JPWO2018037940A1

JPWO2018037940A1 - Ｈｉｌｉｃカラム用充填剤、それが充填されたｈｉｌｉｃカラム、及びそれを用いたオリゴ糖の分析方法

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Publication number: JPWO2018037940A1
Application number: JP2018535599A
Authority: JP
Inventors: 順也加藤; 英幸近藤; 高橋　龍二; 龍二高橋
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2019-06-20
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: EP3505929A1; JP6885958B2; WO2018037940A1; US11247192B2; CN109642893B; CN109642893A; US20190184372A1; EP3505929B1; EP3505929A4

Abstract

液体クロマトグラフィーによるオリゴ糖分析をより正確に、より簡便に行うことができるためのＨＩＬＩＣカラム用充填剤、それが充填されたＨＩＬＩＣカラム、およびそれを用いたオリゴ糖の分析方法を提供する。本発明のＨＩＬＩＣカラム用充填剤は、水酸基を有する多孔質の架橋性重合体基材の水酸基にグリシドールが付加した粒子であって、親水性を示す指数が２．３０以上、かつ表面のｐＨ性を示す指数が０．９５以上１．０５以下であるＨＩＬＩＣカラム用充填剤である。

Description

本発明は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下、「ＨＩＬＩＣ」とする。）カラム用充填剤、ＨＩＬＩＣカラム、及びオリゴ糖の分析方法に関する。
本願は、２０１６年８月２６日に、日本に出願された特願２０１６−１６５９０７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

オリゴ糖は、複数の単糖がグリコシド結合によって結合した糖類のオリゴマーである。例えば、オリゴ糖はビフィズス菌の活性を促進する生理作用を持つなどの有用性が良く知られている。

特に近年では植物を原料とするバイオアルコール燃料生産プロセスの中間体にオリゴ糖が含まれることでオリゴ糖に対する関心が高い。植物原料から単糖及びオリゴ糖を含む中間体を得る工程は糖化と呼ばれる。糖化工程はバイオアルコール燃料生産における生産性並びに経済性を決定する重要な工程である。

バイオアルコール燃料生産においては、主に単糖であるグルコースのアルコール発酵によりエタノールを得る。この際、単糖及びオリゴ糖、さらにはその他の不純物を含む中間体の品質は発酵効率に大きく影響する。すなわち、バイオアルコール燃料の生産性をより一層改善するために、糖化工程を経て得られる中間体の成分を正しく簡便に分析する方法は必要とされている。

液体クロマトグラフィーは、天然物、発酵生産物、培養生産物、あるいは合成反応物中の目的物質を分離分析する手段、あるいはそれらを分離精製する手段として広く用いられていることが知られている。また、液体クロマトグラフィーは、バイオアルコール燃料生産の中間体成分を分析する手段としても用いられることが知られている（非特許文献１）。また、オリゴ糖成分の分析を意図した測定事例も紹介されている（非特許文献２、非特許文献３）。

しかしながら、非特許文献１に代表されるように、単糖類の分析に焦点が当てられるだけでオリゴ糖の同定がなされない場合が多い。これはオリゴ糖の分離が十分でないことが理由の一つである。また、分析条件の最適化が非常に煩雑であることも理由の一つである。非特許文献２のように配位子相互作用による分離モードを用いたり、あるいはサイズ排除分離モードを用いたりすることでオリゴ糖の分離を行う事例もある。しかし、いずれも分離が十分でなく、また分離を改善しようとすると極めて長時間を要することになるなどの課題がある。

液体クロマトグラフィーによる糖類の分離モードとしては、前述の配位子相互作用による分離モードの他にも、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）において親水性相互作用による分離モード（ＨＩＬＩＣモード）が好適であることが知られている（例えば非特許文献３）。ＨＩＬＩＣモードによる分離では相対的に親水性が大きくなる分子量の大きいオリゴ糖ほど保持が強くなり、溶出順は遅くなる。

このようにＨＩＬＩＣカラムはオリゴ糖の分析が可能とされるが、既存のＨＩＬＩＣカラム製品で測定をしてみると、実際に分離できないことが多い。この原因として、既存の多くのＨＩＬＩＣカラムは親水性相互作用を発現する充填剤粒子の官能基構造としてアミノ基やアミド基などを含み、純粋に親水性相互作用だけではなく酸塩基相互作用あるいは静電的相互作用などが保持力として働いていることが推察される。つまり比較的分子量が大きいオリゴ糖に対する保持力が十分でなく、分離が悪くなると考えられる。そのため、これらの既存のＨＩＬＩＣカラムによるオリゴ糖分析の事例では、段階的に移動相の溶離液組成を変えるグラジエント溶離法を適用することが必須である（例えば非特許文献３）。グラジエント溶離法を使えば分離を改善できるが、分析条件の設定が複雑になる。また複数種の移動相液体を準備した上でそれらを混合送液できるグラジエント溶離法専用の装置が必要となるので、その適用は決して容易とは言えない。

東レリサーチセンターＴｈｅＴＲＣＮｅｗｓＮｏ．１１１（Ｊｕｌ．２０１０），ｐ．１５Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社ウェブサイト、http://az621941.vo.msecnd.net/documents/6f28134c-e141-44d3-b884-9f0ac38b47eb.pdf 株式会社島津製作所、島津アプリケーションニュースＮｏ．Ｌ３７４

本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであり、液体クロマトグラフィーによるオリゴ糖分析をより正確に、より簡便に行うことができるためのＨＩＬＩＣカラム用充填剤、それが充填されたＨＩＬＩＣカラム、およびそれを用いたオリゴ糖の分析方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＨＩＬＩＣカラム用充填剤の基材を適切に選択し、ＨＩＬＩＣカラム用充填剤の表面を化学修飾により著しく親水化し、且つその化学修飾により基材の化学構造に由来する酸性あるいは塩基性を緩和し中性とすることにより目的とする性能を発現するＨＩＬＩＣカラムが得られることを見出し、本発明を成すに至った。

すなわち本発明は以下の事項に関する。
［１］水酸基を有する架橋性重合体基材を含み、前記架橋性重合体基材が多孔質の粒子であり、前記架橋性重合体基材の水酸基に、グリシドールが付加され、親水性指数が２．３０以上であり、かつ表面ｐＨ性指数が０．９５以上１．０５以下であることを特徴とするＨＩＬＩＣカラム用充填剤。
前記親水性指数は、ウリジン（Ｕ）と２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）をＨＩＬＩＣ分離モード条件の液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）で定義され、
前記表面ｐＨ性指数は、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）をＨＩＬＩＣ分離モード条件の液体クロマトグラフィーにて測定を行った際の分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義され、
前記分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）および前記分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）は、それぞれの物質の保持係数ｋの比であり、
前記保持係数ｋはいずれもトルエンの溶出時間をｔ_０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとしてｋ＝（ｔ−ｔ_０）／ｔ_０で定義される。
ただし、前記ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件としては、カラム温度が３０℃、移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍＭおよび酢酸アンモニウム１０ｍＭを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。
［２］水酸基を有する多孔質の架橋性重合体基材が、ビニルアルコールとトリアリルイソシアヌレートとの共重合体である［１］に記載のＨＩＬＩＣカラム用充填剤。
［３］［１］又は［２］の前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤と、前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用筐体と、を備えるＨＩＬＩＣカラム。
［４］［３］の前記ＨＩＬＩＣカラムを用いてＨＩＬＩＣモードで分析するオリゴ糖の分析方法。
［５］前記ＨＩＬＩＣモードによるオリゴ糖の分析方法であって、前記移動相の組成を測定の間常に一定（アイソクラティック溶離条件）とし、かつ前記カラム温度を測定の間常に一定として行う［４］のオリゴ糖の分析方法。
［６］前記ＨＩＬＩＣモードによるオリゴ糖の分析方法であって、分析対象のオリゴ糖分子の大きさが１７量体以上である［４］又は［５］のオリゴ糖の分析方法。

本発明によれば、従来の液体クロマトグラフィーでは分離分析が困難であったり、煩雑な手順が必要であったりしたオリゴ糖に含まれる多量体成分を、移動相組成を変更しない簡便なアイソクラティック溶離法を適用する条件下においても分離分析することが可能となる。また、複雑な温度制御プログラムを用いなくても、一定温度の条件で分離分析ができる。

実施例１に記載の条件で得られたオリゴ糖分析のクロマトグラムである。比較例４に記載の条件で得られたオリゴ糖分析のクロマトグラムである。分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）および分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定したときのクロマトグラムである。

以下、本発明を適用したＨＩＬＩＣカラム用充填剤、それが充填されたＨＩＬＩＣカラム及びそれを用いたオリゴ糖の分析方法について、詳細を説明する。
なお、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために代表的な事例の一部を示しており、発明の範囲を限定するものではない。また、以下の説明において例示される材料、寸法等は一例であって、本発明はそれらに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することが可能である。

（ＨＩＬＩＣカラム用充填剤）
本発明のＨＩＬＩＣカラム用充填剤は、水酸基を有する架橋性重合体基材を含む。前記架橋性重合体基材が多孔質の粒子であり、好ましくは球状粒子である。前記架橋性重合体基材の水酸基にグリシドールが付加される。また、前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤の親水性指数が２．３０以上であり、かつ、前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤の表面ｐＨ性指数が０．９５以上１．０５以下であることを特徴とする。そして、前記架橋性重合体基材は、その水酸基にグリシドールが付加することによって、表面にグリシドール由来のジオール構造を有することが好ましい。
本発明の一実施態様のＨＩＬＩＣカラム用充填剤は、水酸基を有する架橋性重合体基材を含む。前記架橋性重合体基材が多孔質の粒子である。前記架橋性重合体基材粒子の表面に、グリシドール由来のジオール構造を有する。また、前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤の親水性指数が２．３０以上であり、かつ、前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤の表面ｐＨ性指数が０．９５以上１．０５以下であることを特徴とする。

＜水酸基を有する多孔質の架橋性重合体＞
水酸基を有する多孔質の架橋性重合体としては、例えば酢酸ビニルと、不飽和二重結合を複数有する架橋性モノマーであるトリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ（登録商標））などを共重合させた後に、けん化反応をさせて得られる架橋性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられる。共重合体のモノマー組成の質量比に関して特に制限はないが、その後のグリシドール付加反応処理により十分な親水性を発現させるためには、架橋性モノマーの比率を９０質量％以下にすることが望ましい。８０質量％以下にすることがより好ましく、７０質量％以下にすることが更に好ましい。また多孔質粒子を液体クロマトグラフィー用充填剤として利用する場合の実用上の機械的強度を確保するためには、架橋性モノマーの比率を１０質量％以上にすることが望ましい。２０質量％以上にすることがより好ましく、３０質量％以上にすることが更に好ましい。機械的強度が不足すると、移動相を送液した際に発生する圧力により変形しカラムを閉塞することにより装置が使用可能な圧力範囲を超えてしまう場合がある。また変形し閉塞を起こさないとしても、多孔質充填剤を構成する共重合体の1次粒子が脱離して、分析に使用する検出器の種類によっては目的物質の検出を妨害する場合がある。

けん化によって得られた架橋性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の水酸基の密度は１．２ｍｅｑ／ｇ〜１０．５ｍｅｑ／ｇの範囲であることが好ましく、１．６ｍｅｑ／ｇ〜９．３ｍｅｑ／ｇの範囲であることがより好ましく、２．０ｍｅｑ／ｇ〜８．０ｍｅｑ／ｇの範囲であることが更に好ましい。この範囲にすることで、グリシドールが十分付加することができ、充填剤に適正な親水性を付与できる。

水酸基を有する多孔質の架橋性重合体の中でも、特に架橋性モノマーとしてＴＡＩＣ（登録商標）を用いた架橋性ＰＶＡは、ＰＶＡがその構造中に有する水酸基に加えグリシドールが付加反応することによって生成する付加的な水酸基の寄与により効率的に親水性が発現される点において好適である。

＜多孔質の粒子＞
前述の水酸基を有する架橋性共重合体を、多孔質の粒子として得る方法としては、モノマーと相溶する非重合性の有機溶剤および重合開始剤とを混合して得た油相を水相に懸濁させ所望の大きさの油滴とし、続いて加熱撹拌することによって粒子を得る懸濁重合法が一般的に用いられる。または、油相をＳＰＧ（シラスポーラスガラス）膜に代表される多孔質膜、あるいは石英基板に形成されたマイクロ流路を通じて水相中に滴下させて所望の大きさの粒子を形成する方法が用いられる。いずれの粒子形成方法とも、油相に混合した非重合性の有機溶剤が占める容積が細孔を形成することになる。このようにして造粒された油相は、引き続き水相中で加熱撹拌することにより重合反応を進行させ、架橋性重合体として強度が付与される。重合反応後、有機溶剤を用いた洗浄により非重合性有機溶剤が除去され多孔質体として完成される。

前記粒子は、球状であることが好ましい。該球状粒子の粒径としては、十分な分離性能及び高感度を得るためには体積平均粒径として１〜３０μｍが好ましく、３〜１０μｍが過剰な圧力上昇を招きにくい点においてさらに好ましい。体積平均粒径の測定は、コールターカウンターあるいは画像解析式粒度分布測定器で行うことができる。所望の粒径を得るために、メッシュを用いた篩分級や、風力分級機を用いた粒径制御を行うこともできる。

多孔質を形成する細孔の大きさとしては、分離性能と機械的強度とを両立するためには平均細孔径として３〜３０ｎｍが好ましく、１０〜２５ｎｍが十分な分離性能を得る点においてさらに好ましい。細孔径が小さすぎると、比表面積が小さくなり親水性相互作用を発現する能力が十分に得られない。細孔径が大きすぎると機械的強度が保てず、カラム内に発生する圧力により粒子がつぶれてしまう問題がある。平均細孔径の測定は、ガス吸着式比表面積測定器、あるいは水銀ポロシメータを用いて行うことができる。

＜グリシドールの付加反応＞
このようにして得られる水酸基を有する多孔質の架橋性重合体粒子に対し、グリシドールを付加反応させることにより、粒子表面に十分に親水性が付与されたＨＩＬＩＣカラム用充填剤を得る。グリシドールの付加反応は、前記粒子とグリシドールとを共存させたところに、例えばカリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシドのような強アルカリ試薬を添加し、加熱撹拌することにより行うことができる。前記粒子の水酸基とグリシドールとが反応してグリシドール由来のジオール構造が生成する態様が好ましい。十分な親水性を付与するためには添加するグリシドールを前記粒子が有する水酸基あるいはグリシジル基等のグリシドールと反応する官能基に対し過剰量存在させておくと良い。また十分な親水性が発現される程度のグリシドールを付加することにより、例えばトリアリルイソシアヌレートを架橋性モノマーとして使用した場合に重合体中に導入される窒素原子に由来する塩基性が減衰し、ＨＩＬＩＣカラムとして使用する際に酸塩基相互作用を含むイオン性相互作用がほとんど示されなくなる。これにより純粋に親水性相互作用が分離モードの主体であるＨＩＬＩＣカラムを得ることができる。ここで、「純粋に親水性相互作用が分離モードの主体である」意味は、親水性相互作用以外の酸塩基相互作用や静電的相互作用などが殆ど保持力として働いていない意味である。このような効果を得るためのグリシドール付加量としては、水酸基を有する多孔質の架橋性重合体粒子の水酸基密度にもよるが、前記粒子の単位質量当りで、１ｍｍｏｌ／ｇ〜５ｍｍｏｌ／ｇの範囲が好ましく、２ｍｍｏｌ／ｇ〜４ｍｍｏｌ／ｇの範囲がより好ましい。

このようにグリシドールを付加させて得られるＨＩＬＩＣカラム用充填剤の親水性を表す指標として、ウリジン（Ｕ）と２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）をＨＩＬＩＣ分離モード条件の液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）で定義される親水性指数を適用することができる。この親水性指数では、数値が大きいほど親水性が高いことを示す。

また、酸塩基相互作用を含むイオン性相互作用に対応する表面のｐＨ性を示す指標として、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）を同様に液体クロマトグラフィーにて測定を行った際の分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義される表面ｐＨ性指数を適用することができる。この表面ｐＨ性指数では、１がちょうど中性であり、１より小さいと塩基性、１より大きいと酸性であることを示す。

各分離係数α１、α２は、それぞれの物質の保持係数ｋの比であり、保持係数ｋはいずれもトルエンの溶出時間をｔ_０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとしてｋ＝（ｔ−ｔ_０）／ｔ_０で定義される。ただし、この保持係数を求めるときのＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件は、カラム温度が３０℃、移動相が（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍＭおよび酢酸アンモニウム１０ｍＭを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。この測定条件以外では、異なった保持係数および異なった分離係数となるため、本発明の範囲を規定する親水性指数、および表面ｐＨ性指数を得ることができない。つまり、分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）＝ｋ１／ｋ２であり、ｋ１はウリジンの保持係数、ｋ２は２’−デオキシウリジンの保持係数である。また、分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）＝ｋ３／ｋ４であり、ｋ３はテオブロミンの保持係数、ｋ４はテオフィリンの保持係数である。

これらの指標は、２０１１年に池上らによって提唱されたＨＩＬＩＣカラムの性能評価指数であり、世の中で一般的に適用可能な技術に基づくものである（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ，１２１８号（２０１１年，５９０３−５９１９頁）。

本発明のＨＩＬＩＣカラム用充填剤は、親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）が２．３０以上、好ましくは２．３０以上２．５０以下であり、かつ表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）が０．９５以上１．０５以下、好ましくは０．９５以上１．００以下であることが要件となる。α１（Ｕ／２ｄＵ）が２．３０より小さいと親水性相互作用が十分でなく、オリゴ糖分析において十分な分離度を得ようとすると、移動相の流速を極端に低下させなければならなかったり、移動相の組成を測定途中で変更するグラジエント法を使わなければならなかったりするなど甚だ煩雑になる。また、α２（Ｔｂ／Ｔｐ）が０．９５以上１．０５以下の範囲にない場合も同様に、オリゴ糖分析において十分な分離度を得ようとすると、移動相の流速を極端に低下させなければならなかったり、移動相の組成を測定途中で変更するグラジエント法を使わなければならなかったりするなど甚だ煩雑になる。尚、上記の範囲に制御するには、グリシドールを付加するときの反応時間、反応温度またはグリシドール添加量を変化させて最適条件を得ることが有効である。
親水性指数である分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）の測定条件としては、溶離液組成：アセトニトリル／１０ｍＭ酢酸＋１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．７）＝９０／１０（容積比）の混合液、流量：０．５５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃である。この条件において、トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、ウリジン０．１ｍｇ／ｍＬ、２'−デオキシウリジン０．１ｍｇ／ｍＬを溶離液に溶解したサンプルを注入し（例えばカラムサイズが内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍの場合４μＬ）、ＵＶ検出器（波長２５４ｎｍ）を用いて得られたクロマトグラムから各成分の保持時間を測定する。
表面ｐＨ性指数である分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）の測定条件としては、溶離液組成：アセトニトリル／１０ｍＭ酢酸＋１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．７）＝９０／１０（容積比）の混合液、流量：０．５５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃である。この条件において、トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、テオブロミン０．１ｍｇ／ｍＬ、テオフィリン０．１ｍｇ／ｍＬを溶離液に溶解したサンプルを注入し（例えばカラムサイズが内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍの場合４μＬ）、ＵＶ検出器（波長２５４ｎｍ）を用いて得られたクロマトグラムから各成分の保持時間を測定する。
（ＨＩＬＩＣカラム）

本発明によるＨＩＬＩＣカラムは、前述の本願発明の充填剤と、前記充填剤を充填した円筒状の液体クロマトグラフィー用筐体（カラムハウジング）とを備えることを特徴とする。

カラムハウジングの材質は、移動相を流通させた際に発生する圧力に耐えられる強度を発現する材料であれば特に制限はないが、一般的にはステンレス材、あるいはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）材が用いられる。

ハウジングサイズは特に制限はないが、分離能良く高感度に分析するためには、円筒状であり、内径１．０〜４．６ｍｍ、長さは５０〜２５０ｍｍとすることが望ましい。

分離良く分析できるカラムとするには充填剤が適切に充填される必要がある。充填方法としては、充填剤を液体に分散させたスラリーとした後、ポンプを用いてハウジング内に送液し加圧することにより行われる。この時、スラリー調製に用いる液体としては、親水性の高い充填剤が分散しやすい水、あるいは水と水溶性有機溶媒との混合物が好ましく用いられる。水溶性有機溶媒の種類としては、一般的にＨＩＬＩＣモードでの分離に使用されるアセトニトリル、メタノール、ＴＨＦなどが挙げられる。さらには、多孔質の充填剤粒子中に水が浸透し、適度な水和状態を形成しながら良好な分散を達成するために、塩を添加すると良い。塩の種類としては、例えば塩化ナトリウム，硫酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムが挙げられるが、架橋性重合体粒子のモノマー組成や粒径に応じて最適なものが選ばれる。また塩濃度についても同様に、架橋性重合体粒子のモノマー組成や粒径に応じて最適な条件が選ばれる。充填圧力は、架橋性重合体粒子のモノマー組成や粒径に加え、ハウジングサイズにも応じて最適な条件が選ばれる。
（オリゴ糖の分析方法）

本発明におけるオリゴ糖の分析方法は、上述のようにして得られるＨＩＬＩＣカラムを用いることを要件とし、送液ポンプ、インジェクター、及び検出器を接続した一般的な液体クロマトグラフィー測定装置が用いられる。ＨＩＬＩＣモードの分離においては、移動相として水及び水と相溶する有機溶媒を混合した液体が用いられる。その混合液の組成としては、有機溶媒の混合前の比率が５０体積％以上であることが一般的である。好ましい範囲としては５０〜９５体積％であり、さらに好ましくは６０〜９０体積％である。水溶性有機溶媒の比率が５０体積％より小さくなると親水性相互作用が低下する場合があり、９５体積％より大きくなるとオリゴ糖の吸着が生じる懸念がある。

水溶性有機溶媒の種類としては、アセトニトリル等のニトリル類；メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類；テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類を用いることができる。

本発明のＨＩＬＩＣカラムの充填剤は表面ｐＨ性がほぼ中性に近いため、移動相への塩の添加は必要であったとしても少量でよい。塩の種類としては、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩が挙げられ、例えば、混合溶液１Ｌに対して１〜２５ｍｍｏｌを添加することができる。基材の種類、あるいは分析する試料の種類によっては、これらを添加することで保持時間が調整される場合がある。

本発明のオリゴ糖の分析方法においては、充填剤の高い親水性及び表面ｐＨ性のほぼ中性に基づくＨＩＬＩＣカラムの優れた分離能により、移動相の組成を一定のまま測定するアイソクラティック溶離条件や、温度を一定のまま測定する条件を適用することができる。このため、移動相組成及び測定温度を最適化するだけで多量体成分を同定可能な程度に分離することができ、従来の測定例では段階的に移動相の組成を変化するグラジエント溶離条件を用いなければ不可能であった１７量体以上でも測定が可能である。これにより、極めて簡便にオリゴ糖成分を検出することが実現される。

オリゴ糖などの糖類は、一般的にＵＶ光検出器で用いられる２５４ｎｍの波長において光の吸収が非常に小さいため、分析する際の検出器としては示差屈折率（ＲＩ）式が用いられる。本発明の分析方法においても、ＲＩ検出器が好適に用いられる。その他にも、質量分析計や蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）、コロナ荷電化粒子検出器（ＣｏｒｏｎａＣＡＤ（登録商標））を用いることも可能である。表面ｐＨ性がほぼ中性であることに由来し、移動相中への塩添加が必要であったとしても少量で良いため、特に質量分析計やＥＬＳＤ、ＣｏｒｏｎａＣＡＤ（登録商標）を用いる場合には塩の影響が少なく好適である。

以下、実施例により本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。

（実施例１）
（１）充填剤１の作製
（ポリビニルアルコールゲル（基材）の合成）
酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート１５０ｇ、酢酸ブチル１００ｇ、ｎ‐デカン２５ｇ及び２，２−アゾビスイソブチロニトリル５ｇよりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１２ｇ及びリン酸水素二ナトリウム１８ｇを溶解した水１２００ｍＬと還流冷却器を備えた５Ｌの三口フラスコに入れ１０分攪拌した。次いで、窒素ガス気流下で攪拌しつつ、６０℃で１６時間重合を行い、粒状共重合体を得た。この共重合体を濾過、洗浄し、アセトン抽出した後乾燥した。次いでこの共重合体を苛性ソーダ３Ｌとともに還流冷却器、窒素ガス導入管及び攪拌器を備えた５Ｌの三口フラスコに入れ、窒素気流下で１５℃、２０時間攪拌してこの共重合体のけん化を行った後、濾過、水洗、更に乾燥及び風力分級処理をした。けん化によって得られたポリビニルアルコール共重合体の水酸基の密度は２．１ｍｅｑ／ｇであった。画像解析式粒度分布測定装置（シスメックス社製ＦＰＩＡ３０００）により粒径測定を行った結果、体積平均粒径は４．８μｍであった。
またガス吸着式比表面積測定装置（日本ベル社製ＢＥＬＳＯＲＰ−ｍｉｎｉ）により測定した平均細孔径は１３ｎｍであった。
水酸基密度の測定は以下の手順で行った。約２ｇのポリビニルアルコール共重合体基材を６０℃で６時間真空乾燥し、その後精密天秤にて正確に重量を測定する。５０ｍＬ三角フラスコに秤量した基材全量と、無水酢酸１７ｍＬとピリジン３３ｍＬの混合液を手早く投入し、次いで三角フラスコの上部に玉入冷却管を設置し、さらに冷却管上部から窒素ガスを静かに通気しフラスコ内の空気を追い出す。そのままマグネティックスターラーで撹拌しながら、オイルバスで９０℃１６時間加熱する。加熱終了後、メタノールを少量ずつ計１５ｍＬ加え、グラスフィルターで基材をろ過する。さらにメタノール９０ｍＬで洗浄した後、６０℃で６時間真空乾燥する。乾燥後の基材を精密天秤にて正確に重量測定し、無水酢酸を反応させる前との重量差を計算する。基材の水酸基にエステル付加した酢酸フラグメント（ＣＨ_３ＣＯ−：分子量４３）が重量増に相当するので、これにより基材重量当たりの水酸基密度（単位：ｍｍｏｌ／ｇ）が算出される。

（基材の表面修飾処理）
上記のようにして得た乾燥ポリビニルアルコール重合体１０ｇ、グリシドール１０ｇ、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド１ｇ、ジエチレングリコールジメチルエーテル１００ｍＬをセパラブルフラスコに入れ、６０℃で２０時間撹拌し、このポリビニルアルコール基材にグリシドールを付加した。導入後の重合体を、水、メタノールで洗浄後、乾燥した。
グリシドール付加量は重量測定により行い、ポリビニルアルコール基材の重量当たり２ｍｍｏｌ／ｇであった。

（２）充填剤１が充填されたカラムの作製
作製した充填剤１を水に分散させたスラリーとし、送液ポンプを用いて内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＰＥＥＫ製のカラムハウジング（株式会社巴製作所製）に１５ＭＰａの一定圧力にて１０分間送液加圧充填した。

（３）充填剤１の親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）および表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）測定
作製した充填剤１を充填したカラムを用いて、以下の測定条件として、トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、ウリジン０．１ｍｇ／ｍＬ、２'−デオキシウリジン０．１ｍｇ／ｍＬ、テオブロミン０．１ｍｇ／ｍＬ、テオフィリン０．１ｍｇ／ｍＬを溶離液に溶解したサンプル４μＬを注入して測定を行った。得られたクロマトグラムを図３に示す。
溶離液組成：アセトニトリル／１０ｍＭ酢酸＋１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．７）＝９０／１０（容積比）の混合液、
流量：０．５５ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：３０℃、
検出器：ＵＶ検出器（波長２５４ｎｍ）。

このクロマトグラムから、トルエン、ウリジン、２'−デオキシウリジン各成分の保持時間を測定し、親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を求めた結果、２．４０であった。
また、このクロマトグラムから、トルエン、テオブロミン、テオフィリン各成分の保持時間を測定し、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を求めた結果、０．９５であった。

（４）充填剤１が充填されたカラムでのオリゴ糖測定
作製した充填剤１を充填したカラムを用いて、以下の測定条件として分析を行った。得られたクロマトグラムを図１に示す。
溶離液組成：アセトニトリル／水＝６０／４０、
流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：４０℃、
検出器：ＲＩ検出器。
分析サンプルは、デキストラン（分子量４０００〜６０００）４０ｍｇを１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ１ｍＬに溶解し１００℃で１５分加熱撹拌した後、水分を留去して得られた固形分をアセトニトリル／水＝５０／５０の混合液に０．１重量％で溶解したものを用いた。ピークとして識別できる信号／ノイズ比を２．０以上とすると、１９量体（Ｓ／Ｎ比：６．６）の存在まで確認できる。

（実施例２）
＜充填剤２の作製＞
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、６０℃での表面修飾処理反応の時間を６時間とした以外は、実施例１と同様にして充填剤２を得た。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．３０であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、０．９５であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１８量体（Ｓ／Ｎ比４．７）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（実施例３）
＜充填剤３の作製＞
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、表面修飾処理反応の条件を８０℃６時間とした以外は、実施例１と同様にして充填剤３を得た。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．３１であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、１．０５であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１７量体（Ｓ／Ｎ比５．３）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（実施例４）
＜充填剤４の作製＞
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、表面修飾処理反応の条件を８０℃２０時間とした以外は、実施例１と同様にして充填剤４を得た。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．４０であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、１．０５であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１７量体（Ｓ／Ｎ比２．３）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（実施例５）
＜充填剤５の作製＞
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、表面修飾処理反応に使用するグリシドールの量を２０ｇとした以外は、実施例１と同様にして充填剤５を得た。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．４９であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、０．９５であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１９量体（Ｓ／Ｎ比６．１）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（実施例６）
＜充填剤６の作製＞
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、表面修飾処理反応に使用するグリシドールの量を２０ｇとし、表面修飾処理反応条件を８０℃２０時間とした以外は、実施例１と同様にして充填剤６を得た。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．４８であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、１．０４であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１８量体（Ｓ／Ｎ比５．２）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（実施例７）
＜充填剤７の作製＞
実施例１に記載のポリビニルアルコールゲル合成の手順において、風力分級の条件を、平均粒径が３．５μｍとなるように変更した以外は、実施例１と同様の方法で充填剤７を得た。平均細孔径は１２ｎｍであった。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．４０であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、１．００であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１８量体（Ｓ／Ｎ比３．３）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（比較例１）
＜充填剤８の作製＞
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、表面修飾処理反応に使用するグリシドールの量を２０ｇとし、表面修飾処理反応条件を５０℃２０時間とした以外は、実施例１と同様にして充填剤８を得た。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．４１であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、０．９３であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１２量体（Ｓ／Ｎ比２．８）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（比較例２）
＜充填剤９の作製＞
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、表面修飾処理反応に使用するグリシドールの量を２０ｇとし、表面修飾処理反応条件を８０℃６時間とした以外は、実施例１と同様にして充填剤９を得た。
＜親水性指数、表面ｐＨ性指数＞
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．４０であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、１．０６であった。

＜オリゴ糖分析＞
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１１量体（Ｓ／Ｎ比４．３）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（比較例３）
＜充填剤１０の作製）
実施例１に記述の充填剤１を作製する過程において、表面修飾処理反応に使用するグリシドールの量を７ｇとした以外は、実施例１と同様にして充填剤１０を得た。

＜親水性指数、表面ｐＨ性指数）
実施例１と同様に親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．２３であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、０．９９であった。

＜オリゴ糖分析）
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、１０量体（Ｓ／Ｎ比３．０）まで識別された。著しいベースラインドリフトや、オリゴ糖ピークの不規則分離は認められなかった。

（比較例４）
ＨＩＬＩＣカラムとして、昭和電工（株）製ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ−５０４Ｄ（内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用いた。実施例１と同様に、親水性指数α１（Ｕ／２ｄＵ）を測定した結果、２．２５であった。また、表面ｐＨ性指数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）を測定した結果、０．３７であった。
実施例１と同様の条件でオリゴ糖分析を行った結果、図２に示すクロマトグラムを得た。異性体分離を含むとみられるピーク分離の不規則が観測され、正当な測定は不可能であった。

Claims

水酸基を有する架橋性重合体基材を含み、
前記架橋性重合体基材が多孔質の粒子であり、
前記架橋性重合体基材の水酸基に、グリシドールが付加され、
親水性指数が２．３０以上であり、かつ
表面ｐＨ性指数が０．９５以上１．０５以下であることを特徴とするＨＩＬＩＣカラム用充填剤、
前記親水性指数は、ウリジン（Ｕ）と２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）をＨＩＬＩＣ分離モード条件の液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）で定義され、
前記表面ｐＨ性指数は、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）をＨＩＬＩＣ分離モード条件の液体クロマトグラフィーにて測定を行った際の分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義され、
前記分離係数α１（Ｕ／２ｄＵ）および前記分離係数α２（Ｔｂ／Ｔｐ）は、それぞれの物質の保持係数ｋの比であり、
前記保持係数ｋはいずれもトルエンの溶出時間をｔ_０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとしてｋ＝（ｔ−ｔ_０）／ｔ_０で定義され、
ただし、前記ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件としては、
カラム温度が３０℃であり、
移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍＭおよび酢酸アンモニウム１０ｍＭを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。
水酸基を有する多孔質の架橋性重合体基材が、ビニルアルコールとトリアリルイソシアヌレートとの共重合体である請求項１に記載のＨＩＬＩＣカラム用充填剤。
請求項１又は２に記載の前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤と、
前記ＨＩＬＩＣカラム用充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用筐体と、
を備えるＨＩＬＩＣカラム。
請求項３に記載の前記ＨＩＬＩＣカラムを用いてＨＩＬＩＣモードで分析するオリゴ糖の分析方法。
前記ＨＩＬＩＣモードによるオリゴ糖の分析方法であって、前記移動相の組成を測定の間常に一定（アイソクラティック溶離条件）とし、かつ前記カラム温度を測定の間常に一定として行う請求項４に記載のオリゴ糖の分析方法。
前記ＨＩＬＩＣモードによるオリゴ糖の分析方法であって、分析対象のオリゴ糖分子の大きさが１７量体以上である請求項４又は５に記載のオリゴ糖の分析方法。