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JPWO2003097862A1 - 抗糖尿病作用を有する物質の探索方法 - Google Patents

抗糖尿病作用を有する物質の探索方法 Download PDF

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JPWO2003097862A1
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聡 中西
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Abstract

本発明によれば、縮合プリン誘導体と、膵臓β細胞若しくは該細胞の処理物または縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を用いた、縮合プリン誘導体と膵臓β細胞若しくは該細胞の処理物との結合を阻害する物質、縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体に結合する蛋白質との結合を阻害する物質、縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の発現、酵素活性を阻害する物質の探索方法が提供される。

Description

技術分野
本発明は糖尿病治療剤、およびインスリン分泌促進剤の探索方法に関する。
背景技術
糖尿病は、インスリンの分泌不足又はその標的細胞側の感受性低下などに基づく糖代謝を中心とした代謝異常であり、高血糖をきたすことが大きな特徴である。高血糖が長期間持続すると、血管障害を主要因として、網膜症、腎症、神経障害など、種々の臓器や神経に深刻な合併症が生じる。従って、糖尿病の治療では血糖値をコントロールして正常値に維持することが極めて重要であり、そのための手段が古くから研究されている。
糖尿病のうち、発症が緩徐で生命維持に必ずしもインスリン治療を必要としない病型（２型糖尿病）では、運動療法や食事療法と薬物の組み合わせにより血糖値をコントロールする治療が行われている。薬物としては、経口血糖低下剤の一種であるスルホニル尿素インスリン分泌促進剤が臨床で広く用いられている。また、最近、ナテグリニドやリパグリニドといった非スルフォニルウレアＫ＋ＡＴＰチャンネルブロッカーであるインスリン分泌促進剤も市販されている。
スルフォニルウレア剤は、膵臓β細胞からのインスリン分泌を促進することにより血糖値を低下させる２型糖尿病の治療薬であり、血糖低下作用の強弱や作用持続時間などの異なる多くの種類のスルフォニルウレア剤が知られている〔Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ １３ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２９，５０５−５２５（１９９４）〕。
しかしながら、スルフォニルウレア剤には共通の副作用や合併症、あるいは、スルフォニルウレア剤に対する無効症が認められている〔Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ １３ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２９，５０５−５２５（１９９４）〕。
スルフォニルウレア剤の使用に際する主たる合併症として低血糖症が挙げられる〔Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．Ｊ．，２９６，９４９−９５０（１９８８）、Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ １３ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２９，５０５−５２５（１９９４）〕。
現在利用可能なスルフォニルウレア剤やナテグリニドやリパグリニドといった非スルフォニルウレアＫ＋ＡＴＰチャンネルブロッカーは、いずれも血糖値に非依存的にインスリン分泌を促進するため、用量を誤ると重篤な低血糖を引き起こす、あるいは十分に血糖値をコントロールできないという問題があり、必ずしも満足できるものではない。過去６ヶ月以内にスルフォニルウレア剤の投与を受けている患者の２０．２％に低血糖症状がみられるとの報告もある〔Ａｃｔａ．Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６０５，７−４８（１９７７）、Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ １３ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２９，５０５−５２５（１９９４）〕。また、上記患者の約６％は低血糖症状を毎月経験している。
上記の理由から、スルフォニルウレア剤やナテグリニドやリパグリニドといった非スルフォニルウレアＫ＋ＡＴＰチャンネルブロッカーとは異なり、低血糖等の合併症を起さない糖尿病治療剤の開発が望まれている。
上記非スルフォニルウレアＫ＋ＡＴＰチャンネルブロッカーとは異なる構造を有する縮合プリン誘導体や、縮環ピラジン誘導体等が血糖値に応じてインスリン分泌を促進できる血糖低下剤となりうることが報告されている（ＷＯ００／０１３８８、ＷＯ０１／４７９３１、特開２０００−１５４１３９）。しかしながら、血糖値に応じてインスリン分泌を促進できる血糖低下剤を効率よく見いだす方法は知られていない。
縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とが、特異的に結合すること、および該結合活性と縮合プリン誘導体の血糖低下作用との間の関係については知られていない。
配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、ｐ３１とも称する）は、いずれもＮＡＤＰＨ依存的なレチノールや短鎖アルコールの酸化還元酵素活性を有する酵素として知られいる〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３８，４７（１９９７）〕が、該酵素と糖尿病との関連に関する報告は無い。
トリアジン誘導体は、キナーゼ阻害作用を有し、糖尿病の治療に用いることができることが知られている（ＷＯ０１／４７９２１）が、具体的に糖尿病治療作用を有することは示されていない。また、トリアジン誘導体がインスリン分泌作用を有することも知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、低血糖症等の合併症を引き起こさない糖尿病治療薬、およびインスリン分泌促進剤の探索方法を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討の結果、縮合プリン誘導体のインスリン分泌促進活性と、縮合プリン誘導体と該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質との結合活性が相関することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）［１］被検物質存在下、下記の一般式（Ｉ）
Figure 2003097862
（式中、Ｒ１Ａは水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、又は置換若しくは非置換の芳香族複素環基を示し、Ｒ２Ａは水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアラルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、又は置換若しくは非置換の芳香族複素環基を示し、Ｒ３Ａは水素原子、低級アルキル基又は置換若しくは非置換のアラルキル基を示し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアラルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を示し、ｎは０〜３の整数を示す）で表わされる化合物、または下記の一般式（ＩＩ）
Figure 2003097862
｛式中、Ｘ…Ｙ…ＺはＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表す）またはＮ＝Ｃ−Ｗ［式中、Ｗはハロゲン、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、−ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表すか、Ｒ４とＲ５が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成する）、−ＯＲ６（式中、Ｒ６は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表す）、−ＳＲ６ａ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ６と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルまたはシアノを表す］を表し、Ｒ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記Ｒ４およびＲ５と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌはハロゲンを表す）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記Ｒ４およびＲ５と同義である）または−ＣＨＯを表し、Ｒ３は水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは低級アルコキシアルキルを表し、ｎは０〜３の整数を表し、Ｖ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｖ２は置換低級アルキルまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｖ１が水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表し、かつ（ａ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１ａＮ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１ａは前記Ｒ１の定義中、置換低級アルキル以外の基を表す）を表し、Ｒ２が置換低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌは前記と同義である）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記と同義である）または−ＣＨＯを表すか、（ｂ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１は前記と同義である）を表し、Ｒ３が低級アルコキシアルキルを表すか、（ｃ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１ｂＮ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１ｂは置換低級アルキルを表す）を表すか、（ｄ）Ｘ…Ｙ…ＺがＮ＝Ｃ−Ｗ（式中、Ｗは前記と同義である）を表し、Ｒ２が置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌは前記と同義である）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記と同義である）または−ＣＨＯを表すか、（ｅ）Ｘ…Ｙ…ＺがＮ＝Ｃ−Ｗ（式中、Ｗは前記と同義である）を表し、Ｒ３が低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは低級アルコキシアルキルを表す場合、Ｖ２は低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表してもよい｝で表される化合物から選ばれる化合物（以下、縮合プリン誘導体と略す）と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合を阻害する物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
（２）［１］被検物質存在下、上記（１）の縮合プリン誘導体と該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質の結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と該蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質の結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合を阻害する物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
（３）［１］被検物質存在下、上記（１）の縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合を阻害する物質を選択する工程、［５］［４］の工程で得られる物質より、縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質の探索方法。
（４）［１］被検物質存在下、上記（１）の縮合プリン誘導体と該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と該蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合を阻害する物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質の探索方法。
（５）［１］被検物質と上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該蛋白質の活性を測定する工程、［２］被検物質を接触させない場合での該蛋白質の活性を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質の活性を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の活性を変化させる物質の探索方法。
（６）［１］被検物質と上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該蛋白質の活性を測定する工程、［２］被検物質を接触させない場合での該蛋白質の活性を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質の活性を抑制する物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の活性を抑制する物質の探索方法。
（７）［１］被検物質と上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の細胞応答を測定する工程、［２］被検物質非存在下での該形質転換体の細胞応答を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該形質転換株の細胞応答を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の機能を変化させる物質の探索方法。
（８）［１］被検物質と上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程、［２］被検物質非存在下での該形質転換体の該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質の探索方法。
（９）［１］被検物質と上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の該蛋白質の発現量を測定する工程、［２］被検物質非存在下での該形質転換体の該蛋白質の発現量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質の発現量を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の発現量を変化させる物質の探索方法。
（１０）縮合プリン誘導体が下記式（ＩＩＩ）
Figure 2003097862
で表される化合物である上記（１）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
（１１）上記（１）の縮合プリン誘導体を固定化した担体を用いることを特徴とする上記（２）および（４）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
（１２）担体が、セファロース粒子である上記（１１）の探索方法。
（１３）縮合プリン誘導体が下記式（ＩＶ）
Figure 2003097862
で表される化合物である上記（１１）または（１２）の探索方法。
（１４）上記（１）の縮合プリン誘導体を固定化した担体。
（１５）縮合プリン誘導体が、上記（１３）の式（ＩＶ）で表される縮合プリン誘導体である上記（１４）の担体。
（１６）担体が、セファロース粒子である上記（１４）または（１５）の担体。
（１７）上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質が、下記［ｉ］〜［ｉｉｉ］から選ばれるいずれか１つの蛋白質である上記（２）および（４）〜（１３）のいずれか１つに記載の探索方法。
［ｉ］配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［ｉｉ］配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質
［ｉｉｉ］配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ上記（１）の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質
（１８）上記（１）〜（１３）および（１７）のいずれか１つの探索方法で得られる物質または該物質の薬学的に許容される塩。
（１９）上記（１８）の物質または該物質の薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
（２０）上記（１８）の物質または該物質の薬学的に許容される塩を有効成分として含有する糖尿病治療剤。
（２１）上記（１８）の物質または該物質の薬学的に許容される塩を有効成分として含有するインシュリン分泌促進剤。
（２２）下記の一般式（Ｖ）
Figure 2003097862
［式中、Ｒ１Ｂ、Ｒ２ＢおよびＲ３Ｂは同一または異なって、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、またはＮを含有する置換若しくは非置換の複素環基（該複素環基はＮ原子でトリアジン環に結合する）を表す］で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するインシュリン分泌促進剤。
（２３）上記（２２）の一般式（Ｖ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含むインシュリン分泌の促進方法。
（２４）インシュリン分泌促進剤の製造のための上記（２２）の一般式（Ｖ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
以下、本発明について、詳細に説明する。
１．本発明の探索方法に用いられる縮合プリン誘導体
本発明の探索方法に用いられる縮合プリン誘導体とは、下記の一般式（Ｉ）
Figure 2003097862
（式中、Ｒ１Ａは水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、又は置換若しくは非置換の芳香族複素環基を示し、Ｒ２Ａは水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアラルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、又は置換若しくは非置換の芳香族複素環基を示し、Ｒ３Ａは水素原子、低級アルキル基又は置換若しくは非置換のアラルキル基を示し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアラルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を示し、ｎは０〜３の整数を示す）で表わされる化合物、または下記の一般式（ＩＩ）
Figure 2003097862
｛式中、Ｘ…Ｙ…ＺはＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表す）またはＮ＝Ｃ−Ｗ［式中、Ｗはハロゲン、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、−ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表すか、Ｒ４とＲ５が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成する）、−ＯＲ６（式中、Ｒ６は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表す）、−ＳＲ６ａ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ６と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルまたはシアノを表す］を表し、Ｒ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記Ｒ４およびＲ５と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌはハロゲンを表す）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記Ｒ４およびＲ５と同義である）または−ＣＨＯを表し、Ｒ３は水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは低級アルコキシアルキルを表し、ｎは０〜３の整数を表し、Ｖ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｖ２は置換低級アルキルまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｖ１が水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表し、かつ（ａ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１ａＮ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１ａは前記Ｒ１の定義中、置換低級アルキル以外の基を表す）を表し、Ｒ２が置換低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌは前記と同義である）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記と同義である）または−ＣＨＯを表すか、（ｂ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１は前記と同義である）を表し、Ｒ３が低級アルコキシアルキルを表すか、（ｃ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１ｂＮ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１ｂは置換低級アルキルを表す）を表すか、（ｄ）Ｘ…Ｙ…ＺがＮ＝Ｃ−Ｗ（式中、Ｗは前記と同義である）を表し、Ｒ２が置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌは前記と同義である）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記と同義である）または−ＣＨＯを表すか、（ｅ）Ｘ…Ｙ…ＺがＮ＝Ｃ−Ｗ（式中、Ｗは前記と同義である）を表し、Ｒ３が低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは低級アルコキシアルキルを表す場合、Ｖ２は低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表してもよい｝で表される化合物から選ばれる化合物（以下、縮合プリン誘導体と略す）である。
式（Ｉ）の各基の定義において、低級アルキル基又は低級アルキル部分を含む置換基（例えばアラルキル基）の低級アルキル部分としては、炭素原子数１個〜９個程度のアルキル基を用いることができ、アルキル基という用語には、直鎖状、分枝鎖状、環状、及びこれらの組み合わせからなるアルキル基が包含される。環状アルキル基又はアルキル基中の環状アルキル部分は、１又は２個以上の環を有していてもよい。Ｒ１Ａが示す低級アルキル基としては、直鎖若しくは分枝鎖状の低級アルキル基、又は１〜３環性の環状低級アルキル基（例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、３−ノルアダマンチル基など）が好ましく、Ｒ２Ａが示す低級アルキル基としては、直鎖若しくは分枝鎖状の低級アルキル基、又は単環性の環状低級アルキル基が好ましい。
直鎖状又は分枝鎖状の低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、又はｎ−ノニル基などをあげることができる。環状低級アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、ノルアダマンチル基、アダマンチル基などをあげることができる。これらのうち、ｔｅｒｔ−ブチル基又はシクロペンチル基が好ましい。
アリール基又はアリール部分を含む置換基（アラルキル基など）におけるアリール部分としては、単環性又は２以上の縮合環からなる芳香族基を用いることができる。より具体的には、環構成炭素原子数が６〜１４個程度のアリール基が好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、又はアントラニル基などを好適に用いることができる。アラルキル基としては、例えば、炭素数７〜１５個のアラルキル基を用いることができ、より具体的には、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ベンズヒドリル基、ナフチルメチル基などを用いることができる。
芳香族複素環基としては、単環性又は２以上の縮合環からなる芳香族複素環基を用いることができる。芳香族複素環基に含まれるヘテロ原子の種類及び個数は特に限定されないが、例えば、窒素原子、硫黄原子、及び酸素原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を１個又は２個以上含んでいてもよい。より具体的には、環構成原子数が６から１４個程度の芳香族複素環基が好ましく、例えば、フリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、インドリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、フタラジニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、又はプリニル基などを好適に用いることができる。
アリール環又は芳香族複素環に置換基が存在する場合には、その置換基の種類及び個数は特に限定されることはなく、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい。例えば、環上に１個〜３個程度の置換基を有していてもよい。アリール環上又は芳香族複素環上の置換基としては、例えば、置換若しくは非置換の低級アルキル基、置換若しくは非置換の低級アルケニル基、置換若しくは非置換の低級アルキニル基、置換若しくは非置換のアラルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、ヒドロキシル基、置換若しくは非置換の低級アルコキシ基、置換若しくは非置換のアラルキルオキシ基、置換若しくは非置換のアリールオキシ基、置換若しくは非置換のアロイル基、低級アルコキシカルボニル基、置換若しくは非置換の低級アルキルチオ基、置換若しくは非置換の低級アルキルスルホニル基、カルボキシル基、置換若しくは非置換のカルバモイル基、置換若しくは非置換の低級アルカノイル基、ハロゲン原子（本明細書においてハロゲン原子という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、ニトロ基、アミノ基、モノ若しくはジ低級アルキル置換アミノ基、シアノ基などをあげることができる。
上記の官能基において、低級アルキル基又は低級アルキル部分を含む官能基（例えば、アラルキル基、低級アルコキシ基、アラルキルオキシ基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイル基、モノ若しくはジ低級アルキル置換アミノ基など）の低級アルキル部分としては、上記に説明したものを用いることができる。低級アルキル基又は低級アルキル部分が置換基を有する場合、置換基の個数及び種類は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合にはそれらは同一でも異なっていてもよい。例えば、１個〜３個程度の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホ基、ホスホノ基、これらの酸性基から誘導されるエステル基（低級アルキルエステル、アラルキルエステル、アリールエステルなど）などをあげることができる。置換基を有するアルキル基の例として、より具体的には、ヒドロキシエチル基、トリフルオロメチル基などをあげることができる。ジ低級アルキル置換アミノ基において、２個のアルキル基は同一でも異なっていてもよい。
また、上記の官能基において、アラルキル基又はアラルキルオキシ基のアラルキル部分は前記アラルキル基と同義であり、アリール基、アリールオキシ基、又はアロイル基のアリール部分は前記アリール基と同義である。低級アルケニル基としては、直鎖又は分枝鎖状の炭素数２〜６のアルケニル基を用いることができる。例えば、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、メタクリル基、ブテニル基、クロチル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などを用いることができる。低級アルキニル基としては、直鎖又は分枝鎖状の炭素数２〜６のアルキニル基を用いることができる。例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などを用いることができる。低級アルケニル基又はアルキニル基における不飽和結合の個数は特に限定されないが、好ましくは１個である。
上記低級アルケニル基、低級アルキニル基、アラルキル基、アリール基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基、アロイル基が置換基を有する場合、置換基の個数、種類、又は置換位置は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合にはそれらは同一でも異なってもよい。例えば１〜３個程度の置換基を有していてもよい。置換基としては低級アルキル基についての置換基として例示したものを用いることができる。
なお、上記の一般式（Ｉ）において、Ｘ１又はＸ２の置換位置は特に限定されることはなく、それぞれ環上の任意の位置に置換可能である。また、Ｘ１又はＸ２が水素原子以外の置換基である場合、それらが結合する炭素原子の立体配置はＳ又はＲのいずれでもよい。ｎは０であることが好ましい。
式（ＩＩ）の各基の定義において、低級アルキル、低級アルキルチオ、低級アルコキシカルボニルおよび低級アルコキシアルキルの低級アルキル部分としては、炭素原子数１〜１０個程度の、直鎖状、分枝鎖状、環状およびこれらの組み合わせからなるアルキルが包含される。環状の低級アルキルは、１または２個以上の環を有していてもよい。直鎖状または分枝鎖状の低級アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどが挙げられる。環状の低級アルキルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、１−メチルシクロヘキシル、４−メチルシクロヘキシル、ノルアダマンチル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．３．０］オクチル、ビシクロ［３．３．１］ノニルなどが挙げられる。
低級アルコキシアルキルおよびアラルキルのアルキレン部分は、前記直鎖状または分枝鎖状低級アルキルから水素原子を一つ除いたものと同義である。
アリールおよびアラルキルのアリール部分は、単環性または２つ以上の縮合環からなり、環構成炭素原子数が６〜１４個程度の、例えば、フェニル、ナフチル、インデニル、アントラニルなどが挙げられる。
芳香族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性芳香族複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性芳香族複素環基などが挙げられ、より具体的には、環構成原子数が５〜１４個程度の、例えば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、インドリル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プリニルなどが挙げられる。
脂環式複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性脂環式複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性脂環式複素環基などが挙げられ、より具体的には、ピロリジニル、２，５−ジオキソピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、２−オキソオキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノキサリニル、オクタヒドロキノリル、ジヒドロインドリル、１，３−ジオキソイソインドリニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジオキソラン−２−スピロシクロペンチルなどが挙げられる。
隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも１個の窒素原子を含む５員または６員の単環性複素環基（該単環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で少なくとも１個の窒素原子を含む縮環性複素環基（該縮環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）などが挙げられ、より具体的には、ピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジノ、ホモピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、オクタヒドロキノリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、プリニル、ジヒドロインドリル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリルなどがあげられる。
ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子が挙げられる。
置換アリール、置換アラルキル、置換芳香族複素環基および置換脂環式複素環基の置換基としては、同一または異なって、置換数１〜３の置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアラルキルオキシ、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルキルチオ、置換もしくは非置換の低級アルキルスルホニル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、モノもしくはジ低級アルキル置換カルバモイル、モノもしくはジ低級アルキル置換アミノ、ハロゲン、カルボキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、シアノなどをあげることができる。ここで、低級アルケニルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数２〜６の、例えばビニル、アリル、１−プロペニル、メタクリル、ブテニル、クロチル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられ、低級アルキニルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数２〜６の、例えばエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどが挙げられる。低級アルケニルおよび低級アルキニルにおける不飽和結合の個数は特に限定されないが、好ましくは１個である。低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルチオ、低級アルキルスルホニル、低級アルカノイル、モノもしくはジ低級アルキル置換カルバモイルおよびモノもしくはジ低級アルキル置換アミノの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アラルキルおよびアラルキルオキシのアルキレン部分は前記アルキレン部分と同義である。アリール、アリールオキシおよびアロイルのアリール部分は前記アリールと同義である。ハロゲンは前記ハロゲンと同義である。置換低級アルキル、置換アリール、置換アリールオキシ、置換アロイル、置換アラルキル、置換アラルキルオキシ、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換低級アルコキシ、置換低級アルコキシカルボニル、置換低級アルキルチオ、置換低級アルキルスルホニルおよび置換低級アルカノイルの置換基としては、同一または異なって置換数１〜３のヒドロキシ、前記と同義のハロゲン、カルボキシ、スルホ、ホスホノ、これらの酸性基から誘導されるエステル（低級アルキルエステル、アラルキルエステル、アリールエステルなど；これらエステルの低級アルキル部分、アラルキル部分およびアリール部分はそれぞれ前記と同義である）などをあげることができる。ジ低級アルキル置換カルバモイルおよびジ低級アルキル置換アミノにおいて、それぞれカルバモイルおよびアミノに結合する２個の低級アルキルは同一でも異なっていてもよい。
置換低級アルキルの置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の低級アルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、アジド、カルボキシ、ホスホノもしくはこれらの酸性基から誘導されるエステル（低級アルキルエステル、アラルキルエステル、アリールエステルなど；これらエステルの低級アルキル部分、アラルキル部分およびアリール部分はそれぞれ前記と同義である）、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノカルボニル、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、−ＮＲ１１Ｒ１２（式中、Ｒ１１およびＲ１２は同一または異なって水素原子、低級アルキル、低級アルカノイル、アリール、アラルキルまたはアラルキルオキシを表すか、Ｒ１１とＲ１２が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成する）、ハロゲン、低級アルキルで置換されていてもよいアリールスルホニルオキシ、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシなどがあげられる。
ここで、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノカルボニル、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイル、低級アルキルで置換されていてもよいアリールスルホニルオキシ、低級アルキルスルホニルおよび低級アルキルスルホニルオキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義である。アリール、アラルキル、アラルキルオキシおよびアリールスルホニルオキシのアリール部分は前記アリールと同義である。アラルキルのアルキレン部分は、前記アルキレン部分と同義である。ハロゲン、芳香族複素環基、脂環式複素環基および隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基は、それぞれ前記と同義である。置換芳香族複素環基および置換脂環式複素環基の置換基は、前記と同義である。
また式（ＩＩ）において、Ｖ１またはＶ２の置換位置は特に限定されることはなく、それぞれ環上の任意の位置に置換可能である。また、Ｖ１またはＶ２が水素原子以外の置換基である場合、それらが結合する炭素原子の立体配置はＳまたはＲのいずれでもよい。ｎは０であることが好ましい。
本発明に用いられる化合物として、好適には、式（Ｉ）中、Ｒ１が水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、又は置換若しくは非置換の芳香族複素環基であり、Ｒ２が低級アルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基であり、Ｒ３が水素原子、又は置換若しくは非置換のアラルキル基であり、Ｘ１が水素原子、低級アルキル基、又は置換若しくは非置換のアラルキル基であり、Ｘ２が水素原子であり、ｎが０である化合物、または、式（ＩＩ）中、Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表す）であり、Ｒ２が水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換の芳香族複素環基であり、Ｒ３が水素原子、又は低級アルキルであり、Ｖ１が水素原子であり、Ｖ２が置換低級アルキルであり、ｎが０である化合物であり、さらに好適には、式（Ｉ）中、Ｒ１が水素原子、ｎ−プロピル基、シクロペンチル基またはｔｅｒｔ−ブチル基であり、Ｒ２がｎ−プロピル基、エチル基、又はベンジル基であり、Ｒ３が水素原子、メチル基、又はベンジル基であり、Ｘ１が水素原子、低級アルキル基、又は置換若しくは非置換のアラルキル基であり、Ｘ２が水素原子であり、ｎが０である化合物又は、式（ＩＩ）中、Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１はエチル基、ｎ−プロピル基、シクロプロピルメチル基、又はベンジル基を表す）であり、Ｒ２がｎ−プロピル基、シクロブチル基、又はシクロペンチル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｖ１が水素原子であり、Ｖ２がピコリル基であり、ｎが０である化合物をあげることができる。
本発明に用いられる、より好適な縮合プリン誘導体としては、具体的には、下記第１表の化合物をあげることができる。
Figure 2003097862
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さらに好適な化合物としては、下式（ＩＩＩ）
Figure 2003097862
で表される上記第１表中の化合物番号１６で表される化合物（以下、化合物１６と称すこともある）をあげることができる。
２．本発明の探索方法に用いられる縮合プリン誘導体の製造方法
上記式（Ｉ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法は、ＷＯ ９８／１５５５５に具体的に記載されており、また特開平３−２０４８８０、ＷＯ ００／０１３８８、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，３５７８（１９９２）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，２５０８（１９９３）、Ｊ．Ｈｅｔｅｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．，３０，２４１（１９９３）などにも説明されている。
上記式（ＩＩ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法は、ＷＯ ０１／４７９３１などに具体的に記載されている。
また、原料化合物および中間体化合物における各官能基の変換および置換基に含まれる官能基の変換は、上記文献記載の方法以外にも公知の他の方法〔例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９９）に記載の方法等〕によっても行うことができる。
上記の方法等を適宜組み合わせて、また必要に応じてそれらの方法に修飾および改変を加えることにより、上記式（Ｉ）および（ＩＩ）に包含されるいずれの化合物も製造することができる。
上記製造方法において得られる中間体化合物および目的化合物は、有機合成化学で常用される精製方法、例えば中和、濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィーなどの手段により単離・精製することができる。また、中間体化合物は、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表される化合物の塩を製造する場合には、遊離形態の化合物を適当な溶媒に溶解又は懸濁させた後、適宜の酸または塩基を加えて塩を形成させ、必要に応じて分離・精製すればよい。塩の形態で得られた目的物質を遊離形態に変換した後、所望の塩に変換することも可能である。
３．縮合プリン誘導体および膵臓β細胞または該細胞の処理物を用いた抗糖尿病作用を有する物質の探索方法
▲１▼被検物質存在下、上記１．に記載の縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量と、▲２▼被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較し、▲４▼被検物質より縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合を阻害する物質を選択することにより、抗糖尿病作用を有する物質を選択することができる。
［１］標識化縮合プリン誘導体の製造方法
上記探索方法には、上記１の縮合プリン誘導体をそのまま用いることもできるが、標識された該縮合プリン誘導体を用いることが好ましい。
標識された該化合物としては、例えば３Ｈ、１２５Ｉ、１３Ｃなどによる放射標識、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチアネート）などによる蛍光標識、ビオチン標識された該縮合プリン誘導体などをあげることができるが、好ましくは３Ｈにより放射標識された該縮合プリン誘導体をあげることができる。
上記１の縮合プリン誘導体は、周知の方法に準じて標識することができ、例えば放射標識する場合は、上記２の本発明の探索方法に用いる縮合プリン誘導体を合成する際に、市販されている放射標識された原料を用いる方法、例えば官能基にハロゲン基を有する縮合プリン誘導体と放射性同位元素を有する水素とを直接接触反応させることにより、上記１の縮合プリン誘導体に該放射性元素を導入する方法をあげることができる。
具体的には、上記探索方法に化合物１６の標識体を用いる場合、第１表中の化合物番号２３で表される化合物のＲ体をパラジウム存在下、３Ｈガス雰囲気で接触水素化することにより化合物１６の３Ｈ標識体を得ることができる。
Figure 2003097862
［２］膵臓β細胞または該細胞の処理物の調製方法
本発明の探索方法に用いられる膵臓β細胞または該細胞の処理物は、いずれの動物由来の細胞または該細胞の処理物であってもよいが、好ましくはラット、マウス、イヌ、ヒト等由来の該細胞または該細胞の処理物をあげることができる。
また、本発明の探索方法には、縮合プリン誘導体との特異的な結合が認められる限りにおいて、膵臓β細胞を含有する臓器または組織を用いることもできる。
具体的には、本発明の探索方法には、ラット、マウス、イヌ、ヒト等の動物の膵臓、ランゲルハンス氏島、膵臓から単離することができる膵臓β細胞そのもの、あるいは該細胞を培養して得られる細胞培養物、またはそれらの処理物を用いることができる。
膵臓β細胞としては、常法に従い膵臓から単離できる膵臓β細胞そのものを用いることができるが、不死化または細胞株化した細胞を用いることが好ましい。不死化または細胞株化された膵臓β細胞として、具体的には、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，１１３２−１１４０（１９９６）〕、ＩＮＳ−１細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１６７−１７８（１９９２）〕、βＴＣ細胞〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，９０３７−９０４１（１９８８）〕、あるいは、ＭＩＮ６細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６−１３２（１９９０）〕、ＲＩＮｍ５Ｆ〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３１，５２１−５３１（１９８２）〕、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７７）などをあげることができ、より好ましくはＭＩＮ６細胞をあげることができる。
膵臓β細胞の処理物としては、膵臓β細胞または該細胞を含有する組織の界面活性剤処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理物、酵素処理物、膵臓β細胞または該細胞を含有する組織の固定化物、膵臓β細胞または該細胞を含有する組織から常法によって調製することができる細胞膜画分、蛋白質分画物、酵素標品などをあげることができる。
上記界面活性剤処理物は、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＮＰ−４０、ジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、シュークロース モノカプロネート（ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｏｎｏｃａｐｒｏｎａｔｅ）などの動物細胞膜の可溶化に一般的に用いられている界面活性剤を用いて調製することができる。
機械的摩砕処理物は、ホモゲナイザー、超音波、フレンチプレスなどを用いて調製することができる。
蛋白質分画物および酵素標品は、細胞または組織の機械的摩砕処理物から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いることで調製することができる。
［３］標識化縮合プリン誘導体と膵臓β細胞またはその処理物との結合体の検出方法
標識化縮合プリン誘導体と膵臓β細胞またはその処理物との結合体は、膵臓β細胞またはその処理物と結合した標識化縮合プリン誘導体と未結合の標識化縮合プリン誘導体を分離後、標識化縮合プリン誘導体を検出することで測定することができる。
膵臓β細胞またはその処理物と結合した標識化縮合プリン誘導体と未結合の標識化縮合プリン誘導体とを分離する方法としては、膵臓β細胞または非溶解性の膵臓β細胞の処理物を用いて結合実験を行う場合は、遠心分離により分離する方法をあげることができる。膵臓β細胞の処理物が、蛋白質画分あるいは酵素標品等の可溶性物質である場合は、ゲル濾過により蛋白質あるいは酵素標品等を含む画分を分離する方法をあげることができる。
標識化縮合プリン誘導体は、該誘導体を放射性同位体で標識した場合は、液体シンチレーションカウンター等を用いて、蛍光物質で標識した場合は蛍光検出器等を用いて、ビオチンで標識した場合は、適当な酵素を結合させたアビジンと反応させた後、該酵素活性を測定することにより検出・測定することができ、該測定値から標識化縮合プリン誘導体と膵臓β細胞またはその処理物との結合体の量を決定することができる。
［４］インスリン分泌促進活性の測定方法
上記方法により縮合プリン誘導体と膵臓β細胞またはその処理物との結合を阻害する物質として選択される物質が抗糖尿病作用を有する物質であることは、例えば膵臓β細胞または該細胞を含有する組織と上記で選択される物質とをグルコース存在下で接触させたとき、該物質との接触により膵臓β細胞のインスリン分泌が促進されることにより確認することができる〔Ｄｉａｂｅｔｏｒｏｇｉａ，３６，１１３９（１９９３）〕。
縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合活性を指標に、その結合を阻害する物質を選択することを特徴とする抗糖尿病作用を有する物質の探索方法である上記［１］〜［３］の探索方法は、膵臓β細胞のインスリン分泌促進活性を指標に、直接、該活性を促進する物質を探索する方法に比べ、操作性、迅速性等の面で格段に優れた方法である。
４．縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を用いた抗糖尿病作用を有する物質の探索方法
［１］縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の選択方法
本発明で用いられる縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の選択方法としては、縮合プリン誘導体と特異的に結合する蛋白質を選択する方法であれば、いかなる公知の方法も用いることができ、例えば、縮合プリン誘導体を、担体と呼ぶ不溶性の高分子に固定化して、結合活性評価に用いる細胞の抽出液と混合後、洗浄して、縮合プリン誘導体に結合している分子を同定するアフィニティー精製法［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ９），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（２００１）］等をあげることができる。
（１）担体の調製方法
本発明で用いられる縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を選択するために用いられる担体は、縮合プリン誘導体が固定化できる担体であればいかなる担体も用いることができる。好ましくは、縮合プリン誘導体と化学反応により結合することができる官能基を担体表面に有し、かつ蛋白質の非特異的吸着の少なく、操作性が優れた担体が望ましい。
具体的には、例えば担体の材質としては、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等をあげることができる。担体の大きさとしては、直径１０ｎｍから１ｍｍ、好ましくは５０ｎｍから１００μｍの粒子をあげることができる。担体の形状としては、多孔質、貫通孔質、無孔質などをあげることができる。本発明で用いられるより好ましい担体としては、例えば、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（バイオラッド社製）等をあげることができる。
本発明で担体に固定化できる縮合プリン誘導体は、担体に固定化できる縮合プリン誘導体であればいかなる縮合プリン誘導体でも用いることができる。担体に固定化できる縮合プリン誘導体の具体例としては下記式（ＩＶ）
Figure 2003097862
で表される化合物（以下、化合物１５５と称す）をあげることができる。
縮合プリン誘導体を担体に結合させる化学反応は、本発明での使用に支障の無い限りいかなる反応でも良い。
担体上の官能基と縮合プリン誘導体を反応させることにより縮合プリン誘導体固定化担体を作製することができる。例えば、官能基としてカルボン酸スクシンイミドを有する担体を縮合プリン誘導体の溶液と接触し、担体上のカルボン酸スクシンイミド基と縮合プリン誘導体を反応させることができる。この時の溶媒と反応条件は、上記の固定化反応が進む溶媒と反応条件の組み合わせであって、カルボン酸スクシンイミドを有する担体、縮合プリン誘導体が、上記の固定化反応以外の分解反応や縮合反応等を、本発明の目的を阻害するほど起こさない溶媒と反応条件の組み合わせであればいかなる溶媒と反応条件の組み合わせでも良い。具体的には、カルボン酸スクシンイミドを有する担体を１μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの縮合プリン誘導体を含有する溶液と接触させ、静置して、あるいは、ローテーター、ミキサーなどで穏やかに攪拌しながら、０℃〜１００℃で１秒〜１０００時間反応させ、縮合プリン誘導体固定化担体を調製することができる。溶媒としては、例えば、塩、界面活性剤、緩衝成分を含む水溶液、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、メタノール等をあげることができる。
反応終了後、未反応の縮合プリン誘導体を除くために、縮合プリン誘導体が固定化された担体を洗浄する。洗浄方法は、縮合プリン誘導体が固定化された担体が安定で効率的に回収され、未反応縮合プリン誘導体が効率的に除去できる方法であれば、公知のいかなる方法も用いることができる。例えば、担体が粒子であれば、反応終了後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間、室温）し、上清を除去後、溶媒に懸濁し、同様に遠心分離、上清除去を繰り返すことにより洗浄することができる。担体がプレートであれば、プレートを溶媒で洗浄することができる。また、必要に応じて、同様の方法により、保存や細胞抽出液との混合に適した溶媒に置換することもできる。溶媒としては、例えば、塩、界面活性剤、緩衝成分を含む水溶液、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジオキサン、メタノール等をあげることができる。
縮合プリン誘導体固定化担体上に未反応の官能基が残っている場合は、必要に応じて、未反応官能基をブロッキングすることができる。ブロッキングは、官能基と反応し、かつ担体に固定化された縮合プリン誘導体とは反応しない化合物と縮合プリン誘導体固定化担体とを反応させることにより行うことができる。ブロッキングには、官能基と反応し、かつ担体に固定化された縮合プリン誘導体とは反応しない化合物であればいずれも用いることができる。例えば、担体の官能基がカルボン酸スクシンイミドであれば、トリス、エタノールアミンなどを用いて、縮合プリン誘導体固定化担体上の未反応のカルボン酸スクシンイミド基をブロッキングすることができる。
本発明に用いられる縮合プリン誘導体は、スペーサー化合物を介して担体に固定化することもできる。スペーサー化合物は、本発明での使用に支障の無い限りいかなる化合物でも良いが、例えば、Ｐｉｅｒｅｃｅ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社およびＳｈｅａｒ Ｗａｔｅｒ社等から市販されているスペーサー化合物ををあげることができる。具体的には、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６−［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ（ＬＣ−ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｅｃｅ社製）、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（Ｓ−１５３１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）等をスペーサー化合物としてあげることができる。また、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−ｎ−酪酸等をスペーサー化合物として用いることもできる。
スペーサー化合物を介した縮合プリンと担体の結合方法は、本発明での使用に支障の無い限りいかなる方法でも良いが、例えば、担体にスペーサー化合物を導入後、縮合プリン誘導体と該スペーサー化合物とを結合させる方法や、縮合プリン誘導体にスペーサー化合物を結合後、担体に該スペーサー化合物を固定化する方法をあげることができる。
また、これらのスペーサー化合物の一方の官能基を化学的に保護して、担体或いは縮合プリン誘導体と反応後、生成物を脱保護し、縮合プリン誘導体或いは担体と反応させて、縮合プリン誘導体固定化担体を調製することもできる。
担体にスペーサー化合物を導入後、縮合プリン誘導体を結合させる方法では、例えば、官能基としてカルボン酸スクシンイミド基を有する担体と、１級または２級アミンを持つカルボン酸化合物であるスペーサー化合物とを反応させることにより、担体表面にカルボキシル基を持つ担体を作ることができる。１級アミンまたは２級アミンを有するカルボン酸化合物としては、例えば、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−ｎ−酪酸等をあげることができる。
この時の溶媒と反応条件は、上記の固定化反応が進む溶媒と反応条件の組み合わせであって、担体、スペーサー化合物が、上記の固定化反応以外の分解反応や縮合反応等を、該固定化反応を阻害するほど起こさない溶媒と反応条件の組み合わせであればいかなる溶媒と反応条件の組み合わせでも良い。具体的には、担体を１μｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｏｌ／ｌの１級または２級アミンを持つ化合物、例えば６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−ｎ−酪酸等を含有する溶液と接触させ、静置して、あるいは、ローテーター、ミキサーなどで穏やかに攪拌しながら、０℃〜１００℃で１秒〜１０００時間反応させ、表面にカルボキシル基を持つ担体を調製することができることができる。溶媒としては、例えば、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジオキサン、メタノール等をあげることができる。
反応終了後、未反応のスペーサー化合物を除くために、担体を洗浄する。洗浄方法は、スペーサー化合物が固定化された担体が安定で効率的に回収され、未反応のスペーサー化合物が効率的に除去できる方法であれば、公知のいかなる方法も用いることができる。例えば、担体が粒子であれば、反応終了後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間、室温）し、上清を除去後、溶媒に懸濁し、同様に遠心分離、上清除去を繰り返すことで洗浄することができる。担体がプレートであれば、プレートを溶媒で洗浄することができる。また、必要に応じて、同様の方法で、以降の反応に適した溶媒に置換することもできる。
このようにして得られた担体上のカルボキシル基と縮合プリン誘導体とを反応させることにより縮合プリン誘導体固定化担体を作製することができる。具体的には、スペーサー化合物が固定化された担体と縮合プリン誘導体溶液とを接触させ、担体上のカルボキシル基と縮合プリン誘導体とを反応させることができる。
この時の溶液と反応条件は、上記の固定化反応が進む溶液と反応条件の組み合わせであって、スペーサー化合物が固定化された担体、縮合プリン誘導体が、上記の固定化反応以外の分解反応や縮合反応等を、該固定化反応を阻害するほど起こさない溶液と反応条件の組み合わせであればいかなる溶液と反応条件の組み合わせでも良い。具体的には、スペーサーが固定化された担体と、１μｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｏｌ／ｌの縮合プリン誘導体を含有する溶液とを接触させ、静置して、または、ローテーター、ミキサーなどで穏やかに攪拌しながら、０℃〜１００℃で１秒〜１０００時間反応させ、担体表面に縮合プリン誘導体を固定化した担体を調製することができる。溶液としては、例えば、塩、界面活性剤、緩衝成分を含む水溶液、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジオキサン、メタノール等に縮合プリンを溶解させた溶液をあげることができる。
反応終了後、未反応の縮合プリン誘導体を除くために、縮合プリン誘導体が固定化された担体を上述した方法により洗浄する。
縮合プリン誘導体固定化担体上に未反応の官能基が残っている場合は、必要に応じて、未反応官能基を上述した方法によりブロッキングすることができる。
また、別の縮合プリン誘導体固定化担体の作成方法としては、縮合プリン誘導体とスペーサー化合物とを反応させ、縮合プリン誘導体を担体上へ結合させるためのスペーサー化合物−縮合プリン誘導体複合体を合成し、該化合物を担体に結合させる方法をあげることができる。
スペーサー化合物−縮合プリン誘導体複合体は、スペーサー化合物と縮合プリン誘導体を反応させることによって調製できる。この時の溶媒と反応条件は、上記の反応が進む溶媒と反応条件の組み合わせであって、スペーサー、縮合プリン誘導体、スペーサー化合物−縮合プリン誘導体複合体が、上記の結合反応以外の分解反応や縮合反応等を、スペーサー化合物と縮合プリン誘導体との複合体形成反応を阻害するほど起こさない溶媒と反応条件の組み合わせであればいかなる溶媒と反応条件の組み合わせでも良い。
具体的には、例えば、１μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌのカルボン酸スクシンイミドを有するスペーサー化合物と１μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの縮合プリン誘導体を混合し、静置して、あるいは、ローテーター、ミキサーなどで穏やかに攪拌しながら、０℃〜１００℃で１秒〜１０００時間反応させ、スペーサー−縮合プリン誘導体複合体を調製することができる。溶媒としては、例えば、塩、界面活性剤、緩衝成分を含む水溶液、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジオキサン、メタノール等をあげることができる。
生成したスペーサー化合物−縮合プリン誘導体複合体は、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、二相分離等の方法によって、単離、精製する事ができる。
担体と上記の方法を用いて調製したスペーサー化合物−縮合プリン誘導体複合体とを反応させることにより、縮合プリン固定化担体を調製することができる。この時の溶液と反応条件は、上記の固定化反応が進む溶液と反応条件の組み合わせであって、担体、スペーサー−縮合プリン誘導体複合体が、上記の固定化反応以外の分解反応や縮合反応等を、該複合体と単体との結合反応を阻害するほど起こさない溶液と反応条件の組み合わせであればいかなる溶液と反応条件の組み合わせでも良い。
具体的には、担体と１μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌのスペーサー−縮合プリン誘導体複合体を含有する溶液とを接触させ、上記したスペーサー化合物を担体に固定化する方法と同様な方法による固定化方法をあげることができる。
このようにして得られた縮合プリン誘導体固定化担体は溶媒に接触させて、保存することができる。この時の溶媒と保存条件は、縮合プリン誘導体固定化担体が安定であれば、いかなる溶媒と保存条件の組み合わせでも良い。具体的には、溶媒としては、例えば、塩、界面活性剤、緩衝成分を含む水溶液、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジオキサン、メタノール等をあげることができる。保存は、室温以下が好ましく、遮光下で、ヘリウムガス、アルゴンガス等の不活性ガス置換下がより好ましい。
（２）縮合プリン誘導体に結合する蛋白質（以下、縮合プリン誘導体結合蛋白質と称す）を含む細胞抽出液の調製方法
本発明の探索方法に用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質は、縮合プリン誘導体と特異的に結合する蛋白質であれば、その由来は限定されないが、好ましくは真核生物由来の蛋白質、より好ましくは動物由来の蛋白質、さらに好ましくは哺乳動物の器官、臓器、組織または細胞由来の蛋白質をあげることができる。
器官、臓器または組織としては、公知のいかなる組織でも良いが、膵臓、ランゲルハンス氏島等の臓器または組織が好ましい。細胞としては、公知のいかなる細胞でも良いが、膵臓β細胞株、膵臓β細胞初代培養細胞等を用いることが好ましい。具体的には、β細胞株としては、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，１１３２−１１４０（１９９６）〕、ＩＮＳ−１細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１６７−１７８（１９９２）〕、βＴＣ細胞〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，９０３７−９０４１（１９８８）〕、ＭＩＮ６細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６−１３２（１９９０）〕、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７７）、およびＲＩＮｍ５Ｆ細胞〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３１，５２１−５３１（１９８２）〕等の細胞があげられる。β細胞初代培養細胞としては、膵臓、ランゲルハンス氏島等の組織から回収した細胞を短期間培養した細胞等をあげることができる。
これらの細胞は、動物細胞培養法入門〔学会出版センター（１９９３）〕等に記載の方法に従って培養することができる。
上記器官、臓器、組織または細胞から、縮合プリン誘導体結合蛋白質を含有する試料を調製する方法は、蛋白質を回収できる方法であれば、公知のいかなる方法を用いても良く、例えば、蛋白質・酵素の基礎実験法、改訂第２版（南江堂、１９９４）などに記載の方法を用いて調製することができる。器官、臓器、組織または細胞の破砕方法としては、公知のいかなる破砕方法でも良いが、ワーリングブレンダー、ポリトロン、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーや超音波破砕機等の装置を用いた機械的破砕、低張液を用いた物理的破砕、界面活性剤を用いた可溶化、遠心分離等の操作を組み合わせることによって、該蛋白質試料を調製することができる。
該蛋白質試料は、冷蔵状態または凍結状態で保存することができる。
（３）本発明に用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質の探索方法
本発明に用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質は、上記（１）の方法で作製することができる縮合プリン誘導体固定化担体、および上記（２）の方法で調製される蛋白質試料を用いて探索することができる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質の探索方法は、縮合プリン誘導体を探索できる方法であれば、公知のいかなる方法を用いても良く、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法、改訂第２版（南江堂、１９９４）などに記載の方法を用いて、探索することができる。
具体的には、上記（１）の方法で調製した縮合プリン誘導体固定化担体を、上記（２）の方法で調製した蛋白質試料液に分散させ、静置またはローテーター・ミキサーなどで穏やかに攪拌しながら、０℃〜５０℃で１秒〜１０００時間反応させ、縮合プリン誘導体固定化担体に縮合プリン誘導体結合蛋白質を吸着させることができる。この結合反応後、縮合プリン誘導体固定化担体を洗浄することにより縮合プリン誘導体固定化担体に非特異的に吸着する蛋白質を除去できる。結合または洗浄に用いられる溶液は、本法に使える限りいかなる溶液でも良く、例えば、蛋白質・酵素の基礎実験法、改訂第２版（南江堂、１９９４）に記載の溶液をあげることできる。
縮合プリン誘導体固定化担体に吸着した縮合プリン誘導体結合蛋白質は、縮合プリン誘導体との結合を弱める手段により、縮合プリン誘導体固定化担体から溶出することができる。縮合プリン誘導体と該結合蛋白質の結合を弱める手段は、本法に使える限り、いかなる手段でも良く、例えば、変性剤の添加、塩濃度の増加、加熱、界面活性剤の添加等の手段があげられる。変性剤としては、ＳＤＳ、尿素、塩酸グアニジンなどが、塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが、界面活性剤としては、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎなどがあげられる。また、加熱とは例えば、３０〜１００℃に温度をあげることをいう。こうして精製した該結合蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２次元電気泳動、質量分析等の蛋白質分析手法により検出することができる。
縮合プリン誘導体固定化担体、またはブロッキングのみを施した担体への該結合蛋白質の結合性を比較することにより、縮合プリン誘導体に特異的に結合する蛋白質を探索することができる。
（４）縮合プリン誘導体結合蛋白質の同定方法
縮合プリン誘導体結合蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色の後、ゲルから切り出すことができる。ゲル中の蛋白質は、リジルエンドペプチダーゼやトリプシン等の特異的切断点を持つエンドプロテアーゼによる処理によりペプチド断片に分けることができる。得られたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ等により精製した後、気相プロテインシークエンサーまたは質量分析器を用いて、当該蛋白質の部分アミノ酸配列を調べることができる。これらの部分アミノ酸配列の情報を用いて、ＰＩＲ，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ等のアミノ酸配列データベースやＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースについて相同性検索を行うことにより、当該蛋白質と公知の蛋白質との相同性を知ることができる。
上記方法で同定された蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。該蛋白質は、ＮＡＤＰＨ依存的なレチノールや短鎖アルコールの酸化還元酵素活性を有する酵素として知られている〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３８，４７（１９９７）〕。
（５）本発明の探索方法に用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質
本発明の探索方法に用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質としては、上記（３）および（４）の方法により同定される蛋白質であれば、いずれも用いることができ、その由来も特に制限されることはないが、具体的には、
（ｉ）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（ｉｉ）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ縮合プリン誘導体に結合する蛋白質、
（ｉｉｉ）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ縮合プリン誘導体に結合する蛋白質、をあげることができる。
配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換、挿入若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換、挿入若しくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加があることを意味し、欠失、置換、挿入若しくは付加が同時に生じてもよく、置換、挿入若しくは付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモモリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
上記で得られる配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が縮合プリン誘導体に結合する蛋白質であるためには、配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と、６０％以上、通常は８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）〕を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
上記で得られる配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が縮合プリン誘導体に結合する蛋白質であることは、以下の方法で確認することができる。
上記（１）の方法で得られる縮合プリン誘導体が固定化された担体と該蛋白質とを、縮合プリン誘導体と該蛋白質の結合を阻害しない溶媒中で十分な時間接触させる。反応後、遠心分離により該担体を分離し、縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合を解離させる作用を有しない溶媒で該担体を懸濁する。同様の操作を数回繰り返すことにより、該担体を洗浄することができる。
縮合プリン誘導体に結合している蛋白質は、縮合プリン誘導体との結合を弱める手段により、縮合プリン誘導体固定化担体から溶出することができる。縮合プリン誘導体と結合蛋白質の結合を弱める手段としては、上記（３）の方法をあげることができる。溶出された蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、該電気泳動により、該蛋白質のバンドが確認できる場合は、該蛋白質は縮合プリン誘導体に結合する蛋白質である。
［２］本発明の探索方法で用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質の調製方法
（１）臓器等からの調製
本発明の探索方法で用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質は、本発明の方法に用いることができる限り、公知のいかなる方法を用いて調製しても良く、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法改訂第２版（南江堂、１９９４）などに記載の方法を用いて、調製することができる。
本発明の探索方法で用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質は、真核生物の器官、臓器、組織または細胞を破砕し、未精製画分、部分精製画分、精製画分として調製することができる。真核生物としては、公知のいかなる生物でも良いが、哺乳類が好ましい。器官、臓器または組織としては、公知のいかなる器官、臓器または組織でも良いが、例えば膵臓、ランゲルハンス氏島等をあげることができる。細胞としては、公知のいかなる細胞でも良いが、例えばＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，１１３２−１１４０（１９９６）〕、ＩＮＳ−１細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１６７−１７８（１９９２）〕、βＴＣ細胞〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，９０３７−９０４１（１９８８）〕、ＭＩＮ６細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６−１３２（１９９０）〕、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７７）、およびＲＩＮｍ５Ｆ細胞〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３１，５２１−５３１（１９８２）〕等の細胞をあげることができる。器官、臓器、組織または細胞の破砕方法としては、公知のいかなる破砕方法でも良いが、ワーリングブレンダー、ポリトロン、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーや超音波破砕機等の装置を用いた機械的破砕、低張液を用いた物理的破砕、界面活性剤を用いた可溶化、遠心分離等の操作を組み合わせることによって、縮合プリン誘導体結合蛋白質を含有する蛋白質画分を調製することができる。
該蛋白質画分は、冷蔵状態または凍結状態で保存することができる。
該蛋白質画分から縮合プリン誘導体結合蛋白質を精製する方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、縮合プリン誘導体を固定化した担体を用いたアフィニティー精製等の方法を単独あるいは組み合わせることにより精製する方法があげられる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質の量は、該縮合プリン誘導体結合蛋白質に反応する抗体を用いた免疫ブロット法等によって測定することができる。
精製された蛋白質の縮合プリン誘導体に対する結合活性の程度は、上記［１］（１）の方法で調製した縮合プリン誘導体を固定化した担体を用いて測定することができる。具体的には、例えば縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合複合体に対して、該結合を弱める手段を講じることにより、該結合複合体から縮合プリン誘導体結合蛋白質を溶出することができる。縮合プリン誘導体と結合蛋白質の結合を弱める手段としては、上記［１］（３）の方法をあげることができる。溶出された蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、該電気泳動により、該蛋白質のバンドを確認することにより分画した画分に含まれる該蛋白質の結合活性の程度を測定することができる。
また、縮合プリン結合蛋白質の活性が知られている場合は、該蛋白質の活性を測定することによっても、結合活性を評価することができる。
例えば、配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する縮合プリン誘導体結合蛋白質（以下、ｐ３１蛋白質と称する）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（２００１）に記載の方法に準じて該蛋白質の活性を測定することにより、縮合プリン誘導体との結合活性を測定することができる。
また、上記で調製した蛋白質画分から縮合プリン誘導体結合蛋白質を精製する方法としては、該蛋白質に反応する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製する方法もあげることができる。すなわち、該蛋白質に反応するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体等を取得した後、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９９）等に記載の方法等を用いて該抗体をクロマトグラフィー担体と架橋し、アフィニティーカラムを調製し、このカラムを用いて、蛋白質画分や部分精製画分から縮合プリン誘導体結合蛋白質を精製することができる。
（２）組換え細胞を用いた縮合プリン誘導体結合蛋白質の調製
本発明に用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質は、該蛋白質をコードするＤＮＡを用いて調製することができる。該ＤＮＡは、上記［１］（４）で同定された縮合プリン誘導体結合蛋白質のアミノ酸配列に基づき作製できる、該アミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡを用いて、該蛋白質を生産する細胞、組織等から調製されるｃＤＮＡライブラリーに対し、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリダイゼーション等の手法（モレキュラー・クローニング第３版）を用いることよって取得することができる。
また、該アミノ酸配列をクエリーにして、公知のデータベースを探索することにより、該アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を取得することもできる。
上記方法により取得することができるＤＮＡとしては、具体的には例えば、
（ｉ）配列番号４〜６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）上記［１］（５）の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号４〜６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ縮合プリン誘導体と結合する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、例えば、配列番号４〜６のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡの全部または該ＤＮＡを制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片などをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．９ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメーター等も用いて計算したときに、配列番号４〜６のいずれかで表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質は、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
また、必要に応じて、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは縮合プリン誘導体結合蛋白質の効率的製造に有用である。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、縮合プリン誘導体結合蛋白質のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌ ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに該組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に縮合プリン誘導体結合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を製造することができる。
該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、縮合プリン誘導体結合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より縮合プリン誘導体結合蛋白質を採取することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を製造することができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質を生産させる形態としては、縮合プリン誘導体結合蛋白質をそのままの構造で生産させる以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、マーカーペプチドを連結させた融合蛋白質として、またはシグナル配列を連結させた分泌蛋白質としてとして生産することができる。
融合させるマーカーペプチドとしては、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエビトープなどがあげられる。シグナル配列としては、任意の分泌蛋白質のシグナル配列をあげることができる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
縮合プリン誘導体結合蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる該蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて縮合プリン誘導体結合蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて縮合プリン誘導体結合蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に縮合プリン誘導体結合蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロプリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて縮合プリン誘導体結合蛋白質を製造する方法としては、例えば縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、縮合プリン誘導体結合蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より縮合プリン誘導体結合蛋白質を採取することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を生産する方法があげられる。
上記形質転換体により製造された縮合プリン誘導体結合蛋白質を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば縮合プリン誘導体結合蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、縮合プリン誘導体結合蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として縮合プリン誘導体結合蛋白質の不溶体を回収する。回収した縮合プリン誘導体結合蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質を正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により縮合プリン誘導体結合蛋白質の精製標品を得ることができる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質、あるいは縮合プリン誘導体結合蛋白質に糖鎖の付加された該蛋白質等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいは該蛋白質の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
さらに、縮合プリン誘導体結合蛋白質は、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて製造することもできる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系としては、公知の方法［Ｋｉｇａｗａ Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９８）、Ｓｐｉｒｉｎ Ａ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｋｉｇａｗａ Ｔ．＆ Ｙｏｋｏｙａｍａ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）］に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いることができる。すなわち、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量の縮合プリン誘導体結合蛋白質ＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽抽出液や大腸菌抽出液等を用いた翻訳系を利用して、縮合プリン誘導体結合蛋白質を生産することができる。該反応液から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明の探索方法で用いられる縮合プリン誘導体結合蛋白質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｐＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
このようにして取得される縮合プリン誘導体結合蛋白質として、例えば、配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
［３］縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いた抗糖尿病作用を有する物質の探索方法
抗糖尿病作用を有する物質は、▲１▼被検物質存在下、縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量と、▲２▼被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と該蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較した後、▲４▼被検物質より該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合を阻害する物質を選択することにより、取得することができる。
上記方法で用いられる縮合プリン誘導体としては、上記２の方法で製造される上記１の化合物をあげることができ、縮合プリン誘導体結合蛋白質としては、上記４［２］の方法で製造される上記４［１］の蛋白質をあげることができる。具体的には、上記４［１］（５）の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の蛋白質をあげることができる。
縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合体の量を測定する方法としては、例えば縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質のいずれか一方の分子をマルチウエルプレート、クロマト担体若しくはラテックス等のビーズ、表面プラズモン共鳴測定用のチップまたは質量測定用のターゲット等の固相に、物理的吸着、共有結合または縮合プリン誘導体結合蛋白質に反応する抗体等、タグペプチド、マーカーペプチドおよびシグナルペプチドより選ばれるペプチドを特異的に認識する分子を介した結合により固定化し、必要に応じて非特異吸着を抑制するブロッキングなどの処理を施した後、他方の分子を添加し、更に未吸着な他方の分子を洗浄除去後、他方の分子である縮合プリン誘導体結合蛋白質または縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性、結合特性、表面プラズモン共鳴の発生、または質量分析の信号強度等により結合した他方の分子を検出することにより、縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合量を検出する方法をあげることができる。
被検物質存在下における縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合量と、被検物質非存在下における該結合量を上記方法のいずれか１つを用いて比較することにより、被検物質から縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合の阻害活性を指標に、抗糖尿病作用を有する物質を選択することができる。
該物質が抗糖尿病作用、例えばインスリン分泌促進作用を有する物質であることは、膵臓β細胞または該細胞を含有する組織と上記で選択される物質をグルコース存在下で接触させたとき、該物質により膵臓β細胞のインスリン分泌が促進されること等により確認することができる〔Ｄｉａｂｅｔｏｒｏｇｉａ，３６，１１３９（１９９３）〕。
［４］縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物を用いた縮合プリン結合蛋白質に結合する物質の探索方法
縮合プリン誘導体結合蛋白質に結合する物質は、▲１▼被検物質存在下、縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量と、▲２▼被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較し、▲４▼被検物質より縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合を阻害する物質を選択した後、▲５▼▲４▼の工程で得られる物質より、縮合プリン誘導体結合蛋白質に結合する物質を選択することにより、取得することができる。
上記▲１▼〜▲４▼の工程は、上記３の方法に従って行うことができる。上記▲１▼〜▲４▼の工程で選択される物質から縮合プリン誘導体結合蛋白質に結合する物質を選択する方法としては、例えば標識化した該物質と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合と、標識化した該物質と膵臓由来細胞若しくは組織またはそれらの処理物以外の細胞等とを接触させた場合の該物質の結合活性を標識に基づいて測定、比較し、膵臓β細胞または該細胞の処理物に対する結合性が高い物質を選択することによる、縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質を選択する方法をあげることができる。結合活性は、上記３［３］の方法に準じて測定することができる。
［５］縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いた縮合プリン誘導体結合蛋白質に結合する物質の探索方法
上記４［４］の方法において、膵臓β細胞または該細胞の処理物の代わりに、上記４［１］および［２］の方法で得られる縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いて、上記４［４］▲１▼〜▲４▼の工程で選択される物質より、上記４［３］の方法に準じ、縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質を取得することができる。
また、縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合は、縮合プリン誘導体結合蛋白質を他の蛋白質との融合タンパク質として生産し、融合させた蛋白質に親和性をもつ物質を用いてタグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドを特異的に検出することにより測定することもできる。例えば、融合させるペプチドとしてβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン等を用いたときは、その酵素活性を指標に、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）等を用いたときは、その蛍光を指標に、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン等を用いたときは、その特異的結合分子との結合を指標に、ｍｙｃポリペプチド、Ｓペプチド、Ｔａｃ抗原、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープ等を用いたときは、その特異的抗体との結合を指標に検出することができる。
β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン等は、それらの特異的抗体との結合を指標に検出することもできる。
また、縮合プリン誘導体結合蛋白質と縮合プリン誘導体のいずれか一方あるいは双方をビオチン等の結合に特異性を有する分子や蛍光試薬、ＲＩ標識試薬等により修飾後、上記の反応系に用いることによって、ビオチン等の結合特異性を用いて固相に結合させたり、ビオチン等の結合特異性や蛍光、放射性等を指標に相互作用を検出することもできる。
さらに、蛋白質およびポリペプチドを適切な蛍光色素でラベル化し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により、縮合プリン誘導体結合蛋白質と縮合プリン誘導体とが結合しているときのみ発する蛍光を利用して、溶液系で縮合プリン誘導体結合蛋白質と縮合プリン誘導体の相互作用を検出することができる。
［６］縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いた縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の活性を変化させる物質の探索方法
縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の活性を変化させる物質は、▲１▼被検物質と縮合プリン誘導体結合蛋白質とを接触させた場合の該蛋白質の活性と、▲２▼被検物質を接触させない場合での該蛋白質の活性を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較した後、▲４▼被検物質より該蛋白質の活性を変化させる物質を選択することにより、取得することができる。
上記方法で用いられる縮合プリン誘導体としては、上記２の方法で製造される上記１の化合物をあげることができ、縮合プリン誘導体結合蛋白質としては、上記４［２］の方法で製造される上記４［１］の蛋白質をあげることができる。
該蛋白質の活性が公知の場合は、公知の方法に準じて該酵素の活性を測定することができる。
例えば、該蛋白質として、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を用いる場合、該活性はＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３３８，４７（１９７７）記載の方法に準じて測定することができる。
具体的には、該蛋白質の基質となりうるＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨやレチノール、レチナール、パラクロロベンズアルデヒドなどのアルコール、アルデヒド等〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３８，４７（１９９７）〕等を用いて、該蛋白質による基質の消失速度または生成物の生成速度を分光光度測定、蛍光光度測定、または高速液体クロマトグラフィー等でモニターすることにより、該蛋白質の活性を測定することができる。
［７］縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いた縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性を抑制する物質の探索方法
縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性を抑制する物質は、上記［６］の方法により得られる縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性を変化させる物質の中から、該蛋白質の活性を低下させる物質として選択することことができる。
また、縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性を抑制する物質は、縮合プリン誘導体結合蛋白質と縮合プリン誘導体結合蛋白質の基質誘導体を調製し、両者の結合を検出する系に、被検物質を加え、被検物質による該結合の阻害を指標に、縮合プリン誘導体結合蛋白質と縮合プリン誘導体結合蛋白質の基質誘導体との結合を阻害する化合物として選択することにより取得することもできる。
具体的には、上記［３］の方法により選択される縮合プリン誘導体結合蛋白質に結合する化合物のなかから、縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性を抑制する物質を選択することができる。
また、▲１▼被検物質存在下、縮合プリン誘導体結合蛋白質と縮合プリン誘導体結合蛋白質の基質誘導体との結合量と、▲２▼被検物質非存在下での該蛋白質と該蛋白質の基質誘導体との結合量を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較した後、▲４▼被検物質より該蛋白質と該蛋白質の基質誘導体との結合を阻害する化合物を選択する方法により、縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の活性を抑制する物質を選択することもできる。
ここで、縮合プリン誘導体結合蛋白質の基質誘導体とは、縮合プリン誘導体結合蛋白質の基質となりうる物質から誘導される物質であり、具体的には、例えば縮合プリン誘導体結合蛋白質として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を用いる場合、該蛋白質基質誘導体としては、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨの誘導体やレチノール、レチナール、パラクロロベンズアルデヒドなどのアルコール、アルデヒド等の該蛋白質の基質となりうる物質〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３８，４７（１９９７）〕の誘導体をあげることができる。
より具体的な方法としては、縮合プリン誘導体結合蛋白質または縮合プリン誘導体結合蛋白質の基質誘導体のいずれか一方の分子をマルチウエルプレートやクロマト担体やラテックス等のビーズ、表面プラズモン共鳴測定用のチップ、質量測定用のターゲット等の固相に、物理的吸着、共有結合や、縮合プリン誘導体結合蛋白質に反応する抗体等や、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドを特異的に認識する分子を介した結合により固定化し、必要に応じて非特異吸着を抑制するブロッキングなどの処理を施した後、他方の分子を添加し、更に未吸着な他方の分子を洗浄除去後、他方の分子である縮合プリン誘導体結合蛋白質の活性、結合特性、表面プラズモン共鳴の発生、または質量分析の信号強度等により結合した他方の分子を検出することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質と縮合プリン誘導体結合蛋白質の基質誘導体との結合量を検出することができる。
上記［５］〜［７］のいずれか方法から選ばれる２つ以上の方法を組み合わせることによって上記［５］〜［７］の方法により選択された物質の中から、インスリン分泌促進剤として好ましい活性を持つ化合物を絞り込むこともできる。また、必要に応じて、下記［１１］の方法により、インスリン分泌促進剤としてより好ましい活性を有する化合物を絞り込むことができる。
インスリン分泌促進剤として好ましい活性を有する化合物とは、例えばインスリン分泌促進剤として好ましくない活性が低い化合物のことをいい、例えば、従来のインシュリン促進剤が有する副作用である体重減少、骨髄抑制、肝臓障害、腎毒性、神経毒性などが軽減された化合物をあげることができる。
［８］縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いた縮合プリン誘導体結合蛋白質の機能を変化させる物質の探索方法
縮合プリン誘導体結合蛋白質の機能を変化させる物質は、▲１▼被検物質と縮合プリン誘導体結合蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の細胞応答と、▲２▼被検物質非存在下での該形質転換体の細胞応答を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較した後、▲４▼被検物質より該形質転換株の細胞応答を変化させる物質を選択することにより、取得することができる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質を発現する形質転換体は、上記４［２］（２）の方法により調製することができる。
被検物質と該形質転換株を接触させた場合の該形質転換株が示す細胞応答としては、例えば、細胞内情報伝達、遺伝子の転写、糖の取り込み、増殖などの変化等をあげることができ、それらの変化は公知の方法により検出することができる。
より具体的な細胞の応答としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、メラニン色素の凝集または拡散、インスリンの分泌促進などをあげることができる。
［９］縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いた縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質の探索方法
縮合プリン誘導体に結合する蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質は、▲１▼被検物質と縮合プリン誘導体結合蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の該蛋白質をコードする遺伝子の発現量と、▲２▼被検物質非存在下での該形質転換体の該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較した後、▲４▼被検物質より該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質を選択することにより、取得することができる。
具体的な方法としては、被検物質と接触および非接触の縮合プリン誘導体結合蛋白質を発現する、上記４［２］（２）の方法により調製することができる形質転換細胞の各々から常法に従い全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製し、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードするＤＮＡから調製されるプライマーＤＮＡを用いた、ＲＴ−ＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定し、各々の発現量を比較することにより、縮合プリン誘導体結合蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質を取得する方法をあげることができる。
［１０］縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質を用いた縮合プリン誘導体結合蛋白質の発現量を変化させる物質の探索方法
縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の発現量を変化させる物質は、▲１▼被検物質と縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の該蛋白質の発現量と、▲２▼被検物質非存在下での該形質転換体の該蛋白質の発現量を測定し、▲３▼被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較した後、▲４▼被検物質より該蛋白質の発現量を変化させる物質を選択することにより、取得することができる。
縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体は、上記４［２］（２）の方法により調製することができる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質の発現量を測定する方法としては、免疫学的定量法をあげることができる。
免疫学的定量法としては、例えば液相中で縮合プリン誘導体結合蛋白質と反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した縮合プリン誘導体結合蛋白質と該蛋白質を認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ法等があげられる。
縮合プリン誘導体結合蛋白質と反応する抗体は、該蛋白質または該蛋白質の部分断片ペプチドの精製品を用いて、公知の方法によりポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等として作製することができる。
［１１］インスリン分秘促進活性評価
インスリン分泌促進剤の評価系としては、公知のいかなる方法も利用することができる。
動物を用いる方法としては、例えば、Ｗｉｓｔａｒ系ラット等を用い、被験物質投与時に、経口糖負荷試験を行い、血糖抑制効果はあるが、低血糖を起さない被験物質を選択する方法（ＷＯ００／０１３８８）等をあげることができる。
摘出組織や培養細胞を用いる方法としては、膵臓ランゲルハンス氏島、初代培養膵臓β細胞、培養β細胞の内、５〜１０ｍｍｏｌ／ｌのグルコース濃度の生理的な変化に応じたインスリン分泌能を示す培養β細胞であるＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，１１３２−１１４０（１９９６）〕、ＩＮＳ−１細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１６７−１７８（１９９２）〕、βＴＣ細胞〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５，９０３７−９０４１（１９８８）〕、あるいは、ＭＩＮ６細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６−１３２（１９９０）〕を用い、低グルコース濃度で被験物質を添加してもインスリン分泌を促進しないが、高グルコース濃度で、被験物質を添加すると高グルコース単独よりもインスリン分泌を促進する被験物質を選択する方法（特開２０００−１５４１３９）等をあげることができる。
培養β細胞株の中でも、膵臓β細胞ＭＩＮ６細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６−１３２（１９９０）〕は、インスリン含量およびグルコース刺激によるインスリン分泌量が生体内の膵臓β細胞に近く、グルコース濃度に応答してインスリン分泌が上昇する点において生体内の膵臓β細胞の性質を良く保存している〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６−１３２（１９９０）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３６，１１３９−１１４５（１９９３）〕。また、ＭＩＮ６細胞は、糖尿病治療薬として用いられているスルフォニルウレア剤、例えばグリベンクラミドに応答して、インスリン分泌が促進される〔Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，５，７７７−７８６（１９９３）〕点でより好ましい。
ＭＩＮ６細胞の培養、およびＭＩＮ６細胞を用いたインスリン分泌試験は、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３６，１１３９−１１４５（１９９３）に記載されている方法に準じて行うことができる。
また、化合物が細胞のインスリン分泌活性に与える影響は、以下のようにして集めた細胞培養上清中のインスリン量を測定することにより求めることができる。
２４ウェルプレートで培養したＭＩＮ６細胞を、２ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含む緩衝液Ａ〔１１９ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、４．７４ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム、２．５４ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、１．１９ｍｍｏｌ／ｌ硫酸マグネシウム、１．１９ｍｍｏｌ／ｌリン酸二水素カリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、０．１％牛血清アルブミンｐＨ７．３〕１ｍｌを用いて２回洗浄した後、１ｍｌの２ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含む緩衝液Ａ中、３７℃で４５分間インキュベートする。インキュベート後、培養上清を、各種濃度の試験化合物および８．４ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含む緩衝液Ａ（１ｍｌ）と交換し、さらに、３７℃で４５分間インキュベートし、培養上清を集める。培養上清中に分泌された抗体反応性のインスリンは１％牛血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１％アジ化ナトリウムを含むりん酸緩衝液で希釈した後、放射線免疫測定法により定量できる。ヒトインスリンを標準物質として標準曲線を作成し、その曲線からそれぞれのインスリン値を算出できる。さらに、試験化合物の代わりに溶媒であるジメチルスルホキシドを添加したときに得られるインスリン値を１００％として、それぞれの測定値の相対量（％）を計算できる。
［１２］本発明の方法で選択されるインシュリン分泌促進活性を有する化合物
本発明の方法で選択されるインシュリン分泌促進活性を有する化合物としては、下記の一般式（Ｖ）
Figure 2003097862
［式中、Ｒ１Ｂ、Ｒ２ＢおよびＲ３Ｂは同一または異なって、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、またはＮを含有する置換若しくは非置換の複素環基（該複素環基はＮ原子でトリアジン環に結合する）を表す］で表される化合物をあげることができる。
Ｎ原子でトリアジン環に結合する複素環基としては、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インドリル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、プリニル、ピロリジニル、２，５−ジオキソピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、２−オキソオキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノキサリニル、オクタヒドロキノリル、ジヒドロインドリル、又は１，３−ジオキソイソインドリニルなどをあげることができる。
上記式（Ｖ）の各基の定義において、置換とは、例えば置換若しくは非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換のアラルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換の芳香族複素環基、置換若しくは非置換の脂環式複素環基による置換などを意味する。
ここで、置換若しくは非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換のアラルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換の芳香族複素環基、置換および非置換の脂環式複素環基は、それぞれ前記式（ＩＩ）の定義の中の置換若しくは非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換のアラルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換の芳香族複素環基、置換および非置換の脂環式複素環基と同義である。
より具体的には、下記第２表に記載の化合物番号１９３〜２００で表される化合物をあげることができる。
Figure 2003097862
上記化合物は、ＷＯ０１／４７９２１に記載の方法、および公知の一般的な合成方法に準じて合成することができる他、ＣｈｅｍＢｒｉｇｅ社より購入することもできる。
［１３］本発明の方法で選択される物質を含有する医薬
本発明の方法で選択される物質を有効成分として含有する医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｇ／ｋｇである
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例、試験例に基づき説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 標識化縮合プリン誘導体の合成
下式（ＶＩ）で示される化合物１６の３Ｈ標識体（以下、［３Ｈ］標識化合物１６という）は、ＷＯ００／０１３８８に記載の方法により合成することができる上記第１表の化合物番号２３で表される化合物のＲ体を原料に用いた３Ｈ−ｇａｓ法によって、アマシャム ファルマシア社で合成された。
Figure 2003097862
実施例２ 膵臓β細胞の破砕液の調製
ＭＩＮ６細胞〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６−１３２（１９９０）〕を、細胞培養用フラスコ（１８２ｃｍ２、グライナー社製）中にて、３７℃、５％炭酸ガス下で、１５％ウシ胎児血清と５ｇ／ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；日水製薬社製）を用いて集密的になるまで培養した。なお、以下の操作は、氷上で行った。
ＭＩＮ６細胞が集密的になった後、培地を取り除き、３０ｍｌの氷冷したリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。その後、氷冷したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、１００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０μｇ／ｍｌロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍｍｏｌ／ｌフェニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ｐＨ７．４〕を３ｍｌ加え、セルスクレーパーを用いて、フラスコに接着している細胞を剥がし、パスツールピペットで細胞を回収した。この操作を、もう一度行うことにより、１８２ｃｍ２フラスコにつき計６ｍｌの細胞懸濁液を取得した。該細胞懸濁液を、ホモジェナイザーを用いて細胞を破砕した後、遠心分離機Ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２（日立社製）を用いて、４℃、１０分間、毎分３５００回転で遠心分離し、その上清を回収し、細胞破砕液とした。
実施例３ 膵臓β細胞の膜画分の調製
実施例２で得られた細胞破砕液を、遠心分離機Ｈｉｍａｃ ＣＰ１００α（日立製作所社製）、ローターＲＰ５０Ｔ（日立製作所社製）を用いて、４℃、３０分間、毎分３５０００回転で遠心分離した後、上清を廃棄し、残った沈殿に氷冷した上記のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加え、１８ゲージ（テルモ社製）の注射針をつけたシリンジ（テルモ社製）を用いて懸濁した。さらに、遠心分離機Ｈｉｍａｃ ＣＰ１００α、ローターＲＰ５０Ｔを用いて、４℃、３０分間、毎分３５０００回転で遠心分離した後、上清を捨て、沈殿に適当量の氷冷したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加え、２５ゲージ（テルモ社製）の注射針をつけたシリンジ（テルモ社製）を用いて懸濁したものをＭＩＮ６細胞の膜画分とした。
実施例４ 膵臓β細胞の可溶化膜画分の調製
実施例３の膜画分に氷冷した可溶化バッファー〔２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム（ＫＣｌ）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ、１ｗ／ｖ％ジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、ｐＨ７．４〕を６ｍｌ加えて懸濁し、ホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした後、そのまま氷上で３０分間放置した。その後、遠心分離機Ｈｉｍａｃ ＣＰ１００α、ローターＲＰ５０Ｔを用いて、４℃、６０分間、毎分３５０００回転で遠心分離することで得られた上清を、可溶化膜画分として回収した。沈殿には再び、氷冷した可溶化バッファーを３ｍｌ加え、上記の操作をさらに２回繰り返し、得られた上清をすべて混合して可溶化膜画分とした。
実施例５ 膵臓β細胞および標識化縮合プリン誘導体を用いた結合実験
細胞培養用の２４ウェルプレート（コーニング社製）にほぼ集密的な状態になるまで培養したＭＩＮ６細胞を、ＫＲＨ緩衝液（１１９ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、４．７４ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．５４ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、１．１９ｍｍｏｌ／ｌ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、１．１９ｍｍｏｌ／ｌリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、２ｍｍｏｌ／ｌグルコース、０．１ｗ／ｖ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．３）を用いて、２回洗浄した後、ＫＲＨ緩衝液を１ウェルにつき１ｍｌ添加し、３７℃にて４５分間プレインキュベーションを行った。プレインキュベーション後、上清を除去し、０．１５ｍｌのＫＲＨ緩衝液と１０ｎｍｏｌ／ｌの［３Ｈ］標識化合物１６、及び１μｍｏｌ／ｌの濃度になるように被験化合物を添加し、４℃にて反応が平衡に達するまで１時間以上インキュベートした後、ＫＲＨ緩衝液を用いて、細胞を２回洗浄した。ＫＲＨ緩衝液を１ウェルにつき２ｍｌ添加し、室温にて２０分間放置した後、再び、ＫＲＨ緩衝液を用いて洗浄し、各ウェルに残った放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定することにより結合量を求めた。
被験化合物を添加しない条件下における［３Ｈ］標識化合物１６の結合量（総結合量）と１０μｍｏｌ／ｌの化合物１６存在下における［３Ｈ］標識化合物１６の結合量（非特異的結合量）との差を、特異的結合量とした。
第１図Ａに結合飽和曲線を、第１図Ｂにスキャッチャードプロットを示した。これらの図から、膵臓β細胞を用いると縮合プリン誘導体に特異的な結合を検出することができることがわかった。また、第３表に各縮合プリン誘導体による［３Ｈ］標識化合物１６結合阻害作用とインスリン分泌促進活性の測定値を、第２図に該阻害作用とインスリン分泌促進作用の相関を示した。両作用の相関係数は０．６７９であり、有意な相関があることがわかった。
Figure 2003097862
実施例６ 膵臓β細胞の膜画分および標識化縮合プリン誘導体を用いた結合実験
細胞培養用の２４ウェルプレート（コーニング社製）に、膜画分（１５０μｇ／ｍｌ）、［３Ｈ］標識化合物１６、および放射標識していない被験化合物を含む実施例２に記載のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ハーベスターＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ １９６−ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ ２４（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて吸引ろ過することにより、ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−２４ＧＦ／Ｂ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ社製）上に膜画分を回収し、該膜画分を、１ｍｌの洗浄バッファー（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ ０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）を用いて、４回洗浄した後、乾燥させてから、マイクロシンチ２０（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて放射活性を測定した。化合物１６の無添加時の放射活性を総結合量、化合物１６を１０μｍｏｌ／ｌ添加した時の放射活性を非特異的結合量として、総結合量から非特異的結合量を差し引いた残りを特異的結合量とした。
第３図Ａに結合飽和曲線を第３図Ｂにスキャッチャードプロットを示した。これらの結果から、膵臓β細胞の膜画分を用いることによって、縮合プリン誘導体に特異的な結合を検出することができることがわかった。また、第４図に縮合プリン誘導体による［３Ｈ］標識化合物１６結合阻害作用とインスリン分泌促進作用の相関を示した。両作用の相関係数は０．７０５であり、有意な相関があることがわかった。
実施例７ 膵臓β細胞の可溶化膜画分を用いる結合実験
可溶化膜画分を蛋白質濃度５００μｇ／ｍｌで用いた以外は、上記実施例６と同様の方法で実験を行った。また、溶解液を目的の濃度に調製する際、界面活性剤を含まない可溶化緩衝液を用いて、溶解液に含まれる界面活性剤の濃度を０．１ｗ／ｖ％となるように希釈した。したがって、インキュベーション液の組成は、０．１ｗ／ｖ％のｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４であった。
化合物番号１６で表される化合物の無添加時の放射活性を総結合量、該化合物を１０μｍｏｌ／ｌ添加した時の放射活性を非特異的結合量として、総結合量から非特異的結合量を差し引いた残りを特異的結合量とした。
第５図に総結合量と非特異的結合量を示した。この結果から、膵臓β細胞の可溶化膜画分を用いることによって、縮合プリン誘導体の特異的結合を検出できることがわかった。
実施例８ インスリン分泌量の測定
ＭＩＮ６細胞の培養、およびＭＩＮ６細胞を用いたインスリン分泌試験は、Ｄｉａｂｅｔｏｒｏｇｉａ，３６，１１３９−１１４５（１９９３）に記載の方法に準じて行った。
すなわち、１４．５ｍｍｏｌ／ｌのグルコース存在下において、化合物がインスリン分泌活性に与える影響を、以下のようにして集めた細胞培養上清中のインスリン量を測定することにより評価した。
２４ウェルプレートで培養したＭＩＮ６細胞を、２ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含む緩衝液Ａ〔１１９ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、４．７４ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．５４ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２、１．１９ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＳＯ４、１．１９ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｍｏｌ／ｌ ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．３〕１ｍｌを用いて２回洗浄した後、１ｍｌの２ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含む緩衝液Ａ中、３７℃で４５分間インキュベートした後、培養上清を、各種濃度の試験化合物および８．４ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含む緩衝液Ａ（１ｍｌ）と交換し、さらに、３７℃で４５分間インキュベートし、培養上清を集めた。
培養上清中に分泌された抗体反応性のインスリンは１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で希釈した後、放射線免疫測定法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２Ａ，２Ｂ，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９７３）〕により定量した。ヒトインスリンを標準物質として標準曲線を作成し、その曲線からそれぞれのインスリン値を算出した。
実施例９ 微生物の培養液を探索源とした抗糖尿病作用を有する物質の探索方法
実施例６に記載の方法に従い、膵臓β細胞膜画分を用いて微生物の培養液から抗糖尿病作用を有する物質を選択することができる。
土壌から平板希釈法を用いて単離した微生物を、０．５％グルコース、３．０％可溶性でんぷん、２．０％大豆粉、０．５％酵母エキス、０．５％コーンスティープリカー、０．３％炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）（蒸煮前ｐＨ７．２）からなる培地を入れた試験管中で２８℃、４日間攪拌機上で培養する。培養終了後、培養液と同量のジメチルスルホキシドを添加して十分攪拌し、遠心分離機によって固形分と上清液に分離する。上清液２μｌを、実施例６に記載した膵臓β細胞の膜画分０．１５ｍｌおよび１０ｎｍｏｌ／ｌの［３Ｈ］標識化合物１６を含む溶液に添加し、室温で１時間インキュベートする。同時に培養上清液の代わりに５０％ジメチルスルホキシドを添加した膵臓β細胞の膜画分０．１５ｍｌおよび１０ｎｍｏｌ／ｌの［３Ｈ］標識化合物１６を含む溶液、および、さらに該溶液に１０μｏｍｏｌ／ｌの非標識の化合物１６を添加した溶液を作成し、同様にしてインキュベートする。
インキュベーション終了後、実施例６に記載の方法により膜画分の回収、洗浄、膜に残った放射活性の測定を行った。非標識の化合物１６を添加した場合に得られる放射活性を非特異的結合量、非標識の化合物１６を添加していない場合の放射活性を総結合量として、実施例６に記載の方法で、それぞれの特異的結合量を計算する。計算された特異的結合量を用いて、以下の式からそれぞれの培養上清液の結合阻害率を求めることができる。
結合阻害率（％）＝（５０％ジメチルスルホキシド存在下の特異的結合量−培養上清液存在下の特異的結合量）／５０％ジメチルスルホキシド存在下の特異的結合量 × １００
実施例１０ 化合物ライブラリーを探索源に用いた抗糖尿病作用を有する物質の探索方法
実施例５に記載の方法に従い、膵臓β細胞と［３Ｈ］標識化合物１６の結合に対する阻害作用を指標にして抗糖尿病作用を有する物質を探索した。被検物質は、ジメチルスルホキシドに溶解し、終濃度が１μｍｏｌ／ｌになるように添加した。非標識の化合物１６を添加した場合に得られる放射活性を非特異的結合量、非標識の化合物１６を添加していない場合の放射活性を総結合量として、実施例６に記載の方法で、それぞれの特異的結合量を計算し、以下の式を用いて結合阻害率を求めた。
結合阻害率（％）＝（５０％ジメチルスルホキシド存在下の特異的結合量−培養上清液存在下の特異的結合量）／５０％ジメチルスルホキシド存在下の特異的結合量 × １００
７０００種の化合物を探索した結果、１０μｍｏｌ／ｌで８４％の阻害率を示す、下式（ＶＩＩ）に記載した構造を有する化合物を選択することができた。
Figure 2003097862
式（ＶＩＩ）で表される構造を有する化合物（第４表の化合物番号１９３で示される化合物。以下、化合物１９３と称す）のインスリン分泌促進作用を、実施例８に記載の方法により測定した。その結果、該化合物のインスリン分泌促進量は、化合物１６による分泌促進量を１００％とした場合、１９５％であった（第４表）。
また、化合物１９３の類縁体である、下記第４表の化合物番号１９４〜１９９で表される化合物は１０μｍｏｌ／ｌの濃度において、化合物番号２００で表される化合物は１μｍｏｌ／ｌの濃度においてインスリン分泌促進活性が認められた（第４表）。
Figure 2003097862
以上のことから、本発明の探索方法の有用性が示された。
上記化合物は、ＣｈｅｍＢｒｉｇｅ社より入手したほか、ＷＯ０１／４７９２１に記載の方法、および公知の一般的な合成方法に準じて合成した。
実施例１１ 縮合プリン誘導体固定化粒子の作製
縮合プリン誘導体として、上記第１表中の化合物番号１５５番で表される化合物を選択して以下の実験に用いた。
１ｍｌのＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ粒子懸濁液（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分間、室温）して、上清を取り除いたペレットに５ｍｌのＴＨＦを加えて粒子を分散させた後、粒子を遠心分離して上清を取り除いた。この操作を３回繰り返した。
溶媒をＴＨＦに交換した５００μｌのＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ粒子のペレットに、化合物１９６の溶液を加えてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ粒子を分散させた。この時の溶媒はＴＨＦ、体積は５００μｌ、化合物１５５の濃度は６ｍｍｏｌ／ｌであった。時々撹拌しながら室温で一晩反応させた。反応終了後、粒子を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分間、室温）して上清を取り除いた。
未反応の化合物１５５を除くために、５ｍｌのＴＨＦを加えて粒子を分散させた後、粒子を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分間、室温）して上清を取り除く操作を３回繰り返した。未反応の粒子状の反応点を不活化するために、２００ｍｍｏｌ／ｌのモノエタノールアミンを含むＴＨＦ溶液を５ｍｌ加えて粒子を分散させ、１０分間静置した。反応終了後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分間、室温）して上清を取り除いた。未反応のモノエタノールアミンを除くために、５ｍｌのＴＨＦを加えて粒子を分散させた後、粒子を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分間、室温）して上清を取り除く操作を３回繰り返した。
このようにして得られた化合物１５５固定化粒子を、５００μｌ粒子／ｍｌとなるようにＴＨＦに分散させた後、遮光条件下、４℃で保存した。
実施例１２ 細胞抽出液の調製
マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６の培養は、４２５ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬社製）に、ＦＢＳを７５ｍｌ、７．５％炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を８．５ｍｌ、２００ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミンを５ｍｌ、ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）−ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（それぞれ１００００ｕｎｉｔｓ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌの混合液）を２．５ｍｌを加えた培地中でディッシュを用いて、５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーター中で静置培養により行った。
ＭＩＮ６が集密的になった後、細胞を３７℃のＰＢＳで２回洗浄し、４℃の緩衝液Ａ〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン〕で細胞を剥がした。４℃で３０分間、ローテーターで穏やかに攪拌した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）により不溶性画分を沈殿させて上清を可溶画分とした。ペレットを１ｍｌの緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１％ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン〕に懸濁し、４℃で３０分間、ローテーターで穏やかに攪拌した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）により不溶性画分を沈殿させて上清を可溶化膜画分とした。この方法でタンパク質濃度約３ｍｇ／ｍｌの可溶画分と可溶化膜画分が得られた。可溶画分、可溶化膜画分は、−８０℃で保存した。
実施例１３ 縮合プリン誘導体結合蛋白質の取得
実施例１２で作製したＭＩＮ６の可溶化膜画分を緩衝液Ｂで１０倍に希釈した溶液１ｍｌに５００μｍｏｌ／ｌの化合物番号１６で表される化合物（以下、化合物１６と称す）を加えて、４℃で２時間穏やかに攪拌した。対照として化合物１６を加えていないＭＩＮ６の可溶化膜画分を緩衝液Ｃ〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１％ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン〕で１０倍に希釈した溶液１ｍｌを４℃で２時間穏やかに攪拌した。次に、化合物１６加えた可溶化膜画分および被検物質を加えていない可溶性膜画分溶液に実施例８で作製した化合物番号１５５で表される化合物を固定化した粒子（以下、化合物１５５固定化粒子と称す）を加え、４℃で３０分間穏やかに撹拌した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間、４℃）により粒子を沈殿させて上清を取り除いた。次に緩衝液Ｃを７５０μｌ加え、３秒間撹拌し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間、４℃）により粒子を沈殿させて上清を取り除いた。次に緩衝液Ｄ〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ〕を７５０μｌ加え、３秒間撹拌し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間、４℃）により粒子を沈殿させて上清を取り除いた。その後、β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプルバッファーを３０μｌ加え、化合物１５５固定化粒子に結合している蛋白質の溶出を行い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。化合物１６を加えた細胞抽出液からの化合物１５５固定化粒子による精製で、化合物番号１６で表される化合物により化合物１５５固定化粒子への特異的結合が阻害されるｐ３１蛋白質を見出した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離したｐ３１蛋白質をゲルから切り出し、２５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で０．３μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）と共に３７℃で１３時間反応させた。リジルエンドペプチダーゼ消化で得られたペプチド断片を含む反応上清を回収し、逆相ＨＰＬＣでペプチドを分離した。カラムはＭａｇｉｃ Ｃ１８（０．２ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５ｃｍ、Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社製）を使用し、アセトニトリル濃度を５％から６０％まで直線的に上昇させるグラジエントによりペプチドを溶出させた。分離したペプチドはチューブに分取し、気相プロテインシーケンサーＰｒｏｃｉｓｅ４９２ｃＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりアミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列を配列番号１１に示した。
リジルエンドペプチダーゼ消化後のｐ３１蛋白質を含むゲル片は、さらに１００ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で０．３μｇのトリプシン（シーケンスグレード、ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）と共に３７℃で１３時間反応させた。トリプシン消化で得られたペプチド断片は、上記と同様の方法により逆相ＨＰＬＣで分離し、そのアミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列を配列番号１２に示した。
配列番号１１および１２で示したアミノ酸配列は、ＰＩＲタンパク質データベースに対して相同性検索を実施した結果、配列番号２に示したマウスＮＡＤＰＨ依存性レチノール デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ由来のアミノ酸配列のＮ末端から１９９番目のアミノ酸残基から２０９番目のアミノ酸残基からなる配列、およびＮ末端から３４番目のアミノ酸残基から４０番目のアミノ酸残基からなる配列に一致していることを確認した。
実施例１４ ｐ３１蛋白質の調製
［１］マウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６）からのｐ３１ ｃＤＮＡのクローン化とＨｉｓ−ｐ３１蛋白質発現プラスミドの造成
マウス膵臓β細胞株（ＭＩＮ６）より抽出された全ＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとして１本鎖ｃＤＮＡを合成した。この１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、完全長のｐ３１蛋白質をコードする遺伝子部分をポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法を用いて調製し、ＮＯＶＡＧＥＮ社より購入した大腸菌発現ベクターｐＥＴ−１４ｂに組み込むことにより、Ｎ末にＨｉｓタグが付加されたＨｉｓ−ｐ３１蛋白質発現プラスミドを構築した。以下、詳細に説明する。
ＭＩＮ６細胞より、常法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７７）〕に従い抽出した全ＲＮＡ１μｇから、１本鎖ｃＤＮＡ合成キットであるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて、オリゴｄＴをプライマーとして１本鎖ｃＤＮＡを合成した。上記で得た１本鎖ｃＤＮＡの０．４％をＰＣＲの鋳型として使用した。
ＰＣＲ用のプライマーセットとしては、ＧＥＮＳＥＴ社にて合成された配列番号７及び８で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡを用いた。
配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡにはＮｄｅＩサイトが，配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡにはＢａｍＨＩサイトが導入されるようにデザインした。
ＰＣＲは、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて行なった。反応液は、該ポリメラーゼの使用説明書に従って調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃で５分間インキュベートした後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行なった後、さらに７２℃で７分間インキュベートすることで反応を行った。反応終了後、ＤＮＡ精製キットであるＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＤＮＡを精製した。
上記のＤＮＡを、ＮＥＢ２緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）１０μｌに溶解し、１０単位のＮｄｅＩおよび１０単位のＰｓｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＥＴ−１４ｂ １μｇをＮＥＢ２緩衝液２０μｌに溶解し、２０単位のＮｄｅＩと２０単位のＰｓｔＩを加え、３７℃２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＥＴ−１４ｂ １μｇをＮＥＢ２緩衝液２０μｌに溶解し、２０単位のＰｓｔＩと２０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間、消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られた、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ由来のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片（０．８ｋｂ）０．１μｇ、ｐＥＴ−１４ｂ由来のＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片（３．４ｋｂ）０．０３μｇおよびＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（１．３ｋｂ）０．０５μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液１０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４００単位を加えて、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
該反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をコーエンらの方法によって形質転換し、形質転換体を取得した。該形質転換株が保有するプラスミドを公知の方法に準じて単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。該プラスミドをｐＥＴ−１４ｂ−ｐ３１と命名した。
上記で取得された、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ｐ３１の塩基配列を、アプライド・バイオシステムズ社の塩基配列決定キット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２．０）を用いて決定した。
その結果、本実施例でクローニングされた遺伝子は、配列番号２で表される２６０アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列はＧｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０４５１３２．１に記載されているマウス由来の蛋白質のアミノ酸配列と一致することが明らかになった。
［２］大腸菌によるマウスＨｉｓ−ｐ３１蛋白質の発現
上記［１］で取得されたプラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ｐ３１を大腸菌ＢＬ２１株にコーエンらの方法によって形質転換し、形質転換株ＢＬ２１／ｐＥＴ−１４ｂ−ｐ３１を取得した。ＢＬ２１／ｐＥＴ−１４ｂ−ｐ３１は、アンピシリン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈ〔１０ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−Ｔｙｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ社製）、５ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、７５μｇ／ｍｌアンピシリン〕５ｍｌが入った１５ｍｌ容の試験管にて、３７℃で８時間振とう培養（２２０ｒｐｍ）した。次に、アンピシリン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈ ５０ｍｌが入った３００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに、上記培養液を２．５ｍｌ添加後、３７℃でＯＤ（５９０ｎｍ）が１．０になるまで振とう培養（２２０ｒｐｍ）し、４℃に保存した。次に、アンピシリン含有Ｌ−ｂｒｏｔｈ ５００ｍｌが入った２本の２Ｌ容のバッフル付き三角フラスコに、上記培養液を２０ｍｌずつを添加し、３７℃で通気攪拌培養（２２０ｒｐｍ）し、ＯＤ（５９０ｎｍ）が０．９に到達した時点で発現誘導剤であるＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を０．２ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、Ｈｉｓ−ｐ３１蛋白質の発現を誘導した。発現誘導後４時間で培養を終了し、培養液を遠心分離し、約６．６ｇ（湿潤重量）の菌体を取得した。
［３］マウスＨｉｓ−ｐ３１の精製
実施例５で得た培養菌体からマウスＨｉｓ−ｐ３１の精製は、全て０〜４℃の条件のもと、以下の方法で行った。
上記［２］で得られた培養菌体６．６ｇ（湿潤重量）を、２０ｍｌのホモゲナイズ溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、１０ｍｍｏｌ／ｌジチオスレイトール、ｐＨ７．４）に懸濁後、超音波破砕機（家田貿易社製、Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ、振幅レベル７０）で５秒間、１０回程度大腸菌を破砕して得られた破砕液を、９，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をフィルター濾過（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、０．２２μｍ）し、濾液を下記の条件による金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
金属キレートアフィニティークロマトグラフィー条件
カラム：２００ｍｍｏｌ／ｌ硫酸亜鉛水溶液を２４ｍｌ／時間の流速で２０分間流した後、６ｍｌ／時間の流速で２時間流すことで、亜鉛を配位させたＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャムファルマシアバイオテク社製、１０×１００ｍｍ）
溶出液：Ａ液（２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、ｐＨ７．４）１０００ｍｌ、Ｂ液（２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５００ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール、ｐＨ７．４）１０００ｍｌ
流速：６ｍｌ／時間
溶出：Ａ液からＢ液の直線濃度勾配溶出
溶出液は１．３ｍｌずつ分画し、各画分をメルカプトエタノール還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析し、分子量３１キロダルトン付近のマウスＨｉｓ−ｐ３１のバンドを含む画分を集め、亜鉛キレートクロマトグラフィーマウスＨｉｓ−ｐ３１画分とした。
亜鉛キレートクロマトグラフィーマウスｐ３１画分を脱塩処理した。脱塩処理は下記の条件で行った。
脱塩処理条件
カラム：ＰＤ−１０（アマシャムファルマシアバイオテク社製）
溶出液：４００ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
溶出液は、０．５ｍｌずつ分画し、各画分をメルカプトエタノール還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析し、分子量３１キロダルトン付近のマウスＨｉｓ−ｐ３１のバンドを含む画分を集め、ＰＤ−１０マウスＨｉｓ−ｐ３１画分とした。取得したＨｉｓ−ｐ３１のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を第６図に示す。
［４］マウスＨｉｓ−ｐ３１の構造確認
上記［３］で取得したマウスＨｉｓ−ｐ３１蛋白質は、Ｎ末端のヒスチジンタグをトロンビン消化により除去した後にＮ末端アミノ酸配列を解析した。すなわち約１０μｇのＨｉｓ−ｐ３１に対して１００ｍＵのビオチン修飾トロンビン（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を添加し、反応液（２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．４、１．５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）中で２０℃、１５時間反応させた。反応液を２−メルカプトエタノール還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１００３５−１００３８（１９８７）に記載の方法に従い、ＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）へ電気的に転写した。転写した膜をクマジーブルー染色し、分子量約３１ｋＤａのバンドを切り出し、気相プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）を用いてメーカー推奨の方法によりＮ末端アミノ酸配列を解析した。得られたアミノ酸配列ほ配列番号９で表される通り、遺伝子配列から推定される配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１残基目からの配列に一致した。配列番号９で表されるアミノ酸配列のうちＮ末端から１残基目より３残基目までがｐＥＴ−１４ｂベクター由来、４残基目以降の配列がマウスｐ３１由来のアミノ酸配列と一致していることを確認した。
実施例１５ ｐ３１蛋白質を用いた結合実験
実施例１４で精製したＨｉｓ−ｐ３１を用いた結合実験を以下のように行った。
センサーチップＣＭ５（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）をＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）にセットし、該センサーチップをＨＢＳ−ＥＰバッファー（１００ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５００ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．４、０．２２μｍフィルターろ過）を用い、付属のマニュアルにしたがって１０℃にて平衡化した。
リガンド固定化用ＥＤＣ試薬（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＢＩＡｃｏｒｅ社製）およびＮＨＳ試薬（Ｎ−ｈｙｄｒｉｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＢＩＡｃｏｒｅ社製）を５０μｌずつ混合し、７０μｌをセンサーチップ上に流速１０μｌ／分で流入させチップ表面を活性化した。固定化用バッファー（２０ｍｍｏｌ／ｌ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５）に上記表１中の化合物番号１５５で表される化合物を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、流速１０μｌ／分でセンサーチップ上に注入し、約５０ＲＵとなるまで固定化した。
次に、７０μｌの１ｍｏｌ／ｌ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを流速１０μｌ／分で注入し、センサーチップ上の未反応なカルボキシル基を反応させた後、１０μｌの１００ｍｍｏｌ／ｌ塩酸で２回洗浄した。
ＨＢＳ−ＥＰバッファーに上記実施例１２で精製したマウスＨｉｓ−ｐ３１を１００ｎｍｏｌ／ｌの濃度で溶解した溶液をＨｉｓ−ｐ３１溶液、Ｈｉｓ−ｐ３１溶液に被検物質濃度が５００μｍｏｌ／ｌとなるように各被検物質溶液を加えたものをＨｉｓ−ｐ３１／被検物質溶液として結合実験に用いた。また、上記第１表中の化合物番号１６、１７、３６、３８、１０３または１４４で表される化合物をそれぞれ５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した溶液、および表１中の化合物番号９４または１８３で表される化合物をそれぞれ１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解した溶液を被検物質溶液として用いた。
被検物質溶液を流速２０μｌ／分で３００秒間センサーチップに流入させ、流入終了１５秒後の結合量（ＲＵ）を測定した。センサーチップ表面は、２ｍｏｌ／ｌグアニジン−塩酸（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）及び１０ｍｍｏｌ／ｌグリシン−塩酸（Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ）を各１２０秒ずつ流入し、再生させた。
ｐ３１溶液流入前の結合量（ＲＵ）を１００％、被験物質溶液の代わりにＤＭＳＯを添加したＨｉｓ−ｐ３１溶液を流入したときの結合量（ＲＵ）を０％として、Ｈｉｓ−ｐ３１／被検物質溶液を流入したときの結合量（ＲＵ）から、各被検物質によるＨｉｓ−ｐ３１と固定化された化合物１５５との結合阻害率（％）を換算した。
各被検物質のＨｉｓ−ｐ３１と固定された化合物番号１５５で表される化合物との結合阻害率（％）と、試験例１記載の方法で測定した各被検物質のインスリン分泌促進活性の相関を第７図に示した。被検物質のＨｉｓ−ｐ３１と固定された化合物番号１５５で表される化合物との結合阻害率と、該物質のインスリン分泌促進活性の相関係数は０．７８であり、有意な相関があることがわかった。
なお、上記被検物質は、ＷＯ００／０１３８８、ＷＯ０１／４７９３１に記載の方法に準じて合成した。
実施例１６ 細胞抽出液と化合物番号１５５で表される化合物を固定化した粒子を用いたインスリン分泌促進剤の探索
実施例１２で作製したＭＩＮ６の可溶化膜画分を緩衝液Ｂで１０倍に希釈した溶液１ｍｌに、５００μｍｏｌ／ｌの被検物質（化合物番号１６または１７で表される化合物）を加えて、４℃で２時間穏やかに攪拌した。対照として被検物質を加えていないＭＩＮ６の可溶化膜画分を緩衝液Ｃ〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１％ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン〕で１０倍に希釈した液１ｍｌを４℃で２時間穏やかに攪拌した。次に、被検物質を加えた可溶化膜画分および被検物質を加えていない可溶性膜画分溶液に実施例８で作製した化合物番号１５５で表される化合物を固定化した粒子（以下、化合物１５５固定化粒子と称する）を加え、４℃で３０分間穏やかに撹拌した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間、４℃）により粒子を沈殿させて上清を取り除いた。次に緩衝液Ｃを７５０μｌ加え、３秒間撹拌し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間、４℃）により粒子を沈殿させて上清を取り除いた。次に緩衝液Ｄ〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ〕を７５０μｌ加え、３秒間撹拌し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間、４℃）により粒子を沈殿させて上清を取り除いた。その後、β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプルバッファーを３０μｌ加え、化合物１５５固定化粒子に結合している蛋白質の溶出を行い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。結果を第８図に示す。
被験化合物を加えていない対照実験ではｐ３１蛋白質のバンドが確認できるが、被検物質化合物１６を加えた実験ではｐ３１蛋白質のバンドは確認できないことから、化合物１５５固定化粒子とｐ３１蛋白質との結合を化合物１６が阻害することを示している。一方、化合物１７を被検物質として用いた実験では、ｐ３１蛋白質のバンドは確認できることから、化合物１５５固定化粒子とｐ３１蛋白質の結合を化合物１７が阻害できないことを示している。。
実施例１７ Ｈｉｓ−ｐ３１蛋白質を用いたインスリン分泌促進剤の探索（１）
９６穴プレートを用いた結合競合実験
実施例１２で調製したＨｉｓ−ｐ３１蛋白質１０μｇを含むＰＢＳ溶液１００μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴に添加し、４℃、一晩静置して吸着させ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ ３００μｌを各穴に加え、４℃、１時間静置してブロッキングする。
フロオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でラベル化された化合物番号１５５で表される化合物（以下、ＦＩＴＣラベル化合物１５５と称す）は、市販のＮＨＳ−フルオロセインと上記表１中の化合物番号１５５で表される化合物をＤＭＳＯ中、室温で３時間混合することにより調製することができる。
１００μｍｏｌ／ｌの被検物質の存在下または非存在下、５μｍｏｌ／ｌのＦＩＴＣラベル化合物１５５ １００μｌと上記Ｈｉｓ−ｐ３１蛋白質を接触させ、上清除去後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、残存するＦＩＴＣラベル化合物１５５を蛍光プレートリーダーで測定することにより、縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合を阻害する作用を有する物質を選択することができる。
該物質のインシュリン分泌促進活性は、上記実施例８の方法によって確認することができる。
実施例１８ Ｈｉｓ−ｐ３１蛋白質を用いたインスリン分泌促進剤の探索（２）
キレートセファロースビーズを用いた結合競合実験
実施例１４で調製したＨｉｓ−Ｐ３１蛋白質を発現する遺伝子組換え大腸菌の培養物の破砕物上清４００μｌとＺｎ２＋イオンキレートセファロース１０μｌとを混ぜ、該蛋白質を結合させた後、ＰＢＳで洗浄し、親和性ビーズとする。該親和性ビーズを５００μｍｏｌ／ｌの被検物質の存在下または非存在下、１μｍｏｌ／ｌのＦＩＴＣラベル化合物１５５を含む溶液１ｍｌと混合し、上清を除去する。該親和性ビーズを洗浄後、残存するＦＩＴＣラベル化合物１５５を、１％ＳＤＳ水溶液１００μｌで抽出し、抽出液の蛍光強度を分光蛍光光度系で測定することにより、縮合プリン誘導体と縮合プリン誘導体結合蛋白質との結合を阻害する物質を選択することができる。
該物質のインシュリン分泌促進活性は、上記実施例８の方法によって確認することができる。
実施例１９ Ｈｉｓ−ｐ３１蛋白質を用いたインスリン分泌促進剤の探索（３）
酵素活性阻害実験
実施例１２で調製したＨｉｓ−ｐ３１蛋白質を１μｇ／ｍｌ、２５０μｍｏｌ／ｌのパラクロロベンズアルデヒドを含む、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）溶液１ｍｌに、ＮＡＤＰＨを５μｍｏｌ／ｌとなるように加えて３７℃でインキュベートし、被検物質存在下、および非存在下におけるパラクロロベンズアルデヒドの分解に伴うＮＡＤＰＨの減少を３４０ｎｍの吸光度で検出した。
被検物質として化合物番号１６または１７で表される物質を用いたときのＨｉｓ−ｐ３１蛋白質の酵素活性阻害を測定した結果、化合物番号１６で表される化合物は化合物番号１７で表される化合物に比べ、該蛋白質の活性を強く阻害した。
実施例２０ Ｈｉｓ−ｐ３１蛋白質を用いたインスリン分泌促進剤の探索（４）
酵素活性阻害実験
実施例１２で調製したＨｉｓ−ｐ３１蛋白質を１μｇ／ｍｌ、２５０μｍｏｌ／ｌのパラクロロベンズアルデヒドを含む、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）溶液１５０μｌに、ＮＡＤＰＨを５μｍｏｌ／ｌとなるように加えて３７℃で５分間インキュベートする。この反応溶液に０．２ｍｏｌ／ｌシアン化カリウム（ＫＣＮ）、０．０６ｍｏｌ／ｌ水酸化カリウム（ＫＯＨ）、１ｍｏｌ／ｌ Ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄからなる溶液を１５０μｌ加え、室温で５分間放置する。さらにクロロホルム８００μｌを加えて混合後、４℃、１５０，０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を０．２ｍｏｌ／ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ６．０）で４倍に希釈後、２５０μｌをＨＰＬＣに注入する。被検物質存在下、および非存在下におけるｐ３１による基質の分解に伴うＮＡＤＰＨの減少を、蛍光検出機（３３０／４６０ｎｍ）で検出する〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２８，３１２（１９９５）〕ことにより、被検物質よりＨｉｓ−ｐ３１の活性を阻害する物質を選択することができる。
選択される物質のインシュリン分泌促進活性は、上記実施例８の方法によって確認することができる。
実施例２１ Ｈｉｓ−ｐ３１蛋白質を用いたインスリン分泌促進剤の探索（５）
酵素活性阻害実験
実施例１２で調製したＨｉｓ−ｐ３１蛋白質を０．１μｇ／ｍｌ、溶液Ａ〔１％牛血清アルブミン、２０％グリセロール、１％ＣＨＡＰＳを含む２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、３ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５）〕及び溶液Ｂ〔４０μｍｏｌ／ｌ ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチナール、２５μｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＰＨ、０．１％牛血清アルブミン、２％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳを含む４０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、６ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５）〕を作成する。溶液Ａ０．２ｍｌと溶液Ｂ０．２ｍｌを混合し３２℃で１０分間インキュベートし、被検物質存在下、および非存在下におけるレチナールの分解に伴うＮＡＤＰＨの減少を３４０ｎｍの吸光度で検出する〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３８，４７（１９９７）〕ことにより、被検物質よりＨｉｓ−ｐ３１蛋白質のＮＡＤＰＨ酸化活性を阻害する物質を選択することができる。
選択される物質のインシュリン分泌促進活性は、上記実施例８の方法によって確認することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、縮合プリン誘導体を用いた、低血糖等の合併症を引き起こさない糖尿病治療薬、およびインスリン分泌促進剤の探索方法が提供される。
【配列表】
Figure 2003097862
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【図面の簡単な説明】
第１図のＡは、膵臓β細胞を用いたときの３Ｈで標識された化合物番号１６で表される化合物の結合飽和曲線を表す図である。図中、○―○は総結合量、○−−−−○は非特異的結合量、●―●は特異的結合量を表す。
第１図のＢは、上記Ａのスキャッチャードプロットである。
第２図は、膵臓β細胞を用いたときの３Ｈで標識された化合物番号１６で表される化合物の特異的結合に対する縮合プリン誘導体の阻害作用とインスリン分泌促進作用の相関を表す図である。
第３図のＡは、膵臓β細胞膜画分を用いたときの３Ｈで標識された化合物番号１６で表される化合物の結合飽和曲線を表す図である。図中、▲−−−−▲は総結合量、○−−−〇は非特異的結合量、●―●は特異的結合量を表す。
第３図のＢは、上記Ａのスキャッチャードプロットである。
第４図は、膵臓β細胞膜画分を用いたときの３Ｈで標識された化合物番号１６で表される化合物の特異的結合に対する縮合プリン誘導体の阻害作用とインスリン分泌促進作用の相関を表す図である。グラフのプロットに付した数字は、化合物番号を表す。化合物番号のうち、９５＊は、化合物９５の酒石酸塩を表す。
第５図は、膵臓β細胞の可溶化膜画分を用いたときの３Ｈで標識された化合物番号１６で表される化合物の結合を示す図である。
第６図は、組換えＨｉｓ−ｐ３１を９％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。レーン１は、精製された組換えＨｉｓ−ｐ３１、レーンＨは分子量マーカーを電気泳動したレーンである。矢印は組換えＨｉｓ−ｐ３１蛋白質の位置を示す。
第７図は、各化合物のＢＩＡｃｏｒｅを用いて算出されたＨｉｓ−ｐ３１蛋白質と化合物番号１５５で表される化合物（以下、化合物１５５という）との結合阻害活性とインスリン分泌促進活性との相関を示す図である。グラフのプロットに付した数字は、化合物番号を表す。
第８図は、ＭＩＮ６細胞の細胞抽出液と縮合プリン誘導体固定化粒子を用いたインスリン分泌促進剤の探索を示す図である。９％アクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１は、化合物１５５を固定化していない粒子を用いてＭＩＮ６細胞抽出液から精製された蛋白質、レーン２は化合物１５５固定化粒子を用いてＭＩＮ６細胞抽出液から精製されたｐ３１蛋白質、レーン３は化合物１５５固定化粒子を用いて、化合物番号１６で表される化合物で前処理したＭＩＮ６細胞抽出液から精製された蛋白質、レーン４は化合物１５５固定化粒子により化合物番号１７で表される化合物で前処理したＭＩＮ６細胞抽出液から精製された蛋白質、レーンＭは分子量マーカーを電気泳動したレーンである。矢印はｐ３１蛋白質の位置を示す。

Claims (24)

  1. ［１］被検物質存在下、下記の一般式（Ｉ）
    Figure 2003097862
    （式中、Ｒ１Ａは水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、又は置換若しくは非置換の芳香族複素環基を示し、Ｒ２Ａは水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアラルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、又は置換若しくは非置換の芳香族複素環基を示し、Ｒ３Ａは水素原子、低級アルキル基又は置換若しくは非置換のアラルキル基を示し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、低級アルキル基、置換若しくは非置換のアラルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を示し、ｎは０〜３の整数を示す）で表わされる化合物、または下記の一般式（ＩＩ）
    Figure 2003097862
    ｛式中、Ｘ…Ｙ…ＺはＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表す）またはＮ＝Ｃ−Ｗ［式中、Ｗはハロゲン、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、−ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表すか、Ｒ４とＲ５が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成する）、−ＯＲ６（式中、Ｒ６は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表す）、−ＳＲ６ａ（式中、Ｒ６ａは前記Ｒ６と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルまたはシアノを表す］を表し、Ｒ２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記Ｒ４およびＲ５と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌはハロゲンを表す）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記Ｒ４およびＲ５と同義である）または−ＣＨＯを表し、Ｒ３は水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは低級アルコキシアルキルを表し、ｎは０〜３の整数を表し、Ｖ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｖ２は置換低級アルキルまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｖ１が水素原子、低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表し、かつ（ａ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１ａＮ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１ａは前記Ｒ１の定義中、置換低級アルキル以外の基を表す）を表し、Ｒ２が置換低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌは前記と同義である）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記と同義である）または−ＣＨＯを表すか、（ｂ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１Ｎ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１は前記と同義である）を表し、Ｒ３が低級アルコキシアルキルを表すか、（ｃ）Ｘ…Ｙ…ＺがＲ１ｂＮ−Ｃ＝Ｏ（式中、Ｒ１ｂは置換低級アルキルを表す）を表すか、（ｄ）Ｘ…Ｙ…ＺがＮ＝Ｃ−Ｗ（式中、Ｗは前記と同義である）を表し、Ｒ２が置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の芳香族複素環基、置換もしくは非置換の脂環式複素環基、ハロゲン、低級アルキルチオ、−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ前記と同義である）、−ＣＯ２Ｈ、低級アルコキシカルボニル、−ＣＯＨａｌ（式中、Ｈａｌは前記と同義である）、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ前記と同義である）または−ＣＨＯを表すか、（ｅ）Ｘ…Ｙ…ＺがＮ＝Ｃ−Ｗ（式中、Ｗは前記と同義である）を表し、Ｒ３が低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは低級アルコキシアルキルを表す場合、Ｖ２は低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表してもよい｝で表される化合物から選ばれる化合物（以下、縮合プリン誘導体と略す）と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合を阻害する物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
  2. ［１］被検物質存在下、請求項１記載の縮合プリン誘導体と該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と該蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合を阻害する物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
  3. ［１］被検物質存在下、請求項１記載の縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該縮合プリン誘導体と膵臓β細胞または該細胞の処理物との結合を阻害する物質を選択する工程、［５］［４］の工程で得られる物質より、縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質の探索方法。
  4. ［１］被検物質存在下、請求項１記載の縮合プリン誘導体と該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量を測定する工程、［２］被検物質非存在下、該縮合プリン誘導体と該蛋白質とを接触させた場合の該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該縮合プリン誘導体と該蛋白質との結合を阻害する物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質に結合する物質の探索方法。
  5. ［１］被検物質と請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該蛋白質の活性を測定する工程、［２］被検物質を接触させない場合での該蛋白質の活性を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質の活性を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の活性を変化させる物質の探索方法。
  6. ［１］被検物質と請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質とを接触させた場合の該蛋白質の活性を測定する工程、［２］被検物質を接触させない場合での該蛋白質の活性を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質の活性を抑制する物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の活性を抑制する物質の探索方法。
  7. ［１］被検物質と請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の細胞応答を測定する工程、［２］被検物質非存在下での該形質転換体の細胞応答を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該形質転換株の細胞応答を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の機能を変化させる物質の探索方法。
  8. ［１］被検物質と請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程、［２］被検物質非存在下での該形質転換体の該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる物質の探索方法。
  9. ［１］被検物質と請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質を発現する形質転換体とを接触させた場合の該形質転換体の該蛋白質の発現量を測定する工程、［２］被検物質非存在下での該形質転換体の該蛋白質の発現量を測定する工程、［３］被検物質存在下と被検物質非存在下での該測定値を比較する工程、［４］被検物質より該蛋白質の発現量を変化させる物質を選択する工程、を含む該縮合プリン誘導体に結合する蛋白質の発現量を変化させる物質の探索方法。
  10. 縮合プリン誘導体が下記式（ＩＩＩ）
    Figure 2003097862
    で表される化合物である請求項１〜９のいずれか１項に記載の探索方法。
  11. 請求項１記載の縮合プリン誘導体を固定化した担体を用いることを特徴とする請求項２および４〜９のいずれか１項に記載の探索方法。
  12. 担体が、セファロース粒子である請求項１１記載の探索方法。
  13. 縮合プリン誘導体が下記式（ＩＶ）
    Figure 2003097862
    で表される化合物である請求項１１または１２記載の探索方法。
  14. 請求項１記載の縮合プリン誘導体を固定化した担体。
  15. 縮合プリン誘導体が、請求項１３の式（ＩＶ）で表される縮合プリン誘導体である請求項１４記載の担体。
  16. 担体が、セファロース粒子である請求項１４または１５記載の担体。
  17. 請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質が、下記［ｉ］〜［ｉｉｉ］から選ばれるいずれか１つの蛋白質である請求項２および４〜１３のいずれか１項に記載の探索方法。
    ［ｉ］配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
    ［ｉｉ］配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質
    ［ｉｉｉ］配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ請求項１記載の縮合プリン誘導体に結合する蛋白質
  18. 請求項１〜１３、および１７のいずれか１項に記載の探索方法で得られる物質または該物質の薬学的に許容される塩。
  19. 請求項１８記載の物質または該物質の薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
  20. 請求項１８記載の物質または該物質の薬学的に許容される塩を有効成分として含有する糖尿病治療剤。
  21. 請求項１８記載の物質または該物質の薬学的に許容される塩を有効成分として含有するインシュリン分泌促進剤。
  22. 下記の一般式（Ｖ）
    Figure 2003097862
    ［式中、Ｒ１Ｂ、Ｒ２ＢおよびＲ３Ｂは同一または異なって、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、またはＮを含有する置換若しくは非置換の複素環基（該複素環基はＮ原子でトリアジン環に結合する）を表す］で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するインシュリン分泌促進剤。
  23. 請求項２２の一般式（Ｖ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含むインシュリン分泌の促進方法。
  24. インシュリン分泌促進剤の製造のための請求項２２の一般式（Ｖ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
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