JPWO2014103553A1

JPWO2014103553A1 - 夾雑物の影響を低減する免疫測定法

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Publication number: JPWO2014103553A1
Application number: JP2014554230A
Authority: JP
Inventors: 武寿磯田; 智典金子
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2017-01-12
Anticipated expiration: 2033-11-15
Also published as: EP2940473B1; US20150355176A1; EP2940473A1; WO2014103553A1; US9874558B2; JP6260541B2; EP2940473A4

Abstract

本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法において、夾雑物由来のノイズを低減し、測定対象化合物の正確な量を求めるのに適した測定方法を提供することを課題とする。本発明は、標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法（リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む）を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物を添加する測定方法である。

Description

本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて、生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法に関する。更に詳しくは、本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法であって、夾雑物由来のノイズが低減された測定方法に関する。

ヒトや動物の血液、尿、その他の生体試料中に含まれる腫瘍マーカー、特定のタンパク質、その他の抗原を検出、定量することは、今日の医療分野における診断や生物、生化学の分野における研究において広く行われている。そして、微量の測定対象化合物（抗原）を特異的に検出する方法として免疫測定法が用いられている。免疫測定法の一つに、一次抗体で捕捉した抗原を二次抗体用いて標識するサンドイッチ法があり、二次抗体に蛍光標識を用いる蛍光抗体法や放射性物質による標識を用いるラジオイムノアッセイが広く実施されている。

一方、糖鎖に結合するタンパク質で、免疫学的な方法で作製したもの以外として、レクチンが知られている。レクチンは、通常１分子あたり二つ以上の糖結合部位をもつ。一般に、生体試料中に含まれるタンパク質等は糖鎖を有しており、測定対象の抗原が有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを、免疫測定法における二次抗体の替わりに使用する方法も提案されている。

しかし、血液（血清、血漿）のような生体試料中には、測定対象の抗原以外に種々のタンパク質や脂質、その他の夾雑物が含まれており、免疫測定において、これらの夾雑物が一次抗体や二次抗体あるいは一次抗体を支持体（ウエル等）に固相化するための固相化層（固相化支持体）等に非特異的に吸着し、この夾雑物に蛍光標識体が結合することにより、夾雑物由来の非特異シグナルが発生し、バックグランドノイズの原因となっている。

非特異反応を抑制した免疫測定法としては、糖鎖を有する測定試薬が用いられる免疫測定法において、非特異反応を減じる効果を有する糖鎖化合物の利用が検討されている（特許文献１）。この場合の糖鎖化合物の作用は、糖鎖を有する測定試薬の反応点を添加した別の糖鎖化合物でブロックすることにより、ノイズを低減するものと考えられる。

このように、免疫測定法で生体試料中の測定対象の抗原を測定する場合のノイズ低減については既に提案があるが、測定感度、測定精度や操作性、費用等の点から、それぞれの生体試料と測定対象の抗原に応じて、最も効果的な方法を選ぶことは重要であり、更なるノイズ低減のための提案が望まれている。

特開2010-60293号公報

本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法において、夾雑物由来のノイズを低減し、測定対象化合物の正確な量を求めるのに適した測定方法を提供することを課題とする。

標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法では、生体試料中に存在する測定対象化合物以外の糖タンパク質や糖脂質といった糖鎖を有する夾雑物も、測定対象化合物を捕捉するためのリガンド（サンドイッチ法の一次抗体）やリガンドを支持体（ウエル等）に固相化するための固相化層（固相化支持体）（以下、リガンド等という）に非特異的に結合する。そして、検出に用いるレクチンは糖鎖認識性にある程度幅を持っているために、リガンド等に非特異的に結合した夾雑物が有する糖鎖とも標識レクチンが結合し、これがノイズの原因となっている（図１参照）。

本発明者らは、レクチンの糖鎖に対する認識性の幅と結合力に着目して検討した。すなわち、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物の有する糖鎖と競合（交差）する糖鎖化合物を添加すれば、標識レクチンと結合している夾雑物の糖鎖が一定の割合で解離し、解離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物とが結合し、その結果、リガンド等に非特的に結合した夾雑物と結合している標識レクチンを遊離させることができることを見出し、本発明を完成させた（図２参照）。更に、この場合、標識レクチンと結合している測定対象化合物の糖鎖と添加した糖鎖化合物との競合は一定範囲におさえ、測定対象化合物由来のシグナル強度を確保することが好ましい。従って、添加する糖鎖化合物と標識レクチンとの解離定数は一定の範囲内にあることが好ましいことを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の一側面では、本発明の測定方法は、次の通りである。
標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法（リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む）を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物を添加する測定方法。

本発明によれば、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法において、夾雑物由来のノイズを低減し、正確なタンパク質の量を求めるのに適した測定方法を提供することができる。

図１は、従来のサンドイッチ法において、生体試料中の夾雑物に由来するノイズ発生の概要を示す概念図である。リガンドや固相化層等に非特異的に結合した夾雑物が有する糖鎖と標識レクチンが結合し、これがノイズの原因となっている。図２は、標識レクチンとの結合において、本発明で添加した糖鎖化合物と生体試料中の夾雑物の糖鎖とが競合（交差）する概要を示す概念図である。糖鎖化合物を添加すれば、標識レクチンと結合している夾雑物の糖鎖が一定の割合で解離し、解離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物とが結合する。その結果、リガンドや固相化層等に非特的に結合した夾雑物と結合している標識レクチンを遊離させることができる。図３は、ＳＰＦＳの場合の一例として、支持体表面にＳＡＭと固相化層が形成され、固相化層にリガンドが固相化されている概要を示す概念図である。

以下に、本発明の測定方法について説明する。
１．測定対象化合物
（１）生体試料
本発明は、生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法である。測定する生体試料は特に制限はなく、例えば、ヒトや動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織及び器官及びこれらの調整物（例えば、生検標本）が挙げられる。特に、癌抗原、腫瘍マーカーを含む可能性のある血液、血清及び血漿は測定する生体試料として好適である。

血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液等の液性の試料は、必要に応じて、適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、器官等の固形の試料は、適当な緩衝液を加えてホモジェナイズして、懸濁液又はその上清を、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。

（２）測定対象化合物
本発明では、サンドイッチ法の標識物質として標識レクチンを用いる。標識レクチンは特定の糖鎖を認識して結合する。従って、本発明における測定対象化合物は糖鎖を有する必要がある。

このような測定対象化合物は、糖鎖を有する化合物であって、リガンド（サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質）に結合する化合物である。このような測定対象化合物としては、例えば、糖タンパク質、糖脂質、これらの修飾分子、複合体等を挙げることができ、好ましい測定対象化合物としては、前立腺特異抗原（prostate specific antigen、ＰＳＡ）その他の腫瘍マーカー（例えばCA19-9、フォルスマン抗原、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、シリアルＴ抗原、等）が挙げられる。

２．サンドイッチ法による免疫測定法
本発明では、サンドイッチ法による免疫測定法を使用するが、その方法は通常用いられている方法で良く、特に制限はされない。
（１）リガンド（サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質）
本発明で使用するリガンド（サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質）は、測定対象化合物を特異的に認識して結合し、かつ、サンドイッチ法の標識物質としての標識レクチンによる測定対象化合物の糖鎖の認識を妨げない物質である。測定対象化合物を捕捉する物質として適切な物質であればリガンドは特に制限されないが、例えば、抗体、アプタマー、合成ペプチド等を用いることができる。特に、測定対象化合物に対するモノクローナル抗体が好適である。癌抗原、腫瘍マーカー等を測定対象化合物とする場合は、その抗原に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体等）をリガンドとして用いることが適切である。例えば、ヒトＰＳＡ（前立腺特異抗原）を測定対象化合物とする場合は、抗ヒトＰＳＡ抗体を用いればよい。

上記のリガンドは測定対象化合物を特異的に捕捉する物質を意味し、完全抗体のみならず任意の抗体断片または誘導体を含み、完全抗体に加え、Ｆａｂ、Ｆａｂ'₂、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等の各種抗体も包含される。

なお、本発明で用いることができる抗体以外のリガンドとしては、例えば、測定対象化合物に対する適当な受容体がある場合は、それを用いることができる。ここで、受容体とは、細胞に存在し、各種の生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現するタンパク質であり、一例として、形質膜を自由に通過できるステロイド、甲状腺ホルモンあるいはビタミンＡやＤ等に特異的に結合する細胞内受容体（すなわち核内受容体）、形質膜を自由に通過できないペプチドホルモン、増殖因子、サイトカインあるいはカテコールアミン等と特異的に結合する細胞表面受容体、等がある。

（２）リガンドの固相化
サンドイッチ法においては、通常、リガンドは支持体（固相）に固相化（固定化）して用いられる。すなわち、測定対象化合物は固相化されたリガンドを通して、支持体上に捕捉される。

リガンドを固相化する支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズ（主として球状）、プレート（主として平面状）などの形状で用いられる。ビーズとしては磁気ビーズ、樹脂ビーズ等が充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート（96穴マルチウェルプレート等）、バイオセンサーチップなどが使用できる。
リガンドと支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により行うことができる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。

（ａ）固相化層を用いたリガンドの固相化
支持体へのリガンドの固相化は、支持体のリガンドを固相化する面に固相化層を設けて行うこともできる。

固相化層とは、支持体表面にリガンドを固相化するための３次元構造を有する層である。この「３次元構造」とは、リガンドの固相化を、支持体表面（ＳＰＦＳを用いる場合は、「センサ基板」表面（及びその近傍））の２次元に限定することなく、その表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう（図３参照）。

固相化層は支持体の表面に直接設けてもよいし、支持体の表面に、後述するＳＡＭを設けて、その上に固相化層を設けてもよい。
このような固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。

ＣＭＤの分子量は、1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下が好ましく、4ｋＤａ以上1,000ｋＤa以下がより好ましい。
ＳＰＦＳを用いた測定法の場合、固相化層（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として2ｎｇ/ｍｍ²未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が後述するＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製「ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ5」の密度は2ｎｇ/ｍｍ²であった。この密度は、このＣＭ5基板および金膜のみの基板を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製のＳＰＲ測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均2000ＲＵを測定した結果、2ｎｇ/ｍｍ²と見積もられたものである。

ＳＰＦＳを用いた測定法の場合、固相化層の平均膜厚は、3ｎｍ以上80ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。

固相化層に含まれる高分子としてカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を用いた場合について、後述するＳＰＦＳの金属薄膜に形成されたＳＡＭ表面にカルボキシメチルデキストランを固定化する方法を具体的に説明する。

カルボキシメチルデキストランは、好ましくは分子量1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを0.01ｍｇ/ｍＬ以上100ｍｇ/ｍＬ以下と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を0.01ｍＭ以上300ｍＭ以下と、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を0.01ｍＭ以上500ｍＭ以下とを含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、透明支持体と金属薄膜とＳＡＭとがこの順序で積層された基板を0.2時間以上3.0時間以下浸漬し、ＳＡＭにカルボキシメチルデキストランを固定化することができる。

得られた固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数），反応溶液のイオン強度およびｐＨ，ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシル基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量および反応時間によって調整することができる。

リガンドの固相化層への固定化方法としては、公知の化学結合反応を用いることができ、特に抗体を修飾する際に用いられる化学結合反応を適用することができる。例えば、固相化層のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法がある。

また、後述するＳＡＭへ直接リガンドを固相化する場合は、ＳＡＭが有するカルボキシル基を、上述のようにしてリガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。

（ｂ）ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−ＡｓｓｅｍｂｌｅｄＭｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子膜）を用いたリガンドの固相化
支持体へのリガンドの固相化は、支持体のリガンドを固相化する面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−ＡｓｓｅｍｂｌｅｄＭｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子膜）を設けて行うこともできる。

ＳＡＭは、リガンド、好ましくは固相化層を固定化する足場として、支持体のリガンドを固相化する表面に形成される。ＳＰＦＳを用いた測定法の場合は、足場としての目的の外に、プラズモンセンサをサンドイッチアッセイに用いた際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、金属薄膜のリガンドを固相化する表面（透明支持体とは接していないもう一方の表面）に形成される。

ＳＡＭが含む単分子としては、例えば、炭素原子数4〜20程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマアルドリッチジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは10-カルボキシ-1-デカンチオールが用いられる。炭素原子数4〜20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。

このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
以下に、ＳＰＦＳを用いた測定法の場合を例に説明する。

金属薄膜上にＳＡＭを形成する方法の具体例としては、その表面に金属薄膜が形成された透明支持体の該薄膜表面にマスク材からなる層が形成されたものを、10-カルボキシ-1-デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、10-カルボキシ-1-デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。

また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭが含む単分子としては、加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。

このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂），二酸化チタン（ＴｉＯ₂）または酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）を含むことが好ましい。

誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常10ｎｍ〜1ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは30ｎｍ以下、より好ましくは10〜20ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは200ｎｍ〜1ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、400ｎｍ〜1,600ｎｍがより好ましい。

誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法，またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
ＳＡＭを形成した場合は、リガンドは、ＳＡＭ上に固相化層を設けて、又はＳＡＭ上に直接、固定化することができる。

（３）サンドイッチ法の標識物質として用いる標識レクチン
本発明では、上記２．（２）でリガンドを通して支持体（固相）上に捕捉された測定対象化合物を標識するために、標識レクチンが用いられる。

レクチンは、その種類に応じた特定の糖鎖に高い結合能で結合するが、それとは別の糖鎖にも低い結合能ながら結合することがある。したがって、本発明で用いる標識レクチンは、後述する糖鎖化合物の添加によるノイズ低減効果を高めるために、測定対象化合物が有する糖鎖には高い結合能で結合する一方、生体試料中の測定対象化合物以外の糖タンパク質や糖脂質等の夾雑物が有する糖鎖には弱い結合能で結合するレクチンを用いるのが好ましい。

レクチンとしては、
（a）動植物，真菌，細菌，ウイルスなどから得られる様々な分子家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシンＢ鎖関連の「Ｒ型レクチン」、
（b）真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン・カルレティキュリン」、
（c）多細胞動物に広く存在する「セレクチン」，「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」、
（d）動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」、
（e）植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」、
（f）これと構造類似性を有し動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」、
（g）リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース６−リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」、
（h）グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」、及び
（i）免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「Ｉ型レクチン」等
が挙げられる。

上記レクチンの具体例としては、ＡＣＡ（センニンコクレクチン），ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン），ＣｏｎＡ（タチナタマメレクチン），ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン），ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン），ＥＣＡ（デイゴマメレクチン），ＥＥＬ（ＳｐｉｎｄｌｅＴｒｅｅレクチン），ＧＮＡ（ユキノハナレクチン），ＧＳＬＩ（グリフォニアマメレクチン），ＧＳＬＩＩ（グリフォニアマメレクチン），ＨＨＬ（アマリリスレクチン），ジャカリン（ジャックフルーツレクチン），ＬＢＡ（リママメレクチン），ＬＣＡ（レンズマメレクチン），ＬＥＬ（トマトレクチン），ＬＴＬ（ロータスマメレクチン），ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン），ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン），ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメレクチン），ＰＨＡ−Ｌ（インゲンマメレクチン），ＰＮＡ（ピーナッツレクチン），ＰＳＡ（エンドウレクチン），ＰＴＬ−Ｉ（シカクマメレクチン），ＰＴＬ−ＩＩ（シカクマメレクチン），ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン），ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン），ＳＢＡ（ダイズレクチン），ＳＪＡ（エンジュレクチン），ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン），ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン），ＳＴＬ（ジャガイモレクチン），ＴＪＡ−Ｉ（キカラスウリレクチン），ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン），ＵＤＡ（ＣｏｍｍｏｎＳｔｉｎｇｉｎｇＮｅｔｔｌｅレクチン），ＵＥＡＩ（ハリエニシダレクチン），ＶＦＡ（ソラマメレクチン），ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン），ＷＦＡ（ノダフジレクチン），ＷＧＡ（パンコムギレクチン），ＡＡＬ（ヒイロチャワンダケレクチン），ＡＯＬ（アスペルギルス・オリゼレクチン）などを挙げることができる。

レクチンは、標識体と複合体化（結合）させて、標識レクチンとする。
標識体としては、蛍光色素、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質等の当業者に公知の標識体を用いることができる。

蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（GEヘルスケアバイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Alexa Fluor（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）等の有機蛍光色素が挙げられる。

また、Eu、Tb等の希土類錯体系の蛍光色素（例えばATBTA-Eu³⁺）、青色蛍光タンパク質（BFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（DsRed）またはAllophycocyanin（APC；LyoFlogen（登録商標））等に代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子等も、蛍光色素として挙げられる。

なお、血液検体に由来する試料を分析に供する場合は、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えるため、Cy5やAlexa Fluor 647など、近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。
放射性物質としては、ラジオアイソトープ(³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹Iなど）が挙げられる。

３．糖鎖化合物
一般に、レクチンと糖鎖との結合は平衡反応であり、抗体と抗原の結合に比べて結合力は弱いとされている。また、レクチンと糖鎖との結合における糖鎖の特異性は、抗体と抗原との結合における抗原の特異性に比べて低い。従って、標識レクチンを用いたサンドイッチ法では、標識レクチンの添加後に別の糖鎖化合物を添加して、平衡反応で標識レクチンと結合している夾雑物に糖鎖化合物を競合（交差）させることが可能である。

本発明では、糖鎖化合物を添加することにより、糖タンパク質や糖脂質等の夾雑物と標識レクチンとの結合において、夾雑物に糖鎖化合物を競合（交差）させる。これにより、標識レクチンと結合していた夾雑物の一部が解離し、解離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物とが結合する。その結果、リガンド等に非特異的に結合している夾雑物を通して固相上に捕捉されていた標識レクチンが遊離する。そして、固相上から遊離して糖鎖化合物と結合した標識レクチンを洗浄その他の方法によって除去することにより、サンドイッチ法における夾雑物由来のノイズの低減を図る（図２参照）。この場合、糖鎖化合物の添加によって、標識レクチンと結合している測定対象化合物とも糖鎖化合物が競合（交差）し、測定対象化合物と結合している標識レクチンも解離し、測定対象化合物由来のシグナルも減少してしまう可能性がある。このシグナルの減少をできるだけ抑えるために、本発明で添加する糖鎖化合物と標識レクチンとの解離定数は一定範囲にあることが好ましい。

従って、本発明で添加する糖鎖化合物は、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物である。
更に好ましくは、本発明で添加する糖鎖化合物は、添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をｘ、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をａとした場合、ｘがｘ＞ａの範囲である。

なお、固相化層に含まれる糖鎖化合物と同じ糖鎖化合物を添加する場合は、糖鎖化合物を添加しない場合と比べてＳ／Ｎの増加が十分でない場合がある。従って、このような場合には、固相化層に含まれる糖鎖化合物（ＣＭＤ等）とは異なる糖鎖を有する化合物を添加するのが好ましい。

（１）生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物
前記のように、本発明で添加する糖鎖化合物は、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物である。本発明で「競合（交差）」とは、一般的な競合阻害等における競合と同義であり、レクチンを受容体とした場合に、その同じ結合部位で、ある物質と他の物質が可逆的に競合して結合する関係をいう。つまり、結合部位を分子レベルで正確に認識して結合している競合に限らず、レクチンの同じ結合領域に結合する糖鎖間で起こる競合も含んでいる。

生体試料中で標識レクチンと結合する夾雑物としては、糖タンパク質や糖脂質が考えられ、標識レクチンを用いるサンドイッチ法による生体試料の測定では、生体試料中の複数の物質が夾雑物として標識レクチンと結合する。従って、本発明では、生体試料中の個々の夾雑物質との競合関係は不明であっても、生体試料中の標識レクチンと結合する夾雑物全体のうちの少なくとも一部と競合する糖鎖化合物であれば使用可能である。ただし、標識レクチンとの結合における競合は添加する糖鎖化合物と測定対象化合物との間でも起こる可能性もある。従って、本発明で添加する糖鎖化合物は、実際のサンドイッチ法の測定系で、夾雑物由来のノイズの減少と測定対象化合物由来のシグナルの減少を調べ、シグナルの減少効果よりもノイズの減少効果が大きいたものを選ぶ必要がある。

本発明で添加する糖鎖化合物の選定方法の一例は次の通りである（実施例参照）。
（i）標識レクチンを用いたサンドイッチ法の測定系で、生体試料に糖鎖化合物を添加して標識レクチンと結合している夾雑物と競合させ、遊離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物との結合体を除去したシグナル強度を測定する（すなわち、競合後の「夾雑物由来のノイズ（Ｎ）」と「測定対象化合物由来のシグナル（ｓ）」の合計（以下、単にノイズ（Ｎ）という）の強度を測定する）、及び
（ii）測定対象化合物の標準品を生体試料に添加した上で糖鎖化合物を添加し、上記（i）と同様にしてシグナル強度を測定する（すなわち、競合後の「標準品由来のシグナル（Ｓ）」、「夾雑物由来のノイズ（Ｎ）」及び「測定対象化合物由来のシグナル（ｓ）」の合計（以下、単にシグナル（Ｓ）という）の強度を測定する）を測定する。そして、「Ｓ」／「Ｎ」の比が、その測定の目的に応じた程度に大きいものを添加する糖鎖化合物として選べばよい。例えば、後述の実施例の生体試料、測定対象化合物及び標識レクチンの場合には、添加する糖鎖化合物としては、Ｓ／Ｎの比が３以上が好ましく４以上が更に好ましい。

この場合、（ii）の測定対象化合物の標準品の添加は、実際の測定における測定対象化合物の濃度の範囲内とする必要がある。標準品を過剰に加えた場合は、標準品由来のシグナル強度が大きくなり、標準品と添加した糖鎖化合物との競合が多く生じていてもＳ／Ｎは大きくなる。一方、標準品の添加量が少なすぎると、夾雑物との競合に糖鎖化合物が効果的であってもＳ／Ｎは小さくなってしまう。従って、実際の測定における糖鎖化合物の競合の効果を適切に把握するために、（ii）の標準品の添加濃度は実際の測定における測定対象化合物の範囲内である必要がある。

なお、上記のＳ／Ｎを求める場合の生体試料は、実際の測定に使用する生体試料を用いてもよいし、含まれている夾雑物がほぼ同様と考えられる生体試料で測定対象化合物が含まれていない生体試料（例えば、市販されている正常ヒトプール血清）を用いてもよい。

（２）解離定数が一定範囲内にある糖鎖化合物
前記のように、本発明で添加する好ましい糖鎖化合物は、添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をｘ、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をａとした場合、ｘがｘ＞aの範囲である糖鎖化合物である。

本発明で、解離定数とは次の通り定義される。
糖鎖化合物（Ａ）とレクチン（Ｂ）との結合は可逆反応であり、平衡状態では次の式が成り立つ（[Ａ]は糖鎖化合物の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、[Ｂ]はレクチンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、[Ａ−Ｂ]は糖鎖化合物とレクチンの結合体の濃度（ｍｏｌ／Ｌ））。

この場合、糖鎖化合物（Ａ）とレクチン（Ｂ）との解離定数Ｋdは、
Ｋd＝[Ａ]×[Ｂ]/[Ａ−Ｂ]

本発明で添加する糖鎖化合物は、前記の通り、標識レクチンとの結合において、測定対象化合物との競合ができるだけ抑えられ、夾雑物との競合が十分生ずるものが好ましく、ｘは、前記のｘ＞aの範囲が好ましい。

（３）添加する糖鎖化合物の例
本発明で添加する糖鎖化合物の好ましい例は、測定対象化合物及び標識レクチンに応じて、表１の通りである。

（４）糖鎖化合物の添加
糖鎖化合物の添加は、標識レクチンを添加し、未反応の標識レクチンを洗浄した後に行うことができ、また、標識レクチンの添加と同時に行うこともできる。

標識レクチンの添加、洗浄後に糖鎖化合物を添加する場合は、リガンドを通して支持体（固相）に捕捉された測定対象化合物の糖鎖及びリガンド等に非特的に結合した夾雑物の糖鎖には既に標識レクチンが結合しており、遊離の標識レクチンが存在しないと考えられ、この場合の糖鎖化合物の添加量は、夾雑物由来のノイズ低減効果が得られるような必要量を添加すれば良い。

標識レクチンの添加と同時に糖鎖化合物を添加する場合は、未反応の標識レクチンが存在していると考えられるので、標識レクチンとの結合において、夾雑物と競合するために十分な量の糖鎖化合物を添加する必要がある。すなわち、糖鎖化合物の添加量が少ないと、添加した全ての糖鎖化合物が未反応の標識レクチンと反応してしまい、競合が起こらない。

４．シグナル強度の測定
本発明の測定法では、リガンド及び測定対象化合物を通して支持体（固相）に捕捉された標識レクチンの発するシグナルの強度を測定する。

本発明において用いられる測定方法は、上記標識レクチンが発するシグナルを測定できるものであれば特に限定されず、それぞれの標識物質に適した当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、放射性物質により標識されたレクチンを検出する場合には、液体シンチレーションやＲＩＡ法により測定することができる。蛍光色素により標識されたレクチンを検出する場合には、ルミノメーター、ＳＰＦＳ測定器等により測定することができる。酵素で標識されたレクチンを検出する場合は、標識された酵素に対応した基質を加えた後に、酵素による基質の化学的変化、例えば、発色、蛍光、化学発光等を測定することができる。

本発明に用いる測定法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光（Surface Plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy:SPFS）法（ＳＰＦＳ）が好適に用いられる。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉された測定対象化合物を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中に測定対象化合物がごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳ法を用いる場合の測定部材は流路、ウエルのいずれの構成もとることができ、センサチップ、反応層、ＳＰＦＳシステム、ＳＰＦＳ測定装置等は通常用いられているものを用いることができる。

５．生体試料中の測定対象化合物の測定
本発明の測定方法を用いた生体試料中の測定対象化合物は、例えば次の（１）〜（６）の工程を順に実施すればよい。
（１）測定対象化合物との結合能を有するリガンドが固相化された測定容器（ウエル、流路等）に生体試料を導入し、測定対象化合物をリガンドに結合させる工程、
（２）工程（１）の測定容器内に標識レクチンを添加し、標識レクチンを測定対象化合物の糖鎖と結合させる工程、
（３）工程（２）の測定容器内を、例えばリン酸バッファー等を用いて洗浄し、未結合の標識レクチンを除去する工程、
（４）工程（３）の測定容器内に本発明の糖鎖化合物を添加し、既に標識レクチンと結合している夾雑物の糖鎖と添加した糖鎖化合物とを競合させる工程、
（５）工程（４）の測定容器内を、例えばリン酸バッファー等を用いて洗浄し、支持体（固相）から遊離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物との結合体を除去する工程、及び
（６）工程（５）の測定容器内の標識レクチンが発するシグナルを測定する工程。

定量にあたっては、例えば、市販の生体試料（血液等）に測定対象化合物の標準品を添加して上記の工程を実施して検量線を作成し、測定する生体試料から得られるシグナル強度をあてはめて、測定する生体試料中の測定対象化合物の濃度を知ることができる。

なお、上記の工程（２）の標識レクチンの添加と工程（４）の糖鎖化合物の添加を同時に行い、工程（３）の洗浄を省略し、工程（５）の洗浄によって、未結合の標識レクチンと固相から遊離した標識レクチンと糖鎖化合物の結合体を同時に除去しても良い。

１．ＳＰＦＳを用いた標識レクチンによる測定（比較例：競合する糖鎖化合物を添加しない場合）
（1-1）ＴＪＡ−IIレクチンの蛍光標識化
ＴＪＡ−IIレクチン〔Trichosanthes japonica Lectin〕（生化学工業(株)）を、Alexa Fluor（商標名）647 タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した。手順は該キットに添付のプロトコールに従った。未反応レクチンや未反応蛍光等を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、Alexa Fluor 647標識ＴＪＡ−II溶液を得た。得られた蛍光標識化ＴＪＡ−IIレクチンの溶液はタンパク定量後、4℃で保存した。

（1-2）ＬＮＣａＰ培養上清の調製
β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基が発現したＰＳＡを産生するＬＮＣａＰ（Human prostate adenocarcinoma cell line）を培養し、上清を回収し、遠心分離後にＰＳＡ濃度をＥＬＩＳＡにて測定し、−80℃で保存した。

（1-3）センサーチップの作製
厚さ1ｍｍのガラス製の透明平面基板「Ｓ−ＬＡＬ10」（(株)オハラ製、屈折率〔ｎd〕＝1.72）を、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ200」（ヤマト科学(株)製）でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該基板の片面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは1〜3ｎｍ、金薄膜の厚さは44〜52ｎｍであった。

次いで、このようにして得られた基板を25ｍｇ/ｍＬに調整した10-カルボキシ-1-デカンチオールのエタノール溶液10ｍＬに24時間浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水（ＭＥＳ）（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。この表面に、2ｍｍ×14ｍｍの穴を有する厚さ0.5ｍｍのシート状のシリコンゴムスペーサを設けることで基板上に流路を形成させ、流路の外側から基板を覆うように厚さ2ｍｍのポリメチルメタクリレート板を乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。

そして、流路に超純水を10分間、その後ＰＢＳを20分間、ペリスタポンプにより、室温、流速500μＬ/ｍｉｎで循環させた。続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を50ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を100ｍＭとを含むＰＢＳを5ｍＬ送液し、20分間循環送液させた後に、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（クローンＮｏ.79；2.5ｍｇ/ｍＬ；(株)ミクリ免疫研究所株式会社製）溶液2.5ｍＬ（抗ＰＳＡモノクローナル抗体濃度を20μｇ/ｍＬに調整）を30分間循環送液することで、ＳＡＭ上に一次抗体を固相化した。最後に重量1％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、30分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、センサーチップを2枚作製した。

（1-4）測定
抗原添加工程：作成した1枚のセンサーチップには、送液をＰＢＳに代え、ＬＮＣａＰ培養上清を市販血清(コージンバイオ社)で希釈し、ＰＳＡ濃度が1.0ｎｇ/ｍＬとなる溶液を0.5ｍＬ添加し、25分間循環させた。作成したもう1枚のセンサーチップには、ＮＣａＰ培養上清を添加していない市販血清(コージンバイオ社)を添加し25分間循環させた。

洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ20を0.05重量％含むＴＢＳを送液として10分間循環させることによって洗浄した。ここでブランクの蛍光を、光源としてレーザ光源を用いて、波長635ｎｍのレーザ光を、光学フィルタ（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、プリズム（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ10」（屈折率〔ｎ〕＝1.72））を通して、センサーチップの金属薄膜に照射し、カットフィルタとして蛍光成分以外の波長をカットするカットフィルタ、対物レンズ（20倍）を用いてＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。

検出工程：前記（1-1）で用意した蛍光標識化レクチン（1ｎｇ/ｍＬ）含むＰＢＳを5ｍＬ添加し、20分間循環させ、その後、Ｔｗｅｅｎ20を0.05重量％含むＴＢＳ溶液へと送液を切り替えて20分後にＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）によりシグナルを取得した。本測定の結果、ＬＮＣａＰ培養上清を添加した実験から得られたシグナル(S)が18000であり、ＬＮＣａＰ培養上清を添加しない実験から得られたシグナル(N)が8900であったことから、Ｓ／Ｎ比は2と算出された。

また、
(a) 生体試料として市販血清（コージンバイオ社)、測定対象化合物としてＰＳＡ、リガンドとして抗ＰＳＡモノクローナル抗体、標識レクチンとしてノダフジレクチン（ＷＦＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ社製）等を使用した場合、及び
(b) 生体試料として市販血清(コージンバイオ社)、測定対象化合物としてα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（ＡＦＰ；2.0ｍｇ/ｍＬ溶液；Acris Antibodies GmbH社製）、リガンドとして抗ＡＦＰモノクローナル抗体（クローン１Ｄ５；1.8ｍｇ/ｍＬ；ミクリ免疫研究所(株)製）、標識レクチンとしてレンズマメレクチン（ＬＣＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、ヒイロチャワンダケレクチン（ＳＳＡ）（Ｊ−ＯＩＬＭＩＬＬＳ社製）等を使用した場合についても、上記と同様に実験を行い、Ｓ／Ｎを求めた。上記(b)の場合、上記（1-3）のセンサーチップの作製におけるＳＡＭ上の一次抗体の固相化では、流路に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液2.5ｍＬ（抗ＡＦＰモノクローナル抗体濃度を50μ/ｍＬに調整）を30分間循環送液した。また、上記（1-4）の抗原添加工程では、1枚のセンサーチップには、ＡＦＰ濃度が3.0ｎｇ/ｍＬとなる溶液（ＡＦＰを市販血清で希釈）を0.5ｍＬ添加し、25分間循環させた。
これらの結果は、表２に示す。

２．ＳＰＦＳを用いた標識レクチンによる測定（実施例：競合する糖鎖化合物を添加する場合）
上記１の検出工程で、蛍光標識化レクチンを含むＰＢＳを添加し、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液を送液して洗浄した後に、糖鎖化合物として、ガラクトシルセラミド（α-Galactosylceramide）（フナコシ社製）、2′-フコシル-D-ラクトース（2′-Fucosyl-D-lactose）（シグマ社製）、ガラクトシルジグリセリド（Galactosyl diglyceride）（シグマ社製）、Fuc-2-Chol（国際公開WO2008/081686号公報の記載に従って合成、下記構造式参照）又はMan-2-Chol（国際公開WO2008/081686号公報の記載に従って合成、下記構造式参照）を濃度0.１重量％で含むＰＢＳ溶液を１０分送液し、標識レクチンと結合している市販血清中の夾雑物と添加した糖鎖化合物を競合させた。次いでＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液を送液して洗浄した。これ以外は上記１と同様に実験し、Ｓ／Ｎを算出した。結果は表２に示す。

（注）上記構造式中で、〜線は糖のアノマー位の立体が、α体及び／又はβ体であることを表す。合成した上記の糖鎖化合物は、α体、β体の混合物であり、また、糖構造もＤ体、Ｌ体の混合物である。

１リガンド（測定対象化合物捕捉物質）
２糖鎖を有する測定対象化合物
３生体試料中の糖鎖を有する夾雑物
４標識レクチンが認識する糖鎖
５標識レクチンが認識しない糖鎖
６固相化層（リガンドを支持体に固相化するためのＣＭＤ等）
７支持体（マイクロプレートのウエル、ＳＰＦＳの透明支持体・金属薄膜、等）
７ａ金属薄膜
７ｂ透明支持体（プリズム）
８標識レクチン
９本発明で添加する糖鎖化合物
１０固相化層（カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ））
１１ＳＡＭ

Claims

標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法（リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む）を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物を添加する測定方法。
添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をｘ、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をａとした場合、ｘがｘ＞ａの範囲である請求項１に記載の測定方法。
測定する生体試料中の糖鎖を有する化合物が、腫瘍マーカーである請求項１又は２に記載の測定方法。
測定対象化合物、標識レクチン及び添加する糖鎖化合物の組合せが次の（１）〜（４）のいずれかである請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
（１）測定対象化合物が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）であり、標識レクチンがキカラスウリレクチン（ＴＪＡ−ＩＩ）であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体又はガラクトース誘導体である。
（２）測定対象化合物が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）であり、標識レクチンがノダフジレクチン（ＷＦＡ）であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体である。
（３）測定対象化合物がα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）であり、標識レクチンがレンズマメレクチン（ＬＣＡ）であり、添加する糖鎖化合物がマンノース誘導体である。
（４）測定対象化合物がα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）であり、標識レクチンがヒイロチャワンダケレクチン（ＳＳＡ）であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体ある。
リガンド（測定対象化合物捕捉物質）を支持体に固相化するための固相化層が糖鎖化合物を含むものであり、当該糖鎖化合物と異なる糖鎖化合物を添加する請求項１〜４のいずれか一つに記載の測定方法。
標識レクチンが発する蛍光を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）で測定する請求項１〜５のいずれか一つに記載の測定方法。