結合するムチン１結合プローブ又はムチン１の有する糖鎖に結合するムチン１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（以下、接触工程（Ｂ−ｂ）と称することがある）、及びＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程、を含むことを特徴とする。
なお、前記検出工程において検出される「Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体」は、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１と１つのプローブとの結合体でもよく、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１と２つ以上のプローブとの結合体でもよい。

前記接触工程（Ａ−ａ）において用いる３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとしては、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体を用いることができる。より具体的には、３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブは、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。
前記接触工程（Ａ−ｂ）において用いる３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブとしては、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体を挙げることができ、具体的には３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。また、ムチン１結合プローブとしては、ムチン１ペプチド結合抗体、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体を挙げることができる。具体的にはムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。

前記接触工程（Ｂ−ａ）において用いる３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブとしては、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体を挙げることができ、具体的には３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。
前記接触工程（Ｂ−ｂ）において用いる３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブとしては、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体を挙げることができ、具体的には３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。また、ムチン１結合プローブとしては、ムチン１ペプチド結合抗体、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体を挙げることができる。具体的にはムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。更に、ムチン１糖鎖結合プローブとしては、ムチン１糖鎖結合レクチン、又はムチン１糖鎖結合抗体を挙げることができる。具体的にはムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又はムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。
以下、詳細に３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、ムチン１結合プローブ、及びムチン１糖鎖結合プローブについて説明する。

《３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ》
３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブは、３´硫酸化コア１糖鎖を認識するプローブである。すなわち、３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブは、３´硫酸化コア１糖鎖のみをエピトープとして認識するプローブであり、後述の３´硫酸化コア１糖鎖及びムチン１のペプチド（アミノ酸）の組み合わせを１つのエピトープとして認識する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチドプローブとは、認識するエピトープがオーバーラップしているが、同一ではない。また、３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブは、「ＳＯ_３ ⁻−３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」を含む糖鎖を認識するものであれば限定されるものではないが、例えば前記３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）、３´硫酸化コア１糖鎖（II）、又は３´硫酸化コア１糖鎖（III）のいずれか一つ以上を認識するプローブであればよい。

（３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン）
３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンは、３´硫酸化コア１糖鎖に結合することのできるレクチンであれば、限定されるものではないが、例えばＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖にアフィニティーを有するレクチン、又はＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１糖鎖にアフィニティーを有するレクチンを挙げることができる。すなわち、３´硫酸化コア１糖鎖に結合することのできるレクチンであれば、その他の糖鎖に親和性を有するレクチンも、本発明に用いる３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンに含まれる。
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖にアフィニティーを有するレクチンとしては、限定されるものではないが、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、ガレクチン−６、ガレクチン−８又はガレクチン−９、を挙げることができる。また、それらのガレクチンの由来も、限定されるものではなく、種々の動物由来のガレクチンを用いることができる。これらのガレクチンは、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合するために必要なアミノ酸配列が保存されており、ムチン１の３´硫酸化コア１糖鎖に結合することができるが、特にはガレクチン−４が好ましい。ガレクチン−４は、ムチン１の３´硫酸化コア１糖鎖への結合特異性が高いからである（非特許文献４）。

ガレクチン−４の由来は、３´硫酸化コア１糖鎖に結合することのできる限り、限定されるものではないが、例えば哺乳類（例えば、ヒト、チンパンジー、ブタオザル、コモンマーモセット、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、パンダ、マウス、又はラット）、鳥類（例えば、ニワトリ、）、両生類（例えば、アフリカツメガエル）、爬虫類（例えば、ミドリアノール）魚類（例えば、サケ）由来のガレクチン−４を挙げることができる。図２に示すように、ヒト（配列番号２）、ブタ（配列番号４）、マウス（配列番号６）、及びラット（配列番号８）など哺乳類のガレクチン−４は、アミノ酸配列の相同性が非常に高い。具体的には、ヒトとブタとの相同率は８０％、ヒトとラットとの相同率は７７％、ヒトとマウスとの相同率は７６％である。従って、本発明の分析方法において、３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとして、制限なく使用することができる。また、ヒトとアフリカツメガエル（配列番号１０）との相同率は５５％、及びヒトとサケ（配列番号１２）との相同率は４９％で、本発明の分析方法において、３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとして使用することができる。
また、図２に示したマウスのガレクチン−６（配列番号１４）は、ガレクチン−４のアミノ酸配列と比較すると、２つの糖結合部位をつなぐリンカー部分が異なるため、ヒトとの相同率は７０％であるが、２つの糖結合部位のアミノ酸配列の相同性は高く、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合するために必要なアミノ酸配列が保存されているので、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に、結合することができる。

本発明の分析方法に用いることのできる３´硫酸化コア１糖鎖に結合することのできるレクチンとしては、具体的には、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドであって、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合するポリペプチド、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号８で表されるアミノ酸配列、配列番号１０で表されるアミノ酸配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１〜１００個のアミノ酸（好ましくは、１〜５０個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは１又は数個のアミノ酸）が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はそのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合するポリペプチド、
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号８で表されるアミノ酸配列、配列番号１０で表されるアミノ酸配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列（好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは８０％以上であるアミノ酸配列、最も好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列）からなるポリペプチド、又はそのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合するポリペプチド、
を挙げることができる。

また、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンは、細胞や組織から分離及び精製されたものでもよく、組換え体を用いて遺伝子工学的に製造されたものでもよい。例えば、後述の実施例のガレクチン−４は大腸菌によってリコンビナント体を用いて得られたものであり、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する。また、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合することのできるドメインを含む、レクチン断片を遺伝子工学的に製造することもできる。

更に、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンとして、マッシュルームレクチン（ＡｇａｒｉｃｕｓｂｉｓｐｏｒｕｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＡＢＡ）を挙げることができる。ＡＢＡは、分子量約６４ｋＤａのマッシュルーム由来のレクチンであり、１４３アミノ酸（分子量約１６ｋＤａ）のサブユニット４個から構成される。ＡＢＡは、３´硫酸化コア１糖鎖に結合するが、「Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」（コア１糖鎖）及び「Ｓｉａα２→３（６）Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」にも結合するが、本発明の分析方法において、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンとして使用することができる。

（３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体）
３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体としては、３´硫酸化コア１糖鎖に結合することのできる抗体であれば、限定されるものではないが、例えばＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する抗体、又はＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１糖鎖に結合する抗体を挙げることができる。前記３´硫酸化コア１糖鎖に結合する抗体は、３´硫酸化コア１糖鎖のみと結合することができるため、３´硫酸化コア１糖鎖を持つ糖タンパク質、又は糖脂質と結合することができる。
３´硫酸化コア１糖鎖に結合する抗体は、免疫抗原として３´硫酸化コア１糖鎖、又は３´硫酸化コア１糖鎖を持つ糖タンパク質を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、３´硫酸化コア１糖鎖、又は３´硫酸化コア１糖鎖を持つ糖タンパク質を単独もしくはＢＳＡ又はＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。

《３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ》
３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブは、３´硫酸化コア１糖鎖及びムチン１のペプチド（アミノ酸）の組み合わせを１つのエピトープとして認識するプローブである。すなわち３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブは、３´硫酸化コア１糖鎖及びムチン１ペプチドの組み合わせからなるエピトープを認識するプローブであり、前記の３´硫酸化コア１糖鎖を認識する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとは、認識するエピトープがオーバーラップしているが、同一ではない。また、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブは、「ＳＯ_３ ⁻−３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」を含む糖鎖及びペプチドの組み合わせを１つのエピトープとして認識するものであれば限定されるものではないが、例えば前記３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）、３´硫酸化コア１糖鎖（II）、又は３´硫酸化コア１糖鎖（III）のいずれか一つ以上の糖鎖及びペプチドの組み合わせを１つのエピトープとして認識するプローブであればよい。

（３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体）
３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体は、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合し、３´硫酸化コア１糖鎖を持たないムチン１に結合せず、そして３´硫酸化コア１糖鎖のみには結合しない抗体である。すなわち、３´硫酸化コア１糖鎖及びムチン１のペプチドの組み合わせを１つのエピトープとして認識する抗体である。３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体としては、後述の実施例で用いたＳｉｇｍａ社の１Ｄ１モノクローナル抗体を挙げることができる。前記モノクローナル抗体は、ヒト乳癌患者胸水のムチン１の部分精製物を免疫抗原として用いて得られたものであり、ムチン１の３´硫酸化コア１糖鎖及びペプチドの組み合わせからなるエピトープに結合する。なお、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体には、３´硫酸化コア１糖鎖及びムチン１のペプチドに強い親和性を示し、且つ３´硫酸化コア１糖鎖以外の糖鎖及びペプチドの組み合わせにも交差反応を示す抗体が存在するが、そのような抗体も３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体に含まれる。
また、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体は、免疫抗原として３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って、作製することができ、ハイブリドーマのスクリーニングにおいて、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合し、３´硫酸化コア１糖鎖を持たないムチン１に結合せず、そして３´硫酸化コア１糖鎖のみに結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合する抗体を取得することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を単独もしくはＢＳＡ又はＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、３´硫酸化コア１糖鎖を持たないムチン１に結合する抗体、及び３´硫酸化コア１糖鎖に結合する抗体を、アフィニティーカラムなどで吸収することによって、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合するポリクローナル抗体を取得することができる。

《ムチン１結合プローブ》
ムチン１結合プローブは、ムチン１に結合するプローブであるが、前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ、又は３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブとは認識するエピトープが、実質的に異なるプローブである。すなわち、ムチン１結合プローブのエピトープは、前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ、又は３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブのエピトープとは、実質的にオーバーラップしない。

（ムチン１ペプチド結合抗体、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体）
ムチン１結合プローブは、具体的にはムチン１ペプチド結合抗体、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体であり、３´硫酸化コア１糖鎖を持たないムチン１及び３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合することができる限り、限定されるものではないが、例えば３´硫酸化コア１糖鎖を持たないムチン１及び３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合し、且つ３´硫酸化コア１糖鎖のみには結合しない抗体を挙げることができる。すなわち、ムチン１のペプチドをエピトープとして認識するムチン１ペプチド結合抗体、及びムチン１の糖鎖及びペプチドの組み合わせをエピトープとして認識するムチン１糖鎖ペプチド結合抗体が含まれる。

前記ムチン１ペプチド結合抗体、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体は、免疫抗原としてムチン１を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ムチン１を単独もしくはＢＳＡ又はＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
また、ムチン１ペプチド結合抗体、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体は、従来数多く取得され、多くの抗ムチン１抗体が市販されており、例えばＣＡ１５−３の検出に用いられているモノクローナル抗体１１５Ｄ８又はモノクローナル抗体ＤＦ３を用いることもできる。

更に、ＫＬ−６の検出に用いられているモノクローナル抗体ＫＬ−６は、ムチン１糖鎖ペプチド結合抗体として、本発明の分析方法に用いることができる。ＫＬ−６抗体は、ムチン１のアミノ酸配列ＰＤＴＲＰＡＰ及びＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖（シアル化糖鎖）を認識するモノクローナル抗体であると報告されている（非特許文献５）。本発明者らは、ＫＬ−６抗体が、前記のシアル化糖鎖に加えて、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３（ＳＯ_３ ⁻−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ糖鎖、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＳＯ_３ ⁻−６）ＧａｌＮＡｃ糖鎖、及びＳＯ_３ ⁻−６[ＳＯ_３ ⁻−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ]糖鎖にも強い親和性を示すことを見出している。更に、前記３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）及び３´硫酸化コア１糖鎖（II）にも親和性を示す。すなわち、ＫＬ−６抗体は、３´硫酸化コア１糖鎖以外の糖鎖及びムチン１のペプチドに強い親和性を示す抗体であるが、３´硫酸化コア１糖鎖及びムチン１のペプチドにも親和性を示す抗体である。このような抗体は、本発明の分析方法においては、便宜的にムチン１糖鎖ペプチド結合抗体に含まれる。しかしながら、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体として、使用することも可能である。

《ムチン１糖鎖結合プローブ》
ムチン１糖鎖結合プローブは、ムチン１が有する糖鎖のみに結合するプローブであるが、３´硫酸化コア１糖鎖以外の糖鎖のみに結合するプローブである。すなわち、ムチン１糖鎖結合プローブのエピトープは、前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ、又は３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブのエピトープとは、実質的にオーバーラップしないが、前記ムチン１結合プローブのエピトープとは、オーバーラップしてもよい。また、前記糖鎖を有するムチン１以外の糖タンパク質にも結合することができるため、ムチン１に特異的に結合するプローブではない。

（ムチン１糖鎖結合レクチン）
ムチン１糖鎖結合レクチンは、ムチン１が持つ３´硫酸化コア１糖鎖以外の糖鎖にアフィニティーを有するレクチンであれば、限定されるものではない。例えば、ムチン１が有するＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖を認識するレクチンを挙げることができる。具体的には、Ｊａｃａｌｉｎ、又はマッシュルームレクチン（ＡＢＡ）を挙げることができるが、ＡＢＡは、３´硫酸化コア１糖鎖に結合することもできるため、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンとして用いることも可能であり、ムチン１糖鎖結合レクチンとして用いることも可能である。更に、ムチン１糖鎖結合レクチンとして、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｒ、又はＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｒを認識することのできるレクチンを挙げることができる。加えて、「Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌ（以下、α２，８ジシアリル糖鎖と称することがある）に結合するレクチンを挙げることができる。

（ムチン１糖鎖結合抗体）
ムチン１糖鎖結合抗体は、３´硫酸化コア１糖鎖以外のムチン１が持つ糖鎖に結合する抗体であれば、限定されるものではない。ムチン１が有するＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｒ、又はＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｒを認識する抗体を挙げることができる。更に、α２，８ジシアリル糖鎖であるＮｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ→Ｒに結合することのできるＳ２−５６６モノクローナル抗体、及び１Ｅ６モノクローナル抗体を挙げることができる。

本発明の分析方法において用いるプローブとしては、前記レクチンの糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は前記抗体の抗原結合部位を有する抗体断片を用いることもできる。
レクチンの糖鎖結合部位を有するレクチン断片は、例えば、糖鎖結合部位を有するポリペプチドを、遺伝子工学的に組換え体を用いて製造することが可能である。
また、抗体の抗原結合部位を有する抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ´）_２、Ｆａｂ´、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体断片は、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。

《サンドイッチ法》
本発明の分析方法の第１態様及び第２態様は、限定されるものではないが、具体的には以下のように行うことができる。
本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法の第１態様は、前記接触工程（Ａ−ａ）、接触工程（Ａ−ｂ）、及び検出工程を含むものである。前記接触工程（Ａ−ａ）、及び接触工程（Ａ−ｂ）は、接触工程（Ａ−ａ）、又は接触工程（Ａ−ｂ）の何れを先に行ってもよい。従って、接触工程（Ａ−ａ）、接触工程（Ａ−ｂ）及び検出工程を実施する順番として、以下の２つの実施態様がある。
（１）接触工程（Ａ−ａ）を実施し、接触工程（Ａ−ｂ）を実施し、そして検出工程を実施する。
（２）接触工程（Ａ−ｂ）を実施し、接触工程（Ａ−ａ）を実施し、そして検出工程を実施する。

また、同様に本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法の第２態様も以下の２つの実施態様がある。
（１）接触工程（Ｂ−ａ）を実施し、接触工程（Ｂ−ｂ）を実施し、そして検出工程を実施する。
（２）接触工程（Ｂ−ｂ）を実施し、接触工程（Ｂ−ａ）を実施し、そして検出工程を実施する。

例えば、サンドイッチ法により本発明の分析方法の第１態様を行う場合、以下の２つの実施態様を挙げることができる。なお、第２態様もプローブを置き換えることにより、同じように行うことができる。
（１）３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（ａ）；３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、又はムチン１結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（ｂ）；及び３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程；をこの順番で行うサンドイッチ法（以下、サンドイッチ法（１）と称する）。
（２）３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、又はムチン１結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（ｂ）；３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（ａ）；及び３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程；をこの順番で行うサンドイッチ法（以下、サンドイッチ法（２）と称する）。

前記サンドイッチ法は、例えば以下のように行うことが可能である。
（ｉ）一次反応工程
マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、捕捉プローブ（一次プローブ）を固相化する。次に、捕捉プローブや不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉プローブ（一次プローブ）が固相化された不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ）に、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１が含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉プローブ（一次プローブ）と３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を接触させ、結合させる。その後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。
（ii）二次反応工程
３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１と結合するプローブに西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素を標識した標識プローブ（２次プローブ）を添加し、捕捉された３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に標識プローブを結合させる。この反応により、捕捉プローブ−３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１−標識プローブの複合体が不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ）上に形成される。
また、２次抗体として酵素を標識した「標識プローブ」に代えて、ビオチンを結合させた「ビオチン標識プローブ」又は「非標識プローブ」を用いることも可能である。
（iii）検出工程
不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ等）を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
また、２次抗体を直接標識せずに、非標識プローブを用いた場合は、２次プローブに結合する抗体を標識し、シグナルを検出することも可能である。更に、前記ビオチン標識抗体を用いた場合は、酵素標識アビジンを用いて、シグナルを検出することも可能である。

前記第１態様のサンドイッチ法（１）の場合、捕捉プローブ（一次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用い、標識プローブ（２次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用いる。

また前記第１態様のサンドイッチ法（２）の場合、捕捉プローブ（一次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用い、標識プローブ（２次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用いる。

前記第２態様のサンドイッチ法（１）の場合、捕捉プローブ（一次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用い、標識プローブ（２次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、ムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用いる。

また前記第２態様のサンドイッチ法（２）の場合、捕捉プローブ（一次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、ムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、ムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用い、標識プローブ（２次プローブ）として、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はそれらの混合物を用いる。

前記サンドイッチ法は、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、又は放射免疫測定法、によって行うことができる。従って、抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、ルテニウム錯体などの電気化学発光物質、Ｉ^１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体として、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体を使用することができる。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法の第３の態様は、第１態様の接触工程（Ａ−ａ）を含み、前記接触工程（Ａ−ｂ）及び検出工程を含まないものである。具体的には、３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブに、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を結合させ、それを３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブから解離させて、回収する方法を挙げることができる。３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとして、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンを用いた場合はレクチンアフィニティーカラムを、３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとして、３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体を用いた場合は、抗体アフィニティーカラムを用いる。

前記のレクチンアフィニティーカラム又は抗体アフィニティーカラムを用いて試料中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を結合させ、そして溶出することによって、試料中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を回収する。回収した３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、一般的なタンパク検出法（例えば、ゲル電気泳動後のタンパク質の染色、ＵＶメーターによるタンパク質の検出）、又はムチン１特異的な検出法（例えば、抗ムチン１抗体の酵素免疫測定法による検出）により、検出することができる。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法の第４の態様は、前記接触工程（Ａ−ａ）、及び検出工程を含み、前記接触工程（Ａ−ｂ）を含まないものである。
具体的には、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程（Ａ−ａ）を行い、次に３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１と前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとの結合体を検出する工程を行う。３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとしては、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体を用いることができる。

第４態様は、３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体を用いた場合、例えばラテックス凝集免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロットなどによって行うことができる。３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンを用いた場合、レクチンブロットによって行うことができる。

（被検試料）
本発明の分析方法に用いる被検試料としては、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を含む可能性のある生体由来試料を挙げることができる。例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調製物（例えば、生検標本、特には、乳癌患者の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は乳腺の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿が好ましい。健常人の血液、血清、又は血漿中には、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、ほとんど存在しておらず、乳癌患者においては、血液中に放出されるために、乳癌を検出するための被検試料として適当であるからである。

前記尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液などの液性の試料は、前記分析方法において、それぞれの分析方法に応じて適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、又は器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液で溶解して、懸濁液又はその上清を、前記分析方法において、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。

本明細書において「３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を含む可能性のある生体由来試料」とは、ムチン１を含む被検試料及びムチン１を含む可能性のある被検試料を含む。この理由は、乳癌又はその他の癌の疑いのある患者由来の被検試料を分析に用いることがあるからである。

［３］乳癌の検出若しくはモニタリング方法
前記３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法により、乳癌の検出若しくはモニタリングを行うことができる。

（乳癌の検出方法）
前記３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法により、対象（患者）の試料中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の量を測定し、健常人試料中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の量と比較することにより、前記対象（患者）が乳癌であるか否かを検出又は診断することができる。
表２及び図７に示すように、本発明の乳癌の検出方法は、ステージＩ及びステージＩＩの原発性乳癌患者において、従来のＣＡ１５−３の測定による検出率と比較すると、４０％及び５５％の高い検出率を示した。

（乳癌のモニタリング方法）
また、前記３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法により、治療を行っている乳癌患者の試料中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の量を測定することにより、乳癌患者のモニタリング（例えば、乳癌の悪性度、乳癌の進展度、乳癌の転移、及び乳癌の再発のモニタリング）を行うことができる。
表１に示すように、乳癌の転移患者において、従来のＣＡ１５−３の測定による陽性率と比較すると、非常に高い陽性率を示す。従って、本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法は、乳癌の転移の予測方法、又はモニタリング方法として用いることができる。
更に、図６に示すように、再発又は転移を起こした患者は、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の測定値が、５年以上再発の指摘のない患者よりも高かった。従って、発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法は、乳癌の再発、又は転移のモニタリング方法として用いることができる。

［４］Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット
本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析キットは、前記３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法に用いるキットである。本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析キットは、乳癌の検出若しくはモニタリング用キットとして用いることもできる。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析キットの第１態様は、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ；及びＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ又はムチン１に結合するムチン１結合プローブを含む。
本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析キットの第２態様は、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ；及びムチン１に結合するムチン１結合プローブ又はムチン１の有する糖鎖に結合するムチン１糖鎖結合プローブを含む。
本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析キットの第３態様は、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブを含む。

３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブとしては、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブとしては、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。ムチン１結合プローブとしては、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。ムチン１糖鎖結合プローブとしては、ムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又はムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片を用いることができる。

前記プローブは、分析キットの測定方法に従って、担体に結合させてもよく、緩衝液に溶解させてもよい。例えば、担体としてはセファロース、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、セラミックスを挙げることができる。担体の形状も特に限定されるものではないが、粒子状のビーズ、プレート及びゲルなどの形状の担体を用いることができる。

また、前記分析方法が、標識化抗体を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、電気化学発光免疫測定法、又は放射免疫測定法）の場合には、プローブは、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として^３Ｈ、^１４Ｃ、又は^１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないため、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。

本発明の分析キットは、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を、標準物質として含むことができる。標準物質として使用するＭＵＣ１ムチンはＹＭＢ−１など乳癌細胞株培養上清、乳癌患者の胸水、腹水などの体液を原料として常法により精製することができる。更に、本発明のキットは、乳癌の検出若しくはモニタリングを明記した使用説明書を含むことができる。乳癌の検出若しくはモニタリング用である旨の記載は、分析キットの容器に付されていてもよい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《解析例１》
本解析例では、乳癌細胞（ＹＭＢ−１）の分泌ムチン１における３´硫酸化コア１糖鎖の解析を行った。乳癌細胞（ＹＭＢ−１）の分泌ムチン１の糖鎖を、β−エリミネーションで遊離し、ＮａＢ^３Ｈ_４で還元標識した。得られた糖鎖をｐＨ５．４の高圧濾紙電気泳動で分画した。分画した各フラクションをＢｉｏ−ＧｅｌＰ−４カラムクロマトグラフィー、各種レクチンカラムクロマトグラフィー、シアリダーゼを含むエキソグリコシダーゼ消化によって、それぞれのフラクションに含まれる糖鎖構造を決定した。

その結果、３´硫酸化コア１糖鎖を含む糖鎖としては、式（Ｉ）

で表される３´硫酸化コア１糖鎖（Ｉ）が約７モル％、式（II）

で表される３´硫酸化コア１糖鎖（II）が約３モル％、式（III）

で表される３´硫酸化コア１糖鎖（III）が約１０モル％含まれていた。

《実施例１：３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分離》
本実施例では、乳癌細胞株から３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分離及び精製を行った。
乳癌由来の細胞株ＹＭＢ−１細胞培養液を回収し、遠心分離により浮遊する細胞を除去後、１００ＫＤａカットのメンブランで濃縮回収した。回収した培養液を、ＰＢＳで平衡化した抗ムチン１抗体のアフィニティーカラムにアプライし、同緩衝液で洗浄したのち、溶出緩衝液（１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４，３ＭＮａＣｌ、ｐＨ２．５）溶出し、ムチン１溶液を得た。
なお、抗ムチン１のアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、メーカーの推奨する添付のプロトコールに従い、作製した。

《実施例２：ガレクチン−４の調製、及びガレクチン−４−ＨＲＰの調製》
本実施例では、３´硫酸化コア１糖鎖に結合する組換えヒトガレクチン−４の調整を行った。
まず、ガレクチン−４のＯＲＦをコードするｃＤＮＡを、ヒトＴ−８４結腸上皮ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって取得した。使用したプライマーは、センスプライマー：５´−ｇｃｔｇｔｃｇａｃＡＴＧＧＣＣＴＡＴＧＴＣＣＣＣＧＣＡ−３´（配列番号１７）、及びアンチセンスプライマー：５´−ｃｃｔａａｇｃｔｔＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＧＧＡＣＡＡＧＧ−３´（配列番号１８）である。得られたＰＣＲフラグメントを、ｐＱＥ−９ベクターのＳａｌＩサイトとＨｉｎｄIIIサイトに組み込み、Ｇ４−ｐＱＥ−９ベクターを得た。Ｇ４−ｐＱＥ−９ベクターで大腸菌Ｍ１５株を形質転換した。形質転換された大腸菌を培養し、ＩＰＴＧでガレクチン−４の発現を誘導した。得られた大腸菌を、リゾチームにより処理し、遠心分離により上清を得た。得られた上清から、Ｎｉ−ＮＴＡレジン、アシアロフェツイン結合レジンを用いて、ガレクチン−４を精製した。精製したガレクチン−４の濃度をＢｉｏ−ＲａｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙによって測定し、以下の実験に使用した。

（ガレクチン−４−ＨＲＰの調製）
精製したガレクチン−４を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。ＨＲＰの標識は、ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて、添付のプロトコールに従って行い、ガレクチン−４−ＨＲＰを得た。

《実施例３：３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の測定系の構築》
本実施例では、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１のサンドイッチ法による免疫学的分析方法の構築を行った。

５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で４μｇ／ｍＬに希釈した抗ムチン１モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）５０μＬを、９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡｐｌａｔｅｓ（コーニング社）に加え、４℃、１６時間で固相化した。表面をブロッキング試薬Ｎ１０２（日油社）２０％含有ＰＢＳで、２５℃、１．５時間、ブロッキングした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に１０％Ｃａｒｂｏｆｒｅｅｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を添加した希釈液で、標準物質として、実施例１で得た３´硫酸化コア１糖鎖を持つＹＭＢ−１ムチン１溶液を１０〜６０００倍に希釈し、５０μＬ加え、２５℃、１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、２０００倍希釈したガレクチン−４−ＨＲＰ５０μＬを加え、２５℃、１．５時間インキュベートした。各ウエルをＰＢＳ−Ｔで、４回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質溶液（ピアス社）を加え、２５℃、１５分間インキュベートした後、２Ｎ硫酸溶液で反応を停止後、ＰｌａｔｅＣＨＡＭＥＬＥＯＮＶ（ハイデックス社）で、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
得られた標準直線を図３に示す。なお、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の量は、前記ＹＭＢ−１ムチン１溶液を、「エイテストＫＬ−６」（エーザイ株式会社）により測定し、得られたユニット数を基準として算出した。

《実施例４：乳癌患者血清の測定》
再発又は転移した乳癌患者血清４８検体、又は健常人血清８５検体について、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の測定を行った。
ＹＭＢ−１ムチン１溶液に代えて、乳癌患者血清４８検体、又は健常人血清８５検体を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。実施例３において得られた標準直線から、それぞれの検体のユニット数を計算した。結果を図４に示す。健常人血清のムチン１の平均値は１８２±８５Ｕ／ｍＬであった。一方、乳癌患者血清のムチン１の平均値は、１０８２±１１４５Ｕ／ｍＬであった。カットオフ値を３５０Ｕ／ｍＬとしたところ、乳癌患者の陽性率は、９２％であった。

《比較例１：ＣＡ１５−３の測定》
本比較例では、実施例４において測定した乳癌患者血清４８検体について、乳癌マーカーであるＣＡ１５−３の測定を行った。
ＣＡ１５−３の測定は、「Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＣＡ１５−３）」（東ソー株式会社）を用い、添付のプロトコールに従い、測定した。
結果を図４に示す。乳癌患者血清４８検体の陽性率は、５２％であった。

ＣＡ１５−３の測定値と、前記実施例４で測定した本発明の分析方法での測定値をプロットした（図５）。ＣＡ１５−３で陰性の多くの検体が、本発明の分析方法では、陽性と判定できることがわかる。

《実施例５：乳癌患者の再発の予測》
本実施例では、実施例４で測定した再発又は転移した乳癌患者４８検体、及び健常人血清８５検体に加えて、手術後５年以上で再発の指摘のない乳癌患者２４検体を、実施例４の測定方法で測定した。結果を図６に示す。
手術後５年以上で再発の指摘のない乳癌患者は、再発又は転移した乳癌患者の測定値よりも明らかに低く、従って本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の分析方法は、乳癌の再発、又は転移の有用なマーカーとなると考えられる。

《実施例６》
本実施例では、再発又は転移した乳癌患者８名の血清中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を、実施例４の操作に従って測定した。実施例４で測定した４８検体と本実施例で測定した８検体とを加えた５６検体について、乳癌の転移先とＧａｌ４／ＭＵＣ１の陽性率との関係を表１に示す。

《比較例２》
本比較例では、再発又は転移した乳癌患者８名の血清中のＣＡ１５−３を、比較例１の操作に従って測定した。比較例４で測定した４８検体と本比較例で測定した８検体とを加えた５６検体について、乳癌の転移先とＣＡ１５−３の陽性率との関係を表１に示す。

３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１は、再発又は転移した乳癌患者の９１％（５１／５６）で陽性となった。また、転移先に係らず高い陽性率を示した。一方、ＣＡ１５−３は、再発又は転移した乳癌患者の４８％（２７／５６）で陽性であり、陽性率は高くなっかった。

《実施例７》
本実施例では、原発性乳癌患者５４名の血清中の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を測定した。
原発性乳癌患者５４名の血清を用いたことを除いては、実施例４の操作を繰り返した。ステージＩ及びステージＩＩの原発性乳癌患者の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の陽性率を表２に示す。カットオフ値を３５０ユニットとすると、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の陽性率は、ステージＩで４０％、そしてステージＩＩで５５％であった。これらの陽性率は、後述のＣＡ１５−３の陽性率と比較すると、非常に高かった。

《比較例３》
本比較例では、原発性乳癌患者５４名の血清中のＣＡ１５−３を測定した。
原発性乳癌患者５４名の血清を用いたことを除いては、比較例１の操作を繰り返した。ステージＩ及びステージＩＩの原発性乳癌患者のＣＡ１５−３の陽性率を表２に示す。ＣＡ１５−３の陽性率は、ステージＩで４％、そしてステージＩＩで１０％であった。

また、実施例７で測定した３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１の測定値と、本比較例で測定したＣＡ１５−３との測定値の相関を図７にプロットした。ＣＡ１５−３で陰性である検体でも、３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１では陽性となる検体が多く存在した。

本発明の３´硫酸化コア１糖鎖を持つムチン１を分析する方法は、乳癌の検出若しくはモニタリングに用いることができる。本発明の分析方法又は分析キットは、乳癌の再発又は転移マーカーとして用いることが可能である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

（Ａ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、又はムチン１に結合するムチン１結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程、を含むこと；又は
（Ｂ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ、ムチン１に結合するムチン１結合プローブ又はムチン１の有する糖鎖に結合するムチン１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程、を含むこと；
を特徴とするＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法。
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程、を含むことを特徴とする、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法。
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブと、被検試料とを接触させる工程；及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１とプローブとの結合体を検出する工程；
を含む請求項２に記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法。
前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記ムチン１結合プローブが、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、そして前記ムチン１糖鎖結合プローブが、ムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又はムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法。
前記３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンが、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、ガレクチン−６、ガレクチン−８、及びガレクチン−９からなる群から選択される、請求項４に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法。
前記ガレクチン−４が、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、又は魚類由来のガレクチン−４である、請求項５に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析方法により、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の量を分析することを特徴とする、乳癌の検出又はモニタリング方法。
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ、を含むことを特徴とする、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット。
（Ａ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖に結合する３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブ；及び
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ又はムチン１に結合するムチン１結合プローブ、又は
（Ｂ）Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合する３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブ；及び
ムチン１に結合するムチン１結合プローブ、又はムチン１の有する糖鎖に結合するムチン１糖鎖結合プローブ、
を含むことを特徴とするＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット。
前記３´硫酸化コア１糖鎖結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又は３´硫酸化コア１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合プローブが、３´硫酸化コア１糖鎖ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、前記ムチン１結合プローブが、ムチン１ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片、又はムチン１糖鎖ペプチド結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片であり、そして前記ムチン１糖鎖結合プローブが、ムチン１糖鎖結合レクチン若しくはその糖鎖結合部位を有するレクチン断片、又はムチン１糖鎖結合抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体断片である、請求項８又は９に記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを持つムチン１の分析キット。
前記３´硫酸化コア１糖鎖結合レクチンが、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、ガレクチン−６、ガレクチン−８及びガレクチン−９からなる群から選択される、請求項１０に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを持つムチン１の分析キット。
前記ガレクチン−４が、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、又は魚類由来のガレクチン−４である、請求項１１に記載のＳｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを持つムチン１の分析キット。
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を更に含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット。
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の、Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キットを用いる、乳癌の検出又はモニタリングキット。
Ｓｕｌｆｏ−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖を持つムチン１。