JPWO2003018796A1 - Oxidative dehalogenase gene useful for the synthesis of optically active 1,2-diol and halogenohydrin and a method for overexpression thereof - Google Patents

Abstract

The present invention provides an oxidative dehalogenase gene useful for the synthesis of optically active 1,2-diol and halogenohydrin, and a method for overexpressing the gene.

Description

したがって、ＨＤＤを使用することによって、そのＨＤＤ活性による触媒作用により、安価なラセミ体１，２−ジオールまたはハロゲノヒドリンから、（Ｓ）体１，２−ジオールまたは（Ｓ）もしくは（Ｒ）体ハロゲノヒドリンが選択的に分解除去され、残存する（Ｒ）体１，２−ジオール、または（Ｒ）もしくは（Ｓ）体ハロゲノヒドリンが回収される（特開平７−１４７９９３号公報，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２３９−２４６，１９９４）。
本発明者等は、アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株から電気泳動分析において単一な酵素標品を得ることができたことにより、種々の遺伝子工学的手法を駆使してＨＤＤ遺伝子を単離し、その塩基配列ならびにアミノ酸の一次構造を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。
発明の開示
本発明は、光学活性１，２−ジオールおよびハロゲノヒドリンの合成に有用な酸化的脱ハロゲン化酵素遺伝子およびその大量発現法を提供する。
本発明は、配列番号１の塩基配列からなるハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ遺伝子に関する。
また、本発明は、配列番号２及び３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子にも関する。
また、本発明は、配列番号２及び３において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子にも関する。
また、本発明は、上記の遺伝子を含有する組換えベクター、この組換えベクターを導入した形質転換体及びその形質転換体を用いるハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼの製造方法にも関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号１に示すＨＤＤ遺伝子は、例えばアルカリゲネスに属する微生物ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９８）の染色体ＤＮＡから分離することができる。その遺伝子供与体からのＨＤＤ遺伝子をもつＤＮＡ断片の取得は、例えば精製酵素ＨＤＤのポリペプチド鎖の部分アミノ酸配列をもとに行なうことができる。即ち、プロテインシークエンサーによりアミノ酸配列の一部を決定し、これをもとにしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用プライマーを合成する。次いでアルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行ない、ＨＤＤ遺伝子の一部を増幅して、その塩基配列を明らかにする。得られたＨＤＤ遺伝子の部分塩基配列をプローブとして、遺伝子供与体の染色体ＤＮＡから常法により作製したＤＮＡライブラリーよりハイブリダイゼーション法を用いて目的のＨＤＤをコードする遺伝子のＤＮＡ断片を得ることができる。
取得したＨＤＤ遺伝子のＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法としては、例えばジデオキシシークエンス法が挙げられる。この方法には、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法や核酸分解酵素により欠失させる方法などの、遺伝子工学分野で慣用される様々な手法が含まれる。これらの方法により、配列番号１で示される目的のＤＮＡ塩基配列中に大サブユニットと小サブユニットの全アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が確認できる。
本発明のＨＤＤをコードするＤＮＡは、ＨＤＤ活性を有するアミノ酸配列が実質的に配列番号２，３に示されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むことを特徴とする。ここで、ＨＤＤ活性を有する限り、配列番号２および配列番号３に示したアミノ酸配列についてアミノ酸の１個又は数個の欠失、挿入、置換等があってもよい。例えば、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、置換等を生じるようにＤＮＡを改変することは、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法などの周知の方法で適宜行うことができる。また、配列番号１に示したＤＮＡまたは該ＤＮＡを適宜改変したＤＮＡを鋳型にして、Ｍｎ^２＋イオンの存在下（通常０．５〜１０ｍＭの濃度）、または特定のヌクレオチドの濃度を低くしてＰＣＲ法を行うことによってランダムに変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。
ＨＤＤの遺伝情報を担うＤＮＡ断片から必要な部分をベクターに組み込むことにより、宿主細胞に導入し形質転換体を得ることができる。導入された宿主細胞内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主細胞内で、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に制限なく使用できる。
このようなベクターとしては、宿主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付与されたものがあげられる。さらに、このようなベクターは公知のベクター等から公知の技術を用いて業者が容易に製造し得るようなものであってもよいし、商業的に販売されているものでも良い。
具体的なベクターとしては、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターがあげられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよいし、ランナウェイベクターやスリーパーベクターなどの遺伝子産物の発現効率を向上せしめるために特別に工夫されたものであってもよい。本発明のＤＮＡを微生物中で発現させるためには、それが有する遺伝情報を転写、翻訳させる必要がある。そのために本発明のＤＮＡを用いるベクターＤＮＡの適当な位置、かつ適当な方向に組み込む必要がある。また本ＤＮＡは、ＨＤＤの大小各サブユニットをコードする配列から、ヘテロ二量体として発現させなければならない。例えば大小各サブユニットをコードする配列がオペロンを形成している本ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを適当な同制限酵素で消化切断し、５′−側上流にプロモーターを、３′−側下流にターミネーターがくるよう組み込めばよい。プラスミドベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に組み込んだｐＵＣ−ＨＤＤ１は効果的である。
更に本発明は、アミノ酸配列が配列番号２および配列番号３に示されているポリペプチドをコードするＤＮＡにより形質転換された、ＨＤＤ活性を有する酵素の産生能を有する微生物を提供する。
用いられる宿主細胞としては、得られた組換えベクターでもって形質転換され、かつ本遺伝子を発現させることができるようなものであれば特に制限なく使用することができる。このような宿主細胞としては、本発明の目的に沿って本遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用できる。
具体的に本発明で使用することのできる宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス属、サッカロミセス属、キサントモナス属、アセトバクター属、シュードモナス属、グルコノバクター属、アゾトバクター属、リゾビウム属、クレブシエラ属、サルモネラ属及びセラチア属から選ばれる微生物が挙げられる。特に好ましいのは大腸菌ＪＭ１０９株である。
形質転換体は、適当な栄養培地中で培養を行なうことにより大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地であれば何でも良い。例えば炭素源としてグルコース，フラクトース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール等のアルコール類、酢酸，クエン酸，リンゴ酸，マレイン酸，フマル酸，グルコン酸とその塩類などの有機酸、またはそれらの混合物を用いることが出来る。窒素源として硫酸アンモニウム，硝酸アンモニウム，リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物および尿素，ペプトン，カゼイン，酵母エキス，肉エキス，コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩，マグネシウム塩，カリウム塩，マンガン塩，鉄塩，亜鉛塩，銅塩など、更に必要に応じてビタミン類を加えてもよい。また、高酵素活性を持った形質転換菌体を得るための酵素誘導添加物として、上記培地およびペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地に使用する菌株に応じて、効果的に目的のＤＮＡを発現させるためにアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加してもよいし、イソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等のプロモーターの活性化誘導剤を用いることもできる。培養は好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の任意の範囲に制御して１〜５日間培養を行えばよいが、用いる形質転換体により最適な条件で培養すると更に効果的である。
得られたＨＤＤ産生形質転換体の細胞から本酵素の抽出は次の方法で行うことが出来る。１）フレンチプレスや超音波破砕による機械的（物理的）方法、２）リゾチームなどの酵素処理方法、３）自己溶解法、４）浸透圧を利用した抽出法などの方法によって形質転換体を破壊して行うことができる。酵素の単離精製にあたっては、特開平７−１４７９９３号に記載の種々のカラムクロマトグラフィーを利用した方法が使用できる他、タグ付きのベクターを用いて親和性カラムによりアフィニティークロマトグラフィーを利用して簡便に行なうこともできる。
本方法で産生される酵素は、起源のアルカリゲネス属におけるＨＤＤのポリペプチド配列と一致するもののみに限定されず、塩基配列変換や遺伝子変換などの遺伝子組換え手法を利用して得られるポリペプチドで、ＨＤＤ活性を示すものと解すべきである。すなわちペプチド配列中のアミノ酸の１個又は数個が欠損したもの、あるいはそのペプチド配列中のアミノ酸の１個又は数個が他のアミノ酸で置き換えられたものをも包含する。
本発明に使用される形質転換体とは、上記の宿主細胞をＨＤＤ遺伝子で形質転換した細胞のことであり、好ましくは組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行なった組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）を挙げることができる。
実施例
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１ 遺伝子のクローニング
（１）アルカリゲネス属からの染色体ＤＮＡの調製
アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９８）をＰＹＧ培地（１％ポリペプトン、１％酵母エキス、１％グリセリン）８ｍｌ中で２０時間培養し、遠心分離により菌体を回収した。菌体を４９０μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、１０％ＳＤＳを３０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫを５０μｌ添加し、５０℃で１時間インキュベートした。その後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）による抽出を行なった後、０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を添加し、０．６倍量の２−プロパノールを静かに重層した。その結果、界面に生じたＤＮＡをガラス棒で糸状に巻きつけて回収した。
得られたＤＮＡを５００μｌのＴＥ溶液に溶解させた。約１．７ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。
（２）プローブの作製
アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株からのＨＤＤを、鈴木等の方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２７０−２７９，１９９４）にしたがって単離精製した。この精製ＨＤＤの２量体の各サブユニットをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、アクリルアミドゲルより回収した。大サブユニットについてＮ末端部分アミノ酸配列（配列番号４に示す）と、キモトリプシン処理を行ない、得られたペプチド断片の部分アミノ酸配列（配列番号５に示す）をアミノ酸シークエンサーで決定した。配列番号４及び５のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列をコドン縮重を考慮してＰＣＲプライマーを合成し（配列番号７及び８に示す）、上記（１）で抽出した全染色体ＤＮＡ５０ｎｇを鋳型にしてＰＣＲ反応（熱変性９６℃、３０秒、アニーリング４８℃、１分、伸長反応７２℃、１分）を４０サイクル行ない、４℃まで冷却後アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認し、ＤＮＡ断片を常法によりアガロースゲルより回収した。次いで、そのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にサブクローニングし、塩基配列をＤＮＡシークエンサーで決定した。その結果、決定したＤＮＡ塩基配列中に、あらかじめ決定した大サブユニットの部分アミノ酸配列（配列番号４及び５）をコードする領域を確認できたので、得られた増幅ＤＮＡを常法に従って^３２Ｐでラベルし、プローブＤＮＡとした。
（３）制限酵素地図の作成
上記で決定したＤＮＡ塩基配列の一部配列より合成したＰＣＲプライマー（配列番号９に示す）と、小サブユニットのＮ末端アミノ酸配列（配列番号６に示す）より合成した縮重プライマー（配列番号１０に示す）とを用いて上記反応と同様の方法でＰＣＲを行なったところ、ＤＮＡの増幅がアガロース電気泳動により確認できた。その結果、大サブユニットをコードする塩基配列（オープンリーディングフレーム：ＯＲＦ）のすぐ３′下流に小サブユニットのＯＲＦが存在することがわかった。次いで、抽出したＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の染色体ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ない、染色体ＤＮＡに由来する塩基配列であることを確認すると共に、大、小それぞれのポリペプチドに相当するＯＲＦとその周辺の塩基配列について制限酵素地図を作成した。
（４）ゲノムライブラリーからの遺伝子のクローニング
作製した制限酵素地図から目的とするＨＤＤ遺伝子の全長が含まれることを考慮して、ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の染色体ＤＮＡをＮｏｔＩ，ＰｓｔＩで切断後、約５３００塩基対に相当する多種類のＤＮＡ断片をｌａｃプロモーターとは逆向きにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳの同制限酵素部位に挿入したゲノムライブラリーを作製した。これを大腸菌ＤＨ５α株に導入して得られた形質転換体３２０個体から、上記で作製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションにより８個体の陽性株を得た。挿入されていたＨＤＤ遺伝子の全長を図１に示す。
（５）塩基配列の決定
上記陽性株の一株から常法によりプラスミドを抽出し、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびマングマメのエンドヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により挿入遺伝子断片を種々欠失させ、それぞれの試料の塩基配列をジデオキシ法により決定した。決定した塩基配列とその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号４〜６に示す精製ＨＤＤの部分アミノ酸配列は、陽性株由来の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、その部分アミノ酸配列が完全に一致した。
〔実施例２〕組換えプラスミドの作製
上記で抽出したプラスミドについて、ｌａｃプロモーターの支配下になるようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫのＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＳＫ−ＨＤＤを得た。また、配列番号１に示した目的とする構造遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ部位にｌａｃプロモーターの支配下になるように挿入し、組換えプラスミドｐＫＳ−ＨＤＤ１を得た。また同様にｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＵＣ−ＨＤＤ１を得た（図２）。
〔実施例３〕組換え大腸菌の作製
常法により実施例２で得た組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行ない、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳＫ−ＨＤＤ）、ＪＭ１０９（ｐＫＳ−ＨＤＤ１）、ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）を得た。なお、宿主に大腸菌ＤＨ５αを用いた場合、形質転換体を得ることはできなかった。
〔実施例４〕組換え大腸菌におけるＨＤＤの発現
（１）組換え大腸菌で発現したＨＤＤの評価
実施例３で得た形質転換体ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）を試験管に５ｍｌ入ったＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）で、１６時間、３０℃で好気的に種培養し、１ｍｌを３００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに入った新しいＬＢ培地５０ｍｌに移植した。Ｏ．Ｄ．が０．５になるまで培養し、１ｍＭのＩＰＴＧによる２時間誘導後、形質転換体を集菌した。また、アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株については、同三角フラスコに入ったＰＹＧ培地（１％ポリペプトン、１％酵母エキス、１％グリセリン）を２０時間３０℃で好気的に種培養したものを集菌した。各々の試料を５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して超音波破砕（２０ｋＨｚ、２０Ｗ）により破砕し、遠心操作により不要物を除去して細胞抽出液を得た。これをポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）に供し、泳動後にＨＤＤ活性による活性染色を行った。反応液として、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に０．５ｍＭフェナジンメソサルフェート（ＰＭＳ）、０．５ｍＭテトラニトロテトラゾリウムブルー、基質として０．２％（ｖ／ｖ）（Ｒ）体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを添加した溶液を調製し、電気泳動後のゲルを２０分間浸してＨＤＤ活性を基にした活性染色を行なった（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２３９−２４６，１９９４）。
その結果、ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）からの抽出液では、アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来のＨＤＤのものと同じ位置に染色バンドが観察されたのに対し、ベクタープラスミドのみの形質転換体ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８）では染色バンドはみられなかった。したがって、組換えプラスミドによって形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）が産生するＨＤＤは、ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来のものと同一のものであることが明らかになった（図３）。
（２）組換え大腸菌におけるＨＤＤ活性の測定
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に０．２５ｍＭフェナジンメソサルフェート（ＰＭＳ）、０．２５ｍＭ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、０．２％（ｖ／ｖ）各種基質を加えた反応液を調製し、この２．７ｍｌに実施例４の（１）と同様の方法で調製したＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）細胞抽出液３００μｌを加え、３０℃で１０分間反応させた。ＨＤＤ活性は、ＤＣＩＰの還元による６００ｎｍの吸光度の減少を利用した比色定量により行なった（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２３９−２４６，１９９４）。基質の２，３−ジクロロ−１−プロパノールは、式（１）に、３−クロロ−１，２−プロパンジオールは、式（２）に、１，２−プロパンジオール、１，２，４−ブタントリオールは、式（３）の反応式の基質に相当する。その結果、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）の細胞抽出液は、アルケリゲネスＤＳ−Ｓ−７Ｇ株同様に各々の基質に対して立体選択性を有し、さらにタンパク質１ｍｇ当たりの活性は、ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の約１．１〜１．９倍であった。その結果を表１に示す。なお、１Ｕは、３０℃で１分間あたりに１μモルのＤＣＩＰを還元する酵素量を表わし、結果はタンパク質１ｍｇ当たりの活性として表した。タンパク質の定量は、ブラッドフォード法により行った。

また、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳＫ−ＨＤＤ）、ＪＭ１０９（ｐＫＳ−ＨＤＤ１）についても同様に（Ｒ）体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを基質としてＨＤＤ活性を測定したところ、活性はＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）より低かった（表２）。

（３）組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）由来ＨＤＤの熱安定性の評価
実施例４の（１）と同様の方法で調製したＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）の細胞抽出液３００μｌを３０℃〜６０℃で１５分静置後（２）と同様の方法で（Ｒ）体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを基質として３０℃で反応させた。その結果、４０℃以上でアルケリゲネスＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来の細胞抽出液と比較して組換え大腸菌由来の細胞抽出液のＨＤＤ活性は熱安定性が増していた。３０℃での活性に対する相対活性が５０％に減少する温度は、アルケリゲネスＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来の酵素では４４℃、また組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）由来の酵素では５０℃であった（表３）。

アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株は、ＨＤＤ活性を約５倍上昇させるタンパク質を有していることが確認されている（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２７０−２７９，１９９４）。これに対して、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）由来細胞抽出液のタンパク質１ｍｇあたりのＨＤＤ比活性は、ＨＤＤ遺伝子発現のみでアルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来の抽出液よりも１．１〜１．９倍高活性であり、熱安定性も向上した。ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８４０３として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、医薬、農薬、及び強誘電性液晶などに使用される光学活性化合物またはその中間体の合成において、有用なキラルビルディングブロックとなりうる光学活性１，２−ジオールおよびハロゲノヒドリンの製造を効率よく実施することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳにクローニングされたＨＤＤ遺伝子を含む領域の制限酵素地図、ならびに大小２つのサブユニットのＯＲＦを示す図である。ＯＲＦを挟むＥｃｏＲＩ部位間で塩基配列の決定を行なった。
第２図は、ｐＵＣ−ＨＤＤ１の制限酵素地図である。クローニングされたＨＤＤ遺伝子のＯＲＦを挟むＥｃｏＲＩ部位間をｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。
第３図は、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ活性染色後のゲル写真である。左のレーンから、１）ＤＳ−Ｓ−７Ｇ（アルカリゲネス属）、２）ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）、３）ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８）を示している。Technical field
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in the production of optically active 1,2-diols and halogenohydrins that can be useful chiral building blocks in the synthesis of optically active compounds or intermediates thereof used in pharmaceuticals, agricultural chemicals, ferroelectric liquid crystals, and the like. The present invention relates to a gene encoding an oxidative dehalogenase (halohydrin dehydrodehalogenase: HDD), which is a novel biocatalyst, and a large-scale production of the polypeptide using a transgenic microorganism thereof. That is, the present invention relates to a gene encoding the oxidative dehalogenase HDD, a recombinant vector containing the gene, a transformant transformed with the recombinant vector, and a method for producing the enzyme using the transformant.
As for the chemical production method of optically active 1,2-diols, a production method of reducing an optically active amino acid to 1,2-diol as a chemical method has long been used (Nippon Kagaku Magazine, Vol. 91, pp. 265, 1970). A process for ring-opening an optically active 1,2-epoxyglycidyl derivative to the corresponding optically active 1,2-diol (JP-A-1-146834) is known. Recently, production methods using chemical catalysts such as a BiNAP catalyst (Tetrahedron Lett., Vol. 32, pp. 4163-4166, 1991) and a cobalt salen catalyst (Science, Vol. 277, pp. 936-938, 1997) are known. However, it is difficult to say that the production method is industrially inexpensive and economical, for example, a raw material having high optical purity is required, the reaction conditions are high temperature and high pressure, and an expensive catalyst is required.
As a biological production method, a production method of (R) -form 1,2-propanediol and (R) -form 1,2-butanediol by a reduction reaction using glycerol dehydrogenase by Lee and Whitesides is known (Journal of Organic Chemistry). 51, pp. 25-36, 1986. In addition, optically active 3-chloro-1,2- by transesterification reaction between 3-chloro-1,2-propanediol and triglyceride using fungal lipase. A method for producing propanediol and its ester is known (JP-A-3-53885), and a stereoselective assimilation and resolution method using a microorganism starting from an inexpensive racemic compound has been proposed. One enantiomer is assimilated from -1,2-propanediol and the remaining A production method for recovering the other enantiomer is known (microbial assimilation method, Japanese Patent Laid-Open Publication No. 4-73999), but the assimilation method using microorganisms has a problem that a long time is required for the reaction. I have.
As a solution to such a point, the present inventors have already reported that Alcaligenes sp., A bacterium belonging to the genus Alcaligenes isolated from soil. From the DS-S-7G strain (FERM BP-3098), halohydrin dehydro, an enzyme that catalyzes a highly stereoselective oxidative dehalogenation reaction on halogenohydrin as shown in the following formulas (1) and (2) A dehalogenase (hereinafter abbreviated as HDD) was found (Appl Microbiol Biotechnol Vol. 42, pp. 270-279, 1994). In addition, the inventors have also found that the HDD has a highly stereoselective alcohol dehydrogenase activity for a 1,2-diol compound represented by the following formula (3). Hereinafter, this unique enzyme activity is abbreviated as HDD activity. The HDD is a 70 kDa protein composed of two polypeptides, large and small (molecular weights of 58 kDa and 16 kDa, respectively).

Therefore, by using an HDD, the (S) -form 1,2-diol or (S) -form or (R) -form halogenohydrin can be converted from inexpensive racemic 1,2-diol or halogenohydrin by the catalysis by the HDD activity. It is selectively decomposed and removed, and the remaining (R) -form 1,2-diol or (R)-or (S) -form halogenohydrin is recovered (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-149993, Tetrahedron Asymmetry Vol. 239-246, 1994).
The present inventors were able to obtain a single enzyme preparation by electrophoresis analysis from Alcaligenes genus DS-S-7G strain, isolated the HDD gene using various genetic engineering techniques, The inventors succeeded in determining the nucleotide sequence and the primary structure of the amino acid, and completed the present invention.
Disclosure of the invention
The present invention provides an oxidative dehalogenase gene useful for the synthesis of optically active 1,2-diol and halogenohydrin, and a method for overexpressing the gene.
The present invention relates to a halohydrin dehydrodehalogenase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
The present invention also relates to a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3.
The present invention also relates to a gene comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in SEQ ID NOS: 2 and 3, and encoding a protein having halohydrin dehydrodehalogenase activity. Also concerns.
The present invention also relates to a recombinant vector containing the above gene, a transformant into which the recombinant vector has been introduced, and a method for producing halohydrin dehydrodehalogenase using the transformant.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The HDD gene shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention can be isolated from, for example, chromosomal DNA of microorganism DS-S-7G belonging to Alcaligenes (FERM BP-3098). The DNA fragment having the HDD gene can be obtained from the gene donor based on the partial amino acid sequence of the polypeptide chain of the purified enzyme HDD, for example. That is, a part of the amino acid sequence is determined by a protein sequencer, and a primer for polymerase chain reaction (PCR) is synthesized based on the determined amino acid sequence. Then, PCR is performed using the chromosomal DNA of the Alcaligenes genus DS-S-7G strain as a template to amplify a part of the HDD gene to reveal its nucleotide sequence. Using the obtained partial nucleotide sequence of the HDD gene as a probe, a DNA fragment of the gene encoding the target HDD can be obtained by a hybridization method from a DNA library prepared from a chromosomal DNA of a gene donor by a conventional method. .
Examples of a method for determining the DNA base sequence of the obtained DNA fragment of the HDD gene include a dideoxy sequencing method. This method includes various methods commonly used in the field of genetic engineering, such as a method of amplifying a gene by PCR and a method of deletion by a nuclease. By these methods, an open reading frame (ORF) encoding all amino acids of the large subunit and the small subunit in the target DNA base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be confirmed.
The DNA encoding the HDD of the present invention is characterized in that the amino acid sequence having HDD activity substantially contains the nucleotide sequence encoding the polypeptide shown in SEQ ID NOs: 2 and 3. Here, as long as it has HDD activity, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 may have one or several amino acid deletions, insertions, substitutions and the like. For example, modification of DNA so as to cause some deletion, insertion, substitution, etc. of amino acids in the amino acid sequence encoded by DNA can be performed by well-known methods such as site-directed mutagenesis using synthetic oligonucleotides. It can be performed appropriately. Using the DNA shown in SEQ ID NO: 1 or a DNA obtained by appropriately modifying the DNA as a template, Mn ²⁺ By performing a PCR method in the presence of ions (usually at a concentration of 0.5 to 10 mM) or at a lower concentration of a specific nucleotide, a DNA into which a mutation has been randomly introduced can be obtained.
By incorporating a necessary portion from the DNA fragment carrying the genetic information of the HDD into a vector, the vector can be introduced into a host cell to obtain a transformant. The vector used for expression in the introduced host cell can be used without any particular limitation as long as it can express the gene of the present invention in an appropriate host cell.
Examples of such a vector include a vector that is capable of autonomous replication in a host cell and is provided with an appropriate selection marker or the like that allows selection of only a recombinant host cell. Further, such a vector may be one which can be easily produced by a trader using a known technique from a known vector or the like, or may be a commercially available vector.
Specific vectors include, for example, plasmid vectors, phage vectors, and cosmid vectors. In addition, the vector may be a shuttle vector capable of gene exchange with another host strain, or a specially devised one for improving the expression efficiency of gene products such as a runaway vector and a sleeper vector. You may. In order to express the DNA of the present invention in a microorganism, it is necessary to transcribe and translate the genetic information possessed by the DNA. For that purpose, it is necessary to integrate the vector DNA using the DNA of the present invention at an appropriate position and in an appropriate direction. In addition, the present DNA must be expressed as a heterodimer from a sequence encoding each subunit of the HDD. For example, the present DNA fragment in which the sequence encoding each of the large and small subunits forms an operon and the vector DNA are digested and cleaved with the same restriction enzymes, and a promoter is placed upstream of the 5'-side and a terminator is placed downstream of the 3'-side. You just need to incorporate it. PUC-HDD1 integrated into the EcoRI site of plasmid vector pUC18 is effective.
Furthermore, the present invention provides a microorganism capable of producing an enzyme having HDD activity, which is transformed with a DNA encoding the polypeptide whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
Any host cell can be used without particular limitation as long as it can be transformed with the obtained recombinant vector and can express the present gene. As such a host cell, as long as the expression of the present gene can be achieved for the purpose of the present invention, gram-negative bacteria or gram-positive bacteria can be distinguished, and further, lower cells or higher cells can be distinguished. It can be used whether it is from cells of plant or plant origin.
Specific examples of host cells that can be used in the present invention include Escherichia coli, Alcaligenes, Saccharomyces, Xanthomonas, Acetobacter, Pseudomonas, Gluconobacter, Azotobacter, and Rhizobium. , Klebsiella, Salmonella and Serratia. Particularly preferred is E. coli JM109 strain.
Transformants can be obtained in large amounts by culturing in a suitable nutrient medium. The medium used for the culture may be any ordinary medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of the microorganism. For example, as a carbon source, carbohydrates such as glucose and fructose; alcohols such as glycerol, mannitol, sorbitol, and propylene glycol; organic acids such as acetic acid, citric acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid and salts thereof, and the like. Can be used. Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium phosphate, and organic nitrogen compounds such as urea, peptone, casein, yeast extract, meat extract, and corn steep liquor, and mixtures thereof. In addition, vitamins may be added as necessary, such as phosphates, magnesium salts, potassium salts, manganese salts, iron salts, zinc salts, and copper salts. In addition, as an enzyme-inducing additive for obtaining transformed cells having high enzyme activity, the desired DNA can be effectively expressed according to the strain used in the nutrient medium such as the above medium and peptone medium or bouillon medium. For this purpose, an antibiotic such as ampicillin, kanamycin, chloramphenicol or the like may be added to the culture solution, or a promoter activation inducer such as isopropyl β-D (-)-thiogalactopyranoside (IPTG). Can also be used. The cultivation may be performed under aerobic conditions at an arbitrary range of pH 4 to 10 and a temperature of 20 to 60 ° C. for 1 to 5 days, but it is more effective to culture under optimal conditions depending on the transformant used. It is.
The present enzyme can be extracted from the cells of the obtained HDD-producing transformant by the following method. 1) Mechanical (physical) method by French press or ultrasonic crushing 2) Enzyme treatment method such as lysozyme 3) Autolysis method 4) Destruction of transformants by extraction method using osmotic pressure You can do it. For the isolation and purification of the enzyme, various methods utilizing column chromatography described in JP-A-7-147993 can be used, and a simple method using affinity chromatography with an affinity column using a vector with a tag can be used. Can also be performed.
The enzyme produced by this method is not limited to the one that matches the polypeptide sequence of the HDD in the genus Alcaligenes, and may be a polypeptide obtained by using a genetic recombination technique such as base sequence conversion or gene conversion. , HDD activity. That is, it also includes those in which one or several amino acids in the peptide sequence are deleted, or those in which one or several amino acids in the peptide sequence are replaced with other amino acids.
The transformant used in the present invention is a cell obtained by transforming the above host cell with the HDD gene, and is preferably a recombinant E. coli JM109 obtained by transforming Escherichia coli JM109 using a recombinant plasmid. pUC-HDD1).
Example
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited at all by these examples.
Example 1 Gene Cloning
(1) Preparation of chromosomal DNA from Alcaligenes genus
Alcaligenes genus DS-S-7G strain (FERM BP-3098) was cultured in 8 ml of PYG medium (1% polypeptone, 1% yeast extract, 1% glycerin) for 20 hours, and the cells were collected by centrifugation. The cells were suspended in 490 μl of a TE solution (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA), 30 μl of 10% SDS and 50 μl of 20 mg / ml protease K were added, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 1 hour. Then, after performing extraction with an equal volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), 0.1 volume of 3M sodium acetate solution was added, and 0.6 volume of 2-propanol was gently removed. Overlaid. As a result, the DNA generated at the interface was wound around a glass rod and collected.
The obtained DNA was dissolved in 500 μl of a TE solution. About 1.7 mg of chromosomal DNA was obtained.
(2) Preparation of probe
The HDD from Alcaligenes genus DS-S-7G strain was isolated and purified according to the method of Suzuki et al. (Appl. Microb. Biotechnol. Vol. 42, pp. 270-279, 1994). Each subunit of the dimer of this purified HDD was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and recovered from acrylamide gel. The large subunit was subjected to N-terminal partial amino acid sequence (shown in SEQ ID NO: 4) and chymotrypsin treatment, and the partial amino acid sequence of the obtained peptide fragment (shown in SEQ ID NO: 5) was determined by an amino acid sequencer. PCR primers were synthesized from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5 in consideration of codon degeneracy (shown in SEQ ID NOs: 7 and 8), and 50 ng of the whole chromosomal DNA extracted in (1) above was used as a template. PCR cycle (heat denaturation 96 ° C., 30 seconds, annealing 48 ° C., 1 minute, extension reaction 72 ° C., 1 minute) was performed for 40 cycles, and after cooling to 4 ° C., the amplified DNA was confirmed by agarose gel electrophoresis. Was recovered from the agarose gel by a conventional method. Next, the DNA fragment was subcloned into pUC118, and the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer. As a result, in the determined DNA base sequence, a region encoding a predetermined partial amino acid sequence of the large subunit (SEQ ID NOs: 4 and 5) could be confirmed. ³² Labeled with P was used as probe DNA.
(3) Creation of restriction map
A PCR primer (shown in SEQ ID NO: 9) synthesized from a partial sequence of the DNA base sequence determined above and a degenerate primer (SEQ ID NO: 10) synthesized from the N-terminal amino acid sequence of the small subunit (shown in SEQ ID NO: 6) PCR was performed in the same manner as in the above reaction, and the amplification of DNA was confirmed by agarose electrophoresis. As a result, it was found that the ORF of the small subunit exists immediately 3 ′ downstream of the nucleotide sequence (open reading frame: ORF) encoding the large subunit. Next, Southern hybridization was performed using the extracted chromosomal DNA of the DS-S-7G strain to confirm that the nucleotide sequence was derived from the chromosomal DNA, and ORFs corresponding to the large and small polypeptides and their ORFs A restriction map was created for the surrounding nucleotide sequences.
(4) Cloning of genes from genomic libraries
Taking into account that the full length of the target HDD gene is included from the prepared restriction enzyme map, the chromosomal DNA of the DS-S-7G strain was cut with NotI and PstI, and then various types of DNA corresponding to about 5300 base pairs were obtained. A genomic library was prepared in which the fragment was inserted in the reverse direction of the lac promoter into the same restriction enzyme site of plasmid pBluescript II KS. From the 320 transformants obtained by introducing this into E. coli DH5α strain, 8 positive strains were obtained by colony hybridization using the probe prepared above. FIG. 1 shows the full length of the inserted HDD gene.
(5) Determination of base sequence
Plasmids were extracted from one of the positive strains by a conventional method, the inserted gene fragments were variously deleted by exonuclease III and mung bean endonuclease, and the base sequence of each sample was determined by the dideoxy method. . The determined nucleotide sequence and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The partial amino acid sequences of the purified HDDs shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 were present in the amino acid sequence deduced from the base sequence of the inserted DNA fragment derived from the positive strain, and the partial amino acid sequences completely matched.
[Example 2] Preparation of recombinant plasmid
The plasmid extracted above was inserted into the NotI and PstI sites of pBluescriptII SK under the control of the lac promoter to obtain a recombinant plasmid pSK-HDD. In addition, an EcoRI fragment containing the target structural gene shown in SEQ ID NO: 1 was inserted into the EcoRI site of the multicloning site of pBluescript II KS under the control of the lac promoter, to obtain a recombinant plasmid pKS-HDD1. Similarly, it was inserted into the EcoRI site of pUC18 to obtain a recombinant plasmid pUC-HDD1 (FIG. 2).
[Example 3] Production of recombinant Escherichia coli
Escherichia coli JM109 was transformed using the recombinant plasmid obtained in Example 2 by a conventional method to obtain recombinant Escherichia coli JM109 (pSK-HDD), JM109 (pKS-HDD1), and JM109 (pUC-HDD1). When Escherichia coli DH5α was used as a host, a transformant could not be obtained.
[Example 4] Expression of HDD in recombinant Escherichia coli
(1) Evaluation of HDD expressed in recombinant Escherichia coli
The transformant JM109 (pUC-HDD1) obtained in Example 3 was placed in a test tube in 5 ml of an LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride) for 16 hours at 30 ° C. The seed culture was conducted aerobically, and 1 ml was transferred to 50 ml of fresh LB medium in a 300 ml baffled Erlenmeyer flask. O. D. Was raised to 0.5, induction was performed with 1 mM IPTG for 2 hours, and then the transformants were collected. For the DS-S-7G strain of the genus Alcaligenes, a PYG medium (1% polypeptone, 1% yeast extract, 1% glycerin) in the same Erlenmeyer flask was subjected to aerobic seed culture at 30 ° C. for 20 hours. The bacteria were collected. Each sample was suspended in 5 ml of 20 mM phosphate buffer (pH 7.2), crushed by sonication (20 kHz, 20 W), and unnecessary substances were removed by centrifugation to obtain a cell extract. This was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (Native PAGE), and after electrophoresis, activity staining by HDD activity was performed. As a reaction solution, 0.5 mM phenazine mesosulfate (PMS) and 0.5 mM tetranitrotetrazolium blue in 20 mM phosphate buffer (pH 7.2), 0.2% (v / v) (R) form 3-substrate as a substrate A solution to which chloro-1,2-propanediol was added was prepared, and the gel after electrophoresis was immersed for 20 minutes to perform activity staining based on HDD activity (Tetrahedron Asymmetry Vol. 5, pp. 239-246, 1994).
As a result, in the extract from JM109 (pUC-HDD1), a staining band was observed at the same position as that of the HDD derived from Alcaligenes genus DS-S-7G strain, while the transformant JM109 containing only the vector plasmid was observed. No staining band was observed in (pUC18). Therefore, it was revealed that the HDD produced by Escherichia coli JM109 (pUC-HDD1) transformed with the recombinant plasmid was the same as that derived from the DS-S-7G strain (FIG. 3).
(2) Measurement of HDD activity in recombinant Escherichia coli
Reaction in which 0.25 mM phenazine meso sulfate (PMS), 0.25 mM 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), and 0.2% (v / v) various substrates were added to a 20 mM phosphate buffer (pH 7.2). A solution was prepared, and to this 2.7 ml, 300 μl of a JM109 (pUC-HDD1) cell extract prepared by the same method as in (1) of Example 4 was added, and reacted at 30 ° C. for 10 minutes. The HDD activity was determined by colorimetry using the decrease in absorbance at 600 nm due to the reduction of DCIP (Tetrahedron Asymmetry Vol. 5, pp. 239-246, 1994). The substrate 2,3-dichloro-1-propanol is represented by the formula (1), 3-chloro-1,2-propanediol is represented by the formula (2), 1,2-propanediol, 1,2,4- Butanetriol corresponds to the substrate of the reaction formula of formula (3). As a result, the cell extract of the recombinant Escherichia coli JM109 (pUC-HDD1) had stereoselectivity for each substrate similarly to Alkerigenes DS-S-7G strain, and the activity per mg of the protein was DS- It was about 1.1 to 1.9 times that of the S-7G strain. Table 1 shows the results. 1 U represents the amount of enzyme that reduces 1 μmol of DCIP per minute at 30 ° C., and the results are expressed as activity per 1 mg of protein. The protein was quantified by the Bradford method.

The HDD activity of the recombinant E. coli JM109 (pSK-HDD) and JM109 (pKS-HDD1) was measured in the same manner using the (R) -form 3-chloro-1,2-propanediol as a substrate. pUC-HDD1) (Table 2).

(3) Evaluation of thermal stability of HDD derived from recombinant Escherichia coli JM109 (pUC-HDD1)
300 μl of the cell extract of JM109 (pUC-HDD1) prepared by the same method as (1) of Example 4 was allowed to stand at 30 ° C. to 60 ° C. for 15 minutes, and then the (R) body 3 was obtained by the same method as (2). The reaction was carried out at 30 ° C. using -chloro-1,2-propanediol as a substrate. As a result, at 40 ° C. or higher, the thermostability of the HDD activity of the cell extract derived from recombinant Escherichia coli was higher than that of the cell extract derived from Alkerigenes DS-S-7G strain. The temperature at which the relative activity to the activity at 30 ° C. was reduced to 50% was 44 ° C. for the enzyme derived from Alkerigenes DS-S-7G, and 50 ° C. for the enzyme derived from recombinant Escherichia coli JM109 (pUC-HDD1). (Table 3).

Alcaligenes genus DS-S-7G strain has been confirmed to have a protein that increases HDD activity by about 5-fold (Appl Microbiol Biotechnol Vol. 42, pp. 270-279, 1994). On the other hand, the specific activity of HDD of the cell extract derived from Escherichia coli JM109 (pUC-HDD1) per mg of protein was 1.1 to 1 compared to the extract derived from the genus DS-S-7G of Alcaligenes sp. 0.9 times higher activity and improved thermal stability. JM109 (pUC-HDD1) has been deposited with the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM P-18403.
Industrial applicability
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the method of this invention, in the synthesis | combination of the optically active compound used for pharmaceuticals, agrochemicals, ferroelectric liquid crystal, etc., or its intermediate, optically active 1,2-diol and halogenohydrin which can become a useful chiral building block Manufacturing can be performed efficiently.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a restriction map of a region containing an HDD gene cloned into pBluescript II KS in the present invention, and ORFs of two large and small subunits. The nucleotide sequence was determined between the EcoRI sites sandwiching the ORF.
FIG. 2 is a restriction map of pUC-HDD1. The region between the EcoRI sites sandwiching the ORF of the cloned HDD gene was subcloned into the EcoRI site of the multicloning site of pUC18.
FIG. 3 is a gel photograph after native PAGE activity staining. From the left lane, 1) DS-S-7G (genus Alcaligenes), 2) JM109 (pUC-HDD1), 3) JM109 (pUC18) are shown.

Claims (14)

A halohydrin dehydrodehalogenase gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3. A gene comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in SEQ ID NOs: 2 and 3, and encoding a protein having halohydrin dehydrodehalogenase activity. The halohydrin dehydrodehalogenase activity is determined by the following formulas (1) to (3):

(Wherein, R is an alkyl or aryl group, X is Cl or Br, and PMS represents phenazine methosulfate)
4. The compound according to claim 3, which has a stereoselective alcohol dehydrogenase activity or a stereoselective oxidative dehalogenation activity with respect to any of the 1,2-diol compound and the halogenohydrin compound having the steric structure shown in the above. Gene. 4. The gene according to claim 3, wherein the halohydrin dehydrodehalogenase activity is a stereoselective oxidative dehalogenation activity with respect to the halogenohydrin compound having the steric structure represented by the above formula 1. The gene according to claim 3, wherein the halohydrin dehydrodehalogenase activity is an alcohol dehydrogenase activity that is stereoselective with respect to a 1,2-diol compound having the steric structure represented by the above formulas 2 and 3. . A recombinant vector containing the gene according to any one of claims 1 to 6. The vector according to claim 7, wherein the recombinant vector is a plasmid pUC-HDD1. A transformant into which the recombinant vector according to claims 7 to 8 has been introduced. The transformant according to claim 9, wherein the host is Escherichia coli. The transformant according to claim 9, wherein the host is of the genus Alcaligenes. The host according to claim 9, wherein the host is selected from the genus Saccharomyces, Xanthomonas, Acetobacter, Pseudomonas, Gluconobacter, Azotobacter, Rhizobium, Alcaligenes, Klebsiella, or Salmonella. Transformants. 13. Any of claims 9 to 12, wherein the halohydrin dehydrodehalogenase activity per mg of protein produced is 1.1 to 1.9 times the activity produced by the gene donor. Or the transformant according to item 1. A method for producing a halohydrin dehydrodehalogenase using the transformant according to any one of claims 9 to 13.

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