JPWO2019146670A1

JPWO2019146670A1 - 光応答性Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄリガンド

Info

Publication number: JPWO2019146670A1
Application number: JP2019567129A
Authority: JP
Inventors: 与志穂池内; 龍志三澤
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2021-01-28
Also published as: US20200397901A1; WO2019146670A1

Abstract

本発明は、Smoリガンドの活性部位（アゴニストまたはアンタゴニスト活性に重要な部位）に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドの提供を目的とする。すなわち、本発明は、Smoリガンドの活性部位に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドである。より具体的には、例えば、前記Smoリガンドが1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体であり、光分解性保護基が芳香環を含むものであることを特徴とする光応答性Smoリガンドである。

Description

本発明は、光に応答して活性化するSmoothenedリガンドに関する。

ヘッジホッグシグナルパスウェイ（Hedgehog signaling pathway）は、胚の発生や組織の再生において各細胞が正しい位置情報を得るために重要な役割を果たしており、ヘッジホッグタンパク質を中心とするシグナル伝達経路である。このパスウェイを阻害すると、重篤な発達異常等が引き起こされ、致死となる場合もある（非特許文献１）。成体では、異常なヘッジホッグシグナルが、骨芽腫、基底細胞がんおよび横紋筋肉腫などの腫瘍の形成および進行に関与していることが報告されている（非特許文献２および非特許文献３など）。そのため、ヘッジホッグパスウェイを創薬のターゲットとする研究が進んでおり、例えば、アゴニストは、脳梗塞や脳出血などの脳虚血の治療薬（非特許文献４）として、また、アンタゴニストは抗がん剤（非特許文献２および非特許文献３など）としての利用に注目が集まっている。

ヘッジホッグシグナル伝達は、ヘッジホッグタンパク質によって開始される。ヘッジホッグタンパク質が存在しない場合、12回膜貫通レセプターであるPatched（Ptch）が、7回膜貫通GPCR様レセプターであるSmoothened（Smo）の活性を抑制している。脊椎動物において、Smoが不活性化されると、転写因子GliにSufu（Suppressor of Fused）が結合してヘテロ二量体を形成し、Gliタンパク質のリン酸化が促進され、N末端が切断されたGli^Rが生成される。生じたGli^Rは、ヘッジホッグ応答遺伝子のレプレッサーとして機能し、GLI1やPTCH1などのヘッジホッグ標的遺伝子の転写を抑制する。
一方、ヘッジホッグタンパク質がPtchに結合すると、Smoの抑制が解除され、Gliタンパク質のN末端側の切断が抑制されて、活性型である全長のGli（Gli^A）が生じる。この活性型のGliは核へ移行して、ヘッジホッグ標的遺伝子の転写を誘導する（非特許文献４）。

ヘッジホッグパスウェイの異常によって引き起こされる発達異常や腫瘍形成などを治療する目的で、ヘッジホッグパスウェイのアゴニストまたはアンタゴニストの開発が行われている。
ヘッジホッグパスウェイの過剰な活性化によって、骨芽腫、横紋筋肉腫脳腫瘍、基底細胞がん、肺がんおよび乳がんなどの様々ながんが引き起こされることが示されている。そのため、ヘッジホッグパスウェイアンタゴニストは、抗がん剤の候補としての使用が期待され、多くのアンタゴニストが報告されている（特許文献１、非特許文献３、非特許文献５および非特許文献６）。

他方、ヘッジホッグパスウェイのアゴニストは、発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病や肥満の他、虚血性心疾患や脳虚血疾患などの虚血などの治療薬として期待されている（非特許文献４）。現在、最もよく研究されているアゴニストとして、Smoに直接結合するSAG（Smoothened agonist）（非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６）やPumorphamine（非特許文献４）などが知られている。SAGはSmoのヘプタヘリカルドメインに結合する小分子化合物で、共通の骨格を持ついくつかの化合物が報告され、アゴニスト活性に重要な置換基などについても、詳細に研究が行われている（非特許文献４）。

ヘッジホッグパスウェイの主役であるヘッジホッグタンパク質は、哺乳類ではソニック（Sonic）ヘッジホッグ、インディアン（Indian）ヘッジホッグおよびデザート（Desert）ヘッジホッグの３つのヘッジホッグホモログが同定されている。なかでも、ソニックヘッジホッグに関する研究が最も進んでいる。ソニックヘッジホッグは、例えば、脳の初期発生における神経管の体軸の決定において、モルフォジェンとして機能する。近年、多能性幹細胞を凝集体として培養し、三次元的な組織を分化誘導することが試みられており、人工脳組織（非特許文献７および非特許文献８など）や肺上皮（非特許文献９）などのオルガノイドをヒトの疾患モデルとして利用する試みが盛んである。
しかし、既存の報告で用いられる均一な培養液中で得られる人工脳組織は、自在に体軸を規定することができないため、様々な脳の部位が無秩序に形成されてしまい、疾患モデルとしての実用化は、ほど遠いのが現状である。

US2010/0048637 A1 US6,683,108 B1

Zhangら, Cell 106:781-792 2001 SekulicおよびVon Hoff, Cell 164:831 2016 Rimkusら, Cancers 8, 22: 2016 Doi:10.3390/cancers8020022 Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014 Yangら, J. Biol. Chem. 284:20876-20884 2009 King, J. Biol. 1(2), 8 2002 Lancasterら, Nature 501:373-379 2013 Di Lulloら, Nature Review neuroscience 18:573-584 2017 Dyeら, eLife 4, Doi:10.7554/eLife.05098 2015

上記事情に鑑み、本発明は、構成細胞が正しく配置された人工組織の誘導および発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病や肥満の他、虚血性心疾患や脳虚血疾患などの虚血などの治療に利用するための光応答性Smoothenedアゴニスト（光応答性Smoアゴニスト）、ならびに、ヘッジホッグパスウェイの異常によって生じるがんなどの治療に利用し得る光応答性Smoothenedアンタゴニスト（光応答性Smoアンタゴニスト）（以下、アゴニストとアンタゴニストをまとめて、「光応答性Smoリガンド」と称する）の提供を目的とする。

胚発生においてSmo受容体が適時適所に活性化されることは、体軸形成において極めて重要である。また、Smo受容体を不活性化することによるがん細胞の抑制を考えた場合も、正常細胞にまでその効果が及ぶと副作用が惹起されることになりかねない。
そこで、発明者らは、組織（人工組織を含む）中の所望の位置に存在するSmoリガンドのみが活性化するような光応答性Smoリガンドの開発を試みた。発明者らは、Smoリガンドの代表としてSAGを選択しその活性に重要なアミノ基に光応答性保護基を結合させたところ、SAG活性が消失した。次いで、光応答性保護基を結合したSAG（以下「caged SAG」とも記載する）に光照射を行ったところ、SAG活性が回復することを確認した。
本発明は以上の知見に基づいて完成された「光応答性Smoリガンド」である。

すなわち、本発明はSmoリガンドの活性部位（アゴニストまたはアンタゴニスト活性に重要な部位）に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドである。
より具体的には、前記Smoリガンドは、好ましくはSAGまたはSAG誘導体（アンタゴニストを含む）であり、光分解性保護基が芳香環を含むものであることを特徴とする光応答性Smoリガンドである。
また、本発明は、インヴィトロにおける人工組織の誘導方法であって、上記光応答性Smoリガンドの存在下で細胞または組織を培養することを含む、誘導方法である。
さらに、本発明は、上記光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を有効成分として含む、医薬または医薬組成物である。

本発明により、ヘッジホッグシグナルを高時空間分解能で制御することが可能となり、ヘッジホッグ経路の多様な機能の解明手段が提供される。

さらに、本発明によりヘッジホッグシグナルの異常に起因する疾患の治療剤および治療方法の開発が可能となる。

Caged SAGの吸光スペクトル測定による特性評価の結果。上図は、Caged SAGとSAGの吸光スペクトルのグラフである。下図は、異なるエネルギー強度で光照射を行ったCaged SAGの吸光スペクトル変化の差分を示したグラフである。 PBS中で光照射したCaged SAGをHPLC（270 nmの吸光で検出）によって解析したチャートと、23分付近に溶出している分子と14分付近に溶出している画分をESI Massによって解析した結果（枠内）である。図２のHPLCチャートのCaged SAGとSAGのピーク面積を光照射量に対してプロットしたグラフである。光照射後のCaged SAGによる脳オルガノイドにおける大脳腹側マーカーの発現誘導。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、SAG、光照射前のCaged SAGおよび光照射後のCaged SAGの存在下で培養した脳オルガノイドにおける、大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現量を測定した結果である。光照射後のCaged SAG存在下で培養した脳オルガノイドを抗NKX2.1抗体および抗MASH1抗体で免疫組織染色した結果である。 Caged SAG存在下で培養したNIH-3T3細胞に光照射したのち、細胞内のヘッジホッグシグナル下流遺伝子の発現量を調べた結果である。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、Caged SAG存在下で培養したNIH-3T3細胞に光照射した後、Gliの発現量を測定した結果を示す。 SAGの量とGli発現量との関係について検討した結果を示す。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、SAG、Caged SAG（光照射有りまたは無し）存在下で培養したNIH-3T3細胞中のGliの発現量を測定した結果を示す。 Caged SAGの存在下で培養した脳オルガノイドに光照射したのち、大脳腹側マーカーの発現量を調べた結果である。上図は、実験の概要を示す図である。下図は、Caged SAG存在下で培養した脳オルガノイドに光照射した後、大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現量を測定した結果である。 IR-783-SANT75（SANT75：アンタゴニスト活性を有するSAG誘導体、IR-783：光分解性保護基）の特性について検討した結果を示す。 NVOC-SANT75（NVOC：光分解性保護基）に光照射することによるアンタゴニスト活性の回復を確認した結果を示す。

本発明の第１の実施形態は、Smoリガンドの活性部位に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドである。
ここでSmoリガンドとは、7回膜貫通GPCR様レセプターであるSmoothenedに結合して、その活性を正（Smoアゴニスト）または負（Smoアンタゴニスト）に制御する物質のことである。これまでに、Smoリガンドに関する多くの研究報告が存在する（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６などを参照のこと）。より具体的には、特に限定はしないが、例えば、Smoリガンドとして、SAGおよびSAG誘導体と称される1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体、ならびに、Pumorphamineおよびその誘導体などを挙げることができる（US2010/0048637A1、Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014、Yangら, J. Biol. Chem. 284:20876-20884 2009、King, J. Biol. 1(2), 8 2002、Bruntonら, Bioorg Med Chem Lett. 19:4308-4311 2009、Seiferら, Bioorg Med Chem. 20:6465-6481 2012およびCheら, Beilstein J Org Chem. 8:841-849 2012などを参照のこと）。
第１の実施形態にかかる光応答性Smoリガンド（以下「本発明の光応答性Smoリガンド」とも記載する）は、既知のSmoリガンドの活性部位（アゴニストまたはアンタゴニスト活性に重要な部位）に光分解性保護基が結合している。本発明の光応答性Smoリガンドは、この状態では、ほとんど活性（アゴニストまたはアンタゴニスト活性）を示さないが、光を照射して光分解性保護基が脱離すると本来の活性を示すという特徴を有している。

Smoリガンドの活性部位は、構造活性相関（Structure-activity Relationships : SAR）解析など当該分野において周知の方法によって特定することができる。Smoリガンドの１例である1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体（SAGおよびその誘導体）の場合、シクロヘキサンに結合するアミノ基（ベンゾチオフェン環またはフラン環などが結合していないアミノ基）の部分に活性部位が存在している。例えば、一般式（Ｉ）で表される1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体では、Ｒ_１が結合しているＮに結合しているＨを、芳香環を含むベンジル基やｎ−ブチル基などの嵩高い官能基に置換すると活性が失われるため（非特許文献５などを参照のこと）この部分が活性部位であると考えられる。

本発明の第１の実施形態において、光分解性保護基とは、光照射によって離脱する任意の官能基のことで、芳香環などの嵩高い構造を含むものが好ましい（例えば、Klanら, Chem. Rev. 113:119-191 2013などを参照のこと）。このような光分解性保護基は、当業者により容易に選択することが可能であり、特に限定はしないが、例えば、２−ニトロベンジル誘導体骨格を有する基、ジメトキシベンゾイン基、２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（NPOC）基、２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（NVOC）基、α−メチル−２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（MeNPOC）基、α−メチル−２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（MeNVOC）基、２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（DNBOC）基、α−メチル−２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（MeDNBOC）基、１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（NPEOC）基、１−メチル−１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（MeNPEOC）基、９−アントラセニルメチルオキシカルボニル（ANMOC）基、１−ピレニルメチルオキシカルボニル（PYMOC）基、３’−メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）基、３’，５’−ジメトキシベンゾイルオキシカルボニル（DMBOC）基、７−ニトロインドリニルオキシカルボニル（NIOC）基、５，７−ジニトロインドリニルオキシカルボニル（DNIOC）基、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニル（AQMOC）基、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルオシキカルボニル（BNIOC）基などを挙げることができる。

さらに、本発明の光応答性リガンドを医薬として使用する場合、光分解性保護基を脱離させるために照射する光は、生体毒性が低く、組織透過性の高い波長を使用する必要がある。そのために、例えば、近赤外光（波長；650 nm〜900 nm程度）の照射で脱離する光分解性保護基を使用するのが望ましい。このような光分解性保護基として、例えば、C4’-dialkylamine-substituted heptamethine cyanines（Grokaら, J. Am. Chem. Soc., 136:14153-14159 2014；Naniら, Angew. Chem. Int. Ed., 54:13635-13638 2015などを参照のこと）などを挙げることができる。このような近赤外光の照射で脱離する光分解性保護基を結合した光応答性リガンドは、生体に投与したのち、所望の部位に到達した時点で、光照射（近赤外光）することで、所望の部位でのリガンドの活性化が可能であり、疾患の治療に用いることができる。

本発明の第１の実施形態で使用される好ましいSmoリガンドとして、特に限定はしないが、例えば、US2010/0048637A1、Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014、Yangら, J. Biol. Chem. 284:20876-20884 2009、King, J. Biol. 1(2), 8 2002、Bruntonら, Bioorg Med Chem Lett. 19:4308-4311 2009、Seiferら, Bioorg Med Chem. 20:6465-6481 2012およびCheら, Beilstein J Org Chem. 8:841-849 2012などに開示されるSAGおよびSAG誘導体を挙げることができる。ここで、SAG誘導体には、SmoアゴニストのみならずSmoアンタゴニストが含まれる。具体的には後述するが、下記一般式（Ｉ）のＲ_１の置換基の種類によっては、アンタゴニストとして機能する場合が知られている。
ここで、SAGおよびSAG誘導体とは、特に限定はしないが、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される1, 4-ジアミノシクロヘキサン誘導体を挙げることができる。
一般式（Ｉ）において、Ｒ_１は水素原子または炭素数１から６の飽和もしくは不飽和の炭化水素基であり、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基または２−プロペニル基である。特に、第１の実施形態のSmoリガンドが、アゴニストの場合、Ｒ_１は水素またはメチル基が好ましく（非特許文献４および非特許文献５の参照のこと）、アンタゴニストの場合、Ｒ_１はエチル基、プロピル基または２−プロペニル基が好ましい（非特許文献５を参照のこと）。
Ｒ_２は水素、置換または無置換のフェニル基または、置換または無置換のピリジル基であり、特に、フェニル基、４−シアノフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−（メチルスルホニル）フェニル基、３−シアノフェニル基または４−ピリジニル基が好ましい。
Ｒ_３は水素、フッ素または炭素数１〜３の酸素を含んでもよい炭化水素基であり、特に、水素、フッ素、メチル基またはメトキシ基が好ましい。
Ｒ_４は水素、メトキシ基または下記式（１）で表される置換基が好ましく、Ｒ_５はアミド結合を含んでもよい炭素数１〜４の炭化水素鎖が好ましい。
Ｒ_６は、置換もしくは無置換の芳香環（複素芳香環を含む）を含む置換基であって、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表されるいずれかの置換基が好ましく、式（５）において、Ｒ_７は塩素またはメチル基が好ましく、Ｒ_８は水素またはフッ素が好ましい。

一般式（Ｉ）で表されるSAGまたはSAG誘導体は、例えば、非特許文献５、Frank-Kamenetskyら, J. Biol. 1(2), 8 2002、Wnagら, J. Comb. Chem. 10:825-834 2008、Jamesら, Proc Natl Acad Sci USA 99:14071-14076 2002およびCheら, Beilstein J Org Chem. 8:841-849 2012などを参照して合成することができる。あるいは、市販品を購入してもよい。

本発明の光応答性Smoリガンドとして、特に限定はないが、例えば、上述のSAGおよびSAG誘導体の活性部位に芳香環を含む光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンドを挙げることができる。本発明の光応答性Smoリガンドの１例として、特に限定はしないが、例えば、下記一般式（ＩＩ）のように表すこともできる。
一般式（ＩＩ）において、Ｘは光分解性保護基である。
Ｒ_１は水素原子または炭素数１から６の飽和もしくは不飽和の炭化水素基であり、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基または２−プロペニル基である。特に、第１の実施形態のSmoリガンドが、アゴニストの場合、Ｒ_１は水素またはメチル基が好ましく（非特許文献４および非特許文献５の参照のこと）、アンタゴニストの場合、Ｒ_１はエチル基、プロピル基または２−プロペニル基が好ましい（非特許文献５を参照のこと）。
Ｒ_２は水素、置換または無置換のフェニル基または、置換または無置換のピリジル基であり、特に、フェニル基、４−シアノフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−（メチルスルホニル）フェニル基、３−シアノフェニル基または４−ピリジニル基が好ましい。
Ｒ_３は水素、フッ素または炭素数１〜３の酸素を含んでもよい炭化水素基であり、特に、水素、フッ素、メチル基またはメトキシ基が好ましい。
Ｒ_４は水素、メトキシ基または下記式（１）で表される置換基が好ましく、Ｒ_５はアミド結合を含んでもよい炭素数１〜４の炭化水素鎖が好ましい。
Ｒ_６は、置換もしくは無置換の芳香環（複素芳香環を含む）を含む置換基であって、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表されるいずれかの置換基が好ましく、式（５）において、Ｒ_７は塩素またはメチル基が好ましく、Ｒ_８は水素またはフッ素が好ましい。

本発明の光応答性リガンドのうち、アゴニストとしては表１〜表５に示す化合物群を例示することができる。表１〜表４中のＲ_１〜Ｒ_８は一般式（ＩＩ’）に示される置換基を、表５中のＲ_１〜Ｒ_８は一般式（ＩＩ”）に示される置換基を表す。

また、本発明の光応答性リガンドのうち、アンタゴニストとしては以下の化合物群を例示することができる。

本発明の第２の実施形態は、本発明の光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を有効成分として含む医薬または医薬組成物である。
本発明の光応答性リガンドはヘッジホッグシグナルの異常に起因する疾患の治療に使用することができ、例えば、光応答性Smoアゴニストは、発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病、肥満症、虚血性心疾患や脳虚血疾患などの虚血の治療のために（Hadden, ChemMedChem 9:27-37 2014）、また、光応答性Smoアンタゴニストは、骨芽腫、横紋筋肉腫脳腫瘍、基底細胞がん、肺がんおよび乳がんなどのがん（SekulicおよびVon Hoff, Cell 164:831 2016；Rimkusら, Cancers 8, 22: 2016 Doi:10.3390/cancers8020022）の治療のために使用することができる。

本発明の第２の実施形態にかかる医薬は、本発明の光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくは水和物自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分であるこれらの物質と１または２以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。
また、本発明の実施形態にかかる医薬の有効成分として、本発明の光応答性Smoリガンドのうち２種類以上を組み合わせて用いてもよい。上記医薬組成物には、その他対象疾患の治療に有効な既知の成分を配合してもよい。

本発明にかかる医薬または医薬組成物の剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

経口投与用または非経口投与用の製剤は、任意の製剤形態で提供される。製剤形態としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤または液剤等の形態の経口投与用医薬または医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬または医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。

本発明にかかる医薬または医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬または医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して1重量％から90重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。

経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは、エチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。

直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。

本発明にかかる医薬または医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。
一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は0.01〜1000mg（有効成分重量）程度であり、一日１回または数回に分けて、あるいは、数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量0.001〜100mg（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。

本発明にかかる医薬または医薬組成物は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。

本発明にかかる医薬または医薬組成物は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる薬剤は、医薬または医薬組成物の構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。
また、キットには使用説明書が添付されてもよい。当該キットの使用説明は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROM、DVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。

さらに、本発明の第３の実施形態は、本発明の第２の実施形態にかかる医薬または医薬組成物を、治療対象に投与し、発達障害、神経変性疾患、骨変成疾患、糖尿病、肥満症、虚血（虚血性心疾患や脳虚血など）またはがん（例えば、骨芽腫、横紋筋肉腫脳腫瘍、基底細胞がん、肺がんおよび乳がんなど）を治療する方法である。
ここで「治療」とは、疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによって該疾患の進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。

本発明の第４の実施形態は、インヴィトロにおいて人工組織を誘導する方法であって、
本発明の光応答性Smoリガンドの存在下で細胞または組織培養を行う工程、および、光照射を行う工程を、を含む誘導方法である。
ここで、人工組織とは、多能性幹細胞などをインヴィトロで培養し、任意の生体内組織と類似の機能および／または構造を有する培養物のことである。より具体的には、例えば、脳、肺、腸などの生体組織と類似の機能および／または構造を有する培養物のことである。さらに、本明細書中では、異なる組織が組み合わさった器官を包含する概念である。
本発明の光応答性Smoリガンドは、当該リガンドに結合している光分解性保護基の分解に適した波長の光を照射することによって当該保護基が脱離し、リガンドが活性化する。本発明の光応答性Smoリガンドの存在下で、細胞または組織を培養し、適時および適所に光照射を行って当該Smoリガンドを活性化することで、組織所望の場所に所望の特徴を有する細胞または細胞集団を分化誘導することができる。例えば、多能性幹細胞（iPS細胞など）をスフェロイド（細胞塊）にまで培養したのち、本発明の光応答性Smoリガンドのうちアゴニストの存在下でスフェロイド上の所望の場所に光照射すると、その場所でSmoアゴニストが活性化され、ヘッジホッグシグナル経路が活性化し所望の細胞分化が誘導される。また、逆に、活性化したヘッジホッグシグナルを抑制したい場合には、本発明の光応答性Smoリガンドのうちアンタゴニストの存在下にて、組織上の所望の場所に光照射を行うことにより、当該所望の場所におけるヘッジホッグシグナルが抑制される。その結果、当該所望の場所で誘導された細胞分化が抑制されることになる。
以上のように、本発明の光応答性Smoリガンド（アゴニストおよび／またはアンタゴニスト）の存在下で培養した細胞塊の所望の場所に光照射することで、所望の三次元的な構造を有する組織の誘導が可能となる。
照射する光の波長およびエネルギー強度は、用いるリガンドに結合している光分解性保護基に適した波長を採用し、細胞へ悪影響を及ぼさず、かつ、保護基の脱離に十分な強度で照射することが望ましい。照射光の波長は、当業者であれば容易に選択することができ、または、予備的な実験により照射する光のエネルギー強度を決定することができる。

本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

１．実験方法
１−１．ヒトiPS細胞培養
iPSC 409B2細胞株（Cell no. HPS0076）は、RIKEN Bioresource center cell bankを介して国立大学法人京都大学から供給された。iPS細胞は、未分化状態を維持するためにEssential 8 培地中、ビトロネクチン（VNT-N, Thermofisher Scientific）でコートしたディッシュ上で培養した。

１−２．NIH-3T3細胞培養およびヘッジホッグシグナルアッセイ
NIH-3T3細胞はDMEM（10% FBS、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加）で生育させた。ヘッジホッグシグナルアッセイを行うために、コンフルエントになるまで培養した細胞を飢餓誘導培地（DMEM；血清非添加）で一晩培養し、飢餓状態にした。次いで、培地を、SAG、Caged SAG、SANT75、Caged SANT75等を添加した飢餓誘導培地に交換した。細胞にハロゲンランプで15分間、光照射を行った。その後、6時間培養したNIH-3T3細胞から総RNAを抽出し、リアルタイムPCRを行った。

１−３．脳オルガノイドの調製
脳オルガノイドは、Lancasterら, Nat Protoc. 9:2329-2340 2014に記載の方法に従って調製した。E8培地で培養したhiPSCsを、TrypLE^TM（Thermofisher Scientific）を用いて単一の細胞に分離した後、低接着性96-ウェル丸底プレート中、100 μL/ウェルのE6培地を用いて10,000細胞密度程度の細胞塊に再凝集させた。
E6培地には、FGF2（5 ng/mL、培養開始0日〜4日）およびROCKインヒビター（Thiazovivine、1 μM、培養開始0日〜4日）を添加した。培養開始後2日と4日に培地交換を行った。培養開始後6日に、SAG、Caged SAG、UV照射後もしくはUV照射前のcaged SAG（光分解性保護基を結合したSAG）を含む、神経分化培地（DMEM/F12、1 % N2サプリメント、インスリン、1 % GlutaMaxサプリメント、1 % NEAA、1 % ペニシリンストレプトマイシンおよび1 μg/mL ヘパリン）に培地を変更した。Caged SAGを添加した場合は、培養物にハロゲンランプで15分間、光照射を行った。培養開始後6日、8日および10日に培地交換を行った。
各条件で培養した3種類のオルガノイドを培養開始後11日に回収し、qPCRを行った。オルガノイドをマトリゲルドロプレット（25 μl）中に包埋し、脳分化用培地（DMEM/F12：Neurobasal^TM media＝ 1：1、0.5 % N2サプリメント、1 % GlutaMaxサプリメント、0.5 % NEAA, 1 % ペニシリンストレプトマイシン、インスリン、1% B27 サプリメント（ビタミン A非含有）含有）を添加した60 mm ディッシュへ移した。培養開始後15日に、ビタミンA含有B27サプリメントを含む脳分化用培地に培地交換し、オービタルシェーカーに移した。その後、培地交換は、培養開始後30日まで、4〜5日毎に行った。

１−４．定量PCR解析
総RNAは、TriPure Isolation Reagent kit (Roche Diagnosis)を用いて抽出した。 cDNAは、SuperScript（登録商標）IV Reverse Transcriptase (Invitrogen)を使用して合成した。定量PCRは、KAPA SYBR Fast qPCR kit (KAPA Biosystems)を用いて行った。データは、GAPDHの発現量に対して標準化した。

１−５．免疫組織染色
オルガノイドは4 % パラホルムアルデヒド／PBS溶液にて、1時間、4℃で固定し、PBS中で洗浄後、30 % スクロース／PBS中で一晩、4℃で抗凍結処理を行った。その後、オルガノイドをTissue-Tek O.C.T. Compound中に包埋して、-80℃で保存した。
オルガノイドを12 μmの凍結切片にカットし、スライドグラス上に回収した。スライドグラスは乾燥後、-20℃で保存した。スライドグラスは、PBSで３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（1% BSA、5% Goat serumおよび0.3 % Triton X-100を含む1×PBS）で、1時間、室温にてインキュベートし、その後、ブロッキングバッファーで希釈した1次抗体（抗-NKX2.1抗体、1:1000および抗-MASH1抗体、1:1000）で、一晩、4℃にてインキュベートした。1次抗体でインキュベートした後、スライドグラスをPBSで3回洗浄し、Alexa Fluor 488を結合した2次抗体でインキュベートし、Hoechst33342でインキュベートした。蛍光イメージは、CMOS カメラ（Zyla4.2, Andor）を付属した倒立蛍光顕微鏡で取得した。

１−６．Caged SAG（光応答性保護基を結合させたSAG）の合成
化合物１の合成
メタノールに溶けたピリジニルベンズアルデヒド溶液（504 mg、2.75 mmol、1 eq）にbocピリジン（604 mg、2.82 mmol、1.02 eq）を添加し、混合物を氷上で30分間撹拌した。撹拌後の溶液にNaBH₄（332mg、8.78 mmol、3.2 eq）を添加し、氷上で20分間、その後、室温で1時間撹拌した。Na₂CO₃飽和溶液を添加して反応を停止し、その後、クロロホルム抽出（30 mL×3）を行い、有機層を混合しMg₂SO₄で乾燥した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH = 10:1）にかけて、化合物１を得た。
収率 82 %（857.4 m）。

化合物２の合成
化合物１（857.4 mg、2.24 mmol、1 eq）および3-クロロベンゾ[b]チオフェン-2-カルボニルクロライド（569.2 mg、2.46 mmol、1.1 eq）のジクロロメタン溶液にEt₃N （750 μL、5.3 mmol、2.4 eq）を添加し、室温で、30分間撹拌した。真空下で溶媒とEt₃Nを除去し、残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（Acetone : Hexane = 1:1）にかけて、化合物２を得た。収率78%（1.00g）。

SAGの合成
化合物２（269.6 mg、0.468 mmol、1 eq）のDMF溶液に、触媒量の水（5 μL）を添加し、氷上で1時間撹拌した。次いで、NaH（150 mg、3.75 mmol、8.6 eq）を添加し、氷上で1時間撹拌した。次に、ヨードメタン（37.5 μL、0.602 mmol、1.3 eq）を添加した後、反応液を撹拌し、室温で一晩撹拌した。Na₂CO₃飽和溶液を添加して反応を停止し、その後、ジメチルエーテル抽出（60 mL×3）を行い、有機層を混合しMg₂SO₄で乾燥した。真空下、溶媒を除去し、4M HCl/エチルアセテート（10 mL）に添加後、反応液を室温で30分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM : MeOH = 3:1 to DCM : MeOH = 1:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、SAGを得た。収率55%（126.2 g）。

化合物３の合成
1-(4-ブロモ-3-メトキシフェニル)エタノン（15.0 g、90.3 mmol、1 eq）、K₂CO₃（20.1 g、144.6 mmol、1.6 eq）およびメチル4-ブロモブチレートをDMF（100 ml）に溶解させ、この混合物を室温で16時間撹拌した。沈殿が溶解するまで純水を加え、酢酸と塩水で抽出を行った。有機層をMgSO₄で乾燥し、エチルアセテートを真空下で除去した。粗製品を真空下で24時間乾燥させた。黄色のオイルから白色結晶（化合物３）を得た。収率93%（22.3 g）

化合物４の合成
氷上にて、硝酸（200 ml、3.3mol）を酢酸（40 ml、406mmol）にゆっくり添加した。この混合物に30mlの酢酸に溶解した化合物３をゆっくり添加した。得られた混合物を氷上で2.5時間撹拌し、その後、純水（4℃）にゆっくり添加した。生じた沈殿を濾過して回収し、真空下で乾燥させ、黄色の粉体（化合物４）を得た。収率69 %（8.02g）。

化合物５の合成
化合物４（1.02 g、2.93 mmol）のエタノール（40 mL）懸濁液に、1M NaOH aq（8 mL）を添加して、40℃で1時間撹拌した。真空下でEtOHを除去し、NaHCO₃の飽和水溶液（20 mL）を添加し、DCM （20 mL×3）で抽出した。有機層をMgSO₄と溶媒蒸発にて乾燥させ、化合物５を得た。収率87%（760 mg）。

化合物６の合成
化合物５をtBuOH/THF (3:1) 溶液に溶解させ、これにBoc₂O（222.6 mg、1.68 mmol、3 eq）のtBuOH/THF (3:1)溶液を15分間かけて少しずつ加え、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM 100%）のカラムクロマトグラフィーにかけて、化合物６を得た。収率47%（92.5mg）。

化合物７の合成
化合物６（92.5 mg、0.289 mmol、1 e）のメタノール溶液（5 mL）にNaBH₄（21.6 mg、0.578 mmol、2 eq）を添加し、氷上で1時間、室温で一晩撹拌した。反応液にクエン酸水溶液（600 mg/mL、10 mL）を添加して酸性にし、クロロホルム（20 mL×3）で抽出した。有機層をMgSO₄で乾燥させた。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 10 : 1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、化合物７を得た。収率77%（79.4 mg）。

化合物８の合成
化合物７（170.0 mg、478.3 μmol、1 eq）および4-ニトロフェニルクロロフォルメート（210.2 mg、1.04 mmol、2 eq）のDCM溶液（7 mL）に、Et₃N（500 μL）を添加し、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 10 : 1 to DCM : MeOH = 3:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、化合物８を得た。収率82%（183.8 mg）。

Caged SAGの合成
SAG（40.0 mg、81.6 μmol、1 eq）と化合物８（90 mg、193.8 μmol、2.3 eq）のDMF溶液（3 mL）にEt₃N（500 μL）添加し、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 10 : 1 to DCM : MeOH = 3:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、boc基で保護されたCaged SAGを得た（81.9 mg）。残渣に5 mLの4 M HCl-酢酸溶液を添加し、室温で40分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣を高速液体クロマトグラフィー（C¹⁸-AR-II column, 4 mL/min, 0 min CH₃CN : H₂O = 50 : 50, 5 min 70 : 50, 25 min 100 : 0）にかけて精製を行った。収率45 %（30.2 mg）。

１−７．Caged SAG誘導体（光応答性保護基を結合させたアンタゴニストタイプSAG誘導体）の合成
１−７−１．IR-783-SANT75の合成
SANT75の合成
化合物２（Mw. 576.15, 90.1 mg, 156.4 μmol, 1 eq）を5 mLのdry DMFに溶解し、水5uLを加えて氷上で1時間撹拌した。その後NaH（60 % in paraffin oil, 60 mg, 1.5 mmol, 10 eq）を加え氷上で1時間反応させた。PrI（Mw. 169.9, 1.75 g/mL, 45 μM, 1.5 eq）を加えて室温にてオーバーナイトで反応させた。水30 mL、酢酸エチル30 mLで３回抽出し、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。そこへ4 M HClを加え15分反応させた後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。残渣をシリカゲル（CHCl₃ to CHCl₃ : MeOH = 6 : 1 to CHCl₃ : MeOH = 3 : 1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、目的物を回収した。収量は46.5 mg、収率は58 %。

IR-783-SANT75の合成
SANT75（9.9 mg、19.1 μmol、1 eq）とIR-783（21.4 mg、28.6 μmol 1.5 eq）のdryDMF溶液（5 mL）にEt₃N（13 μL, 100umol, 5.2 eq）添加し、80 °Cで1時間撹拌した。水30 mLを加え、酢酸エチル15 mLで3回抽出を行い、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。残渣をシリカゲル（CHCl₃ to CHCl₃ : MeOH = 10 : 1 to CHCl₃ : MeOH = 3:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて、青色のフラクションを回収し、ロータリーエバポレーターによって溶媒を除去した。収率5 %（0.9 mg）。

１−７−２．NVOC-SANT75の合成
NVOC-SANT75の合成
SANT75（10 mg、19.2 μmol、1 eq）と化合物８（14.7 mg、28.2 μmol、1.4 eq）のDMF溶液（5 mL）にEt₃N（100 μL）添加し、室温で一晩撹拌した。真空下で溶媒を除去し、再び4M HCl/Dioxiane（1 mL）に溶かし室温で30分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲル（DCM to DCM : MeOH = 50 : 1 to DCM : MeOH = 10:1）のカラムクロマトグラフィーにかけて精製を行った。収率14 %（2.34 mg）。

１−８．HPLCを用いた光分解動力学的解析
100 μMのCaged SAG（PBS:DMSO=9:1）に波長365 nmの光を0〜8 J/cm²のエネルギー強度で照射した。各サンプルについてHPLC（5-C₁₈-AR-II column, 0 min CH₃CN:H₂O=5:95 to 8 min 30:70 to 15 min 0:100）で分析した。HPLCから得られた各分画を回収し、ESIスペックトロメトリーで解析した。

２．結果
２−１．Caged SAG
２−１−１．Caged SAGの特性評価
上記１−６．に合成方法を示したCaged SAGの解析結果を示す。まず、Caged SAGの吸光スペクトルを測定した。SAGは270 nm付近、光分解性保護基は360 nm付近にピークトップを持つ。吸光スペクトルの測定の結果、SAGは270 nm付近にのみピークがあり、Caged SAGは270 nmに加え、360 nm付近にもピークを示した（図１上図）。
次に、Caged SAGに波長365nmの光を、0.25 J/cm²、0.5 J/cm²、1.0 J/cm²、2.0 J/cm²、4.0 J/cm²および8.0 J/cm²で照射し、吸光スペクトルを測定したところ、照射光のエネルギーを上げるに従い、270 nm付近のピークが増大し、360 nm付近のピークが減少した。
また、Caged SAGに波長365 nmの光を0.25 J/cm²、0.5 J/cm²、1.0 J/cm²、2.0 J/cm²、4.0 J/cm²および8.0 J/cm²で照射しHPLCによって分析したところ、光照射量増加に応じてCaged SAGのピーク面積が減少し、SAGのピークが増加することがわかった（図２および図３）。各分画のESI Mass測定によりどのピークがどの化合物に対応するかを同定した。
以上の結果から、合成したCaged SAGに、365 nm光を照射することで、SAGが生じることが確認された。そして、2-4 J/cn²で光分解はほぼ完了することが分かった。

２−１−２．脳オルガノイドにおける光照射後Caged SAGによる大脳腹側マーカーの発現誘導
脳オルガノイドを光照射前のCaged SAG（100 nM）または光照射後のCaged SAG（100 nM）の存在下で培養を行い、大脳腹側マーカーであるNKX2.1およびMASH1の発現量を定量PCR法で測定した。光照射後のCaged SAGの存在下においてNKX2.1およびMASH1のいずれの発現量も増加したのに対し、光照射前のCaged SAG存在下では、SAG非存在下の場合と同様に、大脳腹側マーカーの発現は誘導されなかった（図４）。
以上のことから、Caged SAGは、光分解性保護基によって活性が抑制されており、光照射によって、SAGと同程度のSmoアゴニスト活性を示すことが確認された。

さらに、光照射前または光照射後のCaged SAG（100 nM）の存在下で培養した脳オルガノイドにおける大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現状況を抗NKX2.1抗体または抗MASH1抗体を用いた免疫組織染色により確認を行った。
その結果、SAG存在下（SAG(+)）および光照射後のCaged SAG（Caged SAG(+)）の存在下で培養したとき、NKX2.1およびMASH1の発現が上昇していることが確認された（図５）。

２−１−３．Caged SAGへの光照射によるヘッジホッグシグナルの誘導
Caged SAG（100 nM）の存在下で培養したNIH-3T3細胞に光照射を行い、ヘッジホッグシグナル下流遺伝子のGliの発現量を定量PCR法で測定した。その結果、Caged SAG存在下で培養した細胞に光照射を行うと、SAG存在下で培養したときと同様に、Gliの発現が上昇することが確認された。他方、Caged SAG存在下で培養した細胞に光照射を行わないと、Gliの発現上昇は確認できなかった（図６）。
なお、SAGの量とGli発現量との関係について検討したところ、SAGおよびCaged SAG（光照射有り）を、100 nMより低い濃度で試すと、10 nMでは活性化が見られたものの1 nMではわずかな活性化しか見られなかった（図７）。この結果は、すでに報告されているSAGのEC50=3 nM（Chenら, Proc. Natl. Acad Sci, 99:14071-14076 2002）とも整合性が取れる。
また、Caged SAGの存在下で培養した脳オルガノイドに光照射を行い、大脳腹側マーカー（NKX2.1およびMASH1）の発現状況を抗NKX2.1抗体または抗MASH1抗体を用いた免疫組織染色により確認を行った。その結果、Caged SAG存在下で培養した脳オルガノイドに光照射を行うと、SAG存在下で培養したときと同様に、NKX2.1およびMASH1の発現が上昇していることが確認された（図８）。

２−２．Caged SAG誘導体（アンタゴニストタイプ）
２−２−１．IR-783-SANT75
IR-783-SANT75の特性について検討した。ここで使用したSAG誘導体であるSANT75は、Smoothenedアンタゴニスト活性を示す化合物である。
IR-783-SANT75のスペクトルデータを測定した。光分解性保護基のIR-783は緑色だが、Clの部分がNに置き換わると吸収が短波長にシフトして青色になる。660 nm光を照射後は、シアニン骨格が酸化され、吸収団が壊れさらに吸収が短波長シフトし赤色になったと考えられる（図９）。光照射は、660 nmのLEDライトで1時間照射した。

２−２−２．NVOC-SANT75
次に、アンタゴニストであるSANT75に光分解性保護基のNVOCを結合させたNVOC-SANT75に光照射することで、SANT75のアンタゴニスト活性が回復するかどうかを検討した。
アゴニストのSAG（100 nM）とアンタゴニストのSANT75（1 μM）を同時に存在させ、Gli1の発現量を定量した。その結果、SANT75によるヘッジホッグシグナルの競合阻害が見られた（図１０）。さらにSAG（100 nM）とCaged SANT75（NVOC-SANT75）（1 μM）同時存在下で培養し、光照射後のGli1の発現量を定量したところ、光照射応答的にヘッジホッグシグナルが阻害されることがわかった（図１０）。
以上のことから、アンタゴニストタイプのCaged SAG誘導体であるNVOC-SANT75は、光分解性保護基によって活性が抑制されており、光照射によって、SANT75と同程度のSmoアンタゴニスト活性を示すことが確認された。

本発明によれば、ヘッジホッグ経路の機能解析が可能となる。そのため、ヘッジホッグ経路が関係する疾患の原因および治療方法の解明が期待される。

Claims

Smoリガンドの活性部位に光分解性保護基が結合した光応答性Smoリガンド。
前記Smoリガンドが、SAGまたはSAG誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の光応答性Smoリガンド。
前記光応答性保護基が芳香環を含むことを特徴とする請求項２に記載の光応答性Smoリガンド。
前記光分解性保護基が、SAGまたはSAG誘導体のアミノ基であって、ベンゾチオフェン環が結合していないアミノ基に結合していることを特徴とする請求項２または３に記載の光応答性Smoリガンド。
下記一般式（ＩＩ）で表される請求項２ないし４のいずれかに記載の光応答性Smoリガンド。
［式（ＩＩ）中、Ｘは光分解性保護基、Ｒ_１は水素原子または炭素数１から６の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、Ｒ_２は水素、置換または無置換のフェニル基または置換または無置換のピリジル基、Ｒ_３は水素、フッ素または炭素数１〜３の酸素を含んでもよい炭化水素基、Ｒ_４は水素、メトキシ基または下記式（１）で表される置換基
（式（１）中、Ｒ_５はアミド結合を含んでもよい炭素数１〜４の炭化水素鎖を表す。）、Ｒ_６は、置換もしくは無置換の芳香環（複素芳香環を含む）を含む置換基を表す。］
前記Ｒ_１が水素原子またはメチル基であることを特徴とする請求項５に記載の光応答性Smoリガンド。
前記Ｒ_１がエチル基、プロピル基または２−プロペニル基であることを特徴とする請求項５に記載の光応答性Smoリガンド。
請求項１ないし７のいずれかに記載の光応答性Smoリガンドもしくはその塩またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を有効成分として含む、医薬または医薬組成物。
インヴィトロにおいて人工組織を誘導する方法であって、
請求項１ないし７のいずれかに記載の光応答性Smoリガンドの存在下で細胞または組織培養を行う工程、および、
光照射を行う工程、
を含む方法。