JPWO2017018060A1 - Cysteine derivative and method for producing cysteine sulfoxide derivative - Google Patents
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Abstract
本願発明は、シスタチオニンβ−シンターゼの存在下、式（Ｉ）：（式中、Ｒは明細書中に記載の通りである）で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させて式（ＩＩ）：（式中、Ｒは上述の通りである）で表されるシステイン誘導体を製造する方法、及び該システイン誘導体と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させて式（ＩＩＩ）：（式中、Ｒは上述の通りである）で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する方法を提供する。当該方法により、システイン誘導体やシステインスルホキシド誘導体を、工業的規模で安定的に、且つ食品に使用する際にも安全な方法で製造することが可能となる。In the present invention, in the presence of cystathionine β-synthase, a thiol compound represented by the formula (I): (wherein R is as described in the specification) and L-serine are reacted to form the formula ( II): (wherein R is as described above), and the cysteine derivative is reacted with oxidase and its substrate to give a formula (III): (wherein Wherein R is as described above) is provided. This method makes it possible to produce cysteine derivatives and cysteine sulfoxide derivatives stably on an industrial scale and in a safe manner when used in foods.
Description
本発明は、システイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a cysteine derivative and a cysteine sulfoxide derivative.
システイン誘導体やシステインスルホキシド誘導体は、医薬品の中間体、食品添加物の原材料として期待されており、安価な工業的製法が種々検討されている。システイン誘導体の製造法として、システインデスルフヒドラーゼ（特許文献１、２）、トリプトファンシンターゼ（特許文献３、４）によるＳ−アルキルシステイン又はＳ−アルケニルシステインの製造法の報告があるが、その産生量は十分なものではない。 Cysteine derivatives and cysteine sulfoxide derivatives are expected as intermediates for pharmaceuticals and raw materials for food additives, and various inexpensive industrial production methods have been studied. As methods for producing cysteine derivatives, there are reports of methods for producing S-alkylcysteine or S-alkenylcysteine using cysteine desulfhydrase (Patent Documents 1 and 2) and tryptophan synthase (Patent Documents 3 and 4). The amount is not enough.
一方、システインスルホキシド誘導体の製造法として、過酸化水素によるＳ−アルキルシステインスルホキシド又はＳ−アルケニルシステインスルホキシドの製造法が複数報告されているが（非特許文献１、２）、食品に使用する際には残存する過酸化水素の除去が必要となる。 On the other hand, as a method for producing a cysteine sulfoxide derivative, a plurality of methods for producing S-alkylcysteine sulfoxide or S-alkenylcysteine sulfoxide using hydrogen peroxide have been reported (Non-Patent Documents 1 and 2). Requires removal of the remaining hydrogen peroxide.
本発明は、医薬品の中間体、食品添加物の原材料として期待されているシステイン誘導体やシステインスルホキシド誘導体、特に、Ｓ−アルキルシステインやＳ−アルケニルシステイン等のシステイン誘導体、及びＳ−アルキルシステインスルホキシドやＳ−アルケニルシステインスルホキシド等のシステインスルホキシド誘導体を、工業的規模で安定的に、且つ食品に使用する際にも安全な方法で製造する方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to cysteine derivatives and cysteine sulfoxide derivatives expected as raw materials for pharmaceutical intermediates and food additives, in particular, cysteine derivatives such as S-alkylcysteine and S-alkenylcysteine, and S-alkylcysteine sulfoxide and S An object of the present invention is to provide a method for producing a cysteine sulfoxide derivative such as alkenyl cysteine sulfoxide stably on an industrial scale and also in a safe manner when used in foods.
本発明者らは、上記目的を達成すべく、チオール化合物とＬ−セリンから酵素的にシステイン誘導体を製造する方法に着目し、鋭意検討した結果、シスタチオニンβ−シンターゼがその責任酵素となり得ることを見出した。さらに、システイン誘導体を酵素的にシステインスルホキシド誘導体に変換する方法に着目し、鋭意検討した結果、オキシダーゼによって効率よくシステイン誘導体をシステインスルホキシド誘導体に変換する方法を見出した。これらの知見を得て、従来に比べ、より効率よく、安定的にシステイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体を得ることに成功して本発明を完成するに至った。 In order to achieve the above object, the present inventors focused on a method for enzymatically producing a cysteine derivative from a thiol compound and L-serine, and as a result of intensive studies, it has been found that cystathionine β-synthase can be the responsible enzyme. I found it. Furthermore, paying attention to a method for enzymatically converting a cysteine derivative to a cysteine sulfoxide derivative, and as a result of extensive studies, the present inventors have found a method for efficiently converting a cysteine derivative to a cysteine sulfoxide derivative with oxidase. Obtaining these findings, the present invention was completed by successfully obtaining cysteine derivatives and cysteine sulfoxide derivatives more efficiently and stably than in the past.
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］シスタチオニンβ−シンターゼの存在下、式（Ｉ）：That is, the present invention is as follows.
[1] Formula (I) in the presence of cystathionine β-synthase:
（式中、ＲはＣ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：(In the formula, R represents a C 1-6 alkyl group or a C 2-6 alkenyl group)
Wherein the thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体の製造方法。
［２］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［１］記載の方法。
［３］前記シスタチオニンβ−シンターゼがシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物由来である、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］前記微生物が、シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強されている変異株である、上記［３］記載の方法。
［５］前記シスタチオニンβ−シンターゼがＣＹＳ４遺伝子によってコードされる酵素である、上記［４］記載の方法。
［６］前記微生物が、シスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株である、上記［３］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記シスタチオニンγ−リアーゼがＣＹＳ３遺伝子によってコードされる酵素である、上記［６］記載の方法。
［８］前記微生物が酵母である、上記［３］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記酵母がSaccharomyces属酵母である、上記［８］記載の方法。
［１０］前記Saccharomyces属酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、上記［９］記載の方法。
［１１］シスタチオニンβ−シンターゼの存在下、式（Ｉ）：(Wherein R is as described above)
The manufacturing method of the cysteine derivative represented by these.
[2] The method of the above-mentioned [1], wherein in each formula, R is a 1-propenyl group, a propyl group, a methyl group or an allyl group.
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the cystathionine β-synthase is derived from a cystathionine β-synthase-producing microorganism.
[4] The method according to [3] above, wherein the microorganism is a mutant having enhanced cystathionine β-synthase activity.
[5] The method described in [4] above, wherein the cystathionine β-synthase is an enzyme encoded by a CYS4 gene.
[6] The method according to any one of [3] to [5] above, wherein the microorganism is a mutant strain having reduced cystathionine γ-lyase activity.
[7] The method according to [6] above, wherein the cystathionine γ-lyase is an enzyme encoded by a CYS3 gene.
[8] The method according to any one of [3] to [7], wherein the microorganism is yeast.
[9] The method according to [8] above, wherein the yeast is a Saccharomyces genus yeast.
[10] The method according to [9] above, wherein the Saccharomyces genus yeast is Saccharomyces cerevisiae.
[11] Formula (I) in the presence of cystathionine β-synthase:
（式中、ＲはＣ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させて式（ＩＩ）：(In the formula, R represents a C 1-6 alkyl group or a C 2-6 alkenyl group)
A thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体を製造する工程（工程１）、及び
工程１で得られたシステイン誘導体と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させて式（ＩＩＩ）：(Wherein R is as described above)
A step (Step 1) for producing a cysteine derivative represented by formula (III): and reacting the cysteine derivative obtained in Step 1 with an oxidase and a substrate thereof to formula (III):
（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する工程（工程２）を含む、該システインスルホキシド誘導体の製造方法。
［１２］オキシダーゼがグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びアシルＣｏＡオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、上記［１１］記載の方法。
［１３］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［１１］又は［１２］記載の方法。
［１４］前記シスタチオニンβ−シンターゼがシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物由来である、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記微生物が、シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強されている変異株である、上記［１４］記載の方法。
［１６］前記シスタチオニンβ−シンターゼがＣＹＳ４遺伝子によってコードされる酵素である、上記［１５］記載の方法。
［１７］前記微生物が、シスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株である、上記［１４］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記シスタチオニンγ−リアーゼがＣＹＳ３遺伝子によってコードされる酵素である、上記［１７］記載の方法。
［１９］前記微生物が酵母である、上記［１４］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記酵母がSaccharomyces属酵母である、上記［１９］記載の方法。
［２１］前記Saccharomyces属酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、上記［２０］記載の方法。
［２２］シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母を培養し、該酵母の抽出物および／または培養物の存在下、式（Ｉ）：(Wherein R is as described above)
The manufacturing method of this cysteine sulfoxide derivative including the process (process 2) of manufacturing the cysteine sulfoxide derivative represented by these.
[12] The method according to [11] above, wherein the oxidase is at least one selected from the group consisting of glucose oxidase, galactose oxidase, uricase, cholesterol oxidase, choline oxidase and acyl CoA oxidase.
[13] The method according to [11] or [12] above, wherein in each formula, R is a 1-propenyl group, a propyl group, a methyl group or an allyl group.
[14] The method according to any one of [11] to [13] above, wherein the cystathionine β-synthase is derived from a cystathionine β-synthase-producing microorganism.
[15] The method according to [14] above, wherein the microorganism is a mutant having enhanced cystathionine β-synthase activity.
[16] The method according to [15] above, wherein the cystathionine β-synthase is an enzyme encoded by a CYS4 gene.
[17] The method according to any one of [14] to [16] above, wherein the microorganism is a mutant having reduced cystathionine γ-lyase activity.
[18] The method described in [17] above, wherein the cystathionine γ-lyase is an enzyme encoded by a CYS3 gene.
[19] The method according to any one of [14] to [18], wherein the microorganism is yeast.
[20] The method described in [19] above, wherein the yeast is a Saccharomyces genus yeast.
[21] The method described in [20] above, wherein the Saccharomyces genus yeast is Saccharomyces cerevisiae.
[22] A yeast having cystathionine β-synthase activity is cultured, and in the presence of an extract and / or culture of the yeast, the formula (I):
（式中、ＲはＣ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：(In the formula, R represents a C 1-6 alkyl group or a C 2-6 alkenyl group)
Wherein the thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体の製造方法。
［２３］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［２２］記載の方法。
［２４］シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母を培養し、該酵母の抽出物および／または培養物の存在下、式（Ｉ）：(Wherein R is as described above)
The manufacturing method of the cysteine derivative represented by these.
[23] The method described in [22] above, wherein in each formula, R is a 1-propenyl group, a propyl group, a methyl group or an allyl group.
[24] A yeast having cystathionine β-synthase activity is cultured, and in the presence of an extract and / or culture of the yeast, the formula (I):
（式中、ＲはＣ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す）
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させて式（ＩＩ）：(In the formula, R represents a C 1-6 alkyl group or a C 2-6 alkenyl group)
A thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステイン誘導体を製造する工程（工程１）、及び
工程１で得られたシステイン誘導体と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させて式（ＩＩＩ）：(Wherein R is as described above)
A step (Step 1) for producing a cysteine derivative represented by formula (III): and reacting the cysteine derivative obtained in Step 1 with an oxidase and a substrate thereof to formula (III):
（式中、Ｒは上述の通りである）
で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する工程（工程２）を含む、該システインスルホキシド誘導体の製造方法。
［２５］オキシダーゼがグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びアシルＣｏＡオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、上記［２４］記載の方法。
［２６］各式中、Ｒが１−プロペニル基、プロピル基、メチル基またはアリル基である、上記［２４］又は［２５］記載の方法。
［２７］前記酵母が、ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株；ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株；及びＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現変異株からなる群より選択される少なくとも１種である、上記［２２］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］前記酵母がSaccharomyces属酵母である、上記［２２］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］前記Saccharomyces属酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、上記［２８］記載の方法。
［３０］該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンβ−シンターゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり２５００Ｕ以上、５０００Ｕ以上、１００００Ｕ以上、２００００Ｕ以上、３００００Ｕ以上、又は４００００Ｕ以上である、上記［２２］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンβ−シンターゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり１×１０６Ｕ以下、５×１０５Ｕ以下、１×１０５Ｕ以下、又は５×１０４Ｕ以下である、上記［２２］〜［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］該酵母の抽出物および／または培養物のシスタチオニンγ−リアーゼ活性が、抽出物および／または培養物１ｇあたり１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、１０Ｕ以下、１Ｕ以下、又は実質的に含まないかあるいは０Ｕである、上記［２２］〜［３１］のいずれかに記載の方法。(Wherein R is as described above)
The manufacturing method of this cysteine sulfoxide derivative including the process (process 2) of manufacturing the cysteine sulfoxide derivative represented by these.
[25] The method according to [24] above, wherein the oxidase is at least one selected from the group consisting of glucose oxidase, galactose oxidase, uricase, cholesterol oxidase, choline oxidase and acyl CoA oxidase.
[26] The method according to [24] or [25] above, wherein in each formula, R is a 1-propenyl group, a propyl group, a methyl group or an allyl group.
[27] The above [22], wherein the yeast is at least one selected from the group consisting of a CYS4 gene high expression mutant; a CYS3 low expression mutant; and a CYS4 high expression and CYS3 low expression mutant -The method in any one of [26].
[28] The method according to any one of [22] to [27] above, wherein the yeast is a genus Saccharomyces.
[29] The method described in [28] above, wherein the Saccharomyces genus yeast is Saccharomyces cerevisiae.
[30] The cystathionine β-synthase activity of the yeast extract and / or culture is 2500 U or more, 5000 U or more, 10,000 U or more, 20000 U or more, 30000 U or more, or 40000 U or more per 1 g of the extract and / or culture. The method according to any one of [22] to [29] above.
[31] The cystathionine β-synthase activity of the yeast extract and / or culture is 1 × 10 6 U or less, 5 × 10 5 U or less, 1 × 10 5 U or less per gram of the extract and / or culture. Or the method according to any one of [22] to [30] above, which is 5 × 10 4 U or less.
[32] The cystathionine γ-lyase activity of the yeast extract and / or culture is 100 U or less, 50 U or less, 10 U or less, 1 U or less, or substantially free per gram of the extract and / or culture, or The method according to any one of [22] to [31] above, which is 0 U.
本発明によれば、より効率よく、且つ安定的にシステイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体を製造することができる。 According to the present invention, a cysteine derivative and a cysteine sulfoxide derivative can be produced more efficiently and stably.
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６、好ましくは１〜３の直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。好ましくは、メチル及びプロピルである。
本明細書中、「Ｃ２−６アルケニル基」とは、炭素数２〜６、好ましくは２又は３の直鎖又は分岐鎖アルケニル基を意味し、前記アルキル基において、１個又は複数の二重結合を有するもの等が挙げられる。具体的には、ビニル、アリル（２−プロペニル）、１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等が挙げられる。好ましくは１−プロペニル又はアリルである。In the present specification, the “C 1-6 alkyl group” means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 3 carbon atoms, specifically, methyl, ethyl, n- Examples include propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl and tert-butyl, pentyl, hexyl and the like. Preferred are methyl and propyl.
In the present specification, the “C 2-6 alkenyl group” means a straight chain or branched chain alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, preferably 2 or 3 carbon atoms. The thing etc. which have a heavy bond are mentioned. Specific examples include vinyl, allyl (2-propenyl), 1-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1,3-butadienyl, 3-methyl-2-butenyl, and the like. 1-propenyl or allyl is preferable.
１．システイン誘導体の製造方法
本発明は、式（ＩＩ）：
1. Process for producing cysteine derivative
（式中、ＲはＣ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す）
で表されるシステイン誘導体（以下、単にシステイン誘導体（ＩＩ）とも称する）を酵素的に製造する方法を提供する。
当該方法は、シスタチオニンβ−シンターゼの存在下、式（Ｉ）：(In the formula, R represents a C 1-6 alkyl group or a C 2-6 alkenyl group)
(Hereinafter simply referred to as cysteine derivative (II)) is enzymatically produced.
The method comprises formula (I) in the presence of cystathionine β-synthase:
（式中、Ｒの定義は上述の通りである）
で表されるチオール化合物（以下、単にチオール化合物（Ｉ）とも称する）とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする。
本発明において、Ｒとして好ましくは、１−プロペニル基、プロピル基、メチル基及びアリル基である。(Wherein the definition of R is as described above)
Is characterized by reacting L-serine with a thiol compound represented by formula (hereinafter also simply referred to as thiol compound (I)).
In the present invention, R is preferably a 1-propenyl group, a propyl group, a methyl group or an allyl group.
シスタチオニンβ−シンターゼは、ホモシステインとセリンからシスタチオニンを合成する反応を触媒する酵素をいい、ＥＣ４．２．１．２２に分類される。その構造遺伝子は例えばSaccharomyces cerevisiaeではＣＹＳ４遺伝子（GenBank NM_001181284）として知られている。本発明で用いられるシスタチオニンβ−シンターゼは、チオール化合物（Ｉ）とＬ−セリンとからシステイン誘導体（ＩＩ）を製造できるものであればその由来は特に限定されない。天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、また、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物由来である。シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物は、シスタチオニンβ−シンターゼを細胞内に蓄積できるものであれば特に限定されない。具体的には、酵母、糸状菌、担子菌などが挙げられ、好ましくは酵母である。酵母とは、単細胞の真菌を示し、有胞子酵母、担子菌酵母、不完全酵母などが挙げられる。この中でも例えば、Saccharomyces属、Candida属、Picha属、Hansenula属、Zygosaccharomyces属など有胞子酵母が好ましく、Saccharomyces属、Candida属がより好ましく、Saccharomyces属が最も好ましい。Saccharomyces属酵母には、実験室酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母なども含まれる。より好ましくはSaccharomyces cerevisiae及びCandida utilisであり、最も好ましくはSaccharomyces cerevisiaeである。これらの菌株は商業的に入手が可能であるか、あるいは既知文献に基づいて入手、調製が可能である。例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）では、各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。Saccharomyces cerevisiaeとしては、具体的には、ＢＹ４７４２株(ATCC204508)やＳ２８８Ｃ株(ATCC26108)を用いることができる。また、Candida utilisとしては、具体的には、Candida utilis ATCC22023株を用いることができる。特に好ましくはSaccharomyces cerevisiaeである。 Cystathionine β-synthase refers to an enzyme that catalyzes the reaction of synthesizing cystathionine from homocysteine and serine, and is classified into EC 4.2.1.22. The structural gene is known as CYS4 gene (GenBank NM_001181284) in Saccharomyces cerevisiae, for example. The origin of the cystathionine β-synthase used in the present invention is not particularly limited as long as the cysteine derivative (II) can be produced from the thiol compound (I) and L-serine. It may be a natural product, chemically or biochemically synthesized, or may be produced by genetic engineering. Preferably, it is derived from a cystathionine β-synthase producing microorganism. The cystathionine β-synthase-producing microorganism is not particularly limited as long as it can accumulate cystathionine β-synthase in cells. Specific examples include yeast, filamentous fungi, basidiomycetes and the like, and yeast is preferred. Yeast refers to a unicellular fungus, and examples include spore yeast, basidiomycetous yeast, and incomplete yeast. Among these, for example, spore yeast such as Saccharomyces genus, Candida genus, Picha genus, Hansenula genus, Zygosaccharomyces genus is preferable, Saccharomyces genus and Candida genus are more preferable, and Saccharomyces genus is most preferable. Saccharomyces yeasts include laboratory yeast, sake yeast, shochu yeast, wine yeast, beer yeast, baker's yeast, and the like. More preferred are Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis, and most preferred is Saccharomyces cerevisiae. These strains are commercially available or can be obtained and prepared based on known literature. For example, the American Type Culture Collection (address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 PO Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America) has a registration number corresponding to each strain. Can be sold (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection. Specific examples of Saccharomyces cerevisiae include BY4742 strain (ATCC204508) and S288C strain (ATCC26108). Moreover, as Candida utilis, specifically, Candida utilis ATCC22023 strain can be used. Particularly preferred is Saccharomyces cerevisiae.
シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物は、野生株であってもよいし、システイン誘導体（ＩＩ）の合成に関与する酵素に変異を有するよう改変されたもの、即ち変異株であってもよい。
シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物における、システイン誘導体（ＩＩ）の合成に関与する酵素としては、後述の実施例で本発明者らが明らかにしているように、正に制御する酵素としてシスタチオニンβ−シンターゼが、負に制御する酵素としてシスタチオニンγ−リアーゼが挙げられる。シスタチオニンγ−リアーゼは、シスタチオニンをシステインとα−ケト酪酸に分解するような反応を触媒する酵素をいい、ＥＣ４．４．１．１に分類される。その構造遺伝子は例えばSaccharomyces cerevisiaeではＣＹＳ３遺伝子（GenBank NM_001178157）として知られている。
ここで、「変異株」とは、野生株もしくは改変前の株（親株）と比較して、該酵素活性が増強されている、あるいは低減されている（活性の完全な消失も含む）株のことを意味する。本発明において好適に用いられる変異株としては、Saccharomyces cerevisiae変異株が挙げられ、特に、シスタチオニンβ−シンターゼをコードする遺伝子を高発現する「ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株」やシスタチオニンγ−リアーゼをコードする遺伝子の発現が抑制された「ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株」が挙げられる。野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、「ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株」では、ＣＹＳ４遺伝子の発現が有意に増強されており、具体的には、１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、特に好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上増強されている。野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、「ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株」では、ＣＹＳ３遺伝子の発現が有意に低減されており、具体的には５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低減されている。また、シスタチオニンγ−リアーゼ遺伝子の発現が実質的に消失している（即ち、検出限界未満である）のが好ましい。これらの変異株は天然に存在する（自然変異）ものであってもよいし、人為的に作出されたものであってもよい。人為的に作出する方法としては、セルフクローニングによる方法、従来育種法（例えば薬剤変異、交雑）等が挙げられる。後述の「酵素活性が低減されるような改変」あるいは「酵素活性を増強させるような改変」の為の各手法であってもよい。The cystathionine β-synthase-producing microorganism may be a wild strain or a strain that has been modified to have a mutation in an enzyme involved in the synthesis of cysteine derivative (II), that is, a mutant strain.
As an enzyme involved in the synthesis of cysteine derivative (II) in a cystathionine β-synthase-producing microorganism, cystathionine β-synthase is an enzyme that is positively controlled, as has been clarified by the inventors in the examples described later. However, cystathionine γ-lyase can be mentioned as an enzyme that is negatively regulated. Cystathionine γ-lyase refers to an enzyme that catalyzes a reaction that decomposes cystathionine into cysteine and α-ketobutyric acid, and is classified as EC 4.4.1.1. The structural gene is known as, for example, CYS3 gene (GenBank NM_001178157) in Saccharomyces cerevisiae.
Here, the “mutant strain” refers to a strain in which the enzyme activity is enhanced or reduced (including complete loss of activity) as compared to a wild strain or a strain before modification (parent strain). Means that. Examples of the mutant strain preferably used in the present invention include a Saccharomyces cerevisiae mutant strain, and particularly, a “CYS4 high expression mutant strain” that highly expresses a gene encoding cystathionine β-synthase and a cystathionine γ-lyase. Examples include “CYS3 gene low expression mutant” in which gene expression is suppressed. When compared with the wild type strain (Saccharomyces cerevisiae BY4742), the expression of the CYS4 gene is significantly enhanced in the “CYS4 gene high expression mutant”, specifically 1.5 times or more, more preferably 2 times. More preferably, it is 3 times or more, particularly preferably 5 times or more, and most preferably 10 times or more. When compared with the wild type strain (Saccharomyces cerevisiae BY4742), the expression of the CYS3 gene is significantly reduced in the “CYS3 gene low expression mutant”, specifically 50% or less, more preferably 30% or less, and further It is preferably reduced to 20% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably 5% or less. Moreover, it is preferable that the expression of the cystathionine γ-lyase gene is substantially lost (that is, less than the detection limit). These mutant strains may exist naturally (natural mutation) or may be artificially created. Examples of methods for artificial production include self-cloning methods, conventional breeding methods (for example, drug mutation, hybridization), and the like. Each method for “modification that reduces enzyme activity” or “modification that enhances enzyme activity” described later may be used.
「酵素活性が低減されている」とは、目的の酵素活性（本発明ではシスタチオニンγ−リアーゼ活性）が野生株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、シスタチオニンγ−リアーゼ活性は、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下に低減されている。また、シスタチオニンγ−リアーゼ活性は実質的に消失しているのが好ましい。 “Enzyme activity is reduced” means that the target enzyme activity (in the present invention, cystathionine γ-lyase activity) is reduced as compared to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain. Including the case where is completely disappeared. When compared with the wild type strain (Saccharomyces cerevisiae BY4742), the cystathionine γ-lyase activity is preferably 50% or less, more preferably 30% or less, even more preferably 20% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably 5%. % Or less. Further, it is preferable that the cystathionine γ-lyase activity substantially disappears.
酵素活性が低減されるような改変は、例えば、突然変異処理又は遺伝子組換え技術により実施することができる。 Modifications that reduce enzyme activity can be performed, for example, by mutation treatment or genetic recombination techniques.
突然変異処理としては、紫外線照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異処理に通常用いられている変異剤による処理が挙げられる。 Mutation treatment is usually performed by ultraviolet irradiation or mutation treatment of N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), methylmethanesulfonate (MMS), etc. Treatment with the mutagen used is included.
遺伝子組換え技術としては、例えば、公知の技術（FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340、 JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177、Curr Genet 1986; 10(8): 573-578、WO 98/14600等）を利用できる。 Examples of gene recombination techniques include known techniques (FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177, Curr Genet 1986; 10 (8): 573-578, WO 98/14600 etc.) can be used.
また、酵素活性が低減される（酵素活性の完全な消失を含む）ような改変は、例えば、該酵素をコードする遺伝子を破壊することにより実施することができる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる。また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。 Modifications that reduce enzyme activity (including complete loss of enzyme activity) can be performed, for example, by disrupting a gene encoding the enzyme. Gene disruption can be achieved, for example, by deleting part or all of the coding region of the gene encoding the target enzyme on the chromosome. Furthermore, the entire gene including the sequences before and after the gene on the chromosome may be deleted. In addition, gene disruption can be performed, for example, by introducing an amino acid substitution (missense mutation) into a coding region of a gene encoding a target enzyme on a chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or 1-2 bases. It can also be achieved by introducing a frame shift mutation that adds or deletes. In addition, gene disruption can be achieved, for example, by inserting another sequence into the coding region of the gene encoding the target enzyme on the chromosome.
「酵素活性が増強されている」とは、目的の酵素活性（本発明ではシスタチオニンβ−シンターゼ活性）が野生株や親株等の非改変株と比較して増強されていることを意味する。シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）と比較した場合、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、特に好ましくは５倍以上、最も好ましくは１０倍以上に増強されている。 “Enzyme activity is enhanced” means that the target enzyme activity (cystathionine β-synthase activity in the present invention) is enhanced as compared with a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain. When compared to the wild type strain (Saccharomyces cerevisiae BY4742), cystathionine β-synthase activity is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, still more preferably 3 times or more, particularly preferably 5 times or more, most preferably. Is enhanced more than 10 times.
酵素活性を増強させるような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより達成できる。遺伝子の発現の増大は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。また、遺伝子の発現の増大は、例えば、染色体上に目的の遺伝子を導入する等して遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させてもよい。さらに遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。また、酵素活性が増強されるような改変は、例えば、目的の酵素の比活性を増大させることによっても達成できる。また、「酵素活性が増強されている」とは、もともと目的の酵素活性を有する微生物において目的の酵素活性を増強させるだけでなく、もともと目的の酵素活性を有さない菌株において目的の酵素活性を付与するよう該酵素をコードする遺伝子を新たに導入し、当該酵素を発現するようになる場合を含む。 Modifications that enhance the enzyme activity can be achieved, for example, by increasing the expression of a gene encoding the target enzyme. Increased gene expression can be achieved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a stronger promoter. In addition, increase in gene expression can be achieved by increasing the copy number of the gene, for example, by introducing the gene of interest onto the chromosome. Alternatively, a gene may be incorporated into a transposon and transferred to introduce multiple copies of the gene into the chromosome. Furthermore, the increase in the copy number of the gene can also be achieved by introducing a vector containing the target gene into the host. Moreover, the modification that enhances the enzyme activity can be achieved, for example, by increasing the specific activity of the target enzyme. “Enzyme activity is enhanced” means that not only the target enzyme activity is enhanced in a microorganism originally having the target enzyme activity but also the target enzyme activity in a strain not originally having the target enzyme activity. This includes a case where a gene encoding the enzyme is newly introduced so as to be given and the enzyme is expressed.
目的遺伝子を宿主に導入する場合、宿主は目的遺伝子が由来する菌株と同種であっても異種であってもよい。 When the target gene is introduced into the host, the host may be the same or different from the strain from which the target gene is derived.
目的の酵素活性が増強された、あるいは低減されたことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことができる。シスタチオニンβ−シンターゼの活性を測定する方法としては、例えばKrausらの方法（Jan P. Kraus, Methods in ENZYMOLOGY 143 (1987) 388-394）及びそれに準じた方法が挙げられる。より具体的には、シスタチオニンβ−シンターゼの活性は、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ９）中、基質（３ｍＭホモシステイン、３ｍＭセリン、１００μＭピリドキサールリン酸）と４５℃で１時間反応させる方法によって測定することができる。本発明及び本明細書では該反応により１分間に１μｍｏｌのシスタチオニンを生成するのに必要な酵素量を１Ｕと定義する。シスタチオニンγ−リアーゼの活性を測定する方法としては、例えばYamagataらの方法（Journal of Bacteriology,Aug.1993,p.4800-4808）及びそれに準じた方法が挙げられる。より具体的には、シスタチオニンγ−リアーゼの活性は、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．４）中、基質［３ｍＭシステイン（シスタチオニンを基質とすると、β−リアーゼが共存している場合、その活性が測定値に影響を与える場合があるのでシステインを基質とする）、１００μＭピリドキサールリン酸］と３０℃で１時間反応させる方法によって測定することができる。本発明及び本明細書では該反応により１分間に１μｍｏｌのピルビン酸を生成するのに必要な酵素量を１Ｕと定義する。 Confirmation that the target enzyme activity is enhanced or reduced can be performed by measuring the activity of the enzyme. Examples of the method for measuring the activity of cystathionine β-synthase include the method of Kraus et al. (Jan P. Kraus, Methods in ENZYMOLOGY 143 (1987) 388-394) and the similar methods. More specifically, the activity of cystathionine β-synthase is obtained by reacting with a substrate (3 mM homocysteine, 3 mM serine, 100 μM pyridoxal phosphate) for 1 hour at 45 ° C. in a buffer solution (50 mM potassium phosphate buffer, pH 9). Can be measured. In the present invention and the present specification, the amount of enzyme required to produce 1 μmol of cystathionine per minute by the reaction is defined as 1 U. Examples of the method for measuring the activity of cystathionine γ-lyase include the method of Yamagata et al. (Journal of Bacteriology, Aug. 1993, p.4800-4808) and a method analogous thereto. More specifically, the activity of cystathionine γ-lyase is determined in the presence of a substrate [3 mM cysteine (when β-lyase coexists when cystathionine is used as a substrate in a buffer solution (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4), Since its activity may affect the measured value, it can be measured by a method of reacting with 100 μM pyridoxal phosphate] at 30 ° C. for 1 hour. In the present invention and the present specification, the amount of enzyme required to produce 1 μmol of pyruvic acid per minute by the reaction is defined as 1 U.
目的の酵素活性が増強された、あるいは低減されたことの確認は、目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増加あるいは減少したことを確認することや、目的の酵素の量が増加あるいは減少したことを確認することにより行うことが出来る。 Confirming that the target enzyme activity has been enhanced or decreased is to confirm that the amount of transcription of the gene encoding the target enzyme has increased or decreased, and that the amount of target enzyme has been increased or decreased. This can be done by confirming this.
目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増加あるいは減少したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。該転写量が減少している場合には、mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に減少していることが好ましい。該転写量が増加している場合には、mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、または１０倍以上に増加していることが好ましい。 Confirmation that the transcription amount of the gene encoding the target enzyme has increased or decreased can be confirmed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with that of the unmodified strain. Examples of methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR and the like (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). When the amount of transcription is decreased, the amount of mRNA is, for example, 50% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain. It is preferable that the number is decreased. When the transcription amount is increased, the amount of mRNA is, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, 3 times or more, 5 times or more, or 10 times or more compared to the unmodified strain. It is preferable to increase.
目的の酵素の量が増加あるいは減少したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量が減少している場合には、その量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に減少していることが好ましい。目的の酵素の量が増加している場合には、その量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、または１０倍以上に増加していることが好ましい。 Confirmation that the amount of the target enzyme has increased or decreased can be confirmed by Western blotting using an antibody (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). When the amount of the target enzyme is decreased, the amount is, for example, 50% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0 compared to the unmodified strain. It is preferable to reduce to%. When the amount of the target enzyme is increased, the amount is, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, 3 times or more, 5 times or more, or 10 times or more compared to the unmodified strain. It is preferable that the number is increased.
尚、シスタチオニンβ−シンターゼの酵素反応の生成物であるシスタチオニンはシスタチオニンγ−リアーゼにより分解される為、シスタチオニンγ−リアーゼ共存下では、上記測定法によるシスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子の発現量における変動の程度と上記測定法によるシスタチオニンβ−シンターゼ活性における変動の程度とは必ずしも一致しない。シスタチオニンγ−リアーゼ共存下では、シスタチオニンβ−シンターゼ活性はシスタチオニンγ−リアーゼが存在しない場合に比べて低い値となる。シスタチオニンγ−リアーゼ共存下でシスタチオニンβ−シンターゼ活性を測定する場合には予めシスタチオニンγ−リアーゼ活性によるシスタチオニンの消費量を算出し補正しておくことが好ましい。 Since cystathionine, which is a product of the enzyme reaction of cystathionine β-synthase, is degraded by cystathionine γ-lyase, the degree of variation in the expression level of cystathionine β-synthase gene by the above measurement method in the presence of cystathionine γ-lyase And the degree of variation in cystathionine β-synthase activity by the above measurement method do not necessarily coincide. In the presence of cystathionine γ-lyase, the cystathionine β-synthase activity is lower than that in the absence of cystathionine γ-lyase. When measuring cystathionine β-synthase activity in the presence of cystathionine γ-lyase, it is preferable to calculate and correct the amount of cystathionine consumed by cystathionine γ-lyase activity in advance.
本発明において好ましく用いられるシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物としては、（Ａ）シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強されている変異株、（Ｂ）シスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株、あるいは（Ｃ）シスタチオニンβ−シンターゼ活性が増強され且つシスタチオニンγ−リアーゼ活性が低減されている変異株であり、より好ましくは（Ｄ）ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株、（Ｅ）ＣＹＳ３遺伝子低発現変異株、あるいは（Ｆ）ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現変異株酵母である。
変異株（Ｅ）の好ましい一実施態様としては、ＣＹＳ３遺伝子破壊変異株（Ｅ’）が挙げられる。変異株（Ｆ）の好ましい一実施態様としては、ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子破壊変異株（Ｆ’）が挙げられる。The cystathionine β-synthase producing microorganism preferably used in the present invention includes (A) a mutant strain in which cystathionine β-synthase activity is enhanced, (B) a mutant strain in which cystathionine γ-lyase activity is reduced, or ( C) a mutant strain in which cystathionine β-synthase activity is enhanced and cystathionine γ-lyase activity is reduced, more preferably (D) a CYS4 gene high expression mutant strain, (E) a CYS3 gene low expression mutant strain, or (F) CYS4 gene high expression and CYS3 gene low expression mutant yeast.
A preferred embodiment of the mutant strain (E) includes a CYS3 gene disruption mutant strain (E ′). As a preferred embodiment of the mutant strain (F), a CYS4 gene high expression and CYS3 gene disruption mutant strain (F ′) can be mentioned.
本発明で用いるシスタチオニンβ−シンターゼは、これを産生する微生物（例えば、シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母、当該酵母のＣＹＳ４遺伝子高発現及び／又はＣＹＳ３遺伝子破壊変異株）を培養して得られる微生物の培養物から調製することができる。例えば、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物の培養方法を以下に示す。 The cystathionine β-synthase used in the present invention is a microorganism obtained by culturing a microorganism producing the same (for example, yeast having cystathionine β-synthase activity, CYS4 gene high expression and / or CYS3 gene disruption mutant strain of the yeast). From the culture. For example, a method for culturing a cystathionine β-synthase-producing microorganism is shown below.
シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物を培養するための培地としては、使用するシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物の種類によって適宜選択される。炭素源、窒素源、無機物および必要に応じて少量の微量栄養素を含むものであれば、合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用する炭素源および窒素源は使用する微生物の利用可能なものならばいずれの種類を用いてもよい。炭素源としては、グルコ−ス、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜など種々の炭水化物が使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、または肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物などの天然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源の多くの場合は窒素源であるとともに炭素源にもなり得る。無機物としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄などが必要に応じて使用できる。例えば、実施例に記載したＹＰＤ培地を好適に利用することができる。 The medium for culturing the cystathionine β-synthase producing microorganism is appropriately selected depending on the type of the cystathionine β-synthase producing microorganism to be used. Either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and if necessary, a small amount of micronutrients. Any kind of carbon source and nitrogen source may be used as long as the microorganism used can be used. As the carbon source, various carbohydrates such as glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, starch, starch hydrolyzate and molasses can be used. Nitrogen sources include various inorganic and organic ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, and ammonium acetate, or meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fishmeal or its Natural organic nitrogen sources such as digests, defatted soybean meal or digests thereof can be used. Many natural organic nitrogen sources are both nitrogen sources and carbon sources. As the inorganic substance, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, potassium chloride, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate and the like can be used as necessary. For example, the YPD medium described in the examples can be suitably used.
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌深部培養などの好気的条件下で行う。培養温度は好ましくは２０〜５０℃、特に好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培養中の培地のｐＨは微生物の生育に応じて適宜調整すればよく、例えばｐＨ５〜７が挙げられる。培養時間は通常１２時間〜１０日間、より好ましくは２４時間〜５日間、さらに好ましくは３６時間〜３日間である。 The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration-agitation deep culture. The culture temperature is preferably 20 to 50 ° C, particularly preferably 28 to 37 ° C. What is necessary is just to adjust pH of the culture medium during culture | cultivation suitably according to the growth of microorganisms, for example, pH 5-7 is mentioned. The culture time is usually 12 hours to 10 days, more preferably 24 hours to 5 days, and further preferably 36 hours to 3 days.
前記のようにして得られる微生物等を含む培養物からシスタチオニンβ−シンターゼを回収する。本発明で使用されるシスタチオニンβ−シンターゼはその酵素活性が維持されている限り必ずしも単離精製されている必要はない。すなわち、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）をそのまま、あるいは該微生物の培養物、該培養物から遠心分離などの方法によって採取した生菌体、その乾燥菌体を本発明の方法に用いることができる。あるいはシスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）の生菌体あるいはその乾燥菌体を破砕、自己消化、超音波などで処理することによって得られる抽出物（菌体処理物とも称する）を本発明の方法に用いることができる。さらに該菌体処理物から得られるシスタチオニンβ−シンターゼを含む粗精製物を本発明の方法に用いることができる。また、これらの固定化酵素または固定化菌体を本発明の製造方法に用いることもできる。 Cystathionine β-synthase is recovered from the culture containing the microorganisms obtained as described above. The cystathionine β-synthase used in the present invention does not necessarily have to be isolated and purified as long as the enzyme activity is maintained. That is, a cystathionine β-synthase-producing microorganism (preferably a yeast having cystathionine β-synthase activity) as it is, or a culture of the microorganism, a living cell collected from the culture by a method such as centrifugation, and its dried bacterium The body can be used in the method of the present invention. Alternatively, an extract (bacteria) obtained by crushing, self-digesting, sonicating, or the like, living cells of cystathionine β-synthase-producing microorganisms (preferably yeast having cystathionine β-synthase activity) or dried cells thereof. Can be used in the method of the present invention. Furthermore, a crudely purified product containing cystathionine β-synthase obtained from the treated bacterial cell can be used in the method of the present invention. Moreover, these immobilized enzymes or immobilized cells can also be used in the production method of the present invention.
本発明の方法において、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）の抽出物および／または培養物をシスタチオニンβ−シンターゼとして用いる場合、該抽出物および／または培養物の酵素活性は、１ｇあたり、通常２５００Ｕ以上であり、好ましくは５０００Ｕ以上、１００００Ｕ以上、２００００Ｕ以上、３００００Ｕ以上、又は４００００Ｕ以上である。酵素活性が低すぎると十分な酵素反応が得られない。一方、操作性やコストの観点から、該抽出物および／または培養物の酵素活性は、１ｇあたり、通常１×１０６Ｕ以下、好ましくは５×１０５Ｕ以下、１×１０５Ｕ以下、又は５×１０４Ｕ以下である。
本発明の方法において、シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物（好ましくはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有する酵母）の抽出物および／または培養物をシスタチオニンβ−シンターゼとして用いる場合、該抽出物および／または培養物はシスタチオニンγ−リアーゼ活性が低いものであることが好ましい。従って、該抽出物および／または培養物のシスタチオニンγ−リアーゼ活性は、通常１ｇあたり１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、１０Ｕ以下、１Ｕ以下、又は実質的に含まないかあるいは０Ｕである。In the method of the present invention, when an extract and / or culture of a cystathionine β-synthase producing microorganism (preferably a yeast having cystathionine β-synthase activity) is used as the cystathionine β-synthase, the extract and / or culture The enzyme activity is usually 2500 U or more per gram, preferably 5000 U or more, 10000 U or more, 20000 U or more, 30000 U or more, or 40000 U or more. If the enzyme activity is too low, a sufficient enzyme reaction cannot be obtained. On the other hand, from the viewpoint of operability and cost, the enzyme activity of the extract and / or culture is usually 1 × 10 6 U or less per gram, preferably 5 × 10 5 U or less, preferably 1 × 10 5 U or less, Or it is 5 × 10 4 U or less.
In the method of the present invention, when an extract and / or culture of a cystathionine β-synthase producing microorganism (preferably a yeast having cystathionine β-synthase activity) is used as the cystathionine β-synthase, the extract and / or culture Preferably have low cystathionine γ-lyase activity. Accordingly, the cystathionine γ-lyase activity of the extract and / or culture is usually 100 U or less, 50 U or less, 10 U or less, 1 U or less, or substantially 0 U per gram.
チオール化合物（Ｉ）とＬ−セリンとを前記のシスタチオニンβ−シンターゼの存在下で反応させることにより、システイン誘導体（ＩＩ）を製造することができる。原料である、Ｌ−セリン及びチオール化合物（Ｉ）はいずれも市販されており容易に入手可能である。 The cysteine derivative (II) can be produced by reacting the thiol compound (I) with L-serine in the presence of the cystathionine β-synthase. The raw materials, L-serine and thiol compound (I), are both commercially available and can be easily obtained.
チオール化合物（Ｉ）とＬ−セリンとの反応は、通常、水性溶媒中で行われる。水性溶媒としては、酵素反応を阻害しない限り特に限定されないが、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。 Reaction of thiol compound (I) and L-serine is normally performed in an aqueous solvent. The aqueous solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme reaction, but physiological saline, potassium phosphate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, glycine-sodium hydroxide buffer, boric acid-sodium hydroxide buffer, etc. Can be mentioned.
反応液中のＬ−セリンの濃度は特に限定されないが、好ましくは１〜２０重量％、特に好ましくは１〜１０重量％である。 The concentration of L-serine in the reaction solution is not particularly limited, but is preferably 1 to 20% by weight, particularly preferably 1 to 10% by weight.
反応液中のチオール化合物（Ｉ）の濃度は、用いる化合物の種類によっても異なり、酵素反応を阻害しない範囲であれば特に制限されないが、好ましくは１０重量％以下の濃度で使用される。なお、反応中に酵素反応を阻害しない濃度範囲になるように、チオール化合物（Ｉ）を逐次添加してもよい。また、反応に際して、基質の他に補酵素であるピリドキサールリン酸を０．１〜１００ｐｐｍの範囲で添加することが好ましい。 The concentration of the thiol compound (I) in the reaction solution varies depending on the type of the compound used, and is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme reaction. In addition, you may add thiol compound (I) sequentially so that it may become the density | concentration range which does not inhibit an enzyme reaction during reaction. In the reaction, it is preferable to add pyridoxal phosphate, which is a coenzyme, in the range of 0.1 to 100 ppm in addition to the substrate.
反応に用いるシスタチオニンβ−シンターゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜調整し得るが、好ましくは反応液１ｇ当たり０．１Ｕ〜１０００Ｕ、好ましくは１Ｕ〜５００Ｕ、より好ましくは１０Ｕ〜２５０Ｕの範囲で添加する。 The amount of cystathionine β-synthase used in the reaction can be appropriately adjusted depending on the substrate concentration, reaction time, and other conditions, but is preferably 0.1 U to 1000 U, preferably 1 U to 500 U, more preferably 10 U to 1 g per 1 g of the reaction solution. Add in the range of 250U.
反応はｐＨ７〜９．５、好ましくはｐＨ８〜９の範囲で実施される。反応温度は通常、４℃〜６０℃で実施されるが、酵素の安定性と反応速度の点で、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは３５℃〜５０℃で実施される。反応時間は所望のシステイン誘導体（ＩＩ）の合成量に応じて適宜設定されるが、通常、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、特に好ましくは１〜５時間、最も好ましくは１〜３時間である。 The reaction is carried out in the range of pH 7 to 9.5, preferably pH 8 to 9. The reaction temperature is usually 4 to 60 ° C., preferably 20 to 55 ° C., more preferably 35 to 50 ° C. in terms of enzyme stability and reaction rate. The reaction time is appropriately set according to the synthesis amount of the desired cysteine derivative (II), but is usually 0.5 to 24 hours, preferably 1 to 10 hours, particularly preferably 1 to 5 hours, and most preferably 1 ~ 3 hours.
前記の反応で得られる反応液からシステイン誘導体（ＩＩ）を分離し、回収する方法は、公知のあらゆる方法が使用可能である。一例をあげればトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、限外濾過濃縮法、硫安沈殿法（塩析）、有機溶媒（例、アセトン、エタノール、プロパノール、メタノール等）沈殿法、水溶性ポリマー（例、ポリエチレングリコール、デキストラン等）沈殿法、酸性沈殿法、等電点沈殿法等が挙げられる。 Any known method can be used to separate and recover the cysteine derivative (II) from the reaction solution obtained by the above reaction. For example, trichloroacetic acid (TCA) precipitation method, ultrafiltration concentration method, ammonium sulfate precipitation method (salting out), organic solvent (eg, acetone, ethanol, propanol, methanol, etc.) precipitation method, water-soluble polymer (eg, polyethylene) Glycol, dextran, etc.) precipitation method, acidic precipitation method, isoelectric point precipitation method and the like.
システイン誘導体（ＩＩ）を分離、回収することなく、該システイン誘導体（ＩＩ）と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させることによってシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）を製造することもできる。 Cysteine sulfoxide derivative (III) can also be produced by reacting cysteine derivative (II) with oxidase and its substrate without separating and recovering cysteine derivative (II).
２．システインスルホキシド誘導体の製造方法
本発明は、式（ＩＩＩ） 2. Process for producing cysteine sulfoxide derivative The present invention relates to a compound of formula (III)
（式中、ＲはＣ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す）
で表されるシステインスルホキシド誘導体（以下、単にシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）とも称する）を酵素的に製造する方法を提供する。
当該方法は、システイン誘導体（ＩＩ）と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させることを特徴とする。オキシダーゼとその基質とが反応することにより産生される過酸化水素によりシステイン誘導体（ＩＩ）がシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）に変換される。
本発明において、Ｒとして好ましくは、１−プロペニル基、プロピル基、メチル基及びアリル基である。(In the formula, R represents a C 1-6 alkyl group or a C 2-6 alkenyl group)
A method for enzymatically producing a cysteine sulfoxide derivative represented by the formula (hereinafter also simply referred to as cysteine sulfoxide derivative (III)) is provided.
This method is characterized in that cysteine derivative (II) is reacted with oxidase and its substrate. Cysteine derivative (II) is converted to cysteine sulfoxide derivative (III) by hydrogen peroxide produced by the reaction of oxidase and its substrate.
In the present invention, R is preferably a 1-propenyl group, a propyl group, a methyl group or an allyl group.
当該方法において使用するオキシダーゼは基質と反応することにより過酸化水素を産生するものであれば特に限定されない。具体的には、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ等が挙げられる。これらの酵素の少なくとも1種が使用される。好ましくはグルコースオキシダーゼである。 The oxidase used in the method is not particularly limited as long as it produces hydrogen peroxide by reacting with a substrate. Specific examples include glucose oxidase, galactose oxidase, uricase, cholesterol oxidase, choline oxidase, and acyl CoA oxidase. At least one of these enzymes is used. Glucose oxidase is preferable.
グルコースオキシダーゼは、二量体のタンパク質でＥＣ１．１．３．４に分類される。グルコースオキシダーゼは、グルコースを基質として、酸素存在下、グルコノラクトン（グルコノラクトンは、非酵素的にグルコン酸へと加水分解される）と過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。本発明で用いられるグルコースオキシダーゼは、上記酵素作用を有するものであればその由来は特に限定されない。天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、また、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。本発明では、商業的に入手可能なものが好適に利用できる。例えば、「スミチームＰＧＯ」という商品名で新日本化学工業（株）より市販されている微生物由来のグルコースオキシダーゼが挙げられる。
グルコースオキシダーゼの活性は、生成した過酸化水素にアミノアンチピリン及びフェノール存在下でペルオキシダーゼを作用させることでキノンイミン色素を生成させる反応を用いて測定することができる。生成したキノンイミン色素の量を検量線より求め酵素活性を算出する。本発明及び本明細書では１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化するのに必要な酵素量を１Ｕと定義する。Glucose oxidase is a dimeric protein and is classified as EC 1.1.3.4. Glucose oxidase is an enzyme that catalyzes a reaction that produces gluconolactone (gluconolactone is non-enzymatically hydrolyzed to gluconic acid) and hydrogen peroxide in the presence of oxygen using glucose as a substrate. The origin of the glucose oxidase used in the present invention is not particularly limited as long as it has the enzyme action described above. It may be a natural product, chemically or biochemically synthesized, or may be produced by genetic engineering. In the present invention, commercially available products can be suitably used. For example, a microorganism-derived glucose oxidase commercially available from Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd. under the trade name “Sumiteam PGO” can be mentioned.
The activity of glucose oxidase can be measured using a reaction that produces a quinoneimine dye by allowing peroxidase to act on the produced hydrogen peroxide in the presence of aminoantipyrine and phenol. The amount of the produced quinoneimine dye is obtained from a calibration curve, and the enzyme activity is calculated. In the present invention and the present specification, the amount of enzyme required to oxidize 1 μmol of glucose per minute is defined as 1 U.
ガラクトースオキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．９に分類され、Ｄ−ガラクトースを基質として酸素存在下、Ｄ−ガラクト−ヘキソジアルドースと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。 Galactose oxidase is classified into EC 1.1.3.9, and is an enzyme that catalyzes a reaction of producing D-galacto-hexodialdose and hydrogen peroxide in the presence of oxygen using D-galactose as a substrate.
ウリカーゼは、ＥＣ１．７．３．３に分類され、尿酸を基質として酸素存在下、アラントインと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。 Uricase is classified as EC 1.7.3.3 and is an enzyme that catalyzes the reaction of producing allantoin and hydrogen peroxide in the presence of oxygen using uric acid as a substrate.
コレステロールオキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．６に分類され、３β−ヒドロキシステロイドを基質として酸素存在下、３−オキソステロイドと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。 Cholesterol oxidase is classified as EC 1.1.3.6, and is an enzyme that catalyzes a reaction that generates 3-oxosteroid and hydrogen peroxide in the presence of oxygen using 3β-hydroxysteroid as a substrate.
コリンオキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．１７に分類される酵素である。コリンオキシダーゼは、コリンを基質として酸素存在下、ベタインアルデヒドと過酸化水素を生成する反応（第一反応）と、ベタインアルデヒドを基質として酸素存在下、ベタインと過酸化水素を生成する反応（第二反応）とを触媒する酵素である。 Choline oxidase is an enzyme classified as EC 1.1.3.17. Choline oxidase is a reaction that produces betaine aldehyde and hydrogen peroxide in the presence of oxygen using choline as a substrate (first reaction), and a reaction that produces betaine and hydrogen peroxide in the presence of oxygen using betaine aldehyde as a substrate (second reaction). Reaction).
アシルＣｏＡオキシダーゼは、ＥＣ１．３．３．６に分類され、アシルＣｏＡを基質として酸素存在下、トランス−２、３−デヒドロアシルＣｏＡと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。 Acyl CoA oxidase is classified into EC 1.3.3.6, and is an enzyme that catalyzes a reaction of producing trans-2,3-dehydroacyl CoA and hydrogen peroxide in the presence of oxygen using acyl CoA as a substrate.
本発明で用いられるガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼは、上記酵素作用を有するものであればその由来は特に限定されない。天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、また、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。本発明では、商業的に入手可能なものが好適に利用できる。 The origin of the galactose oxidase, uricase, cholesterol oxidase, choline oxidase, and acyl CoA oxidase used in the present invention is not particularly limited as long as they have the above enzyme action. It may be a natural product, chemically or biochemically synthesized, or may be produced by genetic engineering. In the present invention, commercially available products can be suitably used.
原料である、システイン誘導体（ＩＩ）は、いかなる方法によって調製されたものであってもよいが、好ましくは、上記１．のシステイン誘導体の製造方法により調製された化合物である。 The cysteine derivative (II), which is a raw material, may be prepared by any method. It is a compound prepared by the manufacturing method of a cysteine derivative.
以下、オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである場合を例に詳述する。
システイン誘導体（ＩＩ）と基質であるグルコースとの反応は、通常、水性溶媒中、酸素の存在下で実施される。好ましくは反応容器中に空気を流通させて実施される。水性溶媒としては、酵素反応を阻害しない限り特に限定されないが、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。Hereinafter, the case where the oxidase is glucose oxidase will be described in detail.
The reaction between the cysteine derivative (II) and glucose as a substrate is usually carried out in an aqueous solvent in the presence of oxygen. Preferably, it is carried out by circulating air in the reaction vessel. The aqueous solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme reaction, but physiological saline, potassium phosphate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, glycine-sodium hydroxide buffer, boric acid-sodium hydroxide buffer, etc. Can be mentioned.
反応液中のグルコースの濃度は特に限定されないが、通常、０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。所望によりグルコースを反応の途中で追加することもでき、また、追加することが好ましい。 The concentration of glucose in the reaction solution is not particularly limited, but is usually 0.1 to 10% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight. If desired, glucose can be added during the reaction, and is preferably added.
反応液中のシステイン誘導体（ＩＩ）の濃度は、用いる化合物の種類によって異なるが、酵素反応を阻害しない範囲であれば特に制限されない。通常、０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。 The concentration of the cysteine derivative (II) in the reaction solution varies depending on the type of compound used, but is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme reaction. Usually, it is 0.1 to 10% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight.
反応に用いるグルコースオキシダーゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜調整し得るが、好ましくは反応液１ｇ当たり０．００１Ｕ〜１００Ｕ、好ましくは０．０１Ｕ〜５０Ｕ、より好ましくは０．１Ｕ〜１０Ｕの範囲で添加する。 The amount of glucose oxidase used in the reaction can be appropriately adjusted depending on the substrate concentration, reaction time, and other conditions, but is preferably 0.001 U to 100 U, preferably 0.01 U to 50 U, more preferably 0.00 per gram of the reaction solution. Add in the range of 1U to 10U.
反応はｐＨ５〜７、好ましくは５．５〜６．５で実施される。反応は好ましくは４℃〜６０℃で行われるが、酵素の安定性と反応速度の点で、特に好ましくは、３０℃〜５０℃、より好ましくは３５〜４５℃で実施される。反応時間は所望のシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）の合成量に応じて適宜設定されるが、通常、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、さらに好ましくは１〜５時間である。 The reaction is carried out at a pH of 5-7, preferably 5.5-6.5. The reaction is preferably performed at 4 ° C to 60 ° C, but is preferably performed at 30 ° C to 50 ° C, more preferably 35 to 45 ° C in terms of enzyme stability and reaction rate. Although reaction time is suitably set according to the synthesis amount of desired cysteine sulfoxide derivative (III), it is 0.5 to 24 hours normally, Preferably it is 1 to 10 hours, More preferably, it is 1 to 5 hours.
前記の反応で得られる反応液からシステインスルホキシド誘導体（ＩＩＩ）を分離し、回収する方法は、公知の方法が使用可能である。一例をあげればトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、限外濾過濃縮法、硫安沈殿法（塩析）、有機溶媒（例、アセトン、エタノール、プロパノール、メタノール等）沈殿法、水溶性ポリマー（例、ポリエチレングリコール、デキストラン等）沈殿法、酸性沈殿法、等電点沈殿法等が挙げられる。 As a method for separating and recovering the cysteine sulfoxide derivative (III) from the reaction solution obtained by the above reaction, a known method can be used. For example, trichloroacetic acid (TCA) precipitation method, ultrafiltration concentration method, ammonium sulfate precipitation method (salting out), organic solvent (eg, acetone, ethanol, propanol, methanol, etc.) precipitation method, water-soluble polymer (eg, polyethylene) Glycol, dextran, etc.) precipitation method, acidic precipitation method, isoelectric point precipitation method and the like.
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these do not limit the scope of the present invention.
実施例１：Ｓ−アリルシステイン（ＡＬＣ）生成に関与する酵素の同定
表１に示す酵母の各酵素の遺伝子破壊株を用いてＳ−アリルシステイン生成量を測定し、チオール化合物及びＬ−セリンからのＳ−アリルシステインの生成に寄与する酵素を調べた。Example 1: Identification of enzymes involved in S-allyl cysteine (ALC) production The amount of S-allyl cysteine produced was measured using a gene disruption strain of each enzyme shown in Table 1, and from thiol compounds and L-serine. Enzymes contributing to the production of S-allylcysteine were investigated.
（１）菌株作成
野生株として実験室酵母であるSaccharomyces cerevisiae BY4742を用い、ＣＹＳ３遺伝子、ＣＹＳ４遺伝子、ＴＲＰ５遺伝子又はＭＥＴ１７遺伝子を欠失させた変異株（それぞれ、ΔＣＹＳ３、ΔＣＹＳ４、ΔＴＲＰ５、ΔＭＥＴ１７）を用いた。各変異株はThermo Scientific社製の市販品（Yeast Knockout Clones and Collections）を使用した。
（２）培養／反応
野生株（ＢＹ４７４２）及び各変異株（ΔＣＹＳ３、ΔＣＹＳ４、ΔＴＲＰ５、ΔＭＥＴ１７）をそれぞれ１白金耳ずつ、５ｍＬのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで７２時間振盪培養した。該培養液の全量を１００ｍＬのＹＰＤ培地（０．６％酵母エキス、０．５％ペプトン、３％グルコース）に移し、さらに３０℃、１２０ｒｐｍで４８時間振盪培養した。得られた培養液を１０分間遠心分離（４℃、９０００ｒｐｍ）して沈殿物を菌体として回収した。菌体を１ｍＬのプロテアーゼ阻害剤を含有する抽出用バッファー中でビーズ破砕（４６００ｒｐｍ、氷上）し、遠心分離した。
得られた上清を用いてＳ−アリルメルカプタンからのＡＬＣの生成量を測定した。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、基質としてはＳ−アリルメルカプタン及び硫安・ピルビン酸を用いた。生成したＡＬＣは１０％ＴＣＡで沈殿させ、ＬＣ／ＭＳにより定量した。
（３）結果
２時間反応後のＡＬＣ生成量の結果を図１に示す。ΔＣＹＳ４変異株ではＡＬＣが生成しなかった。ΔＣＹＳ３変異株でＡＬＣ生成量が有意に増加した。これらの結果よりＣＹＳ４遺伝子がＡＬＣ生成に関与する酵素をコードする遺伝子であると考えられた。さらに、ＣＹＳ３遺伝子がＡＬＣ分解に関与する酵素をコードする遺伝子であるか、あるいはＣＹＳ４発現へ負の影響を及ぼす可能性が考えられた。(1) Strain preparation Using a laboratory yeast Saccharomyces cerevisiae BY4742 as a wild strain, mutant strains lacking the CYS3 gene, CYS4 gene, TRP5 gene or MET17 gene (ΔCYS3, ΔCYS4, ΔTRP5, ΔMET17, respectively) are used. It was. Each mutant used a commercial product (Yeast Knockout Clones and Collections) manufactured by Thermo Scientific.
(2) Culture / reaction Wild strain (BY4742) and each mutant strain (ΔCYS3, ΔCYS4, ΔTRP5, ΔMET17) were each placed in one platinum loop in 5 mL of YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose). Inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. and 180 rpm for 72 hours. The whole amount of the culture solution was transferred to 100 mL of YPD medium (0.6% yeast extract, 0.5% peptone, 3% glucose), and further cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 48 hours. The obtained culture solution was centrifuged (4 ° C., 9000 rpm) for 10 minutes, and the precipitate was collected as cells. The cells were crushed with beads (4600 rpm on ice) in an extraction buffer containing 1 mL of protease inhibitor and centrifuged.
The amount of ALC produced from S-allyl mercaptan was measured using the obtained supernatant. A 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) was used as a reaction buffer, and S-allyl mercaptan and ammonium sulfate / pyruvic acid were used as substrates. The produced ALC was precipitated with 10% TCA and quantified by LC / MS.
(3) Results The results of the amount of ALC produced after the reaction for 2 hours are shown in FIG. No ALC was produced in the ΔCYS4 mutant. ALC production was significantly increased in the ΔCYS3 mutant. From these results, the CYS4 gene was considered to be a gene encoding an enzyme involved in ALC generation. Furthermore, it was considered that the CYS3 gene is a gene encoding an enzyme involved in ALC degradation, or that CYS4 expression may be negatively affected.
実施例２：精製シスタチオニンβ−シンターゼによるＳ−アリルシステイン生成
実施例１で、ＣＹＳ４遺伝子がＡＬＣ生成に関与する酵素をコードする遺伝子であると推定されたので、本実施例では、ＣＹＳ４遺伝子高発現変異株から得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼにより、Ｓ−アリルシステインが生成するか検証した。
１．精製シスタチオニンβ−シンターゼの調製
まず、以下に示す手法により、ＣＹＳ４を高発現するSaccharomyces cerevisiae株を作製した。
菌株作製法
遺伝子発現を増強する親株としてはSaccharomyces cerevisiae BY4742を用い、ＣＹＳ３遺伝子破壊株BY4742 cys3Δ含め、Thermo Scientific社製、Yeast Knockout Clones and Collectionsより入手した。ＣＹＳ４遺伝子増強にはインテグレーションタイププラスミドを導入することにより作製した。インテグレーションプラスミドの作成法は以下の方法にて行った。
ＣＹＳ４遺伝子を高発現させるためのインテグレーションタイププラスミドは、まず構成的高発現プロモーターであるＴＤＨ３遺伝子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)プロモーター（ＴＤＨ３ｐ）からＣＹＳ４遺伝子を発現するマルチコピープラスミドを作製し、そのプラスミドを鋳型として増幅したＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４断片をｐＵＣ１９プラスミド（インビトロジェン）にクローン化することにより作製した。プラスミド作製の過程でE.coliコンピテント細胞としてＤＨ５−αもしくはＪＭ１０９株（タカラバイオ）を用いた。
（マルチコピープラスミドの作製）
まず、SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号１で示されるプライマーおよびXbaI制限酵素認識配列を有する配列番号２で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC 204508)のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＴＤＨ３プロモーターを有するＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、変性(94℃, 10 sec)、アニーリング(60℃, 10 sec)、伸長(72℃, 4 min)、２５サイクルとした。次に、このＤＮＡ断片をｐＹＥＳ２のSmaI-XbaI部位にクローン化し、プラスミドｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐを得た（本実施例で使用した制限酵素は全てタカラバイオ社より入手した）。
続いて配列番号３で示されるプライマーおよび６コピーのヒスチジンをコードする塩基配列を付加した配列番号４で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC 204508)のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲし、遺伝子のＣ末端に６コピーのHis-tagを有するＣＹＳ４ ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、変性(94℃, 10 sec)、アニーリング(60℃, 10 sec)、伸長(72℃, 4 min)、２５サイクルとした。次に、このＤＮＡ断片を、制限酵素XbaIで消化し、線状にしたｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法(Clontech社、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit)によりプラスミドｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４＿６ｘＨｉｓを得た。
（インテグレーションタイププラスミドの作製）
SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号５で示されるプライマーおよびAatII制限酵素認識配列を有する配列番号６で示されるプライマーを用い、S288CのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲし、ＵＲＡ３ ＤＮＡ断片を得た。続いてｐＵＣ１９のSmaI-AatII部位にＵＲＡ３断片をクローン化し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３プラスミドを作製した。続いて、配列番号７で示されるプライマーおよび配列番号８で示されるプライマーでｐＹＥＳ２−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４＿６ｘＨｉｓプラスミドを鋳型とし、ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４＿６ｘＨｉｓ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３のSphI-EcoRI部位にｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法により導入し、インテグレーションタイププラスミド、ｐＵＣ１９−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４−ＵＲＡ３を作製した。
（ＣＹＳ４遺伝子高発現プラスミドを有する株（ＣＹＳ４遺伝子高発現株）の作製）
ＣＹＳ４遺伝子高発現用インテグレーションタイププラスミドｐＵＣ１９−ＴＤＨ３ｐ−ＣＹＳ４−ＵＲＡ３をBglIIで消化することにより線状化し、ウラシル要求性株であるBY4742あるいはＢY4742 cys3Δを形質転換することによりＣＹＳ４遺伝子高発現株を作製した。形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research社）を使用して行い、ウラシルを含まない平板培地上で菌体を生育させることによりインテグレーションプラスミドが導入された菌を選択した。
配列番号１
5’ATACCCGGGAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGT 3’
配列番号２
5’ ATATCTAGATTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC 3’
配列番号３
5’GTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGACTAAATCTGAGCAGC 3’
配列番号４
5’ GCGTGACATAACTAATTACATGATTTAATGATGATGATGATGATGTGCTAAGTAGCTCAG 3’
配列番号５
5’ATACCCGGGGATAAGGAGAATCCATACAAG 3’
配列番号６
5’ATAGACGTCTTAGTTTTGCTGGCCGCATC 3’
配列番号７
5’GACCATGATTACGCCAAGCTTGCTATTTTCGAGGACCTTGTC 3’
配列番号８
5’GATCCATGAGATGATGAACGAATTATGCTAAGTAGCTCAG 3’
得られたＣＹＳ４遺伝子高発現株を培養し、培養物からＣＹＳ４遺伝子に付されたＨｉｓタグによりシスタチオニンβ−シンターゼを精製した。
２．反応
得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼ（２．６４ｍｇ／ｍＬ；２００μＬ）を用いてＳ−アリルメルカプタンからのＡＬＣの生成量を測定した。酵素液２００μＬ、セリン溶液（０．１５８ｇ／１０ｍＬ、１７６０μＬ）、１０ｍＭピリドキサールリン酸（２０μＬ）及びＳ−アリルメルカプタン（２０μＬ）を３０℃、５０ｒｐｍで反応させた。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ここで、シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、反応液１ｇあたり１０９Ｕであった。反応直後（０ｈｒ）、１時間後（１ｈｒ）、２時間後（２ｈｒ）及び３時間後（３ｈｒ）のＡＬＣの生成量を評価した。生成したＡＬＣは１０％ＴＣＡを添加して反応を止め、ＬＣ／ＭＳで定量した。
３．結果
結果を図２に示す。シスタチオニンβ−シンターゼにより、Ｓ−アリルメルカプタン及びＬ−セリンからＳ−アリルシステインが生成することが確認された。Example 2: Production of S-allyl cysteine by purified cystathionine β-synthase Since CYS4 gene was estimated to be a gene encoding an enzyme involved in ALC generation in Example 1, in this example, CYS4 gene was highly expressed. It was verified whether purified cystathionine β-synthase obtained from the mutant strain produced S-allylcysteine.
1. Preparation of purified cystathionine β-synthase First, a Saccharomyces cerevisiae strain that highly expresses CYS4 was prepared by the method described below.
Strain preparation method As a parent strain that enhances gene expression, Saccharomyces cerevisiae BY4742 was used, including the CYS3 gene disruption strain BY4742 cys3Δ, obtained from Thermo Scientific, Yeast Knockout Clones and Collections. The CYS4 gene was augmented by introducing an integration type plasmid. The method for preparing the integration plasmid was as follows.
An integration-type plasmid for highly expressing the CYS4 gene is prepared by first preparing a multi-copy plasmid expressing the CYS4 gene from the TDH3 gene (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) promoter (TDH3p), which is a constitutive high expression promoter. The TDH3p-CYS4 fragment amplified using as a template was cloned into pUC19 plasmid (Invitrogen). DH5-α or JM109 strain (Takara Bio) was used as E. coli competent cells in the process of plasmid preparation.
(Production of multi-copy plasmid)
First, a wild-type Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC 204508) genomic DNA was used as a template using a primer represented by SEQ ID NO: 1 having a Sma I restriction enzyme recognition sequence and a primer represented by SEQ ID NO: 2 having an Xba I restriction enzyme recognition sequence. As a result, PCR was performed to obtain a DNA fragment having a TDH3 promoter. PCR conditions were denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 min), 25 cycles. Next, this DNA fragment was cloned into the Sma I- Xba I site of pYES2 to obtain plasmid pYES2-TDH3p (all restriction enzymes used in this example were obtained from Takara Bio Inc.).
Subsequently, PCR was performed using the wild-type Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC 204508) genomic DNA as a template, using the primer represented by SEQ ID NO: 3 and the primer represented by SEQ ID NO: 4 to which a base sequence encoding 6 copies of histidine was added. A CYS4 DNA fragment having 6 copies of His-tag at the C-terminus of the gene was obtained. PCR conditions were denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 min), 25 cycles. Next, this DNA fragment was digested with the restriction enzyme Xba I and linearized into pYES2-TDH3p by the in-fusion cloning method (Clontech, In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit), the plasmid pYES2-TDH3p- CYS4_6xHis was obtained.
(Production of integration type plasmid)
Using the primer represented by SEQ ID NO: 5 having the SmaI restriction enzyme recognition sequence and the primer represented by SEQ ID NO: 6 having the AatII restriction enzyme recognition sequence, PCR was performed using the genomic DNA of S288C as a template to obtain a URA3 DNA fragment. Subsequently, the URA3 fragment was cloned into the SmaI-AatII site of pUC19 to prepare a pUC19-URA3 plasmid. Subsequently, the TDH3p-CYS4_6xHis fragment was amplified using the pYES2-TDH3p-CYS4_6xHis plasmid as a template with the primer shown in SEQ ID NO: 7 and the primer shown in SEQ ID NO: 8. Each DNA fragment was introduced into the SphI-EcoRI site of pUC19-URA3 by in-fusion cloning to prepare an integration type plasmid, pUC19-TDH3p-CYS4-URA3.
(Preparation of a strain having a CYS4 gene high expression plasmid (CYS4 gene high expression strain))
The CYS4 gene high expression integration type plasmid pUC19-TDH3p-CYS4-URA3 was linearized by digestion with BglII and a uracil-requiring strain BY4742 or BY4742 cys3Δ was transformed to produce a CYS4 gene high expression strain. . Transformation was performed using the Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit (Zymo Research), and the cells into which the integration plasmid was introduced were selected by growing the cells on a plate medium not containing uracil.
SEQ ID NO: 1
5'ATACCCGGGAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGT 3 '
SEQ ID NO: 2
5 'ATATCTAGATTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC 3'
SEQ ID NO: 3
5'GTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGACTAAATCTGAGCAGC 3 '
SEQ ID NO: 4
5 'GCGTGACATAACTAATTACATGATTTAATGATGATGATGATGATGTGCTAAGTAGCTCAG 3'
SEQ ID NO: 5
5'ATACCCGGGGATAAGGAGAATCCATACAAG 3 '
SEQ ID NO: 6
5'ATAGACGTCTTAGTTTTGCTGGCCGCATC 3 '
SEQ ID NO: 7
5'GACCATGATTACGCCAAGCTTGCTATTTTCGAGGACCTTGTC 3 '
SEQ ID NO: 8
5'GATCCATGAGATGATGAACGAATTATGCTAAGTAGCTCAG 3 '
The obtained CYS4 gene high expression strain was cultured, and cystathionine β-synthase was purified from the culture with a His tag attached to the CYS4 gene.
2. Reaction The amount of ALC produced from S-allyl mercaptan was measured using the obtained purified cystathionine β-synthase (2.64 mg / mL; 200 μL). 200 μL of enzyme solution, serine solution (0.158 g / 10 mL, 1760 μL), 10 mM pyridoxal phosphate (20 μL) and S-allyl mercaptan (20 μL) were reacted at 30 ° C. and 50 rpm. A 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) was used as a reaction buffer. Here, the cystathionine β-synthase activity was 109 U per 1 g of the reaction solution. Immediately after the reaction (0 hr), 1 hour later (1 hr), 2 hours later (2 hr) and 3 hours later (3 hr), the amount of ALC produced was evaluated. The produced ALC was quenched by adding 10% TCA and quantified by LC / MS.
3. Results The results are shown in FIG. It was confirmed that S-allyl cysteine was produced from S-allyl mercaptan and L-serine by cystathionine β-synthase.
実施例３：精製シスタチオニンβ−シンターゼによるＳ−メチルシステイン生成
実施例２で得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼ（０．２３ｍｇ／ｍＬ；１００μＬ）を用いてＳ−メチルメルカプタンからのＳ−メチルシステインの生成量を測定した。酵素液１００μＬ、セリン溶液（０．１５８ｇ／１０ｍＬ、１７６０μＬ）、１０ｍＭピリドキサールリン酸（２０μＬ）及び１５％メチルメルカプタン（１２０μＬ）を３０℃、５０ｒｐｍで反応させた。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ここで、シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、反応液１ｇあたり１９Ｕであった。反応直後（０ｈｒ）、１時間後（１ｈｒ）、２時間後（２ｈｒ）及び３時間後（３ｈｒ）のＳ−メチルシステインの生成量を評価した。生成したＳ−メチルシステインは１０％ＴＣＡを添加して反応を止め、ＬＣ／ＭＳで定量した。
結果を図３に示す。シスタチオニンβ―シンターゼにより、Ｓ−メチルメルカプタン及びＬ−セリンからＳ−メチルシステインが生成することが確認された。Example 3: S-methylcysteine production by purified cystathionine β-synthase Using purified cystathionine β-synthase (0.23 mg / mL; 100 μL) obtained in Example 2, S-methylcysteine from S-methyl mercaptan The amount produced was measured. 100 μL of enzyme solution, serine solution (0.158 g / 10 mL, 1760 μL), 10 mM pyridoxal phosphate (20 μL) and 15% methyl mercaptan (120 μL) were reacted at 30 ° C. and 50 rpm. A 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) was used as a reaction buffer. Here, the cystathionine β-synthase activity was 19 U per 1 g of the reaction solution. The amount of S-methylcysteine produced immediately after the reaction (0 hr), 1 hour later (1 hr), 2 hours later (2 hr) and 3 hours later (3 hr) was evaluated. The produced S-methylcysteine was stopped by adding 10% TCA, and quantified by LC / MS.
The results are shown in FIG. It was confirmed that cystathionine β-synthase produces S-methylcysteine from S-methyl mercaptan and L-serine.
実施例４：精製シスタチオニンβ−シンターゼによるＳ−プロピルシステイン生成
実施例２で得られた精製シスタチオニンβ−シンターゼ（０．２３ｍｇ／ｍＬ；１００μＬ）を用いてＳ−プロピルメルカプタンからのＳ−プロピルシステインの生成量を測定した。酵素液１００μＬ、セリン溶液（０．１５８ｇ／１０ｍＬ、１７６０μＬ）、１０ｍＭピリドキサールリン酸（２０μＬ）及びプロピルメルカプタン（２０μＬ）を３０℃、５０ｒｐｍで反応させた。反応バッファーには５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ここで、シスタチオニンβ−シンターゼ活性は、反応液１ｇあたり１９Ｕであった。反応直後（０ｈｒ）、１時間後（１ｈｒ）、２時間後（２ｈｒ）及び３時間後（３ｈｒ）のＳ−プロピルシステインの生成量を評価した。生成したＳ−プロピルシステインは１０％ＴＣＡを添加して反応を止め、ＬＣ／ＭＳで定量した。
結果を図４に示す。シスタチオニンβ―シンターゼにより、Ｓ−プロピルメルカプタン及びＬ−セリンからＳ−プロピルシステインが生成することが確認された。Example 4: Production of S-propylcysteine by purified cystathionine β-synthase Using purified cystathionine β-synthase (0.23 mg / mL; 100 μL) obtained in Example 2, S-propylcysteine from S-propylmercaptan The amount produced was measured. 100 μL of enzyme solution, serine solution (0.158 g / 10 mL, 1760 μL), 10 mM pyridoxal phosphate (20 μL) and propyl mercaptan (20 μL) were reacted at 30 ° C. and 50 rpm. A 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) was used as a reaction buffer. Here, the cystathionine β-synthase activity was 19 U per 1 g of the reaction solution. Immediately after the reaction (0 hr), 1 hour later (1 hr), 2 hours later (2 hr) and 3 hours later (3 hr), the amount of S-propylcysteine produced was evaluated. The produced S-propylcysteine was stopped by adding 10% TCA, and quantified by LC / MS.
The results are shown in FIG. It was confirmed that S-propylcysteine was produced from S-propyl mercaptan and L-serine by cystathionine β-synthase.
実施例５：グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）によるＳ−アリルシステインスルホキシド（ＡＬＣＳＯ）の生成
グルコース及びＳ−アリルシステイン（ＡＬＣ）からＡＬＣＳＯを生成する反応を、表２に記載の３つの試験区について調べた。ＡＬＣとしては実施例１で調製したものを用いた。ＧＯとしては、食品添加物「スミチームＰＧＯ」（新日本化学（株））を用いた。
反応は、４０℃、ｐＨ６．０（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液）、３００ｒｐｍで５時間行った。
さらに反応容器中、空気流量１０００ｍＬ／分でノズル径１０〜５０μｍのノズルから空気を通気（エアレーション）した。Example 5: Production of S-allyl cysteine sulfoxide (ALCSO) with glucose oxidase (GO) The reaction for producing ALCSO from glucose and S-allyl cysteine (ALC) was investigated for the three test zones described in Table 2. The ALC prepared in Example 1 was used. As the GO, a food additive “Sumiteam PGO” (Shin Nihon Chemical Co., Ltd.) was used.
The reaction was carried out at 40 ° C., pH 6.0 (50 mM potassium phosphate buffer), 300 rpm for 5 hours.
Further, air was aerated in the reaction vessel from a nozzle having a nozzle diameter of 10 to 50 μm at an air flow rate of 1000 mL / min.
試験区１では、ＧＯを添加せずエアレーションのみ行った。
試験区２では、ＧＯを添加した。
試験区３では、反応１時間後にＧＯを０．２３％、とグルコースを、０．１６％追加した。
結果を図５に示す。
ＧＯを添加しなかった試験区１ではほとんどＡＬＣＳＯを生成しなかった。ＧＯを添加した試験区２ではグルコン酸の生成が見られたが、反応１時間でプラトーに達した。同様の傾向がＡＬＣ消費、ＡＬＣＳＯ生成にも見られた。反応性の低下による過酸化水素供給の減少が影響していると推定された。しかしながら、反応１時間後にＧＯ及びグルコースを追加する（試験区３）ことにより、ＡＬＣからＡＬＣＳＯの変換は再度進行し、終了させることができた。In Test Zone 1, only aeration was performed without adding GO.
In test group 2, GO was added.
In test group 3, 0.23% of GO and 0.16% of glucose were added 1 hour after the reaction.
The results are shown in FIG.
In test section 1 to which no GO was added, almost no ALCSO was produced. In test group 2 to which GO was added, gluconic acid was produced, but reached a plateau in 1 hour of reaction. A similar trend was seen in ALC consumption and ALCSO production. It was estimated that the decrease in hydrogen peroxide supply due to the decrease in reactivity had an effect. However, by adding GO and glucose 1 hour after the reaction (test group 3), the conversion of ALC to ALCSO proceeded again and could be terminated.
実施例６：ＣＹＳ４遺伝子高発現酵母変異株を用いたＳ−アリルシステインスルホキシド
（ＡＬＣＳＯ）の生成
実施例２で作成したＣＹＳ４遺伝子高発現変異株を用いて、実施例１（２）と同様にして培養する。培養後、菌体を集めて（集菌）、菌体を破砕し抽出液を調製する。この抽出液（酵母エキス：酵素源）にＬ−セリン及びＳ−アリルメルカプタン等の基質を添加してＡＬＣを生産させる（工程Ｉ）。
反応液にグルコースオキシダーゼを添加してグルコースを酸化処理し、ＡＬＣをＡＬＣＳＯに変換する（工程ＩＩ）ことによってＡＬＣＳＯを含む酵母エキスを得る。Example 6: Generation of S-allyl cysteine sulfoxide (ALCSO) using a CYS4 gene high-expression yeast mutant The CYS4 gene high-expression mutant prepared in Example 2 was used in the same manner as in Example 1 (2). Incubate. After culturing, the cells are collected (collected), and the cells are crushed to prepare an extract. Substrates such as L-serine and S-allyl mercaptan are added to this extract (yeast extract: enzyme source) to produce ALC (step I).
Glucose oxidase is added to the reaction solution to oxidize glucose, and ALC is converted to ALCSO (step II) to obtain a yeast extract containing ALCSO.
実施例７：ＣＹＳ３遺伝子活性が低減した変異株を用いたＳ−アリルシステインスルホキシド（ＡＬＣＳＯ）の生成
シスタチオニンβ−シンターゼ生産性微生物の野生株に紫外線を照射して変異処理をして、得られた変異株の中からシステイン要求性株をスクリーニングすることによりＣＹＳ３遺伝子活性が低減した変異株を取得する。得られた変異株を用いて実施例６同様、工程Ｉ及び工程ＩＩを実施することによって、ＡＬＣＳＯを含む酵母エキスを得る。Example 7: Generation of S-allyl cysteine sulfoxide (ALCSO) using a mutant strain with reduced CYS3 gene activity A wild strain of a cystathionine β-synthase-producing microorganism was subjected to mutation treatment by irradiation with ultraviolet light. A mutant strain with reduced CYS3 gene activity is obtained by screening a cysteine-requiring strain from among the mutant strains. The yeast extract containing ALCSO is obtained by implementing the process I and the process II like Example 6 using the obtained mutant strain.
実施例８：各遺伝子破壊株、高発現株のＡＬＣ蓄積能の評価
BY4742を親株として、ＣＹＳ３遺伝子の破壊（cys3Δと略す）、ＣＹＳ４遺伝子の高発現（CYS4↑と略す）、ＣＹＳ３遺伝子の破壊かつＣＹＳ４遺伝子の高発現（cys3Δ+CYS4↑と略す）の効果を検証した。親株及び各変異株は、それぞれThermo Scientific社製、Yeast Knockout Clones and Collectionsより入手するか、あるいは実施例２と同様にして作製した。
図６に示した方法にて各菌株から粗酵素液を調製し、図７に示した反応条件にてＡＬＣ生成試験を実施した。各菌株の粗酵素液のシスタチオニンβ−シンターゼ活性（酵母エキス固形分１ｇ当たり）はいずれも２５００Ｕ以上であり、特にＣＹＳ４遺伝子高発現変異株では５０００Ｕ以上でありさらにＣＹＳ３遺伝子が破壊された、ＣＹＳ４遺伝子高発現且つＣＹＳ３遺伝子低発現の変異株では、シスタチオニンβ−シンターゼ活性（酵母エキス固形分１ｇ当たり）は２３３１２Ｕであった。
また、ＣＹＳ３遺伝子が破壊された変異株では、シスタチオニンγ−リアーゼ活性（酵母エキス固形分１ｇ当たり）が０Ｕであることが確認された。
使用した酵母乾燥重量当たりのＡＬＣ蓄積量を測定した。乾燥重量（ＤＭと略す）の測定法は以下の通り。
（測定法）
秤量瓶（＃６−７４３−０１）の空重量を電子天秤にて測定し、酵母菌体懸濁液１ｍｌを秤量瓶に入れた後の重量を電子天秤にて測定。その後オーブン（ＤＮ６００ ＹＡＭＡＴＯ）にて１０５℃１時間乾燥後の重量を測定した。オーブン乾燥前後の重量割合からＤＭ（％）を測定する。
各菌株のＡＬＣ蓄積能を図８に示す。親株と比較して、ＣＹＳ３遺伝子破壊あるいはＣＹＳ４遺伝子高発現によりＡＬＣが有意に蓄積した。また、ＣＹＳ３遺伝子破壊かつＣＹＳ４遺伝子高発現によりＡＬＣの蓄積が顕著に増加した。Example 8: Evaluation of ALC accumulation ability of each gene-disrupted strain and high-expressing strain
By using BY4742 as a parent strain, the effects of CYS3 gene disruption (abbreviated as cys3Δ), CYS4 gene high expression (abbreviated as CYS4 ↑), CYS3 gene disruption and CYS4 gene high expression (abbreviated as cys3Δ + CYS4 ↑) were verified. . The parent strain and each mutant strain were obtained from Thermo Scientific, Yeast Knockout Clones and Collections, or prepared in the same manner as in Example 2.
A crude enzyme solution was prepared from each strain by the method shown in FIG. 6, and an ALC generation test was performed under the reaction conditions shown in FIG. The cystathionine β-synthase activity (per gram of yeast extract solids) of the crude enzyme solution of each strain is 2500 U or more, particularly 5000 U or more in the CYS4 gene high-expression mutant, and the CYS4 gene is further disrupted. In the mutant with high expression and low expression of CYS3 gene, the cystathionine β-synthase activity (per gram of yeast extract solids) was 23312U.
Further, it was confirmed that the mutant strain in which the CYS3 gene was disrupted had 0 U of cystathionine γ-lyase activity (per 1 g of yeast extract solid content).
The amount of ALC accumulated per dry weight of yeast used was measured. The dry weight (abbreviated as DM) is measured as follows.
(Measurement method)
The empty weight of the weighing bottle (# 6-743-01) was measured with an electronic balance, and the weight after 1 ml of yeast cell suspension was placed in the weighing bottle was measured with an electronic balance. Thereafter, the weight after drying at 105 ° C. for 1 hour in an oven (DN600 YAMATO) was measured. DM (%) is measured from the weight ratio before and after oven drying.
The ALC accumulation ability of each strain is shown in FIG. Compared with the parent strain, ALC accumulated significantly due to CYS3 gene disruption or CYS4 gene high expression. In addition, the accumulation of ALC significantly increased due to the CYS3 gene disruption and the high expression of the CYS4 gene.
本発明の方法によれば、医薬品の中間体、食品添加物の原材料として期待されているシステイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体を、より効率よく且つ安定的に製造することができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１５−１４７９３６（出願日２０１５年７月２７日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。According to the method of the present invention, a cysteine derivative and a cysteine sulfoxide derivative, which are expected as raw materials for pharmaceutical intermediates and food additives, can be produced more efficiently and stably.
This application is based on Japanese Patent Application No. 2015-147936 (filing date: July 27, 2015) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.
配列番号１：ＰＣＲプライマー
配列番号２：ＰＣＲプライマー
配列番号３：ＰＣＲプライマー
配列番号４：ＰＣＲプライマー
配列番号５：ＰＣＲプライマー
配列番号６：ＰＣＲプライマー
配列番号７：ＰＣＲプライマー
配列番号８：ＰＣＲプライマーSEQ ID NO: 1: PCR primer SEQ ID NO: 2: PCR primer SEQ ID NO: 3: PCR primer SEQ ID NO: 4: PCR primer SEQ ID NO: 5: PCR primer SEQ ID NO: 6: PCR primer SEQ ID NO: 7: PCR primer SEQ ID NO: 8: PCR primer
Claims (32)
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：
で表されるシステイン誘導体の製造方法。In the presence of cystathionine β-synthase, formula (I):
Wherein the thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
The manufacturing method of the cysteine derivative represented by these.
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させて式（ＩＩ）：
で表されるシステイン誘導体を製造する工程（工程１）、及び
工程１で得られたシステイン誘導体と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させて式（ＩＩＩ）：
で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する工程（工程２）を含む、該システインスルホキシド誘導体の製造方法。In the presence of cystathionine β-synthase, formula (I):
A thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
A step (Step 1) for producing a cysteine derivative represented by formula (III): and reacting the cysteine derivative obtained in Step 1 with an oxidase and a substrate thereof to formula (III):
The manufacturing method of this cysteine sulfoxide derivative including the process (process 2) of manufacturing the cysteine sulfoxide derivative represented by these.
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：
で表されるシステイン誘導体の製造方法。Yeast having cystathionine β-synthase activity is cultured, and in the presence of an extract and / or culture of the yeast, the formula (I):
Wherein the thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
The manufacturing method of the cysteine derivative represented by these.
で表されるチオール化合物とＬ−セリンとを反応させて式（ＩＩ）：
で表されるシステイン誘導体を製造する工程（工程１）、及び
工程１で得られたシステイン誘導体と、オキシダーゼ及びその基質とを反応させて式（ＩＩＩ）：
で表されるシステインスルホキシド誘導体を製造する工程（工程２）を含む、該システインスルホキシド誘導体の製造方法。Yeast having cystathionine β-synthase activity is cultured, and in the presence of an extract and / or culture of the yeast, the formula (I):
A thiol compound represented by formula (II) is reacted with L-serine:
A step (Step 1) for producing a cysteine derivative represented by formula (III): and reacting the cysteine derivative obtained in Step 1 with an oxidase and a substrate thereof to formula (III):
The manufacturing method of this cysteine sulfoxide derivative including the process (process 2) of manufacturing the cysteine sulfoxide derivative represented by these.
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